Nghiên cứu đặc điểm và ứng dụng của hệ Enzym Pectinase
LÔØI GIÔÙI THIEÄU
PHAÀN I
ÑAËC ÑIEÅM CUÛA HEÄ
ENZYM PECTINASE
I.Cô chaát pectin :[ I ]
Pectin laø hôïp chaát cao phaân töû maïch thaúng coù caáu taïo töø söï keát hôïp cuûa caùc
acid galacturonic qua caùc lieân keát α–-1,4 glucoside. Tuøy thuoäc nguoàn pectin maø
pectin coù khoái löôïng phaân töû 800000-200000. Pectin hoaø tan trong nöôùc,
ammoniac, dung dòch kieàm, carbonate natri vaø trong glycerine noùng. Ñoä hoaø
tan cuûa pectin trong nöôùc taêng leân khi möùc ñoä ester hoaù trong phaân töû pectin
taêng vaø khi khoái löôïng phaân töû pectin giaûm.
Pectin laø teân chung ñöôïc goïi cho caùc hoãn hôïp chöùa caùc thaønh phaàn raát khaùc
nhau, trong ñoù pectinic acid laø thaønh phaàn chuû yeáu. Caùc pectin töï nhieân ñònh vò
trong thaønh phaàn cuûa teá baøo coù theå lieân keát vôùi caùc caáu truùc polyssacharide vaø
protein ñeå taïo thaønh caùc protopectim khoâng tan. Coù theå phaân huûy ñeå laøm pectin
tan trong nöôùc baèng caùch ñun noùng pectin trong moâi tröôøng acid. Vì theá, caùc
pectin tan thu nhaän ñöôïc laø keát quaû cuûa söï phaân huûy phaân töû pectin khoâng tan
vaø chuùng khoâng ñoàng daïng vôùi nhau.
Trong thöïc vaät, pectin toàn taïi döôùi ba daïng: pectin hoaø tan, pectin acid vaø
protopectin.
Pectin hoaø tan laø ester methylic cuûa acid polygalacturonic pectin, trong töï
nhieân coù khoaûng 2/3 soá nhoùm carboxyl cuûa polygalacturonic acid ñöôïc ester
hoaù baèng methanol. Pectin ñöôïc ester hoaù cao seõ taïo gel ñaëc trong dung dòch
acid vaø trong dung dòch ñöôøng coù noàng ñoä 65%. Enzyme pectinase taùc ñoäng leân
caùc hôïp chaát pectin coù khoái löôïng phaân töû khaùc nhau vaø caáu truùc hoùa hoïc khoâng
ñoàng daïng. Caáu truùc hoaù hoïc cô baûn cuûa pectin laø α–– D-galacturonan hay α––
D-galacturonoglycan, maïch thaúng coù caáu taïo töø caùc ñôn vò Dgalactopyranosyluronic acid (lieân keát theo kieåu α -1,4). Maët khaùc, möùc ñoä oxy
hoaù trong caùc phaân töû polymer naøy cuõng khaùc nhau, trong ñoù moät soá nhaát ñònh
caùc nhoùm carboxyl bò ester hoaù bôûi caùc nhoùm methoxyl. Trong moät soá tröôøng
hôïp, chaúng haïn trong pectin cuû caûi ñöôøng, coù söï ester hoaù giöõa caùc nhoùm
carboxyl vaø caùc nhoùm acetyl.
Pectinic acid laø polygalacturonic acid coù moät phaàn nhoû caùc nhoùm carboxyl
ñöôïc ester hoaù baèng methanol. Pectinase laø muoái cuûa pectinic acid. Pectic acid
laø polygalacturonic acid ñaõ hoaøn toaøn giaûi phoùng khoûi moät ñôn vò galacturonic
acid. Pectate laø muoái cuûa pectic acid.
Protopectin taïo ñoä cöùng cho quaû xanh, khoâng tan trong nöôùc vaø coù caáu taïo
hoaù hoïc phöùc taïp. Trong pectin coù caùc phaân töû pectin, caùc phaân töû cellulose vaø
caùc ion Ca2+ , Mg2+ , caùc goác phosphoric acid, acetic acid vaø ñöôøng. Protopectin
khi bò thuûy phaân baèng acid thì giaûi phoùng pectin hoaø tan.
II. Pectinase:[I]
Enzyme pectinase laø enzyme xuùc taùc söï phaân huûy cuûa caùc polymer pectin.
Söï phaân huûy pectin trong töï nhieân thöôøng xaûy ra khi traùi caây chín. Nhöõng
enzyme naøy vì vaäy coù moät vai troø heát söùc quan troïng trong quaù trình baûo quaûn
traùi caây vaø rau quaû. Vieäc kieåm soaùt caùc enzyme naøy trong caø chua chuyeån gen
laø moät ví duï ñieån hình trong vieäc öùng duïng RNA ñoái maõ ñeå thao taùc söï bieåu
hieän gen. Enzyme pectinase cuõng ñöôïc öùng duïng nhieàu trong quaù trình cheá
bieán thöïc phaåm, ñaëc bieät laø khaû naêng laøm trong nöôùc quaû. Vieäc kieåm soaùt hoaït
ñoäng cuûa enzyme pectinase cuõng coù theå kieåm soaùt ñöôïc ñoä nhôùt cuûa saûn phaåm.
Enzyme pectinase coù theå ñöôïc phaân loaïi theo cô cheá taùc duïng cuûa chuùng.
• Pectinesterase (PE): xuùc taùc söï thuûy phaân cuûa caùc nhoùm methyl ester.
Enzyme thöôøng taán coâng vaøo caùc nhoùm ester methyl cuûa ñôn vò
galaturonate naèm keà ñôn vò khoâng bò ester hoaù, phaân caét caùc nhoùm methoxy
(COOCH3) ñöùng caïnh caùc nhoùm –COOH töï do, taïo thaønh acid pectinic hoaëc
acid pectic vaø methanol. Pectinesterase thu ñöôïc töø caùc nguoàn khaùc nhau coù
giaù trò pH toái öu khaùc nhau. Neáu thu töø nguoàn VSV thì PH toái öu töø 4,5-5,5,
coøn neáu töø nguoàn thöïc vaät thì coù pH toái öu töø 5,0-8,5. Pectinesterase töø naám
moác coù nhieät ñoä toái öu laø 30-40oC vaø bò voâ hoaït ôû 55-62oC. Pectinesterase
thöôøng ñöôïc hoaït hoaù bôûi caùc ion Ca2+ vaø Møg2+.
• Polygalacturonase coøn coù teân goïi laø poly -1,4-galacturoniglucanohydrolase,
xuùc taùc söï phaân caét caùc moái lieân keát α–1,4-glycosid. Caùc exo-PG (exo-poly
1,4-α-D-galacturonide) galacturonohydrolase, phaân caét töø caùc ñaàu khoâng
khöû, vaø endo-PG (endo-poly1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, taán
coâng ngaãu nhieân vaøo giöõa maïch cô chaát. Polygalacturonase ít gaëp trong
thöïc vaät nhöng coù chuû yeáu ôû moät soá naám moác vaø vi khuaån.
Polygalacturonase laø moät phöùc heä enzyme goàm coù nhieàu caáu töû vaø thöôøng
coù tính ñaëc hieäu cao ñoái vôùi cô chaát. Treân cô sôû tính ñaëc hieäu vaø cô cheá taùc
duïng vôùi cô chaát, enzym polygalacturonase ñöôïc chia laøm boán loaïi:
Polymethylgalacturonase hay coøn goïi laø α-1,4-galacturonitemethylesglucanohydrolase, taùc duïng treân polygalactorunic acid ñaõ ñöôïc
methoxyl hoaù (töùc laø pectin). Enzyme naøy laïi ñöôïc phaân thaønh hai nhoùm
nhoû phuï thuoäc vaøo khaû naêng phaân caét ôû trong hay cuoái maïch trong phaân
töû pectin, ñoù laø endo-glucosidaùe-polymethyl galacturonase kieåu I vaø
exo-glucosidase-polymethylgalaturonase kieåu III.
Polygalacturonase, enzyme taùc duïng treân pectic acid hoaëc pectinic,
cuõng ñöôïc chia thaønh hai nhoùm nhoû laø endo-glucosidasepolygalacturonase kieåu II vaø exo-glucosidase-polygalacturonase kieåu
IV. Enzyme endo-glucosidase-Polymethyl-galacturonase kieåu I laø
enzyme polymethylgalacturonase dòch hoaù pectin coù möùc ñoä methyl hoaù
caøng cao thì bò thuûy phaân bôûi enzyme naøy caøng nhanh vaø caøng coù hieäu
quaû. Trong dung dòch, khi coù maët cuûa enzyme pectinesterase thì hoaït ñoä
cuûa enzyme naøy thöôøng bò giaûm. Enzyme naøy raát phoå bieán trong caùc
VSV, ñaëc bieät laø naám moác A. niger, A, awamori.
•
•
•
•
Pectate lyase (PEL): xuùc taùc söï phaân caét caùc ñôn vò galacturonate khoâng bò
ester hoaù. Caû hai enzyme exo-PEL (exo-Poly(1,4-α-D-galacturonide)
lyase) vaø endo-PEL (endo-poly(1,4-α-D-galacturonic) lyase) ñeàu toàn taïi.
