Tài liệu Nghiên cứu định lượng một số hoạt chất trong thuốc kháng sinh bằng phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------------- Đoàn Thị Huyền NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT TRONG THUỐC KHÁNG SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI KẾT HỢP VỚI THUẬT TOÁN HỒI QUY ĐA BIẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------------- Đoàn Thị Huyền NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT TRONG THUỐC KHÁNG SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI KẾT HỢP VỚI THUẬT TOÁN HỒI QUY ĐA BIẾN Chuyên ngành: Mã Số: Hóa phân tích 62440118 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. Tạ Thị Thảo TS. Bùi Xuân Thành XÁC NHẬN NCS ĐÃ CHỈNH SỬA THEO QUYẾT NGHỊ CỦA HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ LUẬN ÁN Người hướng dẫn khoa học Chủ tịch hội đồng đánh giá Luận án Tiến sĩ PGS.TS. Tạ Thị Thảo PGS.TS. Trần Chương Huyến Hà Nội - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dƣới sự hƣớng dẫn của PGS.TS. Tạ Thị Thảo và TS. Bùi Xuân Thành. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả ĐOÀN THỊ HUYỀN i LỜI CẢM ƠN Luận án này đƣợc hoàn thành với sự hỗ trợ, giúp đỡ, động viên của các Thầy Cô, gia đình và bạn bè, đồng nghiệp. Với tình cảm chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Tạ Thị Thảo và TS. Bùi Xuân Thành là những ngƣời thầy đã tận tâm hƣớng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình làm luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tới các quý Thầy, Cô trong Bộ môn Hóa Phân tích, khoa Hóa Học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tâm huyết truyền dạy kiến thức và luôn tạo điều kiện tốt nhất để tôi đƣợc học tập, nghiên cứu tại đây. Tôi xin đƣợc cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí và thiết bị máy móc từ đề tài nghị định thƣ với Cộng hòa Pháp Lotus 2014 - 2016, mã số 39/2014/HD- NĐT. Cảm ơn các bạn trong nhóm nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp phổ hấp thụ hồng ngoại của Bộ môn Hóa Phân tích, khoa Hóa Học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã phối hợp, hỗ trợ tôi hoàn thành nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm kiểm nghiệm dƣợc phẩm - mỹ phẩm Nghệ An đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình làm luận án. Lời sau cùng, xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới những ngƣời thân trong gia đình, tới những ngƣời bạn, tới lãnh đạo và các đồng nghiệp khoa Tự nhiên, trƣờng Cao đẳng Sƣ phạm Hà Tây, các học viên, sinh viên trong Bộ môn Hóa Phân tích, khoa Hóa Học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã luôn kịp thời động viên, ủng hộ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án. Tác giả Đoàn Thị Huyền ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... I LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... II MỤC LỤC............................................................................................................... III DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .......................................... VI DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... IX DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ............................................................... XI MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .................................................................................... 4 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁC NHÓM THUỐC KHÁNG SINH NGHIÊN CỨU............................... 4 1.1.1. Nhóm thuốc kháng sinh Sulfamid ................................................................ 4 1.1.1.1. Cấu tạo của các chất kháng sinh nhóm Sulfamid ................................. 4 1.1.1.2. Tính chất vật lí và hóa học của các Sulfamid ....................................... 5 1.1.1.3. Độc tính của Sulfamid ........................................................................... 6 1.1.2. Nhóm thuốc kháng sinh họ β- lactam ........................................................... 6 1.1.2.1. Cấu tạo hóa học của các kháng sinh nhóm β-lactam (nhóm penicilin và cephalossporin) ............................................................................ 6 1.1.2.2. Tính chất vật lí và hóa học của các β- lactam ...................................... 9 1.1.2.3. Độc tính và tai biến của β- lactam ...................................................... 12 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH CÁC HOẠT CHẤT KHÁNG SINH TRONG THUỐC ............................................................................................................ 