LỜI CẢM ƠN
Trước tiên Chúng Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành sâu sắc tới các Thầy Cô
giáo trong Trường Đại học Khoa học Huế nói chung và các Thầy Cô giáo trong
khoa Sinh học, bộ môn Công nghệ Sinh học nói riêng đã tận tình giảng dạy, truyền
đạt cho Chúng Tôi những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian qua.
Đặc biệt Chúng Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Thầy giáo Cao Đăng Nguyên và
Cô giáo Lê Thị Hà Thanh, Thầy và Cô đã tận tình giúp đỡ, trực tiếp chỉ bảo, hướng
dẫn Chúng Tôi suốt quá trình làm đồ án tốt nghiệp. Trong thời gian làm việc với
Thầy và Cô, Chúng Tôi không ngừng tiếp thu thêm nhiều kiến thức bổ ích mà còn
học tập được tinh thần làm việc, thái độ nghiên cứu khoa học nghiêm túc, hiệu quả.
Đây là những điều rất cần thiết trong quá trình học tập và công tác sau này.
Sau cùng Chúng Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã
động viên, đóng góp ý kiến và giúp đỡ trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn
thành đồ án tốt nghiệp.
MỤC LỤC
Contents
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. 1
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................... 1
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... 2
DANH MỤC ĐỒ THỊ VÀ HÌNH VẼ ........................................................................ 4
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 5
PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 7
I. SƠ LƯỢC VỀ PROTEIN ........................................................................................ 7
1. Những đặc trưng chung của protein ........................................................................ 7
2. Cấu trúc protein ....................................................................................................... 8
2.1. Thành phần hoá học của protein .......................................................................... 8
2.2. Đơn vị cấu tạo cơ sở của protein –Amino acid .................................................... 8
2.3. Các bậc cấu trúc của phân tử protein ................................................................... 9
2.3.1. Cấu trúc bậc nhất (cấu trúc sơ cấp) ................................................................... 9
2.3.2. Cẩu trúc bậc II (cấu trúc thứ cấp) ...................................................................... 9
2.3.3. Cấu trúc bậc III .................................................................................................. 9
2.3.4. Cấu trúc bậc IV................................................................................................ 10
3. Phân loại protein .................................................................................................... 10
3.1. Protein đơn giản ................................................................................................. 10
3.2. Protein phức tạp ................................................................................................. 11
4. Chức năng sinh học của protein ............................................................................ 11
4.1. Xúc tác ................................................................................................................ 11
4.2. Vận tải ................................................................................................................ 11
4.3. Chuyển động....................................................................................................... 11
4.4. Bảo vệ ................................................................................................................. 11
4.5. Truyền xung thần kinh ....................................................................................... 12
4.6. Điều hoà ............................................................................................................ 12
4.7. Kiến tạo và chống đỡ cơ học ............................................................................. 12
4.8. Dự trữ dinh dưỡng .............................................................................................. 12
II. VÀI NÉT VỀ LECTIN......................................................................................... 12
1. Sơ lược lịch sử nghiên cứu lectin .......................................................................... 12
2. Tình hình nghiên cứu lectin trên thế giới và ở Việt nam ...................................... 15
2.1. Tình hình nghiên cứu lectin trên thế giới ........................................................... 15
2.2. Tình hình nghiên cứu lectin ở Việt Nam ........................................................... 16
3. Tính phổ biến của lectin trong tự nhiên. ............................................................... 17
3.1. Sự phân bố lectin trong thực vật. ....................................................................... 17
3.1.1. Phân loại và trình tự của lectin thực vật. ......................................................... 17
3.1.2. Độc tỉnh của lectin thực vật............................................................................. 18
3.1.3. Phân lập lectin thực vật. .................................................................................. 18
3.2. Sự phân bố lectin trong động vật. ...................................................................... 19
3.3.Sự phân bố lectin trong ví sinh vật. .................................................................... 20
3.4. Sự định khu cửa lectin trong tế bào và cơ thể sinh vật. ..................................... 20
PHẦN 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 21
I. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................................... 21
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................ 21
1. Dụng cụ và hóa chất .............................................................................................. 21
2. Xử lý mẫu vật ........................................................................................................ 21
3. Phương pháp xác định hoạt độ lectin .................................................................... 23
3.1. Hoạt độ chung (HĐC) ........................................................................................ 24