Pectate vaø pectin coù löôïng methoxyl thaáp laø caùc cô chaát thích hôïp hôn caû
cho caùc enzyme naøy. Noùi chung, caû hai enzyme naøy ñeàu coù khoaûng pH toái
ña naèm trong khoaûng töø 8,0-11, ñeàu caàn ion Ca2+ ñeå hoaït ñoäng. Pectate
lyase khoâng ñöôïc tìm thaáy trong caây xanh, nhöng coù ôû vi khuaån vaø naám.
Caùc enzyme VSV ngoaïi baøo naøy ñoùng moät vai troø raát quan troïng trong quaù
trình gaây beänh ôû thöïc vaät, gaây ra söï phaân huûy moâ cuûa thaønh teá baøo, laøm
meàm vaø laøm muïc moâ thöïc vaät.
Ngoaøi ra coøn coù:
Pectin-transeliminase hay coøn ñöôïc goïi laø poly α–-1,4-galaturonite –
methylesteglucanoliase, laø enyme taùc duïng treân pectin vaø pectinic acid.
Polygalactorunate-transeliminase coøn ñöôïc goïi laø poly α -1,4D-galaturonite
–glucanoliase, laø enzyme taùc duïng treân pectic acid vaø pectinic acid.
Pectin lyase (PNL): xuùc taùc söï phaân caét caùc ñôn vò galacturonate ñaõ bò ester
hoaù. Taát caû caùc PNL ñeàu laø endo-enzyme
III. Ñaëc ñieåm cuûa caùc pectinase töø caùc nguoàn khaùc
nhau:[ I ]
1. Pectinesterase:
Beân caïnh pectineaterase (PE) VSV, haàu heát caùc loaïi caây cho traùi ñeàu chöùa
enyme PE. Enzyme naøy thöôøng toàn taïi döôùi nhieàu hình thöùc khaùc nhau, naèm
trong phaàn voû teá baøo. PE ôû thöïc vaät noùi chung coù hoaït ñoä toái öu trong khoaûng
pH hôi kieàm. Caùc cation kim loaïi ôû noàng ñoä thaáp, nhö Ca2+ chaúng haïn, coù
khuynh höôùng laøm taêng noàng ñoä hoaït ñoäng cuûa enzyme.
a.Ñaëc ñieåm cuûa pectineaterase thöïc vaät: Caø chua chöùa ít nhaát hai loaïi PE.
Caû PE1 vaø PE2 ñeàu taêng trong giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình chín. Khi böôùc vaøo
giai ñoaïn chín, noàng ñoä enzyme PE1 giaûm xuoáng, nhöng PE2 tích luyõ daàn cho
ñeán khi traùi caây coù maøu ñaëc tröng cuûa traùi chín. PE2 coù khoái löôïng phaân töû
23kD, pH toái öu 7,6. Enzyme naøy bò baát hoaït 50% sau 5 phuùt ñun ôû 67oC. Caùc
ion Ca2+ vaø Na+ laøm taêng hoaït ñoä cuûa enzyme leân toái ña ôû caùc noàng ñoä 0,005M
vaø 0,05M, theo thöù töï.
PE cuûa ñaäu naønh laø protein coù khoái löôïng phaân töû 33kD, hoaït ñoäng toái öu
taïi pH gaàn 8. Polygalacturonic acid, saûn phaåm hình thaønh do quaù trình ñeå
methyl hoaù, laø moät chaát öùc cheá caïnh tranh.
Trong thòt quaû chuoái coù hai isoenzyme PE. Caû hai coù cuøng khoái löôïng phaân
töû laø 30kD, nhöng coù ñieåm ñaúng ñieän khaùc nhau: 8,8 vaø 9,3. Caùc enzyme naøy
hoaït ñoäng ôû pH toái ña laø 7,5. Hoaït ñoä enzyme taêng leân khi theâm vaøo dung dòch
NaCl ôû noàng ñoä 0,2M, vaø ñöa pH cuûa dung dòch veà 6,0. Caùc enzyme naøy bò öùc
cheá bôûi nhieàu loaïi polyol coù khoái löôïng phaân töû thaáp, nhö glycerol, sucrose,
glucose, maltose vaø galactose.
PE trong quaû cam coù hai loaïi: ñoù laø hai isoenzyme PE1 vaø PE2 coù khoái
löôïng phaân töû 36,kD, nhöng coù ñieåm ñaúng ñieän khaùc nhau laø 10,05 vaø $11,0,
theo thöù töï. pH toái öu cuûa PE1 laø 7,6, coøn cuûa PE2 laø 8,0.
Thòt quaû cuõng chöùa hai isoenzymem, moät trong hai enzyme naøy coù tính
beàn nhieät hôn, coøn enzyme kia thì ít maãn caûm hôn khi bò taùc ñoäng cuûa protease.
Ñoä oån ñònh cuûa enzyme coù theå lieân quan ñeán möùc ñoä glycosyl hoaù cuûa caùc phaân
töû enzyme. Enzyme beàn nhieät hôn vaø enzyme coøn laïi coù khoái löôïng laø 51kD vaø
36kD, theo thöù töï.
Caû taùo vaø kiwi cuõng chöùa hai loaïi isoenzyme. Caùc isoenzyme cuûa kiwi
coù cuøng khoái löôïng phaân töû laø 57kD vaø cuøng ñieåm ñaúng ñieän laø 7,3. Tuy nhieân,
chuùng khaùc nhau veà möùc ñoä beàn nhieät.
b.Ñaëc ñieåm cuûa pectineaterase vi sinh vaät:Moät ñieåm ñaùng löu yù laø taát caû
enzyme VSV ñeàu khoâng phaûi laø protein kieàm. PE cuûa Trichoderma reerei coù
ñieåm ñaúng ñieän naèm trong khoaûng 8,3-9,5 vaø pH toái öu laø 7,6. Tuy nhieân, PE
cuûa Aspergillus coù ñieåm ñaúng ñieän vaø pH toái öu trong khoaûng acid. Hoaït ñoäng
cuûa enzyme PE sinh ra bôûi A. niger ñaït toái ña ôû pH 4,5 ôû 40oC. Caùc PE acid vaø
kieàm coù theå ñeà methyl hoaù cô chaát pectin theo cuøng moät kieåu. PE kieàm laøm
hình thaønh caùc pectin ñöôïc ñeà ester hoaù vaø pectin naøy coù theå taïo gel yeáu vôùi
ion calcium; PE acid taïo ra pectin bò ñeà ester hoaù coù khaû naêng taïo gel maïnh vôùi
ion calcium.
c.Trình töï amino acid: Caáu truùc baäc moät cuûa PE caø chua chöùa 305
amino acid vôùi khoái löôïng phaân töû 33 239. Enzyme naøy coù chöùa hai caàu noái
disulfide (Cys98-Cys125 vaø Cys166-Cys200). Cys 166 coù maët trong taát caû caùc
enzyme pectinesterase. Trình töï amino acid suy luaän treân cô sôû caùc nucleotide
cDNA cho thaáy söï khoâng nhaát quaùn, 18 trong 27 vò trí khaùc nhau, coù theå laøm
thay ñoåi ñieän tích cuûa protein. Maët khaùc, chæ coù khoaûng 94% trình töï amino acid
trong moät phaàn chuoãi amino acid coù tính ñoàng daïng vôùi toaøn boä trình töï cuûa
cDNA. Söï khoâng nhaát quaùn naøy coù theå phaûn aùnh söï toàn taïi cuûa caùc isoenzyme,
maëc duø chæ coù hai isoenzyme trong caø chua ñöôïc bieát ñeán. Moät soá gen maõ hoaù
cho caùc enzyme PE ñaõ ñöôïc taùch doøng vaø nghieân cöùu ñaëc ñieåm. Gen taùch doøng
töø Pseudomonas maõ hoaù cho PE coù chöùa 396 amino acid vôùi khoái löôïng phaân töû
laø 41 004.
d.Cô cheá ñeå methyl hoaù: PE loaïi boû caùc nhoùm methoxyl trong phaân töû
pectin baèng töông taùc aùi nhaân cuûa enzyme leân ester, laøm hình thaønh hôïp chaát
trung gian acyl-enzyme vaø phoùng thích methanol. Tieáp theo sau laø phaûn öùng
deayl hoaù, laø phaûn öùng thuûy phaân cuûa hôïp chaát trung gian acyl-enzyme, ñeå giaûi
phoùng enzyme vaø carboxylic acid(H.6.7).
E-N
Caùc PE coù nguoàn goác thöïc vaät phaûn öùng theo kieåu laøm hình thaønh caùc
khoái pectin chöùa caùc nhoùm carboxylate doïc theo maïch pectin. Enzyme cuûa
Trichoderma reesei laø moät protein cô baûn cho kieåu phaûn öùng töông töï. Enzyme
cuûa caùc loaøi Asperillus vôùi pH toái ña trong vuøng acid, xuùc taùc phaûn öùng töø beân
trong.