12 1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƢỢNG CÁC HOẠT CHẤT KHÁNG SINH TRONG THUỐC ............................................................................................................ 14 1.3.1. Phƣơng pháp điện hóa ................................................................................ 14 1.3.2. Phƣơng pháp điện di mao quản .................................................................. 14 1.3.3. Phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao ..................................................... 15 1.3.4. Phƣơng pháp phổ tử ngoại khả kiến ........................................................... 16 1.3.5. Phƣơng pháp phổ Raman ........................................................................... 17 1.4. PHƢƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI KẾT HỢP VỚI THUẬT TOÁN HỒI QUY ĐA BIẾN PHÂN TÍCH CÁC HOẠT CHẤT KHÁNG SINH TRONG THUỐC .......................................... 19 1.4.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp đo phổ hồng ngoại ...................................... 19 1.4.1.1. Sự xuất hiện của phổ hồng ngoại ........................................................ 19 1.4.1.2. Nguyên tắc của phép đo phổ hồng ngoại ............................................ 20 1.4.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo phổ hồng ngoại ...................... 23 1.4.2. Định lƣợng các chất bằng phƣơng pháp phổ hồng ngoại kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến ......................................................................................... 24 1.4.2.1. Cơ sở lí thuyết của phương pháp hồi quy đa biến .............................. 24 1.4.2.2. Các nguyên cứu định lượng các hoạt chất kháng sinh bằng phương pháp phổ hồng ngoại đã được công bố .............................................. 33 iii CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM ............................................................................. 37 2.1. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ....................................................................................... 37 2.1.1. Hóa chất ...................................................................................................... 37 2.1.2. Thiết bị ........................................................................................................ 39 2.2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................... 39 2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................. 39 2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 41 2.2.2.1. Phương pháp phân tích định lượng bằng phổ hồng ngoại kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến .................................................................................. 41 2.2.2.2. Các phương pháp phân tích đối chứng xác định hàm lượng các hoạt chất kháng sinh trong thuốc ....................................................................... 50 2.2.2.3. Quy trình phân tích ............................................................................. 51 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................... 53 3.1. NGHIÊN CỨU TÌM ĐIỀU KIỆN TỐI ƢU PHÉP ĐO HỒNG NGOẠI................................ 53 3.1.1. Lựa chọn vùng đo phổ hấp thụ hồng ngoại của các hoạt chất ...................... 53 3.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng của tá dƣợc .................................................................... 58 3.1.3. Khảo sát tỉ lệ khối lƣợng mẫu /KBr ............................................................... 61 3.1.4. Khảo sát khối lƣợng mẫu đem ép viên và độ lặp lại của quá trình ép viên .. 62 3.1.5. Nghiên cứu đánh giá ảnh hƣởng của độ ẩm của mẫu.................................... 64 3.2. NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN MÔ HÌNH HỒI QUY ĐA BIẾN XÁC ĐỊNH MỘT HOẠT CHẤT KHÁNG SINH TRONG THUỐC. .................................................................. 65 3.2.1. Ma trận mẫu chuẩn và ma trận mẫu kiểm tra xác định hoạt chất cefixim khi có mặt các tá dƣợc................................................................................................... 67 3.2.2. Nghiên cứu xác định cefixim khi có tá dƣợc bằng phƣơng pháp CLS và ILS .................................................................................................................... 69 3.2.3. Nghiên cứu xác định cefixim khi có lẫn tá dƣợc theo phƣơng pháp PCR ... 