3.2. Hoạt độ riêng (HĐR) .......................................................................................... 24
3.3. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp quang phổ .............................. 24
3.4. Nghiên cứu đặc trưng củaprotein bằng điện diSDS-PAGE ............................... 24
PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................................................... 26
I. SỰ TÍCH LUỸ PROTEIN VÀ LECTIN............................................................... 26
1. SỰ TÍCH LŨY PROTEIN. ................................................................................... 26
1.1. Giai đoạn mọc. ................................................................................................... 26
1.2. Giai đoạn lá đơn. ................................................................................................ 27
1.3. Giai đoạn 1 lá kép. ............................................................................................. 27
1.4. Giai đoạn 2 lá kép. ............................................................................................. 28
1.5. Giai đoạn 3 lá kép. ............................................................................................. 28
1.6. Giai đoạn (n-1) lá kép. ....................................................................................... 29
1.8. Giai đoạn hoa rộ. ................................................................................................ 30
1.9. Giai đoạn làm quả. ............................................................................................. 30
1.10. Giai đoạn làm quả rộ ........................................................................................ 31
1.11. Giai đoạn làm hạt. ............................................................................................ 31
1.12. Giai đoạn quả chắc. .......................................................................................... 32
1.13. Giai đoạn chín sinh lý. ..................................................................................... 32
1.14. Giai đoạn chín thu hoạch. ................................................................................ 33
2. SỰ TÍCH LŨY LECTIN....................................................................................... 39
3. Nghiên cứu phổ điện di protein............................................................................. 41
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 42
1. KẾT LUẬN ........................................................................................................... 42
2. KIẾN NGHỊ .......................................................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 43
I.TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT ........................................................................................ 43
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ConA
Concanavalin A
Đv
Đơn vị
HAA
Hemaglutinatiing Activity
HĐC
Hoạt độ chung
HĐR
Hoạt độ riêng
HIV
Human Immuno-deficiency Vius
kDa
Kilo Dalton
Mgpr
Miligam protein
PHA
Phytohemagglutinin
PBS
Phosphate Buffered Saline
OD
Optical Density
SDS-PAGE
Sodium Đoecyl sulfate polyacrylamide
gel electrophoresis
TEMED
Tetramethylethylenediamine
APS
Ammonumpersulfate
X
Cơ quan không có hoặc không nghiên cứu
1
DANH MỤC BẢNG
Số hiệu
Nội dung
Trang
1.1
Khối lượng và cấu trúc phân tử của một số protein
5
2.1
Các thời kỳ sinh trưởng và phát triển của đậu ngự
20
3.1.1
Sự tích lũy protein ở giai đoạn mọc
24
3.1.2
Sự tích lũy protein ở giai đoạn lá đơn
25
3.1.3
Sự tích lũy protein ở giai đoạn lá kép
25
3.1.4
Sự tích lũy protein ở giai đoạn 2 lá kép
26
3.1.5
Sự tích lũy protein ở giai đoạn 3 lá kép
26
3.1.6
Sự tích lũy protein ở giai đoạn (n-1) lá kép
27
3.1.7
Sự tích lũy protein ở giai đoạn ra hoa
27
3.1.8
Sự tích lũy protein ở giai đoạn ra hoa rộ
28
3.1.9
Sự tích lũy protein ở giai đoạn làm quả
28
3.1.10
Sự tích lũy protein ở giai đoạn làm quả rộ
29
3.1.11
Sự tích lũy protein ở giai đoạn làm hạt
29
3.1.12
Sự tích lũy protein ở giai đoạn quả chắc
30
3.1.13
Sự tích lũy protein ở giai chín sinh lý
30
3.1.14
Sự tích lũy protein ở giai đoạn chín thu hoạch
31
3.1.15
Sự tích lũy protein ở tất cả các giai đoạn
37
3.2.1
Sự tích lũy lectin có hoạt độ riêng
37
2
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Số hiệu
Nội dung
Trang
3.1.1
Sự tích lũy protein ở giai đoạn mọc
24
3.1.2
Sự tích lũy protein ở giai đoạn lá đơn
25
3.1.3
Sự tích lũy protein ở giai đoạn lá kép
25
3.1.4
Sự tích lũy protein ở giai đoạn 2 lá kép
26
3.1.5
Sự tích lũy protein ở giai đoạn 3 lá kép
26
3.1.6
Sự tích lũy protein ở giai đoạn (n-1) lá kép
27
3.1.7
Sự tích lũy protein ở giai đoạn ra hoa
27
3.1.8
Sự tích lũy protein ở giai đoạn ra hoa rộ
28
3.1.9
Sự tích lũy protein ở giai đoạn làm quả
28
3.1.10
Sự tích lũy protein ở giai đoạn làm quả rộ
29
3.1.11
Sự tích lũy protein ở giai đoạn làm hạt
29
3.1.12
Sự tích lũy protein ở giai đoạn quả chắc
30
3.1.13
Sự tích lũy protein ở giai chín sinh lý
30
3.1.14
Sự tích lũy protein ở giai đoạn chín thu hoạch
31
3.1.15
Sự tích lũy protein ở tất cả các giai đoạn
37
3.2.1
Sự tích lũy lectin có hoạt độ riêng
37
3
DANH MỤC ĐỒ THỊ VÀ HÌNH VẼ
Trang
Số hiệu
Nội dung
3.1.1
Sự tích lũy protein ở lá qua các giai đoạn
33
3.1.2
Sự tích lũy protein ở thân qua các giai đoạn
33
3.1.3
Sự tích lũy protein ở rễ qua các giai đoạn
34
3.1.4
Sự tích lũy protein ở hoa qua các giai đoạn
34
3.1.5
Sự tích lũy protein ở quả qua các giai đoạn
35
3.1.6
Sự tích lũy protein ở hạt qua các giai đoạn
35
3.1.7
Mối tương quan trong sự tích lũy protein ở tất cả các
bộ phận và giai đoạn.
37
3.1.8
Sự tích lũy lectin
39
3.1.9
Phổ điện di protein
41
4
MỞ ĐẦU
Protein tham gia mọi hoạt động sống trong cơ thể sinh vật, từ việc tham gia
xây dựng tế bào, mô, đến tham gia hoạt động xúc tác và nhiều chức năng khác...
Ngày nay, khi hiểu rõ vai trò to lớn của protein đối với cơ thể sống, người ta càng
thấy rõ tính chất duy vật và ý nghĩa của định nghĩa thiên tài của Anghen F. : “sống
là phương thức tồn tại của những thể protein”. Với sự phát triển của khoa học, vai
trò và ý nghĩa của protein ngày càng được khẳng định, protein là cơ sở vật chất của
sự sống [17].
