GVHD: Ths. Trương Kim Phượng
ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo thống kê của Tổ Chức Y Tế Thế Giới (WHO), trên thế giới có khoảng
14,1 triệu trường hợp ung thư mới và 8,2 triệu trường hợp tử vong xảy ra trong
năm 2012, so với 12,7 triệu trường hợp mới mắc bệnh và 7,6 triệu trường hợp tử
vong trong năm 2008. Ước tính cho thấy, năm 2012, có 32,6 triệu người (trên độ
tuổi 15 năm) còn sống, mà đã được chẩn đoán mắc ung thư trong năm năm trước
đó. Ung thư vú và ung thư cổ tử cung là hai loại ung thư thường gặp và gây tử
vong cao ở phụ nữ [64].
Gen APC là gen ức chế khối u đa chức năng nằm tại vị trí 5q21-q22 trên nhiễm
sắc thể số 5 của bộ gen người. Gen APC bao gồm 15 exon nằm trong một locus
98-kilobase [83]. Sự methyl hóa xảy ra tại các đảo CpG xung quanh vùng promoter
gen APC, dẫn đến ức chế sự biểu hiện của gen, là nguyên nhân dẫn tới ung thư [30].
Sự methyl hóa DNA là sự biến đổi phân tử gắn nhóm -CH3 vào vị trí Cytosin trong
các đảo CpG của trình tự DNA. Nhiều báo cáo khoa học trên thế giới cho thấy sự
methyl hóa vùng promoter của gen APC (Adenomatous polyposis coli gene) là dấu
chứng sinh học tiềm năng trong việc tiên lượng và chẩn đoán bệnh ung thư [37] [55]
[30]
.
Trên thế giới, việc nghiên cứu đánh giá tần số methyl hóa của gen APC được
thực hiện ở nhiều loại ung thư như: ung thư đại trực tràng
[53][89]
[29][51]
, ung thư phổi
, ung thư vú [9][55][86][89], ung thư bàng quang [31], ung thư cổ tử cung [21]....Tuy
nhiên, dữ liệu về sự methyl hóa vùng promoter gen APC đối với bệnh ung thư ở
Việt Nam chưa được công bố nhiều. Do vậy, chúng tôi thực hiện chuyên đề khóa
luận tốt nghiệp: " ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ METHYL HÓA TẠI CÁC ĐẢO CpG
THUỘC VÙNG PROMOTER GEN APC TRÊN CÁC BỆNH UNG THƢ" với
mục tiêu hướng đến tìm dấu chứng sinh học tiềm năng trong tiên lượng, chẩn đoán
bệnh ung thư nói chung và ung thư vú, ung thư cổ tử cung nói riêng. Nội dung
nghiên cứu bao gồm:
Khảo sát in silico
Báo cáo KLTN- Phạm Thị Thương
Trang 1
GVHD: Ths. Trương Kim Phượng
- Thu thập thông tin về đặc điểm, cấu trúc của gen APC và mối tương quan về
sự methyl hóa trên gen APC với các bệnh ung thư, đặc biệt là ung thư vú và ung
thư cổ tử cung.
- Thiết kế bộ mồi đặc hiệu cho phản ứng MSP khuếch đại vùng gen cần khảo
sát.
- Khảo sát, đánh giá thông số vật lý, tính đặc hiệu của bộ mồi (Cặp mồi methyl
APC-MF, APC-MR và cặp mồi unmethyl APC-UF, APC-UR) trên trình tự đảo
CpG thuộc vùng promoter gen APC.
Khảo sát thực nghiệm
- Khảo sát độ đặc hiệu, nhiệt độ lai tối ưu cho cặp mồi methyl và unmethyl.
- Thực hiện quy trình phản ứng MSP để đánh giá mức độ methyl hóa vùng
promoter gen APC với các mẫu sinh thiết mô vú từ những bệnh nhân mắc ung thư
vú (kèm theo thông tin mẫu và các chỉ tiêu lâm sàng) và các mẫu mô vú lành tính,
được cung cấp từ bệnh viện Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh; mẫu máu hoặc
dịch phết tế bào âm đạo được xác định nhiễm HPV kiểu gen nguy cơ cao và nguy
cơ thấp, mẫu máu hoặc dịch phết tế bào âm đạo lành tính (kèm theo các chỉ tiêu
lâm sàng) được công ty cổ phần công nghệ Việt Á cung cấp.
Báo cáo KLTN- Phạm Thị Thương
Trang 2
GVHD: Ths. Trương Kim Phượng
Phần I:
TỔNG QUAN
Báo cáo KLTN- Phạm Thị Thương
Trang 3
GVHD: Ths. Trương Kim Phượng
I.1. Ung thư
I.1.1. Định nghĩa ung thư
Ung thư là thuật ngữ mô tả một nhóm các bệnh lý ác tính của tế bào mà khi bị
kích thích bởi các tác nhân sinh ung thư, tế bào tăng sinh vô hạn, không tuân theo
các cơ chế kiểm soát về phát triển của cơ thể, xâm lấn cục bộ (xâm lấn các mô ở gần)
hay di căn qua hệ thống bạch huyết hay mạch máu. Quá trình di căn là nguyên nhân
gây tử vong chính của ung thư (WHO) [92].
Đa số các loại ung thư đều hình thành các khối u ác tính và khối u lành tính. U
lành tính chỉ phát triển tại chỗ và thường phát triển rất chậm, không xâm lấn, không
di căn, khi được phẫu thuật cắt bỏ, khối u sẽ không tái phát. U ác tính thường phát
triển nhanh, u thường không có ranh giới rõ, xâm lấn ra xung quanh và thường di
căn xa theo đường máu và hạch bạch huyết [106].
