Tài liệu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình tái sinh chồi và ra rễ của cây chùm ngây trong nuôi cấy invitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ™˜ === === TRẦN THỊ THUẬN ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT ĐẾN QUÁ TRÌNH TÁI SINH CHỒI VÀ RA RỄ CỦA CÂY CHÙM NGÂY TRONG NUÔI CẤY IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học Thực vật Người hướng dẫn khoa học PGS.TS NGUYỄN VĂN ĐÍNH HÀ NỘI, 2016 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đến thầy giáo PGS.TS NGUYỄN VĂN ĐÍNH người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành khóa luận này. Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cùng các thầy cô giáo khoa Sinh – Kĩ thuật nông nghiệp, cùng các bạn trong nhóm đề tài Sinh lí học Thực vật đã giúp đỡ em trong quá trình học tập tại trường và tạo điều kiện thuận lợi cho em được thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Trong quá trình nghiên cứu, không tránh khỏi những thiếu sót và hạn chế. Kính mong được sự đóng góp ý kiến của các thầy cô giáo và các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 4 năm 2016 Người thực hiện Trần Thị Thuận LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình tái sinh chồi và ra rễ của cây Chùm Ngây trong nuôi cấy invitro” là kết quả nghiên cứu của chính tôi. Do tôi thực hiện, nghiên cứu là kết quả của riêng cá nhân tôi, hoàn toàn không trùng với bất kỳ kết quả của tác giả khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về sự cam đoan này. Hà Nội, ngày 20 tháng 4 năm 2016 Người thực hiện Trần Thị Thuận DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT WHO : Word Health Organization FAO :Food and Agriculture Organzation ĐHST : Điều hòa sinh tưởng NAA : 1-Naphthalene acetic acid IAA : Indol acetic acid IBA : Indol butyric acid BAP : 6-Benzylamonipurine KI : Kinetin MS : Murashige and Skoog medium CT : Công thức TB : Trung bình MỤC LỤC MỞ ĐẦU...............................................................................................................1 1. Lý do chọn đề tài...............................................................................................1 2. Mục đích và nội dung nghiên cứu.....................................................................2 2.1. Mục đích........................................................................................................ 2 2.2. Nội dung nghiên cứu......................................................................................2 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn..............................................................2 3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài...........................................................................2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài........................................................................... 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................................3 1.1. Các chất điều hoà sinh trưởng ở thực vật.......................................................3 1.2. Giới thiệu về cây Chùm Ngây........................................................................4 1.2.1. Vị trí và phân loại..........................................................................................................................4 1.2.2.Nguồn gốc, phân bố........................................................................................................................4 1.2.3. Đặc điểm thực vật học................................................................................ 5 1.2.4. Giá trị sử dụng cây Chùm Ngây..................................................................5 1.3. Thực trạng gieo trồng và sử dụng cây Chùm Ngây....................................... 7 1.3.1. Trên thế giới................................................................................................ 7 1.3.2. Ở Việt Nam................................................................................................. 8 1.4. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Chùm Ngây....................................... 8 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.......................................................................................8 1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam.....................................................................................10 CHƯƠNG 2: VẬT LIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................... 11 2.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................. 11 2.2. Địa điểm nghiên cứu....................................................................................11 2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm.....................................................................11 2.3.1. Thiết bị...................................................................................................... 11 2.3.2. Dụng cụ.....................................................................................................11 2.4. Môi trường nuôi cấy và chất điều hòa sinh trưởng...................................... 11 2.5. Điều kiện nuôi cấy....................................................................................... 12 2.6. Phương pháp nghiên cứu..............................................................................12 2.6.1. Bố trí thí nghiệm.......................................................................................12 2.6.3. Phương pháp phân tích thống kê dữ liệu thực nghiệm............................. 16 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................17 3.1. Tạo vật liệu khởi đầu....................................................................................17 3.2. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình tái sinh chồi in vitro cây Chùm Ngây...............................................................................19 3.2.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi của Chùm Ngây in vitro 19 3.2.2. Ảnh hưởng Kinetin đến khả năng tái sinh chồi cây Chùm Ngây in vitro 23 3.2.3. Ảnh hưởng BAP + NAA đến khả năng tái sinh chồi cây Chùm Ngây in vitro.....................................................................................................................25 3.3. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của chồi Chùm Ngây in vitro......26 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................... 28 4.1. Kết luận........................................................................................................28 4.2. Kiến nghị......................................................................................................28 TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................29 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Công thức thí nghiệm tạo vật liệu khởi đầu cây Chùm Ngây.............13 Bảng 2.2. Công thức ảnh hưởng của BAP đến quá trình tái sinh chồi in vitro...14 Bảng 2.3. Công thức ảnh hưởng Kinetin đến quá trình tái sinh chồi in vitro cây Chùm Ngây.........................................................................................................15 Bảng 2.4. Công thức ảnh hưởng BAP + NAA đến quá trình tái sinh chồi in vitro cây Chùm Ngây...................................................................................................15 Bảng 2.5. Công thức ảnh hưởng của NAA đến quá trình tạo rễ chồi in vitro cây Chùm Ngây.........................................................................................................16 Bảng 3.1. Kết quả tạo vật liệu khởi đầu in vitro cây Chùm Ngây sau 14 ngày nuôi cấy...............................................................................................................17 Bảng 3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP khả năng tái sinh chồi in vitro cây Chùm Ngây..........................................................................................20 Bảng 3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi invitro cây Chùm Ngây....................................................................................... 23 Bảng 3.