Với vai trò và tiềm năng ứng dụng to lớn, công nghệ protein trở thành một
hướng nghiên cứu quan trọng của công nghệ sinh học và đã đạt được những thành
tựu đáng chú ý ứng dụng vào các lĩnh vực khác nhau của cuộc sống như nông
nghiệp, công nghiệp thực phẩm, đặc biệt trong lĩnh vực y dược học với việc tạo ra
các loại thuốc quý hiếm như insulin, các globulin miễn dịch, các kháng thể đơn
dòng, các yếu tố đông máu, thuốc chống HIV.. [17].
Trong các thành tựu đạt được không thể không nhắc tới protein lectin. Lectin
là một trong những hợp chất được phát hiện cách đây hơn một thế kỷ và hiện nay
vẫn đang thu hút sự quan tâm nghiên cứu bởi hoạt tính và các chức năng đặc biệt
của nó. Bản chất của lectin là protein mà chủ yếu là glycoprotein, có khả năng gây
ngưng kết các tế bào hồng cầu người và động vật, một số tế bào lạ và đặc hiệu với
một số loại đường. Tuy không có nguồn gốc miễn dịch nhưng các nhà khoa học đã
chứng minh rằng chúng có vai trò trong miễn dịch của thực vật, có khả năng gây
ngưng kết với các tế bào dị thường và ác tính, vi khuẩn, virus và kháng nguyên lạ...
Hơn nữa, lectin là hợp chất phân bố rộng trong tự nhiên (có ở cả thực vật, động vật
và vi sinh vật), đặc biệt là ở các cây họ Đậu. Vì vậy, nguồn nguyên liệu để chiết
xuất lectin rất đa dạng và phong phú [31].
Việc điều tra, nghiên cứu để tạo các chế phẩm lectin có hoạt tính cao đang
được chú ý ở Việt Nam và nhiều nguồn lectin đang được nghiên cứu chủ yếu là ở
động thực vật. Đã có nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả như Đỗ Ngọc
Liên, Cao Đăng Nguyên, Nguyễn Quốc Khang và các cộng sự khác được công bố
trên các đối tượng khác nhau, làm cơ sở cho các ứng dụng thực tiễn của lectin trong
miễn dịch cũng như trong y học [2, 3, 6, 7, 19,20].
Lectin phân bố rộng, đặc biệt có nhiều trong các cây họ Đậu, chính vì vậy
mà các cây họ Đậu là đối tượng được tập trung vào nghiên cứu nhiều nhất. Đậu ngự
cũng là một đối tượng được quan tâm. Trong quá trình phát triển, ở các giai đoạn
khác nhau cũng như ở các điều kiện ngoại cảnh khác nhau, cây đậu sẽ có sự tích luỹ
protein cũng như lectin khác nhau. Hiện nay, chưa có công trình nào công bố một
cách đầy đủ về sự tích luỹ của protein và lectin ừong các giai đoạn phát triển của
5
cây. Vì vậy, để hiểu rõ hơn về protein và lectin của cây đậu ngự, chúng tôi đã tiến
hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sự tích luỹ protein và lectin trong các giai
đoạn sinh trưởng và phát triển của cây đậu ngự (Phaseolus lunatus L.) trồng
trên bãi bồi ven sông Thừa Thiên Huế”
6
PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I. SƠ LƯỢC VỀ PROTEIN
1. Những đặc trưng chung của protein
Protein được phát hiện làn đầu tiên ở thế kỷ XVIII (1745 bởi Beccari); mới
đầu được gọi là albumin (lòng trắng trứng). Mãi đến năm 1838, Mulder làn đầu tiên
đưa ra thuật ngữ protein (xuất phát từ chữ Hy lạp proteos nghĩa là “đầu tiên”, “quan
trọng nhất”. Biết được tầm quan trọng và nhu cầu xã hội về protein, đến nay nhiều
cồng trình nghiên cứu và sản xuất hợp chất này đã được công bố, đã đem lại nhiều ý
nghĩa hết sức to lớn phục vụ cho nhân loại. Vì vậy, nhiều nhà khoa học trên thế giới
đã vinh dự nhận được giải thưởng Nobel về các lĩnh vực nghiên cứu liên quan đến
protein [17].
Protein là hợp chất hữu cơ có ý nghĩa quan trọng bậc nhất trong cơ thể sống,
về mặt số lượng, nó chiếm không dưới 50% trọng lượng khô của tế bào, về thành
phần cấu trúc, protein được tạo thành chù yếu từ các amino acid qua liên kết peptide
Cho đến nay, người ta đã thu được nhiều loại protein ở dạng sạch cao có thể kết tinh
được và đã xác định được thành phần các nguyên tố hoá học, thông thường trong
cấu trúc của chúng gồm bốn nguyên tố chính là C, H, O, N với tỷ lệ C: 50%, H: 7%,
O: 23% và N: 16%. Đặc biệt tỷ lệ N trong protein khá ổn định. Nhờ tính chất này để
định lượng protein theo phương pháp Kjeldahl, người ta tính lượng N rồi nhân với
hệ số 6,25. Ngoài ra trong protein còn gặp một số nguyên tố khác như S: 0-3% và p,
Fe, Zn, Cu.[17].
Khối lượng phân tử, ký hiệu là Mr (được tính bằng Dalton) của các loại
protein thay đổi trong những giới hạn rất rộng, thông thường từ hàng trăm cho đến
hàng triệu. Ví dụ: insulin có khối lượng phân tử bằng 5.733 Dalton, glutamatdehydrogengenase trong gan bò có khối lượng phân tử bằng 1.000.000 Dalton
(Bảng l.l).
Bảng 1.1. Khối lượng và cấu trúc phân tử của một số protein.