Aûnh höôûng cuûa caùc ion kim loaïi khi kích hoaït enzyme pectinesterase coù
theå coù lieân quan ñeán töông taùc cuûa noù vôùi cô chaát. Polygalacturonic acid laø moät
chaát öùc cheá caïnh tranh trong phaûn öùng thuûy phaân nhôø söï xuùc taùc cuûa PE. Pectin
chöùa caùc nhoùm cacboxylate ñöôïc saép xeáp nhö hình khoái coù theå taùc duïng theo
caùch töông töï. Söï lieân keát cuûa caùc ion kim loaïi vaøo caùc nhoùm carboxylate trong
tröôøng hôïp naøy coù khuynh höôùng trung hoaø aûnh höôûng öùc cheá cuûa cô chaát pectin
leân enzyme. Tuy nhieân. Löôïng dö caùc ion naøy treân thöïc teá gaây ra söï baát hoaït
cuûa PE vì caùc ion kim loaïi bò vaây quanh bôûi caùc nhoùm carboxylate naèm keá caän
vôùi caùc lieân keát ester caàn thieát cho phaûn öùng thuûy phaân xaûy ra.
2. Polygalacturonase
Haàu heát caùc nghieân cöùu veà PG ñeàu treân cô sôû caùc nguoàn VSV. PG
thöôøng ñöôïc tìm thaáy trong caùc phaàn tieát ngoaïi baøo cuûa caùc loaøi naám vaø vi
khuaån gaây beänh, chaúng haïn nhö Sacchromyces gragilis, Aspergillus niger,
Lactobacillus plantarum, Cochiliobolus carbonum, Neurospora crassa, caùc loaøi
Ascomycete, Phizopus arrchizus, vaø Fusarium osyporum. Tuy nhieân, trong thöïc
teá, PG cuûa thöïc vaät baäc cao ñöôïc nghieân cöùu raát nhieàu ôû caø chua chín.
a.Caùc enzyme trong caø chua chín: Caùc enzyme PG trong caø chua chín
toàn taïi döôùi hai daïng, vaø caû hai ñeàu laø endo-enzyme. PG1 coù khoái löôïng phaân
töû 84kD vaø coù khoaûng 50% bò baát hoaït ôû nhieät ñoä 78oC. PG2 coù khoái löôïng
phaân töû 44kD vaø coù khoaûng 50% bò baát hoaït ôû 57oC. PG1 coù ñoä oån ñònh toái ña ôû
pH 4,3, traùi laïi PG2 oån ñònh toái ña ôû pH 5,6. Söï phaân tích söû duïng SDS-PAGE
cho raèng PG1 laø moät dimer cuûa PG2, tuy nhieân caùc nghieân cöùu khaùc laïi cho
raèng PG1 hình thaønh laø do söï keát hôïp cuûa PG2 vôùi moät $–subunit. Caùc chuoãi
polypeptide cuûa PG ñeàu bò glycosyl hoaù. PG2 chöùa 4,6 ñöôøng trung tính (Dmannose, L-gucose, D-xylose) lieân keát vôùi nhau thoâng qua caàu noái Nacetylglucosaminylasparaginyl. Coù söï khaùc nhau chuùt ít veà khoái löôïng phaân töû,
chaúng haïn caùc isoenzyme cuûa PG2, PG2A va PG2B coù khoái löôïng phaân töû
töông öùng laø 43 vaø 46kD. Söï khaùc nhau naøy coù theå laø do quaù trình söûa sai hoaëc
quaù trình glycosyl hoaù sau dòch maõ. Trong thöïc teá, caùc nghieân cöùu sau ñoù cuõng
ñaõ chöùng minh ñöôïc raèng PG2A vaø PG2B laø caùc daïng glycosyl hoaù khaùc nhau
cuûa cuøng caùc polypeptide.
b. Trình töï amino acid: Caùc trình töï amino acid ñöôïc suy luaän treân cô
sôû caùc nucleotic cuûa cDNA phaân laäp khoâng nhöõng töø traùi caø chua maø coøn töø
phaán cuûa caùc loaøi Pseudomonas solanacearum, Oenothera organesis, phaán hoa
baép, vaø töø traùi bô. Gen cuûa PG2 phaân laäp töø traùi caø chua maõ hoaù cho protein
hoaøn chænh coù 373 amino acid, vôùi khoái löôïng phaân töû laø 40 279. Enzyme naøy
ñöôïc toång hôïp töø moät tieàn chaát, sau ñoù ñi qua quaù trình söûa chöûa sau dòch maõ,
goàm caû caùc quaù trình loaïi boû caùc peptide tín hieäu, bò glycosyl hoaù taïi boán ñieåm
coù khaû naêng glycosyl, vaø söûa chöõa ôû ñaàu C cuoái. Caùc gen PG ñôn maõ hoaù cho
caùc loaïi isoenzyme khaùc nhau, daãn ñeán keát luaän raèng PG1 vaø PG2 ñeàu xuaát
phaùt töø cuøng moät chuoãi polypeptide, vaø raèng PG1 ñöôïc taïo thaønh nhôø söï keát hôïp
cuûa PG2 vôùi β-subunit.
β-subunit. Söï chuyeån ñoåi PG2 vaø PG1 trong quaù trình chín cuûa caø chua
laø moät vaán ñeà gaây ñöôïc nhieàu chuù yù. β-subunit, moät yeáu toá beàn nhieät, ñaàu tieân
ñöôïc phaân laäp töø caø chua xanh, coù khaû naêng chuyeån ñoåi PG2 thaønh PG1 trong
oáng nghieäm. Yeáu toá naøy sau ñoù ñöôïc xaùc minh laø moät glycoprotein raát ñaëc
tröng vôùi polypeptide PG veà maët mieãn dòch. Phaân töû PG1 ñöôïc taïo thaønh töø moät
phaân töû PG2 vaø moät phaân töû β-subunit; tuy nhieân, chæ coù polypeptide PG coù
hoaït tính enzyme.
cDNA maõ hoaù cho –subunit coù trong caø chua laø moät tieàn chaát coù kích
thöôùc phaân töû lôùn (69kD, 630 amino acid). Trong phaân töû naøy, theâm vaøo phaân
töû protein hoaøn chænh laø moät trình töï tín hieäu kò nöôùc (30 amino acid), moät
polypeptide chöùa ñaàu cuoái N-(78 amino acid), vaø moät tieàn peptide chöùa ñaàu
cuoái C-(233 amino acid). Protein hoaøn chænh chöùa glycosyl hoaù laø chöùa 289
amino acid naëng 31,5 kD, ñieåm ñaúng ñieän 4,9. Protein naøy chöùa löôïng lôùn
amino acid gly, tyr, phe, vaø moät motif laëp coù caáu truùc lieân öùng
FTNYGxxGNGGxxx, trong ñoù “x” phaàn lôùn laø caùc amino acid phaân cöïc. Chöùc
naêng cuûa motif naøy trong protein vaãn chöa ñöôïc bieát roõ.
c.Vai troø cuûa PG trong quaù trình laøm chín traùi caây. Hoaït ñoä cuûa
enzyme trong giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình laøm chín chuû yeáu laø nhôø PG1. PG1
tieáp tuïc taêng trong quaù trình chín, vaø coù maët trong taát caû caùc giai ñoaïn cuûa quaù
trình chín. PG2 coù khoái löôïng phaân töû thaáp hôn vaø ít beàn nhieät, PG2 xuaát hieän
trong giai ñoaïn cuoái cuûa quaù trình, vaø chieám löôïng lôùn trong giai ñoaïn chín. Söï
xuaát hieän keá tieáp nhau cuûa hai enzyme naøy laø keát quaû cuûa hoaït ñoäng ñieàu hoaø
cuûa –subunit, yeáu toá naøy ñöôïc tìm thaáy vôùi löôïng ít trong caø chua xanh, sau ñoù
taêng leân trong giai ñoaïn chín.
PG2 ñöôïc coi nhö moät endo-enzyme trong caø chua chín, PG1 ñöôïc hình
thaønh trong suoát quaù trình chín khi β–subunit ñöôïc sinh ra ñeå phaûn öùng vôùi
PG2. Baèng caùch ñieàu chænh nhöõng thay ñoåi trong caùc phaân töû PG trong caùc dòch
chieát khaùc nhau coù caùc noàng ñoä khaùc nhau cuûa NaCl vaø pH ñeäm khaùc nhau.
Treân thöïc teá gen maõ hoaù cho polypeptide PG trong moät soá nghieân cöùu tröôùc ñaây
ñaõ chöùng minh ñieàu naøy. Gaàn ñaây, caùc nghieân cöùu veà caùc kieåu bieåu hieän gen
cuûa β–subunit vaø caùc phaân töû PG cho thaáy mRNA cuûa β–subunit xuaát hieän sôùm
trong quaù trình phaùt trieån cuûa traùi caây(10 ngaøy sau khi thuï phaán) vaø taêng ñeán
möùc toái ña trong 30 ngaøy, cuõng laø luùc traùi caây chín. Sau ñoù, löôïng mRNA cuûa βsubunit giaûm nhanh choùng, trong khi löôïng mRNA cuûa PG taêng moät caùch ñaùng
keå.
