Tài liệu ảnh hưởng của kích thước và phương thức cấy mẫu đến khả năng tái sinh chồi in vitro một số giống hoa cúc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ™˜ === === NGUYỄN DOÃN THỊ HUYỀN ẢNH HƯỞNG CỦA KÍCH THƯỚC, PHƯƠNG THỨC CẤY MẪU ĐẾN KHẢ NĂNG TÁI SINH CHỒI IN VITRO MỘT SỐ GIỐNG HOA CÚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học Thực vật Người hướng dẫn khoa học PGS.TS NGUYỄN VĂN ĐÍNH HÀ NỘI, 2016 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đến thầy giáo PGS.TS Nguyễn Văn Đính – người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân trọng cảm ơn các thầy cô giáo trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Trong thời gian thực hiện đề tài, tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình của thầy La Việt Hồng và cô Mai Thị Hồng cùng tập thể, cán bộ Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành khóa luận, nhân đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn tới những người thân, bạn bè đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ và khích lệ tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 12, tháng 4, năm 2016. Sinh viên Nguyễn Doãn Thị Huyền LỜI CAM ĐOAN Khóa luận tốt nghiệp: “Ảnh hưởng của kích thước và phương thức cấy mẫu đến khả năng tái sinh chồi in vitro một số giống hoa cúc” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Văn Đính. Các kết quả nghiên cứu của khóa luận này là trung thực và các thông tin trích dẫn trong khóa luận này đều được ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 12, tháng 4, năm 2016. Sinh viên Nguyễn Doãn Thị Huyền DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT NAA: Napthlacetic acid BAP: 6-Benzyl amino purin KI: Kinetin IBA: Indol butyric acid GA3: Gibberellic acid MS: Murashige và Skoog Nxb: Nhà xuất bản Cs: Cộng sự MỤC LỤC MỞ ĐẦU.....................................................................................................................................................1 1. Lý do chọn đề tài..........................................................................................................................1 2. Mục đích và nội dung nghiên cứu.....................................................................................2 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn...........................................................................2 NỘI DUNG................................................................................................................................................3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................................................3 1.1. Giới thiệu về cây hoa cúc...................................................................................................3 1.1.1. Nguồn gốc cây hoa cúc..............................................................................................3 1.1.2. Vị trí phân loại.................................................................................................................3 1.1.3. Một số đặc điểm thực vật học................................................................................3 1.2. Tình hình sản xuất cây hoa cúc ở trên thế giới và Việt Nam........................6 1.2.1. Tình hình sản xuất hoa cúc trên thế giới..........................................................6 1.2.2. Tình hình sản xuất hoa cúc ở Việt Nam...........................................................7 1.3. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro về cây hoa cúc trên thế giới và ở Việt Nam............................................................................................................................................8 1.3.1. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro về cây hoa cúc trên thế giới.. 8 1.3.2. Tình hình nghiên cứu in vitro về cây hoa cúc ở Việt Nam...................9 1.4. Tình hình nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước mẫu và phương thức cấy mẫu đến sinh trưởng của cây in vitro........................................................................10 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................13 2.1. Vật liệu nghiên cứu..............................................................................................................13 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu..............................................................................13 2.3. Dụng cụ và thiết bị thí ngiệm........................................................................................13 2.3.1. Thiết bị...............................................................................................................................13 2.3.2. Dụng cụ.............................................................................................................................13 2.4. Môi trường nuôi cấy...........................................................................................................13 2.5. Điều kiện nuôi cấy...............................................................................................................14 2.6. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................................14 2.6.1. Chuẩn bị vật liệu thực vật......................................................................................14 2.6.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm............................................................................14 2.6.3. Phương pháp xử lý số liệu.....................................................................................16 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................................17 3.1. Tạo vật liệu khởi đầu..........................................................................................................17 3.2. Đánh giá khả năng tái sinh chồi in vitro của các giống hoa cúc nuôi cấy in vitro...................................................................................................................................................19 3.2.1. Số chồi/mẫu....................................................................................................................19 3.2.2. Chiều cao chồi...............................................................................................................21 3.2.3. Số lá/chồi..........................................................................................................................23 3.3. Ảnh hưởng của kích thước mẫu đến quá trình nhân nhanh chồi cúc....23 3.4. Ảnh hưởng của phương thức cấy đến sự phát triển của chồi mới phát sinh...............................................................................................................................................25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................................................27 TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................................28 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1. Hiệu quả khử trùng bề mặt của dung dịch Javen đối với đỉnh sinh trưởng của cây hoa cúc 17 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến số chồi/mẫu ở một số giống cúc..................20 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của BAP đến chiều cao chồi ở một số giống cúc............21 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP đến số lá/chồi ở một số giống cúc.......................23 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy đến số chồi/mẫu của cây hoa cúc 24 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của phương thức cấy đến sự phát triển của chồi cúc.....25 DANH MỤC HÌNH Hình 3.1. Các mẫu cúc sạch sau 4 tuần vào mẫu..............................................................18 Hình 3.2. Sự sinh trưởng của giống cúc vàng hè sau 6 tuần......................................20 Hình 3.3. Sự sinh trưởng của giống cúc chi đỏ sau 6 tuần..........................................21 Hình 3.4. Sự sinh trưởng của giống cúc đỏ cờ sau 6 tuần...........................................22 Hình 3.5. Sự sinh trưởng của giống cúc kim cương sau 6 tuần................................22 Hình 3.6. Sự sinh trưởng của giống cúc thạch bích sau 6 tuần.................................23 Hình 3.7. Sự sinh trưởng của chồi cúc chi đỏ ở 3 nhóm kích thước mẫu sau 6 tuần nuôi cấy 25 Hình 3.8. Ảnh hưởng của phương thức cấy đến sự phát triển chồi ở cây cúc vàng hè 27 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Ngày nay, khi xã hội phát triển, không chỉ chất lượng đời sống vật chất của con người được cải thiện mà đời sống tinh thần cũng không ngừng tăng lên, và hoa là vẻ đẹp không thể thiếu trong cuộc sống hiện đại, hoa tô điểm cho cuộc sống, thoả mãn nhu cầu thưởng thức cái đẹp của con người. Và trong vô vàn loài hoa, không thể không kể đến hoa cúc - một loài hoa trồng chậu và cắt cành được rất nhiều người ưa chuộng và phổ biến trên thế giới. Cúc đẹp không chỉ bởi màu sắc phong phú và hình dáng đa dạng mà còn ở mùi hương kín đáo và đặc tính bền. Với các ưu thế đó, hoa cúc đang được các nhà trồng hoa chú trọng đầu tư và phát triển [9]. Trong xu thế hội nhập, cùng với chính sách mở cửa của nhà nước, nhiều nhà đầu tư nước ngoài không ngừng đưa vào Việt Nam những giống cúc đẹp và có giá trị kinh tế cao. Chính vì vậy, hiện nay sản phẩm hoa cúc rất đa dạng về chủng loại, phong phú về màu sắc. Việc xuất hiện liên tục của những giống hoa cúc ngoại nhập, bên cạnh các giống hoa nội địa, đã giúp mở rộng sản xuất để đáp ứng nhu cầu thị hiếu của người tiêu dùng. Theo đó, nhu cầu về giống cũng tăng theo, và phương pháp nhân giống cũng không ngừng cải tiến. Trong những năm gần đây, một trong những phương pháp hiện đại được ứng dụng rộng rãi đó là phương pháp nhân giống in vitro bởi những ưu điểm như: tạo ra được lượng lớn cây giống từ mô, cơ quan với kích thước