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng BAP + NAA khả năng tái sinh chồi invitro cây Chùm Ngây.......................................................................................25 Bảng 3.5: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến sự tạo rễ của chồi Chùm Ngây in vitro....................................................................................................... 26 DANH MỤC HÌNH Hình 3.1. Mẫu vô trùng Chùm Ngây in vitro sống phát sinh chồi sau 14 ngày theo dõi.............................................................................................................................................................18 Hình 3.2. Mẫu vô trùng nhưng không có khả năng phát triển (mẫu chết)..............19 Hình 3.3. Ảnh hưởng của BAP 0,2 mg/l tới phát sinh chồi ở cây Chùm Ngây in vitro....................................................................................................................................................................21 Hình 3.4. Ảnh hưởng của BAP 0,3 mg/l tới phát sinh chồi ở cây Chùm Ngây in vitro....................................................................................................................................................................21 Hình 3.5. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng BAP khác đến quá trình tái sinh chồi ở cây Chùm Ngây in vitro........................................................................................22 Hình 3.6. Ảnh hưởng của môi trường cơ bản MS tới tạo chồi cây Chùm Ngây in vitro....................................................................................................................................................................23 Hình 3.7. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng KI 0,3 mg/l đến tái sinh chồi ở cây Chùm Ngây in vitro....................................................................................................................24 Hình 3.8. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng KI 0,5 mg/l đến tái sinh chồi ở cây Chùm Ngây in vitro....................................................................................................................24 Hình 3.9. Ảnh hưởng của BAP + NAA đến quá trình tái sinh chồi in vitro cây Chùm Ngây...................................................................................................................................................26 Hình 3.10. Ảnh hưởng của NAA 0,5 mg/l đến quá trình tạo rễ chồi Chùm Ngây in vitro...............................................................................................................................................................27 Hình 3.11. Ảnh hưởng của MS cơ bản đến quá trình tạo rễ chồi Chùm Ngây in vitro....................................................................................................................................................................27 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Chùm Ngây có tên khoa học là Moringa oleifera L,. Là một loài cây đa tác dụng, giá trị sử dụng của nó được chia làm hai nhóm chính: (1) sử dụng làm thuốc chữa bệnh, (2) sử dụng làm nguồn lương thực giàu chất dinh dưỡng. Trong cây Chùm Ngây có hơn 90 chất dinh dưỡng tổng hợp và chất khoáng đa dạng không kém các sản phẩm từ động vật. Đặc biệt, trong Chùm Ngây rất giàu dinh dưỡng, hàm lượng Vitamin C cao hơn 7 lần so với Vitamin C trong quả cam, hàm lượng Canxi cao hơn 4 lần so với Canxi trong sữa [19]. Giá trị làm thuốc của Chùm Ngây được khoa học chứng minh là có khả năng chống viêm, kháng khối u, đặc biệt là những khối u ở vùng bụng, kháng nấm gây bệnh, trị bệnh tiểu đường, bảo vệ gan, chống nhiễm xạ, kích thích hoạt động của tim và hệ tuần hoàn, làm giảm lượng cholesterol trong máu [20]. Ngoài ra, Chùm Ngây còn được sử dụng làm mĩ phẩm cao cấp, nước uống dinh dưỡng và làm nguyên liệu tinh cho công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, hóa chất. Đến nay kĩ thuật nhân, chọn tạo giống Chùm Ngây còn rất hạn chế. Hiện nay, Chùm Ngây được nhân giống chủ yếu bằng hạt hoặc giâm cành. Do hạt Chùm Ngây chứa hàm lượng dầu cao lên rất khó bảo quản, tỉ lệ nảy mầm thấp, hiệu quả nhân giống không cao, chất lượng giống không đảm bảo và phụ thuộc vào mùa vụ. Vì vậy