Protein
Glucagon
Insulin
Ribonuclease (tụy bò)
Lysozyme (lòng trắng trứng)
Myoglobin (tim ngựa)
Khối lượng
Số gốc
Số chuỗi
(Dalton)
amino acid
polipeptide
29
51
124
129
153
1
2
1
1
1
3482
5733
12.64
13.93
16.89
7
Chymotripsin (tụy bò)
Hemoglobin (người)
Albumin (huyết thanh người)
Hexokinase (men bia)
Tryptophan-synthetase (E.coli)
-globulin (ngựa)
Glycogen-phosphorylase (cơ thỏ)
Glutamatedehydrogengenase (bò)
Synthetase của acid béo (men bia)
Virus khảm thuốc lá
22.6
64.5
68.5
96
117
149
495
1.000.000
2.300.000
40.000.000
241
574
550
800
975
l25
4.1
8.3
20
336.5
3
4
1
4
4
4
4
40
21
2.13
Protein có vai trò vô cùng quan trọng trong cơ thể của tất cả các sinh vật,
nhóm chất này tham gia vào mọi hoạt động sống của cơ thể, chúng có chức năng từ
việc tham gia xây dựng tế bào, mô đến tham gia hoạt động xúc tác, điều khiển các
quá trình trao đổi chất của cơ thể [ 17]
2.
Cấu trúc protein
Thành phần hoá học của protein
Tất cả các protein đều chứa các nguyên tố C, O, N, H, một số còn chứa
lượng nhỏ S. Tỷ lệ phần trăm khối lượng các nguyên tố này trong phân tử protein
như sau: C từ 50 đến 55%; o từ 21 đến 24%; N từ 15 đến 18%; H từ 6,5 đến 7,3%;
S từ 0 đến 0,24% [1].
2.1.
Ngoài các nguyên tố trên, một số protein còn chứa một lượng rất ít các
nguyên tố khác như P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca.
2.2. Đơn vị cấu tạo cơ sở của protein –Amino acid
Protein là polymer của các amino acid nối với nhau bằng các liên kết cộng
hóa trị là liên kết peptide. Protein có thể bị thủy phân tạo thành các amino acid tự do
bằng nhiều phương pháp khác nhau. Người ta đã xác định protein được cấu trúc từ
20 loại amino acid khác nhau [17].
Amino acid là chất hữu cơ mà phân tử chứa ít nhất một nhóm carboxyl
(COOH) và ít nhất một nhóm amin (NH2), trừ prolin chi có nhóm NH (thực chất là
một acid imin). Trong phân tử amino acid đều cổ các nhóm COOH và NH2 gắn với
carbon ở vị trí α. Hầu hết các amino acid thu nhận được khi thủy phân protein đều ở
dạng L- α amino acid. Như vậy, các protein chỉ khác nhau ở mạch nhánh, hay còn
gọi là chuỗi bên (thường được ký hiệu: R) [17].
8
2.3. Các bậc cấu trúc của phân tử protein
2.3.1. Cấu trúc bậc nhất (cấu trúc sơ cấp)
Cấu trúc bậc I là trình tự sắp xếp các gốc amino acid trong mạch polypeptide
cấu trúc này được giữ vũng nhờ liên kết peptide (liên kết cộng hóa trị [1,17].
Liên kết peptiđe (-CO-NH-) được tạo thành do phản ứng kết hợp giữa nhóm
α-carboxyl của một amino acid này với nhóm α-amin của một amino acid khác, loại
đi một phân tử nước [1]. Những protein đồng thể của những loài khác nhau có một
số gốc amino acid tương đối không đổi ở những vị trí đặc biệt và có những gốc
amino acid thay đổi, nghĩa là ở những loài khác nhau, các amino acid khác nhau có
thể thay thế cho nhau. Ví dụ: insulin của nhiều loài khác nhau có những amino acid
khác nhau ở vị trí 8, 9, 10. Cấu trúc bậc I là bản dịch của mã di truyền, việc xác
định cấu trúc bậc I là cơ sở để tổng hợp nhân tạo protein bằng phương pháp hóa học
hoặc bằng các biện pháp công nghệ sinh học [17].
2.3.2. Cẩu trúc bậc II (cấu trúc thứ cấp)
Cấu trúc bậc II là tượng tác không gian giữa các gốc amino acid ở gần nhau
trong mạch polypeptide. Nói cách khác, là dạng không gian cục bộ của từng phần
trong mạch polypeptide. Cấu trúc này được làm bền nhờ các liên kết hydro được tạo
thành giữa các liên kết peptide ở gần kề nhau, cách nhau những khoảng xác định
[1,17 ].
Theo Paulin và Cori (1951) cấu trúc bậc II của protein bao gồm hai kiểu
chính là xoắn α và phiến gấp β. Ngoài ra còn có kiểu xoắn collagen được tìm thấy
trong phân tử collagen [17]..
2.3.3. Cấu trúc bậc III
Cấu trúc bậc III là tương tác không gian giữa các gốc amino acid ở xa nhau
trong mạch polypeptide, là dạng cuộn lại trong không gian của toàn mạch
polypeptide (hình dạng chung của chuỗi polypeptide). Trong nhiều protein hình cầu
có chứa các gốc Cys, sự tạo thành các liên kết disulfur giữa các gốc Cys ở xa nhau
trong mạch polypeptide, làm cho mạch bị cuộn lại đáng kể. Các liên kết khác như
tương tác Van der Waals, liên kết tĩnh điện, liên kết hydro giữa các mạch bên của
các gốc amino acid. .. đều tham gia làm bền cấu trúc bậc III. Vì vậy khi phá vỡ các
liên kết này phân tử bị duỗi ra đồng thời làm thay đổi một số tính chất của nó, đặc
biệt là tính tan và hoạt tính xúc tác của nó. Kết quả nghiên cứu nhiều protein cho
thấy chính trình tự sắp xếp các gốc amino acid trong chuỗi polypeptide chứa những
thông tin cần thiết để hình thành cấu trúc bậc III [1].