I.1.2. Phân loại ung thư
Ung thư có thể được phân loại dựa theo tính chất giải phẫu bệnh hoặc theo cơ
quan bị tổn thương. Các tế bào ung thư trong một khối u (bao gồm cả tế bào đã di
căn) đều xuất phát từ một tế bào duy nhất phân chia mà thành. Do đó một bệnh
ung thư có thể được phân loại theo loại tế bào khởi phát và theo vị trí của tế bào
đó. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, người ta không xác định được khối u
nguyên phát [97]. Ung thư xuất phát từ tế bào gốc đa năng, thường hiện diện ở tinh
hoàn hoặc buồng trứng [100][102].
Ung thư biểu mô (carcinoma)
Ung thư biểu mô dùng để chỉ một khối u ác tính có nguồn gốc từ tế bào biểu
mô và niêm mạc bên trong hoặc bên ngoài của cơ thể như ống tiêu hóa hay các
tuyến tiêu hoá. Ung thư biểu mô, chiếm 80-90% của tất cả các trường hợp ung thư.
Ung thư biểu mô ảnh hưởng đến các cơ quan hoặc các tuyến có khả năng bài tiết,
như tuyến vú sản xuất sữa, phổi tiết chất nhầy, đại tràng, tuyến tiền liệt hoặc bàng
quang.
Bệnh lý huyết học ác tính (hematological malignancy) như bệnh bạch cầu
Báo cáo KLTN- Phạm Thị Thương
Trang 4
GVHD: Ths. Trương Kim Phượng
(leukemia) và u lympho bào (lymphoma), xuất phát từ máu và tủy xương.
Bệnh bạch cầu thường liên quan đến việc sản xuất quá mức các tế bào bạch cầu
chưa trưởng thành, các tế bào này không đầy đủ các chức năng miễn dịch, do đó
bệnh nhân thường dễ bị nhiễm trùng. Bệnh bạch cầu cũng ảnh hưởng đến các tế
bào hồng cầu, có thể gây đông máu và mệt mỏi do thiếu máu.
U lympho có xu hướng phát triển trong hệ bạch huyết (lá lách, amidan, và
tuyến ức).
Ung thư mô liên kết (sarcoma) là nhóm ung thư xuất phát từ mô liên kết,
xương hay cơ, gân, sụn, và chất béo.
U hắc tố do rối loạn của tế bào sắc tố.
U quái bắt nguồn từ các tế bào mầm.
I.1.3. Bệnh ung thư vú
Ung thư vú là nguyên nhân gây tử vong phổ biến nhất trong các bệnh ung thư ở
phụ nữ. Bệnh ung thư vú liên quan đến sự phát triển bất thường của các tế bào có
nguồn gốc từ các mô vú
[49]
. Ung thư vú không chỉ xảy ra ở phụ nữ mà còn ở cả
nam giới, tỉ lệ mắc bệnh ở nam giới chiếm khoảng 1% của tất cả các trường hợp
ung thư vú [91].
Các yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư vú:
Các yếu tố nguy cơ chính đối với bệnh ung thư vú là giới tính nữ và người lớn
tuổi. Yếu tố nguy cơ khác bao gồm: Tiền sử gia đình, nội tiết tố, lối sống và chế độ
ăn uống thiếu khoa học, môi trường sống bị ô nhiễm...
Tuổi và giới tính
Nguy cơ phát triển ung thư vú tăng theo tuổi tác. Hầu hết các trường hợp ung
thư vú tiến triển được tìm thấy ở phụ nữ trên 50 tuổi. Phụ nữ có nguy cơ bị ung
thư vú cao hơn 100 lần so với đàn ông [68].
Tiền sử gia đình
Nếu một vài thành viên của gia đình bệnh nhân đã bị ung thư (ung thư vú, ung
thư tử cung, ung thư buồng trứng, hoặc ung thư ruột kết...) bệnh nhân có thể có
nguy cơ phát triển ung thư vú
[44]
. Một số người có những đột biến di truyền dẫn
Báo cáo KLTN- Phạm Thị Thương
Trang 5
GVHD: Ths. Trương Kim Phượng
đến nhiều khả năng phát triển ung thư vú, phổ biến nhất được tìm thấy trong các
gen BRCA1, BRCA2 và một số gen khác ít phổ biến như p53, CHEK2, ATM, BRIP,
PALB2, PTEN, và STK11 [17].
Nội tiết tố
Thay đổi mức độ hormon như estrogen, progesterone trong cơ thể có thể kích
thích phát triển ung thư vú. Nội tiết tố bị ảnh hưởng trong giai đoạn bắt đầu và kết
thúc của chu kỳ kinh nguyệt, mang thai sớm, liệu pháp thay thế hormon, sử dụng
thuốc uống [68].
Lối sống và chế độ ăn uống
Cơ thể ít được vận động, chế độ ăn uống nhiều chất béo ở bệnh nhân béo phì
và đặc biệt là ở phụ nữ mãn kinh có thể gây ra ung thư vú. Sử dụng rượu, đồ uống
có cồn, hút thuốc cũng là yếu tố nguy cơ gây ra ung thư vú [25][58].
Yếu tố môi trường
Yếu tố môi trường có thể làm tăng nguy cơ ung thư ở người như tiếp xúc với
hóa chất, tia bức xạ... [25][58].
I.1.4. Ung thư cổ tử cung:
Ung thư cổ tử cung là ung thư đứng thứ hai trong số các loại ung thư thường
gặp ở phụ nữ trên toàn thế giới và là nguyên nhân chính gây tử vong do ung thư ở
phụ nữ thuộc các nước đang phát triển.
Các yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư cổ tử cung:
Hầu như tất cả các trường hợp ung thư cổ tử cung đều có liên quan đến HPV
(Human Papiloma Virus), một loại vi rút có DNA đặc thù theo mô, dễ lây lan và
lây lan rộng rãi. HPV là vi rút dễ lây nhiễm qua đường tình dục nhất. Không có
thuốc điều trị đặc hiệu cho nhiễm HPV [81].