nhằm tạo ra nguồn giống chất lượng cao với số lượng lớn phục vụ hướng sản xuất hàng hóa đáp ứng nhu cầu tiêu dùng và làm nguyên liệu cho các cơ sở sản xuất dược phẩm, mĩ phẩm, thực phẩm [23],[26]… Đề tài “Ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình tái sinh chồi và ra rễ của cây Chùm Ngây trong nuôi cấy in vitro ” được thực hiện nhằm đáp ứng nhu cầu trên. 1 2. Mục đích và nội dung nghiên cứu 2.1. Mục đích Tạo được mẫu sạch Chùm Ngây in vitro và khảo sát sự ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình tái sinh chồi và tạo rễ của cây Chùm Ngây trong môi trường nuôi cấy in vitro 2.2. Nội dung nghiên cứu - Tạo vật liệu khởi đầu mẫu cây Chùm Ngây in vitro - Ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi - Ra rễ tạo cây Chùm Ngây in vitro hoàn chỉnh. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ đóng góp, bổ sung dẫn liệu mới về kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào cây Chùm Ngây. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần nâng cao năng suất, chất lượng và hiệu quả kinh tế cao của cây Chùm Ngây. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Các chất điều hoà sinh trưởng ở thực vật chất điều hoà sinh trưởng là những chất với liều lượng thấp hiệu ứng sinh học cao, được tổng hợp tại một cơ quan và gây ảnh hưởng điều tiết đến các quá trình sinh lý, trao đổi chất nào đó trong những cơ quan khác. Chất điều hoà sinh trưởng là sản phẩm trao đổi chất bình thường của cơ thể thực vật. Nó đóng vai trò chủ đạo trong quá trình sinh trưởng, phát triển và những quá trình sinh lý, sinh hoá khác cũng như trong phản ứng thích nghi của thực vật đối với điều kiện của môi trường [3]. Mỗi chất điều hoà sinh trưởng đều mang chức năng riêng, nhưng trong cơ thể thực vật để điều khiển những hoạt động của thực vật, chúng tham gia vào thường không phải một vài chất. Tuỳ vào mỗi giai đoạn nuôi cấy, mỗi giai đoạn phát triển của thực vật thì sự kết hợp của các chất này là khác nhau. Tuy nhiên, trong nuôi cấy mô tế bào, hai nhóm chất điều hoà sinh trưởng được sử dụng rộng rãi là cytokinin và auxin. - Auxin: có tác dụng tốt đến các quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật,.. [4]. Auxin cùng với một số chất điều chỉnh khác đảm bảo sự tạo thành khối các tế bào đang phân chia tạo thành các cơ thể thực vật hoàn chỉnh. Trong nuôi cấy sử dụng một số chất như: Indol acetic acid (IAA); Naphthyl acetic acid (NAA); 2,4 - D Dichlorophenol acetic acid (2,4- D), Indol butyric acid (IBA) [1]. - Cytokinin: có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ. Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt và đặc trưng lên sự phân hoá của cơ quan thực vật, đặc biệt là sự phân hoá chồi. Từ lâu người ta đã chứng minh rằng sự cân bằng tỉ lệ giữa auxin (phân hoá rễ) và cytokinin (phân hoá chồi) có ý nghĩa quyết định trong quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy in vitro cũng như trên cây nguyên vẹn. Nếu tỷ lệ auxin cao hơn cytokinin thì kích thích sự ra rễ, còn tỷ lệ cytokinin cao hơn auxin sẽ kích thích sự xuất hiện và phát triển của chồi. Để 3 tăng hệ số nhân giống, người ta tăng nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro [4]. Trong nuôi cấy sử dụng một sô chất như: 6- Benzylaaminopurin (BAP); Kinetin (Ki); Zeatin(Z);Thidiazuron (TDZ). 1.2. Giới thiệu về cây Chùm Ngây 1.2.1. Vị trí và phân loại Giới thực vật : Plantae Ngành Ngọc lan : Magnoliophyta Lớp Ngọc lan : Magnoliopsida Bộ Chùm Ngây : Moringales Họ Chùm Ngây : Moringaceae Chi : Moringa Loài : Moringa oleifera L. 1.2.2 Nguồn gốc, phân bố Nguồn gốc: Cây có xuất xứ từ vùng Nam Á, có lịch sử hơn 4 ngàn năm nhưng phổ biến rất nhiều ở Châu Á và Châu Phi Phân bố: Cây Chùm Ngây là cây nhiệt đới và cận nhiệt đới, thích hợp trồng điều kiện đất đai khô cằn và điều kiện khí hậu khắc nghiệt, chịu được hạn hán nên được trồng nhiều nơi trên thế giới để làm hàng rào, che chắn, che bóng, chắn gió, chắn cát. Cây cũng có khả năng cải tạo đất tốt, lá già làm phan hữu cơ và bổ sung cho gia súc rất tốt. Chùm Ngây được trồng phổ biến ở cả Châu Á và Châu Phi. Ở Việt Nam, Chùm Ngây mọc tự nhiên ở Ninh Thuận, Bình Thuận [24], vùng núi Bảy ở An