71 3.2.4. Xác định cefixim khi có lẫn tá dƣợc theo phƣơng pháp pháp PLS .............. 78 3.2.5. Nghiên cứu lựa chọn mô hình hồi quy đa biến xác định hoạt chất kháng sinh sulfaguanidin trong thuốc........................................................................... 84 3.3. NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN MÔ HÌNH HỒI QUY ĐA BIẾN XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI CÁC HOẠT CHẤT KHÁNG SINH TRONG CÙNG NHÓM THUỐC .......................................... 85 3.3.1. Nghiên cứu xác định đồng thời cefaclor, cephalexin, cefadroxil khi có tá dƣợc ................................................................................................................ 86 3.3.1.1. Chế tạo mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra chứa hoạt chất cefaclor, cephalexin, cefadroxil và các tá dược .......................................................................... 86 3.3.1.2. Xác định đồng thời cefaclor, cephalexin, cefadroxil khi có lẫn tá dược theo mô hình PCR ............................................................................................ 88 3.3.1.3. Đánh giá lựa chọn mô hình chuẩn xác định đồng thời cefaclor, cephalexin, cefadroxil khi có lẫn tá dược theo phương pháp pháp PLS..................... 91 iv 3.3.2. Xây dựng mô hình định lƣợng đồng thời các hoạt chất kháng sinh trong thuốc theo mô hình PLS và PCR. ................................................................................. 95 3.3.2.1. Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh nhóm penicilin trong thuốc theo mô hình PLS và PCR ............................................... 95 3.3.2.2. Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh ceftriaxon và cefotaxim trong thuốc theo mô hình PLS và PCR ................................. 97 3.3.2.3. Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh cefixim và cefadroxil trong thuốc theo mô hình PLS và PCR ................................... 101 3.3.2.4. Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh penicilin và cephalexin trong thuốc theo mô hình PLS và PCR. ............................... 104 3.3.2.5. Xây dựng mô hình định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh nhóm sulfamid trong thuốc theo mô hình PLS và PCR ............................................. 108 3.4. ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘ ẨM KHÔNG KHÍ ĐẾN KẾT QUẢ HÀM LƢỢNG TÍNH TOÁN THEO MÔ HÌNH ............................................................................................................. 112 3.5. PHÂN TÍCH MẪU THỰC TẾ ..................................................................................... 114 3.5.1. Định tính mẫu thực tế ................................................................................... 114 3.5.2. Định lƣợng các kháng sinh trong mẫu thuốc ............................................... 118 3.5.2.1. Định lượng các kháng sinh nhóm sulfamid.......................................... 118 3.5.2.2. Định lượng các kháng sinh nhóm penicilin ......................................... 121 3.5.2.3. Định lượng các kháng sinh nhóm Cephalosporin ............................... 122 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................. 127 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ................................................................................. 129 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 130 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Thuật ngữ tiếng anh Thuật ngữ tiếng việt AM Ampicillin Ampicilin AX Amoxicillin Amoxicilin CE capillary electrophoresis Điện di mao quản CFC Cefaclor Cefaclor CFD Cefadroxil Cefadroxil CFX Cefixime Cefixim CLS Classical least square CPL Cephalexin Cephalexin CTR Ceftriaxone Ceftriaxon CTX Cefotaxime Cefotaxim CZE DĐVN 4 FT FT- IR HL HPLC capillary zone Bình phƣơng tối thiểu thông thƣờng Điện di mao quản vùng electrophoresis pharmacopoeia vietnamica 2009-2010 Dƣợc điển Việt Nam 4 Fourier transform Chuyển hóa Fourier Fourier transform infrared Phổ hồng ngoại chuyển spectroscopy hóa Fourier Content Hàm lƣợng High Performance Liquid Chromatography Sắc k lỏng hiệu năng cao The standard ultraviolet HPLC/UV (UV) detector for high Sắc ký lỏng hiệu năng cao performance liquid ghét đầu dò cực tím chromatography ILS inverse least square vi Bình phƣơng tối thiểu nghịch đảo IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại KLTB mean weight Khối lƣợng trung bình viên LC/MS LC-MS/MS