HPV là một tổ hợp các chủng vi rút khác nhau [62]. Trên thế giới đã biết tới hơn
100 chủng HPV. Vi rút HPV được chia làm 2 nhóm: nhóm nguy cơ cao và nhóm
nguy cơ thấp (về tính gây ung thư). Các nhóm nguy cơ cao gây ra hầu hết các bệnh
ung thư vùng hậu môn - sinh dục, trong khi các nhóm nguy cơ thấp có thể gây sùi
mào gà sinh dục, tế bào cổ tử cung bất thường, bệnh u nhú đường hô hấp tái phát,
Báo cáo KLTN- Phạm Thị Thương
Trang 6
GVHD: Ths. Trương Kim Phượng
hoặc phổ biến nhất là các viêm nhiễm không có triệu chứng và không phát hiện
qua thăm khám lâm sàng [80]. Hầu hết các trường hợp ung thư cổ tử cung đều phát
hiện có nhiễm HPV nguy cơ cao; trái lại nhóm HPV nguy cơ thấp thì hiếm khi
gặp[1].
Có ít nhất 13 kiểu gen HPV có nguy cơ cao. Hai kiểu gen HPV có nguy cơ cao
liên quan tới khoảng 70% tất cả các trường hợp ung thư cổ tử cung là HPV-16 và
HPV-18. Bên cạnh đó, HPV-45 và HPV-31 cũng có liên quan đến ung thư cổ tử
cung, chiếm khoảng 4% số ca mỗi kiểu gen [23][78].
Hầu hết các viêm nhiễm ở cổ tử cung đều tự biến mất mà không để lại triệu
chứng, nhưng viêm nhiễm kéo dài với các kiểu gen HPV có nguy cơ cao có thể
gây nên các tổn thương trong biểu mô cổ tử cung. Trong số các phụ nữ nhiễm các
loại HPV nguy cơ cao, khoảng từ 5-10% sẽ chuyển thành viêm nhiễm HPV kéo
dài, dấn đến tăng nguy cơ xuất hiện các tổn thương tiền ung thư ở cổ tử cung. Nếu
không được điều trị, các tổn thương tiền ung thư này sẽ tiến triển thành ung thư cổ
tử cung xâm lấn [78][79].
I.1.5.Các phương pháp chẩn đoán ung thư.
I.1.5.1. Các phương pháp chẩn đoán ung thư vú.
Theo tổ chức y thế thế giới (WHO), chẩn đoán sớm là chiến lược để điều trị
thành công ung thư vú, đặc biệt là ở các nước có thu nhập thấp và trung bình, nơi
bệnh ung thư vú thường chỉ được chẩn đoán ở giai đoạn cuối [104].
Kiểm tra hình ảnh
Chụp nhũ ảnh
Chụp nhũ ảnh được sử dụng khi bệnh nhân đang trải qua những dấu hiệu thay
đổi ở tuyến vú như xuất hiện dịch tiết núm vú hoặc một khối u mới.
Siêu âm
Siêu âm sử dụng sóng âm thanh tần số cao để quan sát hình ảnh của các mô vú.
Siêu âm có thể phân biệt giữa một khối rắn, có thể là ung thư, và một u nang chứa
đầy dịch, mà thường là không ung thư.
Báo cáo KLTN- Phạm Thị Thương
Trang 7
GVHD: Ths. Trương Kim Phượng
Chụp cộng hưởng từ MRI
MRI sử dụng từ trường để quan hình ảnh chi tiết và cho phép phân biệt mức độ
tổn thương của các mô trong cơ thể. MRI cũng có thể được sử dụng để sàng lọc
ung thư vú ở những phụ nữ có nguy cơ mắc bệnh cao.
Sinh thiết tế bào
Mẫu bệnh phẩm có được qua sinh thiết bằng một kim nhỏ thích hợp cho việc
chẩn đoán tế bào học. Sau đó, mẫu mô được kiểm tra dưới kính hiển vi để phân
tích trạng thái của bệnh. Tuy nhiên, sinh thiết tế bào bằng kim nhỏ có thể xảy ra
hiện tượng âm tính giả khi mũi kim không chạm được đến mô ung thư.
I.1.5.2.Các phương pháp chẩn đoán ung thư cổ tử cung.
Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), ung thư cổ tử cung có thể được điều trị
thành công khi nó được phát hiện sớm. Các xét nghiệm Pap’s smear (phết tế bào)
là thử nghiệm duy nhất được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán và đã được chứng
minh là làm giảm tỷ lệ mắc ung thư cổ tử cung và tử vong. Các xét nghiệm khác
(VIA, HPV, khoét chóp sinh thiết CTC...) cũng hứa hẹn mang lại hiệu quả trong
chẩn đoán và điều trị.
Sàng lọc tế bào học – Pap’s smear
Năm 1949, George Papanicolaou đã đưa ra một phương pháp tế bào học phát
hiện những bất thường của tế bào biểu mô CTC để phát hiện sớm ung thư CTC,
được gọi là Pap’s smear. Nguyên lý dựa trên tính chất bong ra một cách tự nhiên,
liên tục của tế bào âm đạo, CTC, đặc biệt là các tế bào bất thường có tính chất
bong sớm và rất dễ bong.
Phân tích hình thái học chi tiết, dấu hiệu của tế bào bị nhiễm HPV là sẽ bị biến
đổi thành các dạng tế bào đa nhân, tế bào đa nhân khổng lồ, hoặc nhân teo lại, hay
có thể tìm thấy tế bào bóng, tế bào có vòng sáng quanh nhân…
Phương pháp Pap’s smear có độ nhạy 44-78% và độ đặc hiệu cao 91-96%. Tuy
nhiên phương pháp này cũng có tỉ lệ âm tính giả, theo các tác giả giao động từ 1,1
-29,7% [4].