Vì taát caû caùc keát quaû nghieân cöùu ñaït ñöôïc ôû treân, ta coù theå cho raèng
endo-enzyme PG2 ñöôïc hình thaønh trong caùc giai ñoaïn sôùm cuûa quaù trình chín
phaûi ñöôïc chuyeån veà PG1 do söï coù maët cuûa β–subunit. Söï tích luõy cuûa PG2
trong caùc giai ñoaïn sau cuûa quaù trình chín laø do β–subunit bò caïn kieät. Vai troø
cuûa quaù trình chuyeån ñoåi naøy laø nhaèm ñieàu hoaø hoaït ñoäng cuûa PG trong caùc giai
ñoaïn cuûa quaù trình chín. β–subunit phaûn öùng vaø neo phaân töû PG2 vaøo thaønh teá
baøo, taïo ra phaân töû PG1 döôùi daïng hoaït ñoäng ñeå phaân huûy pectin. Moät soá
nghieân cöùu khaùc cuõng chöùng minh ñöôïc raèng PG1, chöù khoâng phaûi PG2 coù chöùc
naêng trong vieäc laøm phaân huyû vaø oån ñònh polyuronide, coù nghóa laø söï phaân huûy
cuûa polyuronide döôùi taùc ñoäng cuûa enzyme PG laø nguyeân nhaân daãn ñeán quaù
trình meàm cuûa caø chua.Tuy nhieân, khi nghieân cöùu veà söï xen ñoaïn vaø bieåu hieän
cuûa gen PG trong caø chua chuyeån gen thì keát quaû cho thaáy polyuronide bò phaân
huûy nhöng khoâng laøm cho traùi caø chua meàm ñi.
d.Cô cheá vaø kieåu taùc duïng: Exo-PG thuûy phaân caùc ñaàu khoâng khöû cuûa
chuoãi polygalacturonic, taïo ra galacturonic acid laø saûn phaåm thuûy phaân chieám
öu theá(H.6.8). Söï thuûy phaân polymer naøy bò giaùn ñoaïn cuûa söï toàn taïi cuûa caùc
maïch nhaùnh trong cô chaát. Möùc ñoä thuyû phaân taêng tæ leä vôùi kích thöôùc cô chaát,
ñaït toái ña vôùi möùc polymer hoaù 20 ñoái vôùi caùc exo-PG ôû caø roát vaø ñaøo. Hoaït
ñoäng cuûa caùc exo-enzyme laøm taêng nhanh söï taïo thaønh caùc nhoùm khöû vaø laøm
taêng chaäm ñoä nhôùt cuûa dung dòch cô chaát. Söï phaân huûy polyuronide trong quaù
trình chín khoâng gaây ra söï tích luõy galacturonic acid, vaø chæ coù endo-enzyme
PG laø coù lieân quan.
Caùc endo-PG phaân huûy pectic acid töø beân trong maïch, laøm giaûm nhanh
ñoä nhôùt cuûa dung dòch cô chaát. Tính ñaëc hieäu vaø kieåu taùc duïng cuûa endoenzyme ñöôïc xaùc ñònh bôûi traïng thaùi cuûa ñieåm hoaït ñoäng. Möùc ñoä thuûy phaân
cuûa endo-PG ôû naám men giaûm cuøng vôùi söï giaûm ñoä daøi maïch cô chaát. Vò trí lieân
keát cuûa endo-PG ôû Aspergillus niger ñöôïc caáu thaønh töø 4 ñieåm vaø söï phaân caét
xaûy ra giöõa caùc ñieåm 1 vaø 2(H.6.9). Moät cô chaát tetramer chòu söï phaân caét(3+1)
thaønh trigalacturonic acid galacturonic. Moät cô chaát pentamer cho ra hai saûn
phaåm phöùc taïp hôn, caû hai ñeàu ñaùp öùng söï chieám giöõ hoaøn toaøn cuûa 4 ñieåm lieân
keát, taïo söï phaân caét (4+1) vaø (3+2). Cuõng töông töï, ñoái vôùi cô chaát laø
hexagalacturonic acid, saûn phaåm seõ taïo thaønh loái phaân caét (5+1), (4+2) vaø
(3+3). Trigalacturonic acid baùm vaøo ñieåm hoaït ñoäng ñeå taïo thaønh caùc phöùc hôïp
höõu ích hoaëc khoâng höõu ích. Lieân keát höõu ích trong tröôøng hôïp naøy laøm sinh ra
söï phaân caét (2+1). Lieân keát khoâng höõu ích ñöôïc taïo thaønh khi ba ñôn vò ñôn leõ
baùm vaøo ba ñieåm 2, 3 vaø 4 laø khoâng heà töông taùc vôùi caùc nhoùm xuùc taùc ñònh vò
beân trong ñieåm 1 vaø 2. Cô chaát trong tröôøng hôïp naøy ñoùng vai troø laø moät chaát öùc
cheá caïnh tranh (K = 0,67mM).
3.Pectate lyase:
Pectate lyase (PEL) laø caùc enzyme VSV ngoaïi baøo. Caùc enzyme cuûa
gioáng Erwina vaø Bacillus ñöôïc bieát ñeán laø taùc nhaân gaây ra trieäu chöùng soft-rod
ôû thöïc vaät. Tuy nhieân, chuùng cuõng ñöôïc tìm thaáy phoå bieán ôû Aeromonas,
Pseudomonas, Xanthomonas, Aspergillus vaø Fusarium.
Erwinia chrysanthemi sinh ra caùc enzyme pectate lyase ôû daïng
isoenzyme coù theå ñöôïc phaân thaønh caùc nhoùm treân cô sôû ñieåm ñaúng ñieän cuûa
chuùng: acid (pH 4-5), trung hoaø (pH 7-8,5) vaø kieàm (pH 9-10). Soá löôïng caùc
isoenzyme trong moãi nhoùm coù theå thay ñoåi tuøy theo loaøi. Ña soá caùc loaøi ñöôïc
nghieân cöùu cho naêm hay ít nhaát boán isoenzyme: moät acid (PELA), hai trung
hoaø (PELA vaø C), hai kieàm (PELD vaø E). Taát caû caùc isoenzyme naøy ñeàu caàn
Ca++ ñeå laøm taêng ñoä hoaït ñoäng vaø coù pH toái öu 8-10. Caùc nghieân cöùu treân
chuûng EC16 cho thaáy raèng taát caû 4 isoenzyme treân ñeàu laø endo-enzyme
(PELA(pI 4,2), PELA (pI 8,8), PELC (pI 9,0), vaø PELD (pI 10,0)). Caùc PEL
kieàm raát ñaëc hieäu trong vieäc gaây ra söï giaàm nöôùc cuûa caùc moâ thöïc vaät, tieáp theo
laø caùc isoenzyme trung hoaø, traùi laïi caùc PEL acid khoâng gaây aûnh höôûng gì.
ÔÛ caùc chuûng Erwinia carotovara, coù ít nhaát ba PEL ñöôïc tieát ra, taát caû
ñeàu coù ñieåm ñaúng ñieän ôû pH kieàm: PELI (pI 9,7), PELII (pI 10,2), vaø PELIII (pI
10,35). Caû ba isoenzyme naøy ñeàu coù pH toái öu laø 9,0. Nhieät ñoä toái öu cho hoaït
ñoäng cuûa PELII vaø PELIII laø 50 vaø 60oC, theo thöù töï. PELI coù ñoä beàn nhieät
thaáp. ÔÛ chuûng GIR726, coù boán loaïi endo-PEL isoenzyme vôùi caùc ñieåm ñaúng
ñieän ôû caùc pH raát kieàm (10,0, 10,6, 10,3 vaø 10,9) vaø khoái löôïng phaân töû naèm
trong khoaûng töø 28-33 kD. pH toái öu cho hoaït ñoäng laø 9,3 cho PELII 9,5 cho
PELIV vaø 9,7 cho PEL I vaø III. Cuõng nhö vôùi caùc PEL töø caùc nguoàn khaùc,
nhöõng isoenzyme naøy ñöôïc kích hoaït bôûi Ca++. Hoaït ñoä enzyme taêng 50-70%
khi coù maët cuûa Ca++ oàng ñoä 0,5mM. Isoenzyme vôùi pI>10 chöùa 2,5-4.8% ñöôøng
trung tính. Caùc PEL töø moät soá loaøi Bacillus cuõng coù khaû naêng gaây ra söï giaûm
nöôùc ôû moâ thöïc vaät.
IV. Caùc ñaëc tính kyõ thuaät quan troïng cuûa enzyme
pectinase:[ I ]
1. Pectinesterase:
Caùc PE ôû thöïc vaät taán coâng vaøo hoaëc ñaàu khoâng khöû hoaëc gaàn vôùi nhoùm
carboxyl töï do vaø tieán doïc theo phaân töû baèng cô cheá chuoãi ñôn, taïo ra caùc khoái
galacturonic acid khoâng bò ester hoaù raát maãn caûm vôùi calcium. Caùc caáu truùc
khaùc nhau cuûa chuoãi galacturonan, chaúng haïn nhö caùc monomer acetyl hoaù, caùc
nhoùm ester bò chuyeån ñoåi thaønh amide hay bò khöû ñeán röôïu baäc moät, hay söï toàn
taïi cuûa caùc vuøng coù nhieàu maïch nhaùnh, öùc cheá hoaït ñoäng cuûa PE. PE coù tính ñaëc
hieäu cao ñoái vôùi nhoùm methylester cuûa polygalacturonic acid. Caùc ester khaùc
chæ bò taán coâng raát chaäm, coøn caùc nhoùm methylester cuûa polymanuronic acid thì
khoâng heà bò taán coâng. Toác ñoä ñeà ester hoaù treân maïch pectin phuï thuoäc vaøo ñoä
daøi cuûa maïch; trimethyl trigalacturonate khoâng bò taán coâng. Caùc PE cuûa naám
khaùc vôùi PE cuûa thöïc vaät theo cô cheá ña maïch, caùc nhoùm mehtoxyl bò laáy ñi
moät caùch ngaãu nhieân.