9
2.3.4. Cấu trúc bậc IV
Đối với các phân tử protein bao gồm hai hay nhiều chuỗi polypeptide hình
cầu, tương tác không gian (sự xắp xếp) giữa các chuỗi này trong phân tử gọi là cấu
trúc bậc IV. Mỗi chuỗi polypeptide này gọi là “phần dưới đơn vị” (subunit).
Chúng gắn với nhau nhờ các liên kết hydro, tương tác Van der Waals giữa các
nhóm phân bố trên bề mặt của các phần dưới đơn vị [ 1 ].
Phân tử protein có cấu trúc bậc IV có thể phân ly thuận nghịch thành các
phần dưới đơn vị. Khi phân ly, hoạt tính sinh học của nó bị thay đổi hoặc có thể mất
hoàn toàn [1].
Phân loại protein
Protein gồm hàng trăm, hàng ngàn amino acid nối với nhau bằng liên kết
peptide tạo nên một hay nhiều chuỗi polypeptide có cấu trúc rất phức tạp. Căn cứ sự
có mặt hay vắng mặt của một số thành phần có bản chất không phải protein mà
người ta chia protein thành hai nhóm lớn [17]:
3.
Protein đơn giản
Protein đơn giản là những phân tử mà thành phần cấu tạo của nó gồm hoàn
toàn amino acid. Ví dụ, một số enzyme của tụy bò như ribonuclease gồm hoàn toàn
amino acid nối với nhau thành một chuỗi polypeptide duy nhất (có 124 gốc amino
acid, khối lượng phân tử 12.640 Dalton), chymotripsin gồm toàn amino acid nối với
nhau thành chuỗi polypeptide (có 241 gốc amino acid, khối lượng phân tử 2.600
Dalton)... Dựa theo khả năng hoà tan trong nước hoặc trong dung dịch đệm muối,
kiềm hoặc dung môi hữu cơ người ta có thể chia các protein đơn giản ra một số
nhóm nhỏ như:
3.1.
Albumin: tan trong nước, bị kết tủa ở nồng độ muối (NH4)2SO4 khá cao (70100%).
Globulin: không tan hoặc tan ít trong nước, tan trong dung dịch muối loãng
của một số muối trungtính như NaCl, KCl, Na2 SO4..., và bị kết tủa ở nồng độ muối
(NH4)2SO4 bán bão hoà.
Prolamin: không tan trong nước hoặc dung dịch muối loãng, tan trong
ethanol, isopanol 70-80%.
-
Glutein: chỉ tan trong dung dịch kiềm hoặc acid loãng.
Histon: là protein có tính kiềm dễ tan trong nước, không tan trong dung dịch
amoniac loãng.
10
3.2. Protein phức tạp
Protein phức tạp là những protein mà thành phần phân tử của nó ngoài các αamino acid như protein đơn giản còn có thêm thành phần khác có bản chất không
phải là protein còn gọi là nhóm thêm (nhóm ngoại). Tuỳ thuộc vào bản chất của
nhóm ngoại, người ta chia các protein phức tạp ra các nhóm nhỏ và thương gọi tên
các protein đó theo bản chất nhóm ngoại:
-
Lipoprotein: nhóm ngoại là lipid.
-
Nucleoprotein: nhóm ngoại là acid nucleic.
-
Glycoprotein: nhóm ngoại là carbohydrate và dẫn xuất của nó.
-
Phosphoprotein: nhóm ngoại là acid phosphoric
Cromoprotein: nhóm ngoại là hợp chất có màu. Tuỳ theo tính chất của từng
nhóm ngoại mà có những màu sắc khác nhau như đỏ (ở hemoglobin), vàng (ở
flavoprotein)... [17].
4.
Chức năng sinh học của protein
Trong cơ thể, protein đảm nhận nhiều chức năng khác nhau như:
4.1.
Xúc tác
Các protein có chức năng xúc tác cho phản ứng gọi là enzyme. Hầu hết cảc
phản ứng trong cơ thể sống đều do enzyme xúc tác, từ các phản ứng đơn giản như
hydrate hoá CO2 cho đến các phản ứng phức tạp như sao chép di truyền... [1].
Vận tải
Một số protein cỏ vai trò như những xe tài vận chuyển chất trong cơ thể, ví
dụ như hemoglobin, mioglobin (ở động vật có xương sống), hemoxianin (ở động
vật không xương sống) kết hợp với O2 và vận chuyển chúng đi khắp cơ thể [1].
4.2.
Chuyển động
Nhiều protein tham gia trực tiếp trong quá trình chuyển động như: cò cơ,
chuyển vị trí của nhiễm sắc thể trong phân bào, di động tinh trùng.. .[1].
4.3.
Bảo vệ
Các kháng thể trong máu động vật có xương sống là những protein đặc biệt
cỏ khả năng nhận biết và bắt những chất lạ xâm nhập cơ thể như protein lạ, virus, vi
khuẩn [1]
4.4.
Các inteferon là các protein do tế bào động vật có xương sống tổng hợp và
tiết ra để chống lại sự nhiễm virus.
11
Các protein tham gia vào quá trình đông máu có vai trò bảo vệ cơ thể sống
khỏi bị mất máu.
Ở một số thực vật có chứa các protein có tác đụng độc với động vật ngay cả
ở liều lượng thấp. Chúng có tác dụng bảo vệ thực vật khỏi sự phá hoại của động vật.