Soi cổ tử cung
Báo cáo KLTN- Phạm Thị Thương
Trang 8
GVHD: Ths. Trương Kim Phượng
Soi cổ tử cung được sử dụng khi kết quả sàng lọc cổ tử cung bất thường, hoặc
có triệu chứng của ung thư cổ tử cung. Soi cổ tử cung sử dụng một kính hiển vi
nhỏ để tìm bất kỳ bất thường trong cổ tử cung. Trong khi kiểm tra cổ tử cung, bác
sĩ phụ khoa có thể loại bỏ một mẫu mô nhỏ (sinh thiết) để có thể kiểm tra dưới
kính hiển vi cho các tế bào ung thư [54].
Khoét chóp sinh thiết cổ tử cung
Khoét chóp sinh thiết cổ tử cung là phương pháp chính trong chẩn đoán và
điều trị những bệnh nhân ung thư cổ tử cung ở giai đoạn sớm. Trong phương pháp
này, mẫu mô hình nón nhỏ của cổ tử cung sẽ được loại bỏ để kiểm tra dưới kính
hiển vi cho các tế bào ung thư [54].
Quan sát bằng mắt thƣờng với acid acetic (VIA)
Phương pháp VIA sử dụng dung dịch acid acetic 3-5% (dấm) xịt hoặc bôi lên
bề mặt cổ tử cung và quan sát cổ tử cung bằng mắt thường sau 1 phút. Nếu quan
sát thấy các vùng bị trắng gần với khu vực chuyển tiếp thì xét nghiệm này được
coi là dương tính đối với các thay đổi tế bào tiền ung thư hoặc ung thư xâm lấn
sớm. Phương pháp VIA không đòi hỏi phải có phòng xét nghiệm hay nhân viên
được đào tạo chuyên sâu. Kết quả cho thấy ngay lập tức, cho phép điều trị ngay
trong lần đầu kiểm tra. Độ nhạy của VIA tốt bằng hoặc tốt hơn độ nhạy của Pap’s
smear, nhưng cũng giống như Pap’s smear, kiểm tra bằng mắt thường là rất chủ
quan, và cần phải giám sát để kiểm soát chất lượng của các phương pháp kiểm tra
bằng mắt thường. VIA có thể không phù hợp lắm ở phụ nữ sau mãn kinh bởi vì
vùng chuyển tiếp dịch chuyển vào ống cổ tử cung khi mãn kinh [26][27][76][74].
Phƣơng pháp Sinh học phân tử HPV-PCR
Mẫu máu hoặc mẫu tế bào từ cổ tử cung, âm đạo được lấy và được xét nghiệm
dựa trên kĩ thuật sinh học phân tử đặc biệt là PCR. Một ưu điểm của xét nghiệm
DNA HPV là khi được thực hiện trong các điều kiện lý tưởng, phương pháp này
không mang tính chủ quan như phương pháp sàng lọc bằng mắt thường và sàng
lọc tế bào học. Bên cạnh việc xác định được những người đang có nguy cơ cao bị
Báo cáo KLTN- Phạm Thị Thương
Trang 9
GVHD: Ths. Trương Kim Phượng
nhiễm bệnh, phương pháp này có thể xác định các phụ nữ đã bị bệnh ở cổ tử cung
[88]
.
I.1.6. Tình hình ung thư trên thế giới và ở Việt Nam:
I.1.6.1. Tình hình ung thư trên thế giới
Theo GLOBOCAN 2012, ước tính, trên thế giới có khoảng 14,1 triệu trường
hợp ung thư mới và 8,2 triệu trường hợp tử vong xảy ra trong năm 2012, so với
12,7 triệu trường hợp mới mắc bệnh và 7,6 triệu trường hợp tử vong trong năm
2008. Ước tính cho thấy, năm 2012, có 32,6 triệu người (trên độ tuổi 15 năm) còn
sống, mà đã được chẩn đoán mắc ung thư trong năm năm trước đó [69].
Các loại ung thư phổ biến nhất trên toàn thế giới được chẩn đoán là ung thư
phổi (1,8 triệu trường hợp, chiếm khoảng 13,0% tổng số trường hợp), ung thư vú
(1,7 triệu trường hợp, chiếm khoảng 11,9%), và ung thư đại trưc tràng (1,4 triệu
trường hợp, chiếm khoảng 9,7%)[105 ].
Nguyên nhân phổ biến nhất gây tử vong do ung thư là ung thư phổi (1,6 triệu
trường hợp, chiếm khoảng 19,4% tổng số), ung thư gan (0,8 triệu trường hợp,
9,1%), và ung thư dạ dày (0,7 triệu trường hợp, chiếm khoảng 8,8%)[69].
Theo thống kê, ung thư vú đang gia tăng mạnh trên toàn thế giới, ước tính
522000 trường hợp ung thư vú đã tử vong trong năm 2012 (IARC, 2013). Đồng
thời cũng trong năm này, 1,7 triệu phụ nữ được chẩn đoán bị ung thư vú và có 6,3
triệu phụ nữ còn sống đã được chẩn đoán bị ung thư vú trong năm năm trước đó.
Kể từ năm 2008, ước tính, tỷ lệ mắc bệnh ung thư vú đã tăng hơn 20%, trong khi
tỷ lệ tử vong đã tăng lên 14%. Tỷ lệ ung thư vú cao nhất là trong các nước phát
triển, nhưng tỷ lệ tử vong tương đối cao hơn nhiều ở các nước kém phát triển do
thiếu điều kiện phát hiện sớm và tiếp cận với cơ sở điều trị (IARC) [69].
Điều cấp thiết trong kiểm soát ung thư là cần có phương pháp tiếp cận hiệu quả
để phát hiện sớm, chẩn đoán và điều trị ung thư ở những phụ nữ sống ở các quốc
gia kém phát triển.