2. Polygalacturonase:
Vieäc xaùc ñònh hoaït tính cuûa enzyme naøy baèng caùch ño ñoä nhôùt cuûa dung
dòch pectic acid goàm methylester vaø glycolester cho thaáy söï giaûm nhanh toác ñoä
vaø möùc ñoä thuyû phaân, ñoàng thôùi taêng möùc ñoä ester hoaù. Caùc nhoùm acetyl coù maët
laøm giaûm möùc ñoä thuûy phaân baèng caùch giaûm aùi löïc cuûa caùc phaân töû cô chaát qua
caùc khoái chöùa caùc ñieåm lieân keát. Söï thuûy phaân bò haïn cheá do söï coù maët cuûa caùc
nhoùm acetyl coù theå ñöôïc xaùc minh baèng caùch söû duïng pectin cuû caûi ñöôøng laøm
cô chaát. PG taïo bôûi naám coù theå thuûy phaân ñeán 70% pectin bò acetyl hoaù. Tuy
nhieân, kieåu taùc duïng leân cô chaát cuûa caùc PG coù töø caùc nguoàn khaùc nhau thì khaùc
nhau.
Cô chaát toát nhaát cho söï phaân huûy cuûa endo-pectin-lyase ôû pH>7 laø
pectin hoaøn toaøn bò ester hoùa. Tuy nhieân,ôû caùc giaù trò pH nhoû hôn, enzyme naøy
vaãn hoaït ñoäng ñoái vôùi pectin bò ester hoùa ít hôn, ñoàng thôøi caàn Ca++ ñeå kích
hoaït. Ñieàu naøy coù yù nghóa thöïc söï ñoái vôùi caùc quaù trình cheá bieán traùi caây.
Nhöõng enzyme naøy caàn caùc nhoùm methylester ñeå hoaït ñoäng, traùi laïi chuùng bò
baát hoaït khi coù maët caùc nhoùm glycolester vaø caùc pectate bò amidate hoùa.
3.Endo-pectate lyates:
Traùi laïi, endo-pectate lyates khoâng phaân bieät methylester vaø glycolester
cuûa pectic acid. Ñieàu thuù vò laø pectate khoâng phaûi laø cô chaát toát nhaát cho vi
khuaån PAL töø vi khuaån. Chuùng coù hoaït ñoä cöïc ñaïi (toác ñoä ban ñaàu vaø möùc ñoä
phaân huûy) neân pectin coù haøm löôïng methoxyl thaáp.
4.Rhamno-galacturonase:
Gaàn ñaây, rhamno-galacturonase laø enzyme ñöôïc phaùt hieän coù khaû naêng
phaân caét lieân keát glucoside trong caùc vuøng phaân nhaùnh nhieàu cuûa phaân töû
galacturonic rhamnose acid coù trong pectin cuûa quaû taùo vôùi hoaït tính raát cao khi
nhöõng phaân töû naøy bò ñeà ester hoaù vaø arabinose bò laáy ñi do bò thuûy phaân bôûi
acid (vuøng phaân nhaùnh nhieàu bò söûa chöõa). Enzyme naøy coù maët trong caùc cheá
phaåm thöông maïi cuûa pectinase vaø chaéc chaén phaûi ñöôïc phaân loaïi laø pectinase.
Saûn phaåm cuoái laø caùc oligomer coù caùc ñôn vò rhamnose vaø galacturonic acid,
trong ñoù rhamnose laøm hình thaønh ñaàu khoâng khöû.
5. Pectinase thöông maïi:
Enzyme thöông maïi laø caùc cheá phaåm enzyme cuûa naám moác, ñöôïc ñieàu
cheá chuû yeáu töø caùc loaïi Aspergillus. Chuùng thöôøng laø hoãn hôïp cuûa caùc PE, PG
vaø Pl, hemicellulase vaø endo-β -glucanase (C-x-cellulase). Hoaït tính cuûa ba
cheá phaåm thöông maïi khaùc nhau ñöôïc trình baøy ôû baûng 6.13. Caùc enzyme ñeàu
ñöôïc thu nhaän töø naám moác ñöôïc söû duïng ñeå saûn xuaát cheá phaåm pectinase, tröø
enzyme C-1-dellulase (cellobiohydrolase) laø ñöôïc theâm vaøo ñeå cheá phaåm ñaït
ñöôïc muïc ñích kyõ thuaät. Enzyme arabinanase ñoùng vai troø raát quan troïng trong
quaù trình cheá bieán nöôùc eùp traùi caây.
Baûng 1:Hoaït tính rieâng cuûa caùc phöùc hôïp ña enzyme trong caùc cheá phaåm
pectinase ñöôïc saûn xuaát töø naám
Hoaït tính enzyme
PG
PL
PE
Combined pectolytic
C-α-cellulase
C-l-cellulase
Arabanase: lineararabinan
Arabanase: branched arabinan
α-L-Arabinofuranosidase
Galactomannanase
Mannanase
Galactanase
Xylanase
Cô chaát
A
B
C
1982 3314 1878
Polygalacturonic acid
43
53
74
Pectin DE 90
548 448 227
Pectin DE 65
498 290 274
Pectin DE 75
998 180 1228
CMC
99
1
A vicel
22
9
10
1-5-α-L-arabinan
16
14
1,3;
1,2;
1,5-α-L- 14
16
35
37
arabinan
333
PNP-Arabinofuranoside
3
4
9
Galactomannan
7
0
0
1,4-β-D-Mannan
11
58
91
1,4-β-D-Galactan
4
0
2
1,4-β-D-Xylan
Coù moät ñieàu chaéc chaén laø kyõ thuaät gen seõ ñöôïc söû duïng nhaèm muïc ñích
saûn xuaát caùc cheá phaåm enzyme, môû ra nhöõng khaû naêng môùi cho caùc öùng duïng
coâng nghieäp cuûa caùc cheá phaåm enzyme naøy.
V. Thu nhaän:[ I ]
Hieän nay, ngöôøi ta thu nhaän pectinase chuû yeáu töø VSV. Coù hai phöông
phaùp saûn xuaát pectinase:
1.
Thu nhaän cheá phaåm pectinase töø canh tröôøng beà maët:
Moâi tröôøng söû duïng ñeå nuoâi caáy VSV ñeå thu nhaän pectinase thöôøng laø
caùm gaïo, hay caùm mì, baõ cuû caûi hoaëc thoùc maàm. Nguoàn dinh döôõng boå sung
thöôøng laø caùc muoái ammonium, phosphoric… Ñoä aåm moâi tröôøng phaûi naèm trong
khoaûng 60%. Naám moác A.awamori thöôøng ñöôïc nuoâi caáy ôû 30oC vaø trong thôøi
gian 40h, sau ñoù giaûm xuoáng 24oC vaø nuoâi trong 48-52h. Saûn phaåm leân men
ñöôïc saáy khoâ thaønh cheá phaåm enzyme thoâ vaø ñem tinh cheá.
Ñeå thu ñöôïc cheá phaåm pectinase tinh khieát thì cheá phaåm enzyme thoâ
phaûi ñöôïc trích ly baèng phöông phaùp keát tuûa nhôø dung moâi höõu cô hay muoái
ammonium sulfate. Dung moâi höõu cô söû duïng ñeå keát tuûa enzyme pectinase coù
theå laø röôïu ethanol (72,5-75%) hoaëc isopropanol (55-57%). Muoái ammonium
sulfat söû duïng coù ñoä baûo hoaø 0,79. Khi keát tuûa baèng röôïu ethanol, cheá phaåm
enzyme thu ñöôïc coù ñoä tinh khieát khoaûng 90%, coøn neáu baèng muoái thì ñoä tinh
khieát ñaït khoaûng 75%. Nhieät ñoä keát tuûa toái öu vôùi röôïu laø 2-5oC, thôøi gian tieáp
xuùc vôùi röôïu caøng ngaén caøng toát. Sau ñoù, ly taâm ñeå taùch keát tuûa khoûi dung dòch,
saáy keát tuûa trong thieát bò saáy chaân khoâng hay saáy thaêng hoa roài nghieàn nhoû vaø
ñem baûo quaûn.
2. Thu nhaän cheá phaåm enzyme töø canh tröôøng beà saâu:
Phöông phaùp hieáu khí: Söï tích tuï enzyme trong moâi tröôøng ñöôïc baét
ñaàu khi söï phaùt trieån cuûa VSV gaàn ñaït ñeán pha oån ñònh, khi moâi tröôøng bò acid
hoaù maïnh vaø khi löôïng phospho voâ cô ñöôïc söû duïng hoaøn toaøn. pH cuûa moâi
tröôøng nuoâi caáy thöôøng ñaït töø 6-7,2 laø thích hôïp. Ñoái vôùi naám moác, pH kieàm
kìm haõm söï toång hôïp sinh khoái vaø söï tích luõy enzyme pectinase. pH=4 öùc cheá
hoaøn toaøn söï tích luõy enzyme pectinase. Khi pH dòch veà phía acid, ngay caû khi
pH naèm trong khoaûng 4,5-5,0, tuy söï taïo thaønh sinh khoái khoâng bò aûnh höôûng
nhöng söï taïo thaønh enzyme pectinase bò kìm haõm. Tuy nhieân, pH cuûa caùc
tröôøng nuoâi caáu A. niger vaø A. awamori 16 coù theå dòch veà 3,5-3,8 vaø 2,9-3,2,
theo thöù töï.