nhỏ 0,1 – 10 mm; cây giống tạo ra sạch bệnh, có khả năng nhân nhanh các giống sạch bệnh; có thể điều chỉnh khả năng tái sinh của cây theo ý muốn; hệ số nhân giống cao, có khả năng sản xuất số lượng lớn cây trong thời gian ngắn; có thể tiến hành quanh năm và cây giống in vitro có thể bảo quản trong một thời gian dài trong điều kiện in vitro [2]. Quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi in 1 vitro phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như giống (yếu tố di truyền), môi trường nuôi cấy, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, ánh sáng… Ngoài ra, quá trình này còn chịu ảnh hưởng của kích thước mẫu và phương thức cấy mẫu. Vì vậy, nhằm góp phần đáp ứng nhu cầu về nguồn cây cúc giống sạch bệnh, chất lượng cao bằng kĩ thuật in vitro, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Ảnh hưởng của kích thước và phương thức cấy mẫu đến khả năng tái sinh chồi in vitro một số giống hoa cúc”. 2. Mục đích và nội dung nghiên cứu 2.1. Mục đích Tạo vật liệu khởi đầu, nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước mẫu, phương thức cấy và khả năng tái sinh chồi của 5 giống hoa cúc, góp phần vào việc hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây hoa cúc. 2.2. Nội dung nghiên cứu - Tạo vật liệu khởi đầu. - Đánh giá khả năng tái sinh chồi của các giống hoa cúc nuôi cấy in vitro. - Ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy đến quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi cúc. - Ảnh hưởng của phương thức cấy đến sự phát triển của chồi mới phát sinh. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ đóng góp, bổ sung dẫn liệu mới về kĩ thuật nuôi cấy in vitro cây hoa cúc. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần nâng cao năng suất, chất lượng và hiệu quả kinh tế cao của 5 giống cúc trên. 2 NỘI DUNG Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây hoa cúc 1.1.1. Nguồn gốc cây hoa cúc Cây hoa cúc có tên khoa học là Chrysanthemum sp. được định nghĩa từ Chrysos (vàng) và Anthemon (hoa) bởi Linneaus năm 1753, có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản và một số nước Châu Âu. Chen (1985) đã chứng minh được rằng cúc được trồng ở Trung Quốc từ 500 năm trước công nguyên [11]. 1.1.2. Vị trí phân loại Trong hệ thống phân loại thực vật, Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến (1978) đã xếp hoa cúc vào lớp Hai lá mầm (Dicotyledonae), phân lớp Cúc (Asterydae), bộ Cúc (Asterales), họ Cúc (Asteraceae), phân họ giống hoa Cúc (Asteroidae), chi (Chrysanthemum) [1]. Bộ Cúc có một họ duy nhất là họ Cúc (Asteraceae hay compositae) được xem là họ lớn nhất của ngành hạt kín và giới thực vật. Bao gồm 1000 chi, hơn 20000 loài, có những chi có tới 1000 loài. Họ Cúc phân bố trên khắp nơi trên trái đất, sống được trong nhiều điều kiện khí hậu, môi trường đất đai khác nhau. Dạng sống chủ yếu là thân thảo, cây bụi, hiếm khi thân gỗ, nhưng thân gỗ thấp bé [8]. 1.1.3. Một số đặc điểm thực vật học Rễ: Theo Dowrick và Bayoumi (1996) rễ cúc thuộc loại rễ chùm, khả năng ăn sâu kém, chủ yếu phát triển theo chiều ngang. Khối lượng bộ rễ lớn do sinh nhiều rễ phụ và lông hút nên khả năng hút nước và dinh dưỡng mạnh. Những rễ này không phát sinh từ mầm rễ của hạt mà bắt nguồn những vị trí trên mấu của thân cây, hay còn gọi là “mắt” ở phần sát trên mặt đất, từ những đặc điểm này mà trong sản xuất thường ít vun cao để không làm ảnh hưởng 3 đến chất chất lượng cành mang hoa. Theo Nguyễn Xuân Linh (2000) cũng khẳng định rễ hoa cúc thuộc loại rễ chùm, chỉ khi cây thực sinh còn nhỏ mới có rễ chính rõ ràng. Đầu chóp rễ cúc có sức phân nhánh mạnh, trong điều kiện đất thích hợp thì rất nhanh hình thành bộ rễ có nhiều nhánh, điều đó có lợi cho sự hút nước và dinh dưỡng. Rễ của cây nhân từ phương pháp vô tính đều phát sinh từ thân và đều là rễ bất định. Thân cúc bất kể ở đốt hay giữa lóng đều dễ hình thành rễ bất định, vì vậy cây hoa cúc là một loài cây dễ nhân giống từ thể sinh dưỡng [5]. Thân: Cây hoa cúc thuộc loại thân thảo có nhiều đốt giòn, dễ gẫy, khả năng phân cành mạnh. Thường những giống cúc đơn có thân mập thẳng còn giống cúc chùm thân nhỏ và cong. Theo Vanruiten, De Jong (1984) [32], chiều cao cây, mức độ phân cành, độ mềm hoặc cứng của cành phụ thuộc vào đặc tính di truyền của giống, giống cúc thấp nhất chỉ cao 20 – 30 cm, còn giống cúc cao nhất có thể cao trên 3 m. Theo Vanderkamp (2000) [33] cũng cho rằng thân đứng hay bò, cao hoặc thấp, đốt dài hay ngắn, sự phân cành mạnh hoặc yếu còn phụ thuộc vào từng giống. Các giống thân dài, thường phân cành ít, thích hợp trồng trên nền đất có giàn cao. Giống thân cao, cành cứng thích hợp với việc trồng hoa cắt cành. Giống cành nhiều, cảnh nhỏ và mềm thích hợp với việc tạo hình. Lá: Theo Cockshull và Hughes (1972), lá cây hoa cúc mọc cách và thành vòng xoắn trên thân. Lá phẳng hoặc hơi nghiêng về phía trên hoặc hơi bị gấp. Trên một cành thì lá gần gốc nhỏ, càng lên phía trên lá càng