Báo cáo KLTN- Phạm Thị Thương
Trang 10
GVHD: Ths. Trương Kim Phượng
Hình 1.1.1: Thống kê 10 bệnh ung thƣ gây tử vong phổ biến nhất trên thế
giới, số liệu năm 2012 [105 ].
I.1.6.2. Tình hình ung thư ở Việt Nam
Theo số liệu thống kê của Hiệp hội Ung thư Việt Nam, mỗi năm cả nước có thêm
khoảng 150.000 trường hợp mắc bệnh mới và 75.000 trường hợp tử vong do ung
thư. Nếu cộng thêm với số bệnh nhân đã mắc tính đến thời điểm hiện tại, cả nước có
khoảng 240.000 – 250.000 bệnh nhân bị ung thư đang điều trị. Trong đó, chủ yếu là
ung thư phổi, dạ dày, đại tràng, ung thư gan, ung thư vú và cổ tử cung. Hà Nội và
TP.HCM cũng là hai nơi có tỷ lệ phụ nữ mắc ung thư vú cao nhất nước với tỷ lệ
30/100.000 người tại Hà Nội và 20/100.000 người tại TP.HCM (năm 2010) [96].
Ngoài ra, theo BS Trần Nguyên Hà, Trưởng Khoa Nội 4, bệnh viện Ung bướu
thành phố Hồ Chí Minh, trong 15 năm, từ năm 1995-2010, tại Việt Nam, số phụ
nữ mắc bệnh ung thư vú đã vượt qua ung thư cổ tử cung; hiện trở thành loại bệnh
thường gặp nhất ở nữ giới và sẽ tiếp tục tăng cao trong những năm tới; đồng thời
phụ nữ Việt Nam thường có tâm lý e ngại khi đi khám ung thư vú, và ung thư cổ
tử cung do đó, khó phát hiện bệnh sớm để điều trị hiệu quả
[96]
. Bệnh viện Ung
bướu thành phố Hồ Chí Minh cho biết, mỗi tháng nơi đây tiếp nhận khoảng 300
Báo cáo KLTN- Phạm Thị Thương
Trang 11
GVHD: Ths. Trương Kim Phượng
bệnh nhân bị ung thư vú mắc mới đến thăm khám và điều trị. Trong khi đó tại
Bệnh viện K Hà Nội, mỗi tháng cũng tiếp nhận không dưới 200 bệnh nhân ung thư
vú mắc mới đến điều trị. Tại Việt Nam bệnh nhân ung thư vú ngày càng trẻ hóa so
với các quốc gia khác trên thế giới tới 10 năm, tức là có nhiều phụ nữ dưới 40 tuổi
đã mắc bệnh này. Theo điều tra, phụ nữ trong độ tuổi 30-34 có tới 11,9 trường hợp
trên tổng số 100.000 người mắc bệnh, trong khi ở độ tuổi 40-44 tỉ lệ này là 26,6.
Đặc biệt, ngay cả những phụ nữ độ tuổi từ 20- 30 cũng có thể mắc bệnh [103].
Tại Việt Nam, mỗi năm có trên 5.100 người mắc mới ung thư CTC, 2.400
người tử vong và trung bình có bảy người chết/ngày. TP.HCM có tỉ lệ mắc ung thư
CTC cao nhất nước với tần suất 14-16/100.000 người. Lứa tuổi phát hiện mắc và
tử vong nhiều nhất từ 40-75 tuổi. Riêng tại bệnh viện Từ Dũ, mỗi năm có 600
người được phát hiện ung thư CTC [99].
I.2. Epigenetic và sự methyl hóa DNA
I.2.1 Định nghĩa Epigenetics
Epigenetics là những sự thay đổi bản chất di truyền của DNA và nhiễm sắc thể
mà không làm thay đổi trình tự DNA. Sự biến đổi epigenetics có liên quan đến sự
biểu hiện gen thông qua những cơ chế riêng biệt ảnh hưởng đến sự ổn định, gấp
cuộn, định vị, và tổ chức của DNA [43].
Epigenetics bao gồm nhiều hiện tượng như: methyl hóa DNA, biến đổi histone
và microRNAs
[18]
. Trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ tập trung vào hiện tượng
methyl hóa DNA.
I.2.2. Sự methyl hóa DNA
Methyl hóa DNA là một trong những biến đổi phân tử phổ biến nhất trong sự
hình thành khối u ở người và sự tăng methyl hóa vùng promoter của gen là một
trong những cơ chế thường xảy ra liên quan đến sự mất chức năng của gen
[30]
.
Methyl hóa DNA là biến đổi phân tử xảy ra do một nhóm CH3 liên kết cộng hóa trị
với cacbon số 5 của Cytosin nằm ở vị trí hai nucleotide Cytosin - Guanin (viết tắt
là CpG - với p là liên kết phosphodiester). Cơ chế gắn gốc -CH3 vào DNA trong
Báo cáo KLTN- Phạm Thị Thương
Trang 12
GVHD: Ths. Trương Kim Phượng
quá trình phân bào nhờ các enzyme methyltransferases (DNMTs). DNMTs tìm
thấy trong các tế bào động vật có vú bao gồm DNMT1, DNMT3a, và DNMT3b
[13]
.
Hình 1.2.1: Sự bổ xung nhóm CH3 vào vị trí cacbon số 5 của Cytosin.
Methyl hóa DNA đặc biệt phổ biến trong gen ức chế khối u và gen sửa chữa
DNA [24]. Methyl hóa tại các vị trí CpG trong vùng promoter của các gen ức chế
khối u, sửa chữa DNA trong tế bào bình thường có vai trò điều hòa, kiểm soát chu
kỳ tế bào, kết dính tế bào, hoặc sửa chữa DNA. Sự methyl hóa DNA bất thường ở
những gen p16, INK4A, p14 ARF, p15, CCDN2, DAPK, MGMT, hMLH1, GSTP1,
RARβ2, APC, ERβ, CDH1, CDH13 và những gen tiền ung thư (oncogen) có liên
quan đến sự hình thành và diễn tiến của khối u [24].