Liquid chromatography mass spectrometry Liquid Chromatography - with ultraviolet/Diode Array Detection Malt Sắc ký lỏng ghép 2 lần tandem mass spectrometer khối phổ Liquid Chromatography LC-UV/DAD Sắc kí lỏng khối phổ Sắc ký lỏng ghép nối với đầu dò cực tím/diot array Maltodextrin Maltodextrin Micellar electrokinetic Điện di mao quản điện chromatography động học kiểu Mixen NIR Near infrared Hồng ngoại gần PC Principal component Cấu tử chính MEKC PCA PCR Principal Component Analysis principal component regression Phân tích thành phần chính Hồi qui cấu tử chính Bình phƣơng tối thiểu từng PLS partial least square PN Penicillin Penicilin PP Method Phƣơng pháp RMSE Root mean square error Độ lệch chuẩn Root mean square error of Độ lệch chuẩn của ma trận standard chuẩn Root mean square error of Độ lệch chuẩn của ma trận test kiểm tra RMSES RMSET phần Reverse phase High RP-HPLC Performance Liquid Chromatography vii Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo SFG Sulfaguanidine Sulfaguanidin SFM Sulfamethoxazole Sulfamethoxazol TB Mean Trung bình Tbot Starch Tinh bột TLC TMP UPLCMS/MS USP 34 UV-VIS Thin Layer Sắc kí lớp mỏng Chromatography Trimethoprime Trimethoprim Ultra performance liquid chromatography - tandem mass spectrometer The United State Pharmacopoeia 34, 2012. Ultraviolet-visible Sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép 2 lầnkhối phổ Dƣợc điển Mỹ 34 Phổ tử ngoại khả kiến spectroscopy VN Vietnamese Việt Nam w/w Weight/Weight Khối lƣợng/khối lƣợng Ghi chú: Trong luận án, tên hóa chất và hoạt chất theo quy định trong Dược điển Việt Nam 4 [2] viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Công thức cấu tạo của một số Sulfamid phổ biến ...................................... 4 Bảng 1.2: Công thức cấu tạo một số penicilin ............................................................ 7 Bảng 1.3: Công thức cấu tạo của các hoạt chất trong nhóm cephalosporin ............... 8 Bảng 1.4: Danh sách các dƣợc phẩm đƣợc nghiên cứu bằng phƣơng pháp quang phổ Raman ..................................................................................................... 18 Bảng 1.5: Bảng so sánh một số đặc điểm của 2 loại thiết bị đo phổ hồng ngoại thƣờng IR và FT-IR .................................................................................................. 22 Bảng 1.6: Tóm tắt một số công trình nghiên cứu định lƣợng các hoạt chất kháng sinh trong thuốc bằng phƣơng pháp phổ hồng ngoại ................................................ 35 Bảng 2.1: Mẫu thuốc phân tích ................................................................................. 40 Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của tỷ lệ khối lƣợng mẫu thuốc viên cefalexin/KBr ............. 61 Bảng 3.2: Ảnh hƣởng của tỷ lệ khối lƣợng mẫu thuốc viên Bisepton /KBr............. 61 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của khối lƣợng mẫu đem ép viên đến độ hấp thụ quang ....... 62 Bảng 3.4: Khảo sát độ lặp lại quá trình ép mẫu theo độ hấp thụ và theo diện tích pic ....................................................................................................... 63 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của độ ẩm mẫu đến độ hấp thụ quang tại các số sóng đặc trƣng ................................................................................................................... 64 Bảng 3.6: Hàm lƣợng (%) cefixim và tổng tá dƣợc trong mẫu chuẩn ...................... 67 Bảng 3.7: Hàm lƣợng (%) cefixim và tổng tá dƣợc các mẫu kiểm tra ..................... 68 Bảng 3.8: Hàm lƣợng (%) hoạt chất cefixim và sai số tƣơng ứng ........................... 70 Bảng 3.9: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định cefixim có lẫn tá dƣợc trong mẫu chuẩn tự tạo theo phƣơng pháp PCR ....................................................... 76 Bảng 3.10: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định cefixim có lẫn tá dƣợc trong mẫu kiểm tra tự tạo theo phƣơng pháp PCR ................................................... 77 Bảng 3.11: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định cefixim có lẫn tá dƣợc trong mẫu kiểm tra tự tạo theo phƣơng pháp PLS .................................................... 81 Bảng 3.12: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định sulfaguanidin có lẫn tá dƣợc trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra theo phƣơng pháp PLS và PCR ............ 