Tài liệu Bài giảng nipt – sàng lọc trước sinh không xâm lấn quản lý chất lượng và sự tin cậy

NIPT – SÀNG LỌC TRƯỚC SINH KHÔNG XÂM LẤN Quản lý chất lượng và sự tin cậy ThS.BS. Lê Thị Khánh Linh Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học Bệnh viện Từ Dũ 1 Giới thiệu NIPT Sàng lọc trước sinh không xâm lấn (NIPT) Dựa vào phân tích DNA tự do (cfDNA) trong máu mẹ. • Nguồn gốc: nhau thai • 5-7 tuần vô kinh- sau sinh 2 tiếng • DNA trần • cfDNA mẹ và con • Fetal fraction Công nghệ xét nghiệm NIPT • MPS (massively parallel sequencing) • “counting method” • Chỉ số z-score • Targeted sequencing • CSS (chromosome-selective sequence) • Điểm nguy cơ (risk score) • SNPs sequencing • Phân tích tính đa hình • Vanadis NIPT system biochemistry • Lai huỳnh quang J. Fetal Med. 2015;2(1):11-7 NGS – next generation sequencing Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới ? Thai bất thường Thai bình thường Chỉ 1.36% cfDNA là Chr. 21 10% fetal fraction => chỉ có 0.136% cf DNA thai Chỉ 1.42% cfDNA là Chr. 21 10% fetal fraction => chỉ có 0.142% cf DNA thai Chỉ có 0.06% khác biệt ! SOP NGOẠI KIỂM QUẢN LÝ CHẤT LƯỢNG NỘI KIỂM CHUẨN HOÁ QUY TRÌNH ĐÀO TẠO NHÂN SỰ CE/IVD - RUO • RUO (Research Use Only): chỉ sử dụng trong nghiên cứu • CE-IVD (European Conformity In Vitro Diagnostic): chẩn đoán trên người theo tiêu chuẩn của Châu Âu. Chuẩn hoá Quy trình NIPT Quy trình NIPT tại BV Từ Dũ Mẫu máu: thu nhận và bảo quản Chất kháng đông K3EDTA Tách plasma Tách plasma từ máu toàn phần: EDTA/Streck Tube Centrifugation 3000g ~10 mL Chậm Ly tâm 1 600g (10 phút) ~5 mL Nhanh ~5 mL Ly tâm 16 000g (10 minutes) Tách chiết DNA © 2018 Premaitha Health - Confidential Tách chiết DNA tự do (cell-free DNA) Plasma + Proteinase K + Buffer ACL Ủ 60C trong 30 phút QIAGEN QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (cat 55114) Ủ + Buffer ACB ~ 2-3giờ QIAvac 24 Chuẩn bị thư viện DNA DNA fragments from plasma + Buffer + Enzymes Plate 1 Ủ Định lượng cfDNA sau PCR Kiểm tra chất lượng  Chất lượng : kiểm tra các đoạn DNA (kích thước, độ nhiễu..)  Số lượng : Đo nồng độ DNA mỗi mẫu Marqueur 1 DNA Fragment GX Reviewer Tổ hợp DNA và đo kích thước DNA DNA được: Chuẩn hoá Kết hợp 12 mẫu Pool 2 Pool 1 12 Mẫu/pool Định lượng DNA lần hai GX Reviewer Post-SS Pool Đo nồng độ DNA bằng Labchip GX Touch. Pool 1 . Chuẩn bị mẫu và Giải trình tự Kiểm soát chất lượng ……..… PCR Đánh giá quy trình ……… …… …… Đánh giá quy trình …… Đánh giá mẫu Đánh giá mẫu Đánh giá quy trình GC content • Tỷ lệ Guanine-Cytosine trên NST • Chiếm 40% DNA trong genome • Thay đổi tỷ lệ trình tự đọc của NST cần phân tích và NST tham khảo • Ảnh hưởng đến việc xác định sự khác biệt về số lượng trong trình tự đọc • GC correction: loại bỏ ảnh hưởng của trình tự GC, cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu Đánh giá chất lượng giải trình tự NGS