Sự biến đổi methyl hóa DNA thường dẫn đến ung thư thông qua quá trình
methyl hóa dưới mức (hypomethylation) hoặc methyl hóa vượt mức
(hypermethylation)
[11]
. Methyl hóa dưới mức dẫn đến bất ổn định nhiễm sắc thể
và kích hoạt gen tiền ung thư (oncogene), trong khi đó, methyl hóa vượt mức
thường gắn liền với bất hoạt gen ức chế khối u
[Error! Reference source not found.]
. Tuy
nhiên, sự biến đổi epigenetics được công bố rộng rãi trong các bệnh ung thư của
con người là methyl hóa vượt mức tại các đảo CpG của vùng promoter ở gen ức
chế khối u như CDKN2A, CDKN2B, TP73, MLH1, APC, BRCA1, MGMT, VHL,
CDH1 và DAPK1. Bên cạnh đó, một số gen ức chế khối u như TIMP3, SFRP1,
SFRP2 , SFRP4 , SFRP5 hiếm khi bị đột biến, hoặc đột biến của chúng chưa từng
được báo cáo trong ung thư ở người
[87][85]
. Vì vậy, việc kiểm tra mức độ methyl
hóa trên các gen ức chế khối u có thể là dấu chứng sinh học tiềm năng trong hỗ trợ
chẩn đoán và điều trị ung thư.
Báo cáo KLTN- Phạm Thị Thương
Trang 13
GVHD: Ths. Trương Kim Phượng
Trong nhiều nghiên cứu, các tác giả đều có chung nhận định rằng, trong tương
lai các dấu chứng dựa trên thông tin methyl hóa DNA, sẽ được sử dụng ngày càng
nhiều trong chẩn đoán ung thư như một công cụ sàng lọc, một dấu hiệu có thể phát
hiện bệnh bởi sự methyl hóa vượt mức ở các đảo CpG [24][93].
Hình 1.2.2: Sự methyl hóa trong tế bào bình thƣờng và tế bào ung thƣ.
I.2.3. Đảo CpG
Vùng trình tự có kích thước khoảng 200bp với tập hợp CG chiếm hơn 50% thì
được gọi là đảo CpG
[50]
. Trong tế bào người có khoảng 70-80% đảo CpG bị
methyl hóa, khoảng 40% các đảo CpG thường xuất hiện ở vùng promoter và kéo
dài đến exon 1 trong trình tự gen của động vật có vú
[33]
. Khi DNA bị methyl hóa
trong vùng promoter của các gen, nơi phiên mã được bắt đầu, các gen bị bất hoạt
và im lặng thường dẫn đến rối loạn điều hòa trong các tế bào khối u
[16][46]
. Như
vậy, sự methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen ảnh hưởng đến
sự biểu hiện của gen ức chế khối u, làm cho gen không thể phiên mã và dẫn đến
ung thư.
I.3. Gen APC
I.3.1. Cấu trúc gen APC và protein APC
Gen APC (Adenomatous Polyposis Coli) là gen ức chế khối u đã được Goss
K.H. và cs. xác định năm 2000 thông qua liên kết của nó với một hội chứng di
truyền của ung thư đại trực tràng được gọi là đa polyp tuyến có tính chất gia đình
(viết tắt là FAP) [37]. Gen APC nằm ở vị trí 5q21-q22, gồm 15 exon[49][66].
Báo cáo KLTN- Phạm Thị Thương
Trang 14
GVHD: Ths. Trương Kim Phượng
Gen APC mã hóa cho một protein có tên là protein APC gồm 2.843 acid amin,
trọng lượng phân tử là 311646 Da [77], có khả năng gắn với nhiều loại protein khác
nhau như ß-catenin, Axin, CtBP, Asef, IQGAP1, EB1 và cấu trúc vi ống.
Hình 1.3.1: Cấu trúc protein APC. Protein APC gồm 6 vùng chức năng
chính: vùng Armadillo, vùng lặp lại 15 acid amin, vùng lặp lại 20 acid amin,
vùng cơ bản, vùng gắn Axin và vùng gắn EB1 [98].
I.3.2. Chức năng gen APC và protein APC
Gen APC là một gen ức chế khối u có vai trò ngăn chặn con đường tín hiệu
Wnt kinh điển - con đường cần thiết cho sự hình thành khối u. Chức năng của gen
APC được thể hiện qua chức năng của sản phẩm sinh tổng hợp của nó là protein
APC. Protein APC là một protein ức chế khối u đa chức năng, có vai trò trong một
số quá trình cơ bản của tế bào như quá trình bám dính và di cư của tế bào, cấu tạo
mạng lưới actin và các vi ống, phân chia nhiễm sắc thể và đặc biệt là kìm hãm con
đường truyền tín hiệu Wnt kinh điển [63][37].
Báo cáo KLTN- Phạm Thị Thương
Trang 15
GVHD: Ths. Trương Kim Phượng
Kìm hãm con đường tín hiệu Wnt kinh điển (Canonical)
Một trong những vấn đề quan trọng nhất trong nghiên cứu về gen APC là xác
định con đường chịu trách nhiệm về sinh bệnh học ung thư (tumorigenesis) của nó.
Protein APC là yếu tố trung tâm trong con đường truyền tín hiệu Wnt/β-catenin kiểm soát tăng sinh và biệt hóa tế bào [8].