Truyền xung thần kinh
Một số protein có vai trò làm trung gian cho phản ứng trả lời của tế bào thần
kinh đối với các kích thích đặc hiệu, ví dụ như vai trò của sắc tố thị giác rodopxin ở
màng lưới mắt [1].
4.5.
Điều hoà
Một số protein có chức năng điều hoà quá trình truyền thông tin di truyền,
điều hoà quá trình trao đổi chất [1].
4.6.
Các protein điều hòa quá trình biểu hiện gen như các repressor protein ở vi
khuẩn có thể làm ngừng sự tổng hợp của enzyme của các gen tương ứng.
Các protein có hoạt tính hoormo, các protein ức chế đặc hiệu enzyme đều có
chức năng điều hoà quá trình trao đổi chất khác nhau.
Kiến tạo và chống đỡ cơ học
Các protein này thường có dạng sợi như sclerotin có trong lớp vỏ ngoài của
sâu bọ; fibroin của tơ tằm, tơ nhện; colagen, elastin của mô liên kết, mô xương...
[1].
4.7.
Dự trữ dinh dưỡng
Protein còn là chất dinh dưỡng quan trọng cung cấp các amino acid cho phôi
phát triển. Ví dụ, ovalbumin của lòng trắng trứng, gliadin của hạt lúa mì, zein của
ngô... các protein dự trữ khác như casein của sữa feritine của lá lách [l].
4.8.
II. VÀI NÉT VỀ LECTIN
Sơ lược lịch sử nghiên cứu lectin
Thuật ngữ hemagglutinin hay còn gọi là phytoagglutinin (agglutinin thực
vật) xuất hiện cuối thế kỷ 19 đã được dùng để chi những protein có khả năng gây
ngưng kết hồng cầu người và động vật, chủ yếu được tìm thấy ở các mẫu chiết từ
thực vật [31].
1.
Năm 1888, trong luận án tiến sĩ của mình ở đại học Dorpat, Peter Herman
Stillmark đã tách chiết được một hemagglutinin từ hạt của cây thầu dầu Ricinus
communis mà ông gọi là ricin. Đây được coi là phát hiện đầu tiên về lectin và đặt
nền móng cho các nghiên cứu về lectin sau này [31]. Ricin là một hemagglutinin có
12
độc tính cao đối với các tế bào eukaryote và được xếp vào họ protein bất hoạt
ribosom-RIP nhóm 2 (Xia et al.,2003; Hoiseth et al.,2005). Sau đó, Stillmark tiếp
tục tìm thấy một hợp chất có tính chất tương tự ricin được chiết từ hạt đay Croton
tiglium và được gọi là crotin [31].
Vào năm 1891, H. Hellin tìm thấy một hemagglutinin độc ở cây đậu Abrus
precatorius, gọi là abrin. Sự phát hiện ra ricin, crotin, abrin đã thu hút sự chú ý của
nhiều nhà khoa học. Đáng chú ý là nghiên cứu của Paul Erlich ở Royal Institute of
Experieinental Therapy (Frankfìưt), ông đã sử dụng chúng làm kháng nguyên mô
hình cho các nghiên cứu miễn dịch, từ đó ông xây dựng một số nguyên lý cơ bản về
miễn dịch học vào những năm 1890 [31].
Cùng với các hemagglutinin thực vật, các hemagglutinin động vật cũng dần
được khám phá. Những công trình nghiên cứu lectin động vật đầu tiên chủ yếu
trong ngành động vật không xương sống. Năm 1898, Edfstand cho rằng các tế bào
mô của một số loài động vật không xương sống có chứa các chất có hoạt tính tương
tự như ricin, gây ngưng kết hồng cầu cúa một số loài động vật như lợn, bò [28].
Nouguchi phát hiện chất gây ngưng kết ở sam (Limulus polyphenus) (1903) và tôm
hùm (Homarus amricanus) (1907) [30].
Các nhà khoa học đã kết luận rằng ricin có bản chất là protein từ các công bố
của Lansteiner và Raubischeck vào năm 1903 về các tính chất làm ngumg kết hồng
cầu người và động vật như tan được trong nước, bị kết tủa bởi acetol, alcol bằng các
phản ứng biure, phản ứng xantoprotein và các amino acid vòng [33]
Năm 1926, James B. Summer (Ithaca, New York) là người đầu tiên tinh sạch
một loại protein từ đậu rựa (Canavalia ensiformis) có tên gọi là concanavalin A
(ConA) [31].
Những năm 1940, với các công trình nghiên cứu độc lập của hai nhà khoa
học William C. Boyd tại trường đại học Boston và Karl O.Rankonen tại trường đại
học Helsinki (Phần Lan) đã khám phá, chứng minh tính đặc hiệu nhóm máu người
của hemaglutinin. Họ phát hiện dịch chiết thô của đậu ngự (Phaseolus limensis) và
đậu tằm (Vicia craccci) ngưng kểt đặc hiệu hồng cầu nhóm máu A, trong khi đó
dịch chiết thô của đậu Lotus tetragonolobus làm ngưng kết đặc hiệu hồng cầu nhóm
máu O [31].
Trong những năm 1950, Walter JT Morgan và Winifred M. Watkins ở Viện
Lister (London) đã phát hiện ra rằng sự ngưng kết hồng cầu nhóm máu A do đậu
ngự (.Phaseolus limensis) bị ức chế mạnh nhất bởi
-N-acetyl-D-galactosamin
và sự ngưng kết hồng cầu nhóm máu O do đậu Lotus tetragonolobus bị ức chế mạnh
nhất bởi α-L-fucose. Họ kết luận ràng α-N-acetyl-D-galactosamin và α-L-fucose là
13
những yếu tố quyết định tính đặc hiệu nhóm máu A, O tương ứng [31]. Đây là một
trong những bằng chứng đầu tiên về tính đặc hiệu đường của các hemagglutinin.