84 Bảng 3.13: Hàm lƣợng (%) cefadroxil, cephalexin, cefaclor và tổng tá dƣợc trong mẫu chuẩn ........................................................................................................ 86 Bảng 3.14: Hàm lƣợng (%) cefadroxil, cephalexin, cefaclor và tổng tá dƣợc trong mẫu kiểm tra .................................................................................................... 87 ix Bảng 3.15: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định cefadroxil, cephalexin, cefaclor có lẫn tá dƣợc trong mẫu chuẩn tự tạo theo phƣơng pháp PCR ................. 89 Bảng 3.16: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định cefadroxil, cephalexil, cefaclor có lẫn tá dƣợc trong mẫu kiểm tra tự tạo theo phƣơng pháp PCR.............. 90 Bảng 3.17: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định cefadroxil, cephalexin, cefaclor có lẫn tá dƣợc trong mẫu chuẩn tự tạo theo phƣơng pháp PLS .................. 92 Bảng 3.18: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định penicilin, ampicilin, amoxicilin có lẫn tá dƣợc trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra theo phƣơng pháp PCR, PLS .................................................................................................................. 95 Bảng 3.19: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định ceftriaxon và cefotaxim có lẫn tá dƣợc trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra theo phƣơng pháp PCR, PLS ..... 98 Bảng 3.20: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định cefixim và cefadroxil có lẫn tá dƣợc trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra theo phƣơng pháp PCR, PLS ... 101 Bảng 3.21: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định penicilin, cephalexin có lẫn tá dƣợc trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra theo phƣơng pháp PCR, PLS ... 105 Bảng 3.22: Độ chính xác của mô hình hồi qui xác định hoạt chất kháng sinh nhóm sulfamid có lẫn tá dƣợc trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra theo phƣơng pháp PCR, PLS .......................................................................................... 109 Bảng 3.23: Hàm lƣợng các hoạt chất (mg) và giá trị độ ẩm (%) tƣơng ứng trong các mẫu chuẩn ............................................................................................... 112 Bảng 3.24: Hàm lƣợng hoạt chất (mg) và giá trị độ ẩm (%) tƣơng ứng................. 113 Bảng 3.25: Sai số tƣơng đối (%) khi phân tích các hoạt chất trong mẫu kiểm tra (khi thay đổi độ ẩm mẫu và môi trƣờng đo) ........................................................... 114 Bảng 3.26: Khối lƣợng hoạt chất và tổng tá dƣợc trộn thêm vào các mẫu thực tế ... 119 Bảng 3.27: Hàm lƣợng (mg/viên) của SFG trong các mẫu thực tế ........................... 120 Bảng 3.28: Hàm lƣợng (mg/viên) của SFM và TMP trong các mẫu thực tế ............ 120 Bảng 3.29: Khối lƣợng hoạt chất trong nhóm penicilin và tá dƣợc trộn thêm.......... 121 Bảng 3.30: Hàm lƣợng (mg/viên) của PN, AM, AX trong các mẫu thực tế ............. 122 Bảng 3.31: Khối lƣợng hoạt chất nhóm cephalosporin và tá dƣợc trộn thêm........... 123 Bảng 3.32: Hàm lƣợng (mg/viên) của nhóm Cephalosporin trong các mẫu thực tế ...................................................................................................................... 124 Bảng 3.33: Hàm lƣợng (mg/lọ) thuốc tiêm của nhóm Cephalosporin trong các mẫu thực tế .............................................................................................................. 124 x DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Công thức cấu tạo chung của nhóm Sulfamid ............................................ 4 Hình 1.2: Công thức cấu tạo của Azetidin-2-on (beta-lactam) ................................... 6 Hình 1.3: Công thức cấu tạo chung của các kháng sinh nhóm penicilin .................... 7 Hình 1.4: Công thức cấu tạo chung của các kháng sinh nhóm cephalosporin ........... 8 Hình 1.5: Phản ứng mở vòng β-lactam bởi β-lactamase .......................................... 10 Hình 1.6: Phản ứng thủy phân của β-lactam khi pH>8 ............................................ 10 Hình 1.7: Sơ đồ định lƣợng β-lactam bằng phƣơng pháp đo iod ............................. 10 Hình 1.8: Phản ứng thủy phân β-lactam khi pH<5 ................................................... 11 Hình 1.9: Phản ứng giữa penicilin với hydroxylamin, Cu2+ ..................................... 11 Hình 1.10: Các bƣớc phân tích quang phổ hồng ngoại............................................. 20 Hình 1.11: Giao thoa kế Michell .............................................................................. 