Vaät lieäu gieo caáy coù theå laø sôïi naám 24, 32 vaø 48h tuoåi vaø vôùi haøm löôïng
töø 2-10%. Ñoái vôùi A. niger vaø A. awamori, vaät lieäu gieo caáy laø sôïi naám ñöôïc uû
sô boä trong moâi tröôøng dinh döôõng cho ñeán khi baét ñaàu nöùt nanh baøo töû. Thôøi
gian uû sô boä thöôøng laø38-42h. Löôïng sôïi naám ñem gieo caáy thöôøng laø 2%.
Trong quaù trình nuoâi caáy, haøm löôïng caùc chaát hoaø tan trong moâi tröôøng thöôøng
giaûm töø 6% xuoáng coøn 1,5-1,8%.
Ñeå thu cheá phaåm khoâ, caàn taùch sôïi naám ra khoûi canh tröôøng loûng. Coâ
ñaëc chaân khoâng canh tröôøng loûng ñeán khi haøm löôïng chaát khoâ ñaït 5-8% roài saáy
khoâ treân thieát bò saáy phun. Ñieàu kieän saáy phun laø nhieät ñoä chaát taûi nhieät ñi vaøo
phaûi ñaït 165-180oC vaø ñi ra ñaït 60-70oC. Thôøi gian löu cuûa cheá phaåm enzyme
trong thieát bò saáy phun phaûi khoâng quaù 7 giaây vaø nhieät ñoä cheá phaåm sau khi saáy
phaûi khoâng quaù 40oC. Cheá phaåm thu ñöôïc caàn phaûi ñöôïc ñoùng goùi kín ñeå traùnh
huùt aåm. Coù theå thu cheát phaåm pectinase tinh khieát baèng caùch keát tuûa enzyme
trong dòch loïc canh tröôøng vôùi ethanol theo tæ leä 4:1, vôùi aceton theo tæ leä 2:1 vaø
isopropanol thöo tæ leä 1,3:1, hoaëc vôùi muoái ammonium sulfate (50-80% trong
muoái keát). Neáu keát tuûa baèng ethanol, hoaït ñoä pectinase trong keát tuûa seõ vaøo
khoaûng 88-90% so vôùi hoaït ñoä cuûa dòch canh tröôøng ban ñaàu. Neáu keát tuûa baèng
muoái ammonium sulfate, caàn taùch muoái ra khoûi enzyme baèng phöông phaùp
thaåm tích (vôùi nöôùc hoaëc dung dòch ñeäm), sau ñoù saáy khoâ. Khi ñoä baõo hoaø cuûa
(NH4)2SO4 baèng 0,5 thì seõ keát tuûa ñöôïc ñoaïn coù hoaït ñoä pectinase thaáp (ñoaïn
naøy chieám 0,25% troïng löôïng khoâ), nhöng neáu keát tuûa baèng (NH4)2SO4 coù ñoä
baõo hoaø 1.0 thì seõ keát tuûa ñöôïc ñoaïn chæ chieám 0,11% nhöng laïi coù hoaït ñoä
pectinase cao.
Phöông phaùp yeám khí
Moâi tröôøng: Baõ cuû caûi:2%; (NH4)2HPO4 0,75%
KH2PO4:0,1%; CaCO3: 0,3%; nöôùc chieát ngoâ: 0,5%
Clostridium pectinopermentants 15 coù khaû naêng toång hôïp pectinase moät
caùch maïnh meõ ôû pha taêng tröôûng cuûa quaù trình sinh tröôûng vaø taêng ñoàng thôøi
vôùi söï tích luõy sinh khoái. Söï tích luõy enzyme seõ toái ña töông öùng vôùi pha oån
ñònh cuûa söï sinh tröôûng qua 55-60h. pH ban ñaàu cuûa moâi tröôøng dinh döôõng laø
6,5-7,0. Vaät lieäu gieo caáy ban ñaàu ñöôïc chuaån bò ôû daïng canh tröôøng chöùa baøo
töû vaø ñöôïc caáy vôùi löôïng 4% theo theå tích. Quaù trình nuoâi caáy ñöôïc tieán haønh ôû
nhieät ñoä 35oC.
Cl. Felsineum cuõng coù theå ñöôïc nuoâi caáy yeám khí ñeå thu pectinase.
Thaønh phaàn moâi tröôøng goàm coù: Lactose:2%; pectin cuû caûi:1%; (NH4)2HPO4:
0,4%; K2HPO4: 0,7%; KH2PO4:0,3%; NaCl:0,1%; MgSO4: 0,025%; FeSO4:
daïng veát; CaCO3: 0,5%; dòch naám men töï phaân: 0,05%; ascorbic acid: 0,5%.
Coù theå tieán haønh thu cheá phaåm töø dòch loïc canh tröôøng baèng caùch keát tuûa
enzyme vôùi dung moâi höõu cô hoaëc vôùi muoái ammonium sulfate. Neáu keát tuûa
baèng dung moâi höõu cô, pH cuûa dung dòch ñaõ xöû lí laø: 6,5-6,8. Neáu keát tuûa baèng
2-2,5 theå tích aceton thì hoaït ñoä cuûa enzyme trong keát tuûa ñaït 93-95% so vôùi
hoaït ñoä ban ñaàu.
Khi keát tuûa baèng ammonium sulfate coù ñoä baõo hoaø baèng 0,2 thì seõ thu
ñöôïc cheá phaåm chæ chöùa pectinesterase vaø pectintranseliminase; khi ñoä baõo hoaø
laø 0,9-1 thì seõ thu ñöôïc cheá phaåm chæ chöùa pectintranseliminase vaø
exopolygalacturonase.
Phöông phaùp hieän ñaïi trong chuaån bò cheá phaåm enzyme pectinase
thöôøng theo caùc böôùc cô baûn sau ñaây:
- Khöû muoái baèng phöông phaùp loïc gel(Biogel P100)
- Taùch protein baèng phöông phaùp trao ñoåi anion (DEAE Biogel
A), hay trao ñoåi cation (CM Biogel A)
- Taùch enzyme pectinase baèng alginate lieân keát ngang
- Tinh saïch baèng FPLC.
Alginate lieân keát ngang hoaït ñoäng baèng caùch keát hôïp aùi löïc, aûnh höôûng
tónh ñieän vaø thay theá pectate lieân keát ngang.