Protein APC là một phần của phức hợp Axin gây phosphoryl hóa β-catenin, ức
chế sự dephosphory hóa của β-catenin, thúc đẩy loại bỏ β-catenin từ nhân, làm
giảm phức hợp β-catenin/TCF trong nhân
[40][65][72]
. Bên cạnh đó, protein APC
cũng liên kết với β-catenin, nhằm ngăn chặn sự tương tác với TCF [65].
Hình 1.3.2 : Con đƣờng truyền tín hiệu Wnt kinh điển [107]
Kích thích sự bám dính tế bào
Sự bất hoạt protein APC cũng được cho là thúc đẩy quá trình phát sinh khối u
qua việc làm mất độ bám dính của tế bào [14][15]. Nhiều kết quả nghiên cứu trên thế
giới cho rằng protein APC kích thích sự bám dính tế bào bằng cách gắn β-catenin
tại các vùng lặp lại Armadillo, các vùng lặp lại 15 hoặc 20 acid amin, để kiểm soát
Báo cáo KLTN- Phạm Thị Thương
Trang 16
GVHD: Ths. Trương Kim Phượng
sự phân bố của β-catenin giữa nhân tế bào/ bào tương tế bào và màng bào tương
của tế bào, đồng thời làm tăng mức độ E-cadherin ở màng bào tương của tế bào
[48][60][14][15]
.
Kích thích sự phân cực và di cƣ của tế bào
Protein APC điều hòa sự phân cực và sự di cư của tế bào thông qua sự kiểm
soát của bộ khung actin (actin cytoskeleton) [47].
Protein APC kích thích sự di cư của tế bào bằng cách gắn vào Acef1 và Acef2
các vùng lặp lại Armadillo để hoạt hóa chúng và hoạt hóa Cdc42; gắn vào
IQGAP1 tại các vùng lặp lại Armadillo để thu thập IQGAP1 và CLIP170, tạo nên
một phức hợp với IQGAP1, CLIP170, Rac1 và Cdc42 đã được hoạt hóa, hình
thành mạng lưới actin; gắn với EB1 tại vùng gắn EB1 tạo điều kiện dễ dàng cho
hoạt động của Rho và mDia, làm ổn định và polymer hóa các vi ống, giúp cho việc
phân chia nhiễm sắc thể chính xác [34][47][6][56][67][90].
Ổn định mạng lƣới các vi ống
Protein APC được tìm thấy ở cuối của các vi ống (microtubules), nó có thể
bám vào và ổn định các vi ống. Các kết quả này chỉ ra rằng APC điều hòa mạng
lưới vi ống và có thể đóng vai trò trong các quá trình trung gian của các vi ống
như sự di cư tế bào và sự hình thành trục chính của con thoi (spindle) [64].
Phân chia nhiễm sắc thể chính xác
Sự mất ổn định nhiễm sắc thể (chromosome instability: CIN) được xem là một
trong những cơ chế kích thích sự hình thành khối u thông qua sự phân chia sai
lệch (mis-segregation) của nhiễm sắc thể (Aoki và cs., 2007) [7].
Từ những kết quả nghiên cứu thu được [7][39][84], protein APC giúp sự phân chia
chính xác nhiễm sắc thể bằng cách gắn vào các vi ống tại vùng cơ bản (basic
domain) để điều hòa các chức năng của kinetochore - một cấu trúc protein ở nhiễm
sắc thể, nơi các sợi trục chính đính kèm trong quá trình phân chia tế bào - để đẩy
các nhiễm sắc thể xa ra.
Ức chế sự chết theo chƣơng trình của tế bào (apoptosis)
Protein APC ức chế sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của tế bào
Báo cáo KLTN- Phạm Thị Thương
Trang 17
GVHD: Ths. Trương Kim Phượng
bằng cách gắn vào β-catenin tại các vùng lặp lại Armadillo, các vùng lặp lại 15
hoặc 20 acid amin, để ức chế sự chết tế bào theo chương trình ở giai đoạn G2/M
trong chu trình tế bào qua con đường tín hiệu kinh điển Wnt, điều này cũng giúp
cho sự phân chia nhiễm sắc thể được chính xác hơn [28].
I.3.3. Sự methyl hóa gen APC trong ung thư
Sự methyl hóa bất thường vùng promoter gen APC xảy ra ở rất nhiều loại ung
thư như ung thư đại trực tràng [29][51], ung thư phổi [53[89], ung thư vú [45][89][30], ung
thư cổ tử cung [21]... Theo các nghiên cứu trên thế giới, tần số methyl hóa của gen
APC trong các khối u vú tăng theo giai đoạn và kích thước của khối u (Virmani và
cs., 2001; Roa và cs., 2004; Chen và cs., 2007; Liu và cs., 2007).
Theo các nghiên cứu được công bố, tại Hoa Kỳ, năm 2001, sự methyl hóa tại
vùng promoter gen APC ở bệnh nhân ung thư vú là 44% và ung thư phổi là 53%
(Virmani AK., 2001). Cũng trong năm này, tại Nhật Bản, Jin Z. và cs. công bố
mức độ methyl hóa ở các mẫu mô ung thư vú là 36% và không được phát hiện
trong các mô ung thư lành tính (Jin Z., 2001).
Tại Trung Quốc, năm 2007, mức độ methyl hóa là 36,8% ở các mẫu mô ung
thư vú (Liu Z., 2007), năm 2009, một lần nữa ung thư phổi được đưa vào nghiên
cứu với mức độ methyl hóa là 39,5% ở các mẫu ung thư phổi giai đoạn I và 7,7%
ở các mô phổi lành tính (Lin Q., 2009). Năm 2013, các mẫu mô cổ tử cung được
đưa và nghiên cứu và phát hiện mức độ methyl hóa là 56,8% ở các mẫu mô ung
thư và 10% ở các mẫu mô lành (Chen Yong, 2013).