21 Hình 2.1: Lƣợc đồ phân tích các hoạt chất trong thuốc bằng phƣơng pháp IR kết hợp với hồi quy đa biến ...................................................................................... 52 Hình 3.1: Phổ hồng ngoại của a) sulfaguanidin, b) sulfamethoxazol và c) trimethoprim trong khoảng 4000-400cm-1............................................................ 54 Hình 3.2: Phổ hấp thụ hồng ngoại các hoạt chất trong nhóm sulfamid và trimethoprim trong khoảng 7500 - 2800 cm-1 ........................................................... 55 Hình 3.3: Hình biểu diễn các giá trị của tập dữ liệu ban đầu trên trục tọa độ gốc ...... 55 Hình 3.4: Hình biểu diễn các giá trị của tập dữ liệu ban đầu trên trục tọa độ mới ..... 56 Hình 3.5: Phổ hấp thụ hồng ngoại của các hoạt chất kháng sinh a) nhóm penicilin; b) và c) nhóm cephalosporin trong khoảng 7500 - 2800 cm-1 .................................. 57 Hình 3.6: Phổ hấp thụ hồng ngoại của a) các tá dƣợc trong nhóm sulfamid, b) các tá dƣợc trong nhóm penicilin, c) các tá dƣợc trong nhóm cephalosporin khảo sát trong khoảng phổ 3600 -2800 cm-1............................................................. 59 Hình 3.7: Cách tìm ma trận trị số a) và ma trận trọng số b) ..................................... 72 Hình 3.8: Cách tìm PC trong PCA ............................................................................ 74 Hình 3.9: Phƣơng sai t ch lũy của mô hình biểu diễn theo số cấu tử riêng từng phần khi xác định hoạt chất cefixim và các tá dƣợc ............................... 75 Hình 3.10: Tƣơng quan hàm lƣợng cefixim tìm đƣợc từ mô hình PCR ................... 78 Hình 3.11: Biểu diễn cách tìm ma trận trực giao trong PLS .................................... 80 Hình 3.12: Tƣơng quan hàm lƣợng (%) cefixim tìm đƣợc với hàm lƣợng trong các mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra sử dụng phổ đạo hàm bậc 1 và phƣơng pháp PLS ...... 83 xi Hình 3.13: Tƣơng quan hàm lƣợng (mg) của sulfaguanidin (trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra) tìm đƣợc từ mô hình PLS với giá trị ban đầu .................................... 85 Hình 3.14: Phƣơng sai t ch lũy của mô hình biểu diễn theo số cấu tử riêng ............ 88 Hình 3.15: Tƣơng quan hàm lƣợng (%) của cefadroxil, cephalexin, cefaclor a) trong mẫu chuẩn và b) trong mẫu kiểm tra tìm đƣợc từ mô hình PCR với giá trị ban đầu............................................................................................................ 91 Hình 3.16: Tƣơng quan hàm lƣợng (%) của cefadroxil, cephalexin, cefaclor a) trong mẫu chuẩn và b) trong mẫu kiểm tra tìm đƣợc từ mô hình PLS với giá trị ban đầu............................................................................................................ 94 Hình 3.17: Tƣơng quan hàm lƣợng (g) của penicilin, ampicilin, amoxicilin a) trong mẫu chuẩn và b) trong mẫu kiểm tra tìm đƣợc từ mô hình PCR với giá trị ban đầu............................................................................................................ 97 Hình 3.18: Tƣơng quan hàm lƣợng (%) của ceftriaxone, cefotaxim tìm đƣợc từ mô hình PLS (a) trong mẫu chuẩn và b) mẫu kiểm tra) và PCR (a) trong mẫu chuẩn và b) mẫu kiểm tra) với giá trị ban đầu ........................................................ 100 Hình 3.19: Tƣơng quan hàm lƣợng (%) của cefixim, cefadroxil (a) trong mẫu chuẩn và b) mẫu kiểm tra) tìm đƣợc từ mô hình PLS với giá trị ban đầu .............. 103 Hình 3.20: Tƣơng quan hàm lƣợng (mg) của penicilin, cephalexin (a) trong mẫu chuẩn và b) mẫu kiểm tra) tìm đƣợc từ ma trận đạo hàm bậc 1 và mô hình PLS với giá trị ban đầu ................................................................................................... 108 Hình 3.21: Tƣơng quan hàm lƣợng (mg) của các hoạt chất kháng sinh nhóm sulfamid (trong mẫu chuẩn a) và mẫu kiểm tra b)) tìm đƣợc từ mô hình PCR ...... 111 Hình 3.22: Phổ hấp thụ hồng ngoại của Sulfaguanidin .......................................... 115 Hình 3.23: Phổ hấp thụ hồng ngoại của Sulfamethoxazol ...................................... 116 Hình 3.24: Phổ hấp thụ hồng ngoại của Trimethoprim .......................................... 116 Hình 3.25: Phổ hấp thụ hồng ngoại của sulfaguanidin ........................................... 117 Hình 3.26: Phổ hấp thụ hồng ngoại của mẫu thuốc S1 chứa sulfaguanidin ........... 118 Hình 3.27: Tƣơng quan giữa hàm lƣợng hoạt chất đƣợc xác định bằng hồi quy ... 