3. YÙ nghóa veà maët kyõ thuaät cuûa caùc endo-enzyme
3.1-Pectinesterase: Ethanol coù maët trong phaàn chöng caát ñöôïc töø thòt quaû
leân men laø do pectin methylester bò phaân caét bôûi endo-enzyme PE. Trong suoát
quaù trình leân men, ethanol ñöôïc sinh ra vaø caùc ñôn vò saûn xuaát caàn phaûi thanh
truøng thòt quaû tröôùc khi leân men ñeå noàng ñoä ethanol coù maët trong saûn phaåm
khoâng vöôït quaù giôùi haïn cho pheùp. Söï coù maët cuûa PE trong traùi caây hoï citrus laø
nguyeân nhaân gaây ra caùc vaán ñeà caàn ñöôïc giaûi quyeát trong coâng nghieäp thöïc
phaåm, töùc laø söï maát ñi cuûa caùc veát vaãn ñuïc trong dòch eùp. Neáu PE khoâng bò öùc
cheá tröïc tieáp sau khi taùch chieát dòch quaû baèng caùch baát hoaït bôûi nhieät hay laøm
ñoâng, caùc phaân töû pectin seõ bò ñeà ester hoaù vaø seõ bò ñoâng tuï bôûi söï coù maët cuûa
caùc ion Ca++ trong dòch eùp. Ñeå ngaên ñieàu naøy, nöôùc eùp ñöôïc taùch thaønh phaàn
caën vaø phaàn trong. Neáu nöôùc eùp quaù ñaëc, gel pectate seõ ñöôïc hình thaønh vaø do
ñoù nöôùc eùp seõ khoâng ñöôïc hoaøn nguyeân laïi nöõa. Nhöõng vaán ñeà naøy laøm giaûm
chaát löôïng saûn phaåm moät caùch nghieâm troïng. Caùc chaát taïo höông cuûa traùi caây
hoï citrus cöïc kyø maãn caûm vôùi nhieät, vì theá caùc phöông phaùp saûn xuaát saûn phaåm
traùi caây ñoâng laïnh ñang raát caàn thieát. Phöùc hôïp cuûa ion Ca++ coù theå ngaên ngöøa
söï bieán maát cuûa caùc ñaùm maây vaãn ñuïc do hoaït ñoäng cuûa PE, nhöng laïi laøm phaùt
sinh caùc vaán ñeà mang tính chaát phaùp lyù. Polyphenol coù theå öùc cheá hoaït ñoäng
cuûa PE nhöng lai gaây aûnh höôûng ñeán vaán ñeà caûm quan, chaúng haïn veà vò trí vaø
tính ñoàng nhaát cuûa saûn phaåm. PE ñoàng thôøi laø moät chaát öùc cheá saûn phaåm cuoái,
nhöng neáu theâm pectic acid vaøo laïi laøm nöôùc eùp bò phaân lôùp, theá laø laïi taïo ra
moät vaán ñeà khoâng mong muoán khaùc. Tuy nhieân, vieäc thuûy phaân pectic acid, ñeán
möùc polymer hoaù 8-10, coù aûnh höôûng öùc cheá cuûa caùc cheá phaåm polymer cao
phaân töû nhöng laïi khoâng ñoâng tuï vôùi Ca++. Vieäc theâm caùc cheá phaåm nhö theá seõ
khoâng ngaên ngöøa ñöôïc nhöng seõ trì hoaõn ñöôïc quaù trình töï phaân lôùp, coù leõ ñuû
laâu ñeå phaân phoái nhanh caùc loaïi nöôùc eùp traùi caây töôi ñöôïc laøm tan giaù. Moät
khaû naêng khaùc laø vieäc theâm caùc exo-enzyme (H.6.10): PG laøm phaân huûy pectin
coù möùc ester thaáp hình thaønh tröôùc khi söï ñoâng tuï vôùi Ca++ xaûy ra, hay PL phaân
huûy caùc pectin trong nöôùc eùp traùi caây ñeán caùc saûn phaåm coù khoái löôïng phaân töû
thaáp hôn, laø caùc hôïp chaát khoâng maãn caûm vôùi Ca++, duø laø ñeà ester hoaù vaø thöïc
teá cuõng coù theå hieän chöùc naêng öùc cheá PE. Hoaït ñoäng phaân huûy pectin bôûi
enzyme nhö theá ñaõ ñöôïc öùng duïng trong vieäc laøm giaûm ñoä nhôùt trong nöôùc traùi
caây, vì theá laøm taêng noàng ñoä cuûa caùc thaønh phaàn chaát chieát ñeán caùc giaù trò Brix
cao hôn nhö bình thöôøng coù theå. Cuõng caàn phaûi löu yù vieäc söû duïng caùc giai ñoaïn
bay hôi nhieàu laàn nhaèm toái öu hoaù quaù trình xöû lyù nhieät vaø khoâi phuïc höông vò
saûn phaåm, keát hôïp vôùi vieäc baûo quaûn trong ñieàu kieän ñoâng laïnh vaø vaän chuyeån
saûn phaåm nöôùc eùp coâ ñaëc giuùp traùnh ñöôïc phaàn lôùn PE bò baát hoaït do taùc ñoäng
cuûa nhieät ñoä.Tuy nhieân, ñoái vôùi caùc nöôùc ñang phaùt trieån, vaãn ñang toàn taïi vaán
ñeà naøy trong coâng nghieäp saûn xuaát nöôùc eùp traùi caây hoï citrus vaø caùc loaïi nöôùc
eùp vaån ñuïc khaùc coù hoaït löïc PE cao vaø caùc chaát taïo höông raát maãn caûm vôùi
nhieät, chaúng haïn nhö oåi vaø xoaøi.
Caùc PE ñöôïc phaân laäp töø cam coù hình thöùc khaùc nhau vaø coù aùi löïc khaùc
nhau ñoái vôùi pectin vaø pectate. Maët khaùc, chuùng cuõng khaùc nhau veà ñoä beàn
nhieät, vaø cuõng deã hieåu raèng chuùng ñoùng vai troø khaùc nhau trong hieän töôïng laøm
trong dòch quaû eùp. Moät loaïi ñöôïc phaân bieät bôûi khoái löôïng phaân töû cuûa noù raát
cao, chæ chieám khoaûng 5% hoaït tính toaøn phaàn vaø mang moät soá ñaëc ñieåm noåi
baät. Loaïi naøy beàn nhieät vaø vì theá ñoùng vai troø chính yeáu trong vieäc laøm trong
dòch quaû eùp ñaõ thanh truøng vôùi löôïng nhieät khoâng ñuû. Enzyme naøy cuõng hoaït
ñoäng ôû nhieät ñoä thaáp vaø pH thaáp vaø do ñoù ñöôïc coi laø coù vai troø quan troïng
trong quaù trình töï taùch lôùp cuûa nöôùc chanh trong vaø nöôùc eùp töø quaû chanh thu
ñöôïc baèng caùch ñeå laéng nöôùc eùp trong tank coù chaát baûo quaûn laø sulfur dioxide.
Nhöõng dòch trong töø quaû eùp nhö theá vaãn ñang laø nhöõng saûn phaåm coù giaù trò
thöông maïi ñöôïc saûn xuaát vôùi vieäc öùng duïng caùc cheá phaåm pectinase thöông
maïi.
Trong soá hai isoenzyme trong baûng 6.13, chæ coù isoenzyme PE loaïi I coù
khaû naêng laøm taùch lôùp. PE loaïi II khoâng coù khaû naêng naøy; löôïng methanol töï do
ñöôïc thoaùt ra ít hôn so vôùi methanol taïo ra bôûi caùc enzyme taùch lôùp. Baûng 6 cho
thaáy khaû naêng öùc cheá raát cao cuûa pectate coù leõ ñaõ öùc cheá söï hoaït ñoäng cuûa
enzyme ôû moät möùc nhaát ñònh trong quaù trình ester hoaù. Aûnh höôûng naøy ñöôïc
taêng leân bôûi söï ñoùng goùp cuûa caùc nhoùm acid taïo thaønh. Hình 6.11 cho thaáy, neáu
theâm PG vaøo thì khoái pectate laïi bò phaân huûy tieáp vaø treân thöïc teá toác ñoä phaûn
öùng maø taïi ñoù methanol töï do hình thaønh trong nöôùc cam eùp coù PE hoaït ñoäng
ñöôïc taêng leân bôûi PG. Caùc söï khaùc nhau veà maët ñoäng hoïc nhö theá cuõng coù theå
giaûi thích tính öùc cheá khoâng hoaøn toaøn bôûi oligogalacturonate. Moät loaïi PE
khaùc trong nöôùc cam eùp khoâng gaây ra söï töï phaân lôùp, thaäm chí ngay caû sau khi
giaûi phoùng moät löôïng methanol baèng vôùi löôïng methanol maø PE phoùng thích.
Caùc kieåu taán coâng cuûa enzyme phaûi ñöôïc giaû ñònh sao ñoù ñeå pectin vôùi haøm
löôïng ester thaáp ñöôïc sinh ra maø coù tính maãn caûm vôùi Ca++ giaûm ñi, coù leõ bôûi söï
phaân boá ngaãu nhieân cuûa caùc nhoùm carboxyl töï do. Cô cheá naøy thöôøng thaáy ôû
caùc PE cuûa naám, chaúng haïn nhö ôû A. japonicus, enzyme naøy ñöôïc söû duïng ñeå
saûn xuaát pectin coù möùc ester hoaù thaáp duøng trong cheá bieán möùc ít ñöôøng.
Nhöõng pectin nhö vaäy thöôøng ñöôïc saûn xuaát nhôø quaù trình thuûy phaân nhôø acid.
Pectinesterase cuûa naám cuõng ñöôïc söû duïng ñeå taùch lôùp röôïu taùo Phaùp. Hai
isoenzyme vôùi ñaëc tính laøm taùch lôùp nöôùc cam naøy ñöôïc tìm thaáy trong taát caû
caùc thaønh phaàn cuûa quaû cam. Coù ñeán 12 loaïi PE ñöôïc tìm thaáy trong quaû cam
troàng vaø caùc loaïi quaû hoï citrus khaùc vaø chuùng ñöôïc taùch treân cô sôû aùi löïc cuûa
chuùng ñoái vôùi pectate. Ñieàu caàn chuù yù laø hoaït ñoäng cuûa caùc PE bò öùc cheá bôûi
noàng ñoä cao cuûa ñöôøng ñeå taïo nöôùc eùp coâ ñaëc ñeán 60oBx, taïi ñoù caùc enzyme
naøy khoâng hoaït ñoäng nhöng laïi coù theå hoaït ñoäng sau khi hoaøn nguyeân (pha
loaõng trong nöôùc).
Hieän töôïng ñoâng tuï vôùi calcium cuûa pectin bò ñeà ester hoaù bôûi PE ñöôïc
khai thaùc khi saáy khoâ voû traùi caây hoï citrus sau khi eùp laøm thöùc aên cho gia suùc.
Chaát vöõa calcium hydroxide ñöôïc theâm vaøo khoái voû trong khi nghieàn ñeå ñöa pH
ve giaù trò trung tính hay cao hôn. pH cao, vaø noàng ñoä ion Ca++ cao, laøm kích
hoaït PE, quaù trình ñeà ester hoaù xaûy ra nhanh vaø söï ñoâng tuï cuûa pectate vôùi
calcium xaûy ra. Chaát loûng ñöôïc tieát ra vaø ñöôïc eùp, ñeå chæ coù moät phaàn ít nöôùc
coøn laïi caàn ñöôïc loaïi boû nhôø quaù trình saáy bôûi nhieät. Phaàn nöôùc eùp coù thaønh
phaàn töông töï nhö nöôùc eùp töø quaû ñöôïc coâ thaønh maät vaø cuõng ñöôïc laøm thöùc aên
cho gia suùc. Dó nhieân, voû traùi caây hoï citrus khoâ ñöôïc söû duïng laøm nguyeân lieäu
thoâ ñeå trích chieát pectin, do ñoù caàn phaûi ngaên chaên hoaït tính cuûa PE baèng caùch
taåy traéng voû ngay laäp töùc, neáu khoâng, pectin ñöôïc chieát ra, cho duø bò ñeà ester
hoaù ít thoâi, seõ chöùa caùc khoái galacturonic acid töï do vaø seõ raát maãn caûm vôùi Ca++
vaø vì vaäy khoâng söû duïng ñöôïc ñeå laøm yeáu toá taïo ñoâng.