Dựa vào khả năng ngưng kết đặc hiệu hồng cầu các nhóm máu khác nhau
của các agglutinin thực vật, Boyd và Shapleigh (1954) gọi chúng là lectin, theo
tiếng Latin là legere, nghĩa là chọn ra [31]. Mặc dù sau này, các nhà khoa học cho
rằng số lượng các lectin có khả năng ngưng kết các tế bào hồng cầu đặc hiệu nhóm
máu là rất ít, chiếm khoảng 25% tổng số các lectin đã tìm thấy [33].
Vào năm 1960, Peter C. Nowell tại đại học Pennsylvania ở Philadenphia,
người đầu tiên phát hiện ra lectin đậu đỏ (Pheolus vulgaris) cỏ khả năng kích thích
tế bào lympho nguyên phân. Từ đó, lectin kích thích phân bào được sử dụng làm
công cụ nghiên cứu quá trình truyền tín hiệu vào tế bào và phân tích các phản ứng
hóa sinh xảy ra trong quá trình kích thích bạch cầu trong điều kiện invitro. Vào các
năm 1963 và 1965, Joseph C. Aub đã phát hiện agglutinin mầm lúa mì (WGA) có
khả năng ngưng kết mạnh các tế bào ác tính tại bệnh viện Masachusetts ở Boston.
Phát hiện này đã cung cấp những bằng chứng đầu tiên cho thấy sự thay đồi của các
phân tử đường trên bề mặt tế bào liên quan đến sự phát triển của bệnh ung thư và nó
dẫn đến giả thuyết là tất cả các tế bào ung thư đều có chung tính chất bị gắn kết đặc
hiệu với lectin. Tuy nhiên, hiện nay giả thuyết này đã bị bác bỏ [31].
Cho đến đầu những năm 1970, sự hiện diện của hemaglutin đã được tìm thấy
trong nhiều sinh vật, chủ yếu là ở thực vật nhưng rất ít trong số chúng được tinh
sạch và chủ yếu bằng các kỹ thuật cổ điển. Một số lectin được tinh sạch vào thời
điểm này gồm Con A, lectin đậu tương, đậu xanh, mầm lúa mi, nấm Agarỉcus
campestris (Sharon và Lis, 1972). Cùng thời điểm này lectin động vật cũng đã được
phát hiện như lectin của lươn (Springer và Desai , 1971), ốc (Hammarstrốm và
Kabat, 1969), và cua móng ngựa (Marchalonis và Edelman, 1968) [31]. Cũng trong
thời gian này, cấu trúc phân tử của lectin đã bắt đầu được nghiên cứu. Lectin đầu
tiên được giải trình tự là Con A (Edlman và cộng sự, 1972). Cũng trong năm 1972,
Edman và cộng sự nghiên cứu độc lập với Karl Hardman và Clinton F.Ainsworth
cùng tìm ra được cấu trúc 3D của Con A bằng phương pháp chụp ảnh tia X [31].
Bắt đầu từ cuối những năm 1980, một lượng thông tin đáng kể về lectin đã
được nghiên cứu bằng cách sử dụng phương pháp chụp ảnh tinh thể tia X và các đột
biến điểm. Năm 1988, Kurt Drikamer ở đại học Columbia (New York) dựa trên sự
phân tích chuỗi amino acid của lectin động vật đã xác định được vùng nhận diện
carbohydrate của lectin và đặt tên là CDR [31].
Kể từ lúc phát hiện đến nay, số lượng của các lectin đã biết về tính chất và
cấu trúc còn rất khiêm tốn . Vì vậy, lectin vẫn là lĩnh vực được nhiều nhà khoa học
quan tâm đến, và hứa hẹn sẽ có nhiều đóng góp vào đời sống.
14
2.
Tình hình nghiên cứu lectin trên thế giới và ở Việt nam
2.1. Tình hình nghiên cứu lectin trên thế giới
Kể từ khi phát hiện cho đến đầu thế kỷ XX, các nghiên cứu lectin chỉ mang
tính điều tra cơ bản và tiến hành một cách rời rạc ở các đối tượng khác nhau, hầu
hết chỉ ở thực vật. Mãi đến đầu những năm 1960 với hai khám phá lớn của Peter C.
Nowell (1960) về khả năng kích thích phân bào của lectin đậu đỏ (Phaseolus
vulgaris) và Joseph C. Aub phát hiện lectin mầm lúa mì (WGA) có khả năng ngưng
kết mạnh các tế bào ác tính (Aub và cộng sự, 1963,1965), lectin mới bắt đầu thu hút
sự chú ý của các nhà khoa học như Sumner và Howell (1936), William C. Boýd và
Karl O. Renkonen (1940), Walterr J. T.Morgan và Winifred M. Watkins [31].
Cho đến đầu những năm 1970, việc nghiên cứu lectin vẫn chỉ tập trung chủ
yếu ở thực vật, một số ở động vật và vi sinh vật được phát hiện và cổ rất ít lectin
được tinh sạch gồm có: Con A, lectin hạt đậu tương, hạt đậu xanh, mầm lúa mì,
nấm Agaricus campestris, lươn (springer và desai 1971), lectin ốc (Hammarstrổm
và Kabat, 1969), và cua móng ngựa (Marchalonis và Edelman, 1968) [31]. Số lượng
letin được tinh sạch tăng lên đáng kể từ khi Agrawal và Golstein sử dụng sắc ký ái
lực để tinh sạch Concavalin A vào năm 1965. Cho đến nay, sắc ký ái lực vẫn là
phương pháp hiệu quả được sử dụng trong các phòng thí nghiệm để tách chiết và
tinh sạch lectin [37].