Một nghiên cứu kết hợp giữa Bỉ và Hà Lan năm 2008, cả hai phương pháp phát
hiện mức độ methyl hóa trên DNA là MSP và qMSP được sử dụng cho các mẫu
mô vú. Với phương pháp MSP, phát hiện mức độ methyl hóa ở mẫu mô bệnh, mô
lành lần lượt là 71% và 43%. Phương pháp qMSP phát hiện 74% và 46% sự
methyl hóa ở mô khối u và mô lành tính (Auwera IV., 2008).
Tại Hi Lạp, năm 2011, mức độ methyl hóa ở các mô vú ung thư được phát hiện
là 53,3% (Tserga A., 2012). Tại Đức, năm 2010, các mẫu huyết thanh của bệnh
nhân ung thư vú được sử dụng để đánh giá và phát hiện mức độ methyl hóa là
Báo cáo KLTN- Phạm Thị Thương
Trang 18
GVHD: Ths. Trương Kim Phượng
20% (Matuschek C., 2010).
Nghiên cứu về ung thư biểu mô tế bào vảy thực quản, năm 2008, Iran và
Canada phát hiện mức độ methyl hóa là 44,4% ở các mẫu mô ung thư (ZareM.,
2009). Năm 2011, các tác giả Iran thực hiện nghiên cứu cả ở mô ung thư và mô
lành và có phát hiện thú vị là: mức độ methyl hóa ở các mẫu mô ung thư là 71,4%
thấp hơn ở các mẫu mô lành tính là 87,7% (Rigi-Ladiz M., 2011).
Tại Việt Nam, năm 2011, mức độ methyl hóa được phát hiện là 87,5% ở các
mẫu mô ung thư, và 93,8% trên các mô cách vị trí khối u 5cm ở các bệnh nhân
ung thư vú (Duong Thi Quynh Mai và cs., 201130). Năm 2012, Việt Nam kết hợp
với Thủy Điển nghiên cứu về methyl hóa ở các bệnh nhân mắc bệnh ung thư đại
trực tràng, và phát hiện mức độ methyl hóa ở các bệnh nhân Việt Nam và Thụy
Điển lần lượt là 44,9% và 53,8% (Dimberg JJ., 2013).
Các nghiên cứu về mức độ methyl hóa ở vùng promoter gen APC được thực
hiện ở nhiều quốc gia trên thế giới và ở nhiều loại ung thư. Tuy nhiên, các nghiên
cứu ở Việt Nam còn hạn chế, bên cạnh đó chưa có nghiên cứu về ung thư cổ tử
cung được công bố, vì vậy, nhóm chúng tôi thực hiện đề tài này để khảo sát mức
độ methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter gen APC ở các bệnh nhân
ung thư vú và ung thư cổ tử cung.
I.4. Phƣơng pháp phát hiện sự methyl hóa DNA
Hiện nay, mức độ methyl hóa DNA có thể được phân tích, đánh giá bằng rất
nhiều phương pháp như: giải trình tự trực tiếp Direct sequencing
pyrosequencing
[59]
, Q-MSP
[18]
[35]
, Bisulphite
, Ms-SNuPE [41], đặc biệt phương pháp MSP là
phương pháp được sử dụng nhiều nhất để đánh giá tần số methyl hóa ở đảo CpG.
Phƣơng pháp Methylation Specific PCR (MSP)
Phương pháp MSP do Herman và cộng sự công bố vào năm 1996, được sử
dụng để phân tích nhanh tình trạng methyl hóa của các đảo CpG. Việc lập bản đồ
chính xác của mô hình methyl hóa DNA trong các đảo CpG đã trở thành cần thiết
cho việc tìm hiểu quá trình sinh học khác nhau như in dấu DNA, bất hoạt nhiễm
sắc thể X, và im lặng gen ức chế khối u trong ung thư ở người [42].
Báo cáo KLTN- Phạm Thị Thương
Trang 19
GVHD: Ths. Trương Kim Phượng
Phương pháp MSP là phương pháp kết hợp sự biến đổi DNA bằng natri bisulfit
và phương pháp PCR với hai cặp mồi methyl và unmethyl, sau quá trình biến đổi,
tất cả cytosines không methyl hóa sẽ được chuyển thành uracil, các vị trí cytosines
unmethyl thì không bị biến đổi
[52]
. MSP chỉ cần một lượng nhỏ DNA, nhạy cảm
với 0,1% alen methyl hóa của một locus đảo CpG nhất định, và có thể được thực
hiện trên DNA chiết xuất từ mẫu paraffin. Sản phẩm sau khi PCR sẽ được kiểm tra
bằng cách điện di trên gel agarose được nhuộm ethium bromide và quan sát dưới
tia UV [42].
Hình 1.4.1: Sự biến đổi bisulfit và methyl hóa DNA.
Có thể thấy rằng, hiện nay, trên thế giới sử dụng nhiều phương pháp và các loại
mẫu bệnh phẩm khác nhau để đánh giá mức độ methyl hóa trên các gen, tuy nhiên
phương pháp MSP vẫn được sử dụng nhiều vì sự đơn giản, độ nhạy cao và phát
hiện nhanh chóng hiện tượng methyl hóa tại vùng gen khảo sát.
Khảo sát các đặc tính, thông số vật lý của bộ mồi:
Thành phần nucleotide A, T, G, C trong trình tự mồi là thông số quan trọng cho
một phản ứng PCR, nó ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA cũng như
nhiệt độ bắt cặp của mồi với DNA. Để phân biệt giữa trình tự DNA methyl và
unmethyl, mồi có chứa vị trí CpG càng nhiều càng tốt (ít nhất một CpG) và tốt
nhất ở đầu 3'. Ít nhất một trong ba nucleotide cuối cùng tại đầu 3' của mồi phải là
một CpG "C".
Chiều dài mồi là một yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR, thông thường dao
Báo cáo KLTN- Phạm Thị Thương
Trang 20
- Xem thêm -