125 xii MỞ ĐẦU Dƣợc phẩm và chất lƣợng dƣợc phẩm hiện đang là vấn đề rất đƣợc quan tâm ở Việt Nam [4]. Các thuốc trên thị trƣờng đều có các quy chuẩn kiểm nghiệm theo chuẩn dƣợc điển đƣợc thực hiện tại các trung tâm kiểm nghiệm có uy tín sử dụng các trang thiết bị có độ chính xác cao nhƣng đòi hỏi phải mất nhiều thời gian. Quy trình phân tích bao gồm: Phân lập hoạt chất cần phân tích trong thuốc, làm giàu hoặc pha loãng, phân tích và xử lý kết quả phân tích [2, 3]. Tuy nhiên, trong quá trình lƣu thông thuốc trên thị trƣờng, có nhiều thuốc giả, thuốc nhái, thuốc kém chất lƣợng cần đƣợc phân tích nhanh theo ba khâu: Phân lập thuốc, phân tích và xử lý kết quả. Gần đây, các tác giả xây dựng phƣơng pháp phân t ch nhanh theo ba tiêu chí: Chuẩn bị mẫu nhanh, không cần phân lập hoạt chất, xử lý kết quả tự động và đạt độ chính xác cao kết hợp với quy trình xử lý kết quả tự động là định hƣớng nghiên cứu lý thú cả về phát triển phƣơng pháp và khả năng ứng dụng [53]. Đặc tính của phƣơng pháp phổ hồng ngoại là phổ dao động của các nhóm chức đặc trƣng và các liên kết có trong phân tử hợp chất hóa học, do đó gặp khó khăn khi đƣa ra đƣợc các thông tin đặc trƣng nếu chỉ đo tại một bƣớc sóng [7, 70]. Mặt khác, phổ hồng ngoại chịu ảnh hƣởng mạnh mẽ của các thông số nhƣ điều kiện vật lý của mẫu, môi trƣờng đo mẫu, độ dày của viên mẫu, tỷ lệ ép viên. Vì thế phƣơng pháp phổ hồng ngoại đƣợc biết đến là một phƣơng pháp chủ yếu dùng trong phân tích cấu trúc, các kỹ thuật phân t ch thông thƣờng nhƣ đƣờng chuẩn và thêm chuẩn đƣợc ứng dụng rất hạn chế, phần lớn các trƣờng hợp đều không khả thi [32]. Toán hóa (chemometrics) đƣợc định nghĩa là việc ứng dụng các phƣơng pháp toán học, thống kê, đồ hoạ,… để quy hoạch thực nghiệm, tối ƣu hoá các thông tin hoá học trích ra từ tập số liệu phân t ch và đƣa ra tối đa những thông tin hữu ích từ tập số liệu ban đầu [10]. Ra đời từ những năm đầu của thập kỉ 70, cho tới nay toán hóa đã xác lập đƣợc một vị trí quan trọng cho mình trong ngành hoá học, đặc biệt là trong hoá học phân tích hiện đại. Một mảng lớn trong toán hóa phát triển nhanh gắn liền với toán học và tin học là hồi quy đa biến - kỹ thuật đa biến đƣợc dùng rộng rãi trong phòng thí nghiệm hoá học giúp giải quyết các bài toán xác định đồng thời 1 nhiều cấu tử cùng có mặt trong hỗn hợp mà không cần tách loại trƣớc. Bản chất của thuật toán hồi quy đa biến là chuyển một tập hợp liên tục trên trục số thực thành tập hợp các điểm rời rạc và tìm mối quan hệ toán học của chúng. Nếu các điểm toán học đƣợc mã hóa các tín hiệu điện, ánh sáng…thì các t n hiệu đƣợc phân tách và nhận dạng rõ ràng, nhiễu đƣợc giảm đi tối đa, t n hiệu trở nên sắc nét và đặc trƣng. Vì vậy, phân tích quang phổ hồng ngoại kết hợp với hồi quy đa biến đã mở ra nhiều ứng dụng mới trong nhiều lĩnh vực [20, 53, 69, 71, 80, 87, 97, 99]. Trong nhiều năm gần đây, kỹ thuật phân tích quang phổ hồng ngoại kết hợp với phƣơng pháp hồi quy đa biến đã trở thành một kỹ thuật phân tích có tính ứng dụng cao cho ngành công nghiệp dƣợc phẩm [19, 59, 94, 95, 100] bởi vì đây là một phƣơng pháp phân t ch nhanh, không cần phá hủy mẫu hoặc xử lí mẫu đơn giản, không sử dụng các hóa chất và dung môi độc hại [36, 58, 61, 65, 68, 87]. Do vậy, mục tiêu của đề tài luận án : “Nghiên cứu định lượng một số hoạt chất trong thuốc kháng sinh bằng phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến” nhằm phát triển phƣơng pháp phổ hồng ngoại kết hợp với hồi quy đa biến tuyến t nh xác định các hoạt chất trong thuốc phục vụ phân t ch sàng lọc và định lƣợng nhanh hàm lƣợng hoạt chất trong các sản phẩm kháng sinh thuộc nhóm sulfamid và β-lactam đang đƣợc sử dụng phổ biến trên thị trƣờng Việt Nam hiện nay. Để xây dựng quy trình xác định các hoạt chất bằng phƣơng pháp phổ hồng ngoại kết hợp với phƣơng pháp hồi quy đa biến, nội dung nghiên cứu chủ yếu của luận án gồm: 1. Khảo sát tìm các điều kiện tối ƣu của phép đo phổ hồng ngoại vùng gần và trung với các hoạt chất và mẫu thuốc tự tạo, mẫu thuốc thành phẩm. 2. Nghiên cứu lựa chọn mô hình hồi quy đa biến phù hợp để xác định một hoạt chất khi có mặt các tá dƣợc trong mẫu thuốc viên/thuốc bột và nghiên cứu xác định đồng thời các hoạt chất trong cùng nhóm chất bằng một mô hình hồi quy đa biến tuyến tính. 3. Đánh giá các thông số chính của một quy trình phân tích nhanh trên cơ sở xây dựng mô hình hồi quy đa biến tuyến tính từ các mẫu tự tạo có chứa hoạt chất và tá dƣợc thƣờng dùng. 2 4. Ứng dụng quy trình phân tích xây dựng đƣợc để phân tích một số mẫu thuốc kháng sinh đang lƣu hành trên thị trƣờng hiện nay và so sánh kết quả với phƣơng pháp tiêu chuẩn quy định trong Dƣợc điển.  Điểm mới về mặt khoa học và thực tiễn của luận án: - Lần đầu tiên đã xây dựng đƣợc quy trình phân tích nhanh các hoạt chất nhóm sulfamid và một số chất thuộc nhóm β-lactam (ampicilin, cefixim, cefaclor, ceftriaxon, cefotaxim) bằng phƣơng pháp phổ hấp thụ hồng ngoại vùng gần và trung trên cơ sở sử dụng các mô hình hồi quy đa biến PLS và PCR. Quy trình này cho phép phân tích xử lí mẫu đơn giản, không sử dụng dung môi độc hại, nhanh và cho kết quả phù hợp trong việc sàng lọc nguyên liệu và phân tích nhanh các sản phẩm thuốc. - Lần đầu tiên có thể xác định đồng thời các hoạt chất trong cùng nhóm thuốc sulfamid và β-lactam bằng phƣơng pháp IR kết hợp với hồi quy đa biến trên cùng một mô hình. Quy trình này cho phép xác định đƣợc bất kỳ một chất nào trong thuốc bằng một mô hình hồi quy đa biến. Điều này mở ra khả năng xây dựng phần mềm trên thiết bị cầm tay theo cách bổ sung dần tập số liệu. - Quy trình phân tích các hoạt chất sulfaguanidin, sulfamethoxazol và trimethoprim; cephalexin, cefaclor và cefadroxil; penicilin, ampicilin và amoxicilin; cefotaxim và ceftriaxon; cefixim và cefadroxil bằng các mô hình xác định đồng thời cho phép ứng dụng để phân t ch sàng lọc nguyên liệu và các sản phẩm thuốc thành phẩm. Kết quả luận án mở ra các hƣớng nghiên cứu mới trên các đối tƣợng phức tạp hơn nhƣ thực phẩm chức năng, các mẫu sinh học và thực phẩm. 3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về các nhóm thuốc kháng sinh nghiên cứu 1.1.1. Nhóm thuốc kháng sinh sulfamid 1.1.1.1. Cấu tạo của các chất kháng sinh nhóm sulfamid Các sulfamid kháng khuẩn là dẫn chất của p-aminobenzensulfonamid, có công thức cấu tạo chung nhƣ hình 1.1. R2 HN SO2 NH R1 Hình 1.1: Công thức cấu tạo chung của nhóm sulfamid Trong đó thƣờng gặp R2 là H. Khi R2 là H thì sulfamid mới có hoạt tính kháng khuẩn. Khi R2 ≠H, thì chất đó là tiền thuốc. R1 có thể là mạch thẳng, dị vòng. Tuy nhiên, nếu R1 là dị vòng thì hiệu lực kháng khuẩn mạnh hơn, thông thƣờng là các dị vòng 2 - 3 dị tố. Khi R1 và R2 đều là gốc hidro thì thu đƣợc sulfamid có cấu tạo đơn giản nhất (sulfanilamid) [8, 11, 21, 81]. Bảng 1.1: Công thức cấu tạo của một số sulfamid phổ biến Tên Công thức R1 NH2 Sulfaguanidin C7H10N4O2S NH Sulfadiazin N C10H10N4O2S N CH3 Sulfamethoxazol C10H11N3O3S O N N N Sulfadoxin C12H14N4O4S H3OC 4 OCH3 1.1.1.2. Tính chất vật lí và hóa học của các sulfamid  Tính chất vật lý Sulfamid ở dạng tinh thể màu trắng hoặc màu vàng nhạt trừ prontosil, không mùi, thƣờng ít tan trong nƣớc, benzen, cloroform. Sulfamid tan trong dung dịch acid vô cơ loãng và hydroxyd kiềm (trừ sulfaguanidin) [8, 81].  Tính chất hóa học Hầu hết, các Sulfamid đều có tính chất lƣỡng tính. Tính acid của sulfamid thể hiện do có H ở N- amid linh động (trừ sulfaguanidin) và t nh bazơ do có nhóm amin thơm tự do. Do đó, sulfamid tan trong dung dịch acid [8]. Nhóm amin thơm trong các sulfamid có thể tham gia phản ứng diazo hoá nên thƣờng đƣợc dùng để định t nh và định lƣợng sulfamid. O2SNH2 + NaNO2 NH2 HCl H+ [N N] Cl O2SNH2 OH sulfanllamid O2SNH2 N N Nhân benzen trong phân tử sulfamid cho các phản ứng thế nên có thể áp dụng định t nh hay định lƣợng. SO2NH2 SO2NH2 + Br2 Br NH2 Br NH2 Mặt khác, nhóm NH2 có thể phản ứng với p-aminobenzaldehyd (PDAB) cho sản phẩm có màu. 5 NH2 H2NO2S CH3 + HOC N CH3 CH3 H2N N=CH N CH3 Các sulfamid tác dụng với một số muối kim loại (CuSO4, CoCl2) tạo thành phức kết tủa có màu đặc trƣng cho từng sulfamid, nên thƣờng đƣợc dùng để phân biệt các sulfamid với nhau [8, 81]. 1.1.1.3. Độc tính của Sulfamid Tác dụng phụ khi sử dụng sulfamid là khoảng 5% khác nhau đối với mỗi cá thể và đối với mỗi loại sulfamid. Một số tác dụng có thể gặp khi sử dụng sulfamid nhƣ làm rối loạn hệ thống tạo máu do hiện tƣợng mẫn cảm, hiện tƣợng tan huyết liên quan tới sự hoạt hóa glucose-6 phosphat dehydrogennase. Sulfamid cũng có thể kết tinh ở thận gây tổn thƣơng thận, viêm thận, sỏi thận đái ra máu; Phản ứng tăng nhạy cảm nhƣ nổi ban đỏ, xuất huyết [8, 21]. 1.1.2. Nhóm thuốc kháng sinh họ β- lactam 1.1.2.1. Cấu tạo hóa học của các kháng sinh nhóm β-lactam (nhóm penicilin và cephalossporin) Các kháng sinh nhóm β-lactam có cấu trúc azetidin-2-on (vòng β-lactam) là một amid vòng 4 cạnh (hình 1.2), gồm các nhóm penicilin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem. Trong 4 nhóm trên, 2 nhóm sử dụng phổ biến là penicilin và cephalosporin [72]. Hình 1.2: Công thức cấu tạo của Azetidin-2-on (beta-lactam) 6