Giang, đảo Phú Quốc. Tuy nhiên, nhiều năm gần đây nhiều nghiên cứu đã chứng minh công dụng tuyệt vời của loài cây này đến nay Chùm Ngây được mở rộng diện tích trồng ở nhiều nơi. 4 1.2.3. Đặc điểm thực vật học Cây thân mộc cao cỡ trung bình, ở độ tuổi trưởng thành cây có thể mọc cao hàng chục mét. 1 tuổi nếu không cắt ngọn cây có thể cao tới 5-6m và có đường kính 10 cm. 3-4 năm tuổi là cây ở độ tuổi trưởng thành. Thân cây óng chuốt, không có gai. Lá kép dài 30–60 cm, hình lông chim, màu xanh mốc; lá chét dài 12–20 mm hình trứng, mọc đối có 6-9 đôi. Cây trổ hoa vào các tháng 1–2. Hoa trắng kem, có cuống, hình dạng giống hoa đậu, mọc thành chùy ở nách lá, có lông tơ, nhiều mật. Quả dạng nang treo, dài 25–40 cm, ngang 2 cm, có 3 cạnh, chỗ có hạt hơi gồ lên, dọc theo quả có khía rãnh. Hạt màu đen, tròn có 3 cạnh, lớn cỡ hạt đậu Hà Lan [3],[27]. Cây chùm ngây rất dễ trồng, có thể trồng từ hạt, hom cành, hom củ và trồng được quanh năm. Vùng thiếu nước nên trồng vào mùa mưa, tức khoảng tháng 4, tháng 5. Cây được trồng nhiều ở những vùng đất khô hạn khắc nghiệt nhiệt đới hoặc bán nhiệt đới. Cây chuộng đất ráo nước, nhiều cát, dù là đất xấu cũng dễ mọc, chịu được hạn hán, ưa nắng, hầu như không bị sâu bệnh hại do đó chăm sóc cây không cần điều kiện gì đặc biệt về phân bón và nước tưới. Tuy nhiên cây không chịu được úng ngập và dễ chết nếu không được thoát nước tốt. Biểu hiện ban đầu của sự dư nước dưới rễ chùm ngây là trên lá cây xuất hiện những đốm trắng, khi đó người trồng cây cần ngưng tưới hoặc tìm cách thoát nước cho cây [8]. Gỗ chùm ngây khá mềm, giòn nên thân cành dễ bị gãy trong mưa bão. Do đó nếu trồng cây để khai thác sử dụng người trồng thường cắt ngọn cây khi đạt độ cao nhất định, vừa tiện thu hái; vừa kích thích cây đâm tược, nảy cành theo cấp số nhân như tán dù; vừa hạn chế thiệt hại do gãy đổ [26]. 1.2.4. Giá trị sử dụng cây Chùm Ngây Các bộ phận của cây chứa nhiều khoáng chất quan trọng, giàu chất đạm, vitamin, beta-caroten, acid amin và nhiều hợp chất phenol. Cây chùm ngây cung cấp một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất quý hiếm như zeatin, quercetin, alpha- 5 sitosterol, caffeoylquinic acid và kaempferol. Một số nguồn nghiên cứu cho biết chùm ngây chứa hơn 90 chất dinh dưỡng tổng hợp bao gồm 7 loại vitamin, 6 loại khoáng chất, 18 loại acid amin, 46 chất chống ôxi hóa, liều lượng lớn các chất chống viêm nhiễm, các chất kháng sinh, kháng độc tố, các chất giúp ngăn ngừa và điều trị ung thư, u xơ tiền liệt tuyến, giúp ổn định huyết áp, hạ cholesterol, bảo vệ gan [23],[28]. M. oleifera là một cây có nhiều giá trị cho con người và có một loạt giá trị sử dụng thuốc. Nó có ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe, dinh dưỡng, nông nghiệp, nước, vệ sinh môi trường, đa dạng sinh học và môi trường... Moringa được coi là "cây phép lạ" trong một số nước trên thế giới bởi vì tất cả các bộ phận của nó (rễ, vỏ, lá, hoa, quả, và hạt giống) đều có thể được sử dụng, có tính dinh dưỡng và dùng làm dược liệu [7],[14] Lá moringa giàu dinh dưỡng hiện được hai tổ chức thế giới WHO và FAO xem như là giải pháp ưu việt cho các bà mẹ thiếu sữa và trẻ em suy dinh dưỡng, và là giải pháp lương thực cho thế giới thứ ba. Đối với trẻ em từ 1-3 tuổi, cứ ăn 20gr lá tươi moringa là cung ứng 90% Calcium , 100% Vitamin C, Vitamin A, 15% chat sắt, 10% chất đạm cần thiết và hàm luợng Potassium, Đồng, …và Vitamin B bổ sung cho trẻ . Đối với các bà mẹ đang mang thai và cho con bú, chỉ cần dùng 100gr lá tươi mỗi ngày là đủ bổ sung Calcium, Vitamin C, Sắt , Đồng, Magnesium, Sulfur, các vitamin B cần thiết trong ngày [20] Lá được ăn như rau, và ép hoặc sấy khô để phục vụ trong y học, dược cổ truyền trị nhiều bệnh, hoặc được sử dụn như là gia vị. Hoa sản xuất mật hoa và có đặc tính kháng viêm. Hạt Moringa rất giàu protein và dầu và được sử dụng để chăm sóc sắc đẹp cũng như cho các nước thanh lọc. Gỗ cung cấp một loại thuốc nhuộm màu xanh và được sử dụng làm rào bảo vệ. Cung cấp làm dược liệu để điều trị các bệnh tiểu đường, bệnh thiếu máu, cầm vết thương khi bị nhiễm trùng da, là một loại kháng sinh, chữa lành loét dạ dày và chăm sóc mắt. Tại châu Phi, 6