Endo-PE cuõng ñöôïc khai thaùc ñeå baûo veä vaø caûi taïo keát caáu vaø ñoä chaéc
cuûa nhieàu loaïi rau quaû cheá bieán, nhö taùo caét laùt, caø chua ñoùng hoäp, suùp lô, caø
roát, khoai taây vaø ñaäu. Quaù trình laøm traéng ôû nhieät ñoä thaáp, thôøi gian daøi kích
hoaït PE, laøm cho pectin bò ñeà ester hoaù moät phaàn, sau ñoù pectin bò ñeà ester hoaù
naøy phaûn öùng vôùi Ca++, taïo neân söï keát dính noäi baøo maïnh hôn.
Söï kích thích maïnh hôn ñoái vôùi PG vaø maïnh hôn trong thí nghieäm b,
trong ñoù enzyme, esterase bò öùc cheá maïnh hôn bôûi saûn phaåm cuoái so vôùi trong
thí nghieäm a. Roõ raøng PL (----) khoâng phaân huûy ñöôïc caùc vuøng öùc cheá ñeà ester
hoaù neân khoâng coù aûnh höôûng gì.
3.2-Pectinesterase vaø polygalacturonase:
Hai enzyme naøy coù maët cuøng nhau raát nhieàu trong caø chua, coù aûnh
höôûng raát lôùn trong quaù trình cheá bieán caø chua. Vieäc gaây baát hoaït caùc enzyme
naøy bôûi nhieät ngay laäp töùc laø caàn thieát ñeå coù ñöôïc nöôùc eùp coù ñoä nhôùt cao nhö
ngöôøi tieâu duøng mong muoán hay nöôùc eùp daïng paste, söû duïng laøm nöôùc chaám,
soup, nöôùc soát caø chua naám vaø moät soá saûn phaåm töông töï. Nhöõng loaïi nöôùc quaû
naøy ñöôïc xöû lyù nhieät trong moät thieát bò ñaëc bieät maø trong ñoù caø chua ñöôïc
nghieàn tröïc tieáp thaønh caø chua noùng daïng nhaõo. Roõ raøng, quaù trình xöû lyù nhieät
taïo ra moät soá caùc höông vò ñaëc tröng cho saûn phaåm caø chua cheá bieán. Trong
tröôøng hôïp caùc thaønh phaàn caø chua ñöôïc söû duïng ñeå taïo maøu vaø höông vò, coøn
phaàn chính cuûa saûn phaåm laø do caùc thaønh phaàn khaùc, nhö tinh boät taïo neân thì
nguyeân lieäu nöôùc eùp phaûi ôû traïng thaùi nguoäi hôn, ñoàng thôøi phaûi coù moät thôøi
gian nghæ giöõa hai giai ñoaïn nghieàn eùp vaø xöû lyù nhieät ñeå pectin coù theå bò phaân
huûy nhieàu hôn nhôø taùc ñoäng keát hôïp cuûa PG vaø PE. Coøn trong nhöõng traùi caø
chua ñöôïc caûi taïo gen ñeå giaûm haøm löôïng PG, phaàn raén vaø ñoä chaéc cuõng nhö ñoä
nhôùt cuûa quaû ñöôïc taêng leân.
3.3-Hoaït tính pectinase töø nguoàn VSV gaây nhieãm
PG töø naám men vaø PAL töø vi khuaån cuøng vôùi caùc endo-PE ñeàu coù lieân
quan ñeán quaù trình laøm chín döa chuoät vaø oâ liu ngaâm trong nöôùc muoái. Söï hao
huït veà chaát löôïng naøy coù theå traùnh ñöôïc baèng caùch söû duïng caùc chaát öùc cheá,
chaúng haïn nhö caùc polyphenol roø ræ ra töø laù nho vaøo trong nöôùc muoái. Nöôùc
muoái coù theå ñöôïc söû duïng ñeå thanh truøng naám moác beàn nhieät Byssochlamys
fulva. Naám moác naøy sinh enzyme laøm hoûng daâu taây trong siroâ (syrup) hay möùt.
Moät loaïi PG beàn nhieät coù töø loaøi Rhizobium coù theå laøm hoûng keát caáu cuûa thòt
quaû mô ñoùng hoäp. Söï nhieãm naám coù theå gaây ra hieän töôïng taùch lôùp cuûa nöôùc
cam voâ khuaån vaø ñaõ ñoùng chai, khoâng roõ laø do taùc ñoäng cuûa PE, PG hay caû hai,
nhöng moät löôïng lôùn methanol töï do ñöôïc tìm thaáy trong loaïi nöôùc quaû phaân lôùp
naøy. PG naám men coù theå phaân huûy pectin trong quaù trình leân men boät taùo
nghieàn, laøm cho baõ taùo bò maát ñi moät löôïng lôùn pectin neáu ñöôïc ñem laøm
nguyeân lieäu thoâ ñeå saûn xuaát pectin.
Leân men caø pheâ vaø cacao laø moät lónh vöïc öùng duïng nhieàu trieån voïng cuûa
enzyme pectinase coù töø nguoàn VSV. Trong quaù trình len men, lôùp chaát nhaày
xung quanh caùc haït naøy bò phaân huûy nhanh hôn vaø bò röûa khoûi haït tröôùc khi haït
ñöôïc saáy khoâ. Moät öùng duïng khaùc laø söï taïo höông ñaëc bieät cho saûn phaåm röôïu
do söï hình thaønh caùc saûn phaåm trao ñoåi chaát cuûa naám moác nhieãm vaøo traùi nho
chín coù haøm löôïng ñöôøng cao baèng caùch ñaâm thuûng voû traùi nho vaø ñeå nöôùc
trong nho bay hôi, vaø ñeå nho bò nhieãm naám.
PHAÀN II
ÖÙNG DUÏNG CUÛA HEÄ
ENZYM PECTINASE
I. Tình hình öùng duïng enzym trong coâng nghieäp treân theá
giôùi :[I ]
Töø khi phaùt hieän ra enzym vaø khaû naêng chuyeån hoùa cuûa enzym loaøi ngöôøi ñaõ
taêng nhanh quaù trình saûn xuaát vaø öùng duïng enzym trong coâng nghieäp. Soá löôïng enzym
phaùt hieän ngaøy caøng nhieàu vaø soá löôïng enzym ñöôïc öùng duïng vaøo coâng nghieäp cuõng
ngaøy caøng nhieàu. Caùc enzym quan troïng, ñöôïc öùng duïng roäng raõi trong coâng nghieäp
ñöôïc trình baøy trong baûng sau:
Stt
1
2
3
4
Loaïi enzym
Enzym protease
- Trypsine
- Rennet
- Protease acid
- Protease trung tính
- Protease kieàm yeáu
- Protease kieàm maïnh duøng trong chaát taåy röûa
Carbohydrase
- Pectinase
- Isomerase
- Cellulase
- α - amylase
- β - amylase
Lipase
Caùc enzym khaùc söû duïng trong y hoïc vaø trong phaân tích
Tyû leä öùng
duïng(%)
59%
3%
10%
3%
12%
6%
25%
28%
3%
6%
1%
13%
13%
3%
10%
Baûng 2:Möùc ñoä öùng duïng cuûa moät soá enzym
quan troïng hieän nay treân theá giôùi
Qua baûng treân ta thaáy caùc enzym thuoäc nhoùm protease hieän ñang ñöôïc öùng duïng
nhieàu nhaát. Trong ñoù enzym protease kieàm ñöôïc öùng duïng trong chaát taåy röûa vôùi soá
löôïng lôùn nhaát so vôùi caùc loaïi emzym khaùc.
Trong soá caùc enzym ñöôïc saûn xuaát vaø öùng duïng treân theá giôùi, caùc nöôùc chaâu AÂu
saûn xuaát vaø baùn ra thò tröôøng theá giôùi soá löôïng nhieàu nhaát.
Baûng 3:Thò tröôøng enzym chaâu Aâu
Stt
Loaïi enzym
Giaù trò buoân baùn enzym (trieäu USD)
83,2
1 Carbohydrase
187,2
2 Protease
31,6
3 Lipase
41,6
4 Pectinase
20,8
5 Nhöõng loaïi enzym ñaëc bieät
41,6
6 Caùc loaïi enzym khaùc
Rieâng trong coâng ngheä thöùc phaåm, löôïng enzym ñöôïc tieâu thuï nhieàu nhaát. Soá löôïng
enzym ñöôïc öùng duïng trong coâng nghieäp thöùc phaåm chuû yeáu ôû caùc nöôùc chaâu Myõ, chaâu
AÂu
- Xem thêm -