Lectin động vật cũng được ghi nhận khá sớm, nhưng cho đến giữa những
năm 1970 chỉ có lectin của lươn, ốc, cua móng ngựa được phân lập và mô tả. Năm
1974, Gilbert Ashwell và Anatol G. Morell là những người đầu tiên phân lập được
lectin động vật có vú. Kể từ đầu những năm 1980, nhờ vào sự ra đời của kỹ thuật tái
tổ hợp một số lượng lớn các lectin động vật đã được tinh sạch và nghiên cứu [31].
Việc xác định trình tự amino acid và cấu trúc không gian của các lectin được
thực hiện từ những năm 1970, nhưng với tốc độ khá chậm. Nhưng kể từ những năm
1980 với các kỹ thuật hiện đại như kỹ thuật tái tổ hợp, chụp ảnh tinh thể tia X, sử
dụng đột biến điểm thì đến nay đã có hơn 200 lectin được giải trình tự và mô tả cấu
trúc bậc 3 [31].
Hiện nay, với sự trợ giúp của khoa học kỹ thuật, các nhà khoa học đang tập
trung nghiên cứu các tính chất của lectin để ứng dụng vào đời sống. Theo các nhà
khoa học Pháp, lectin từ hạt mít mật (Artọcarpus heterophyỉlus) có khả năng tương
tác đặc hiệu với virus HIV ở pha đầu tiên của sự nhiễm bệnh suy giảm miễn dịch
AIDS, do đó quá trình nhiễm virus HIV có thể bị kìm hãm và hạn chế khả năng mắc
bệnh (Favero et al, 1993; Corbeau et al, 1994). Lectin ở lá hành được các nhà khoa
học Ẩn Độ chứng minh là có khả năng chống được rầy aphid, côn trùng gây hại ở
thực vật [29]. Theo Hao C. Z. Và cộng sự, lectin từ nấm Agrocybe aegerita cỏ khả
15
năng ức chế sự phát triển các tế bào khối u ở người [32]. Áp dụng kỹ thuật chuyển
gen, các nhà khoa học đã tiến hành chuyển gen lectin vào một số cây làm thực
phẩm giúp phòng ngừa sâu bệnh như ở khoai tây (Nick Birch, 2002). Một số nhà
khoa học sử dụng lectin trong chẩn đoán ung thư gọi là phương pháp “lectin
microarray” [39].
2.2. Tình hình nghiên cứu lectin ở Việt Nam
Việc nghiên cứu lectin ở Việt Nam đã được triển khai có quy mô bắt đầu từ
sự hợp tác quốc tế về khoa học giữa các trường Đại học Tổng hợp Paris 7 (Cộng
hoà Pháp) với trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội (ĐHQG HN). Quá trình
nghiên cứu lectin của các nhà khoa học Việt Nam bước đầu đã có những kết quả rất
khả quan, nghiên cứu theo ba hướng chính:
Hướng thứ nhất là điều tra sự phân bố lectin trong các loài thực vật và động
vật ở Việt Nam.
Ở thực vật, các nhà khoa học đã cho thấy sự phong phú của các loài cỏ chứa
lectin, đặc biệt là các cây họ Đậu (Fabaceae). Theo tác giả Nguyễn Thị Thịnh và
cộng sự có đến 90% loài cây họ Đậu có chứa lectin, trong đó hai loài đậu lục lạc lá
tròn (Crotalaris striata DC.) và đậu dải đỏ (Vigna unguỉculata) đặc hiệu với nhóm
máu A của người, nhưng lại chưa phát hiện được giống đậu đặc hiệu với nhóm máu
B của người [25].
Ở động vật, Nguyễn Diệu Thuý và Cao Phương Dung đã công bố có khoảng
31% loài nhuyễn thể Việt Nam cũng có hoạt tính lectin [26]. Riêng vùng biển Thừa
Thiên Huế, tác giả Cao Đăng Nguyên và Nguyễn Quốc Khang, 1998 đã công bố
75% loài nhuyễn thể chứa lectin, tuy nhiên các tác giả cũng chưa phát hiện được
một loài lectin nào đặc hiệu nhóm máu một cách tuyệt đối [19].
Với các kết quả này có thể khẳng định rằng lectin khá phổ biến trong các loài
động thực vật ở nước ta.
Hướng nghiên cứu thứ hai là tách chiết, tinh sạch và nghiên cứu cấu trúc
phân tử và đặc tính của các lectin từ các loài thực vật và động vật ở Việt Nam.
Với hướng nghiên cứu này nổi bật có các công trình nghiên cứu của tác giả
Đỗ Ngọc Liên vào những năm đầu của thập niên 90 về lectin ở hạt chay, nụ hoa
hòe, các ỉoàỉ mít, các ỉoài đậu và lectỉn trong máu sam biển [7,8,10,12,13,14].
Tiếp theo, Nguyễn Quốc khang đã tinh sạch và nghiên cứu tính chất của
lectin sam biển, hạt mướp đắng, nhị hoa sen và hoa cây thiên lý [2,3,4], sau đó cùng
với Cao Đăng Nguyên và cộng sự đã nghiên cứu tách chiết lectin động vật như loài
trìa mỡ (Meretrix Meretrix Linne), cá nheo (Parasilurus asotus), cá chình hoa và cá
chình Nhật (Anguilia bengalesnis, Anguila mamorata) [5,19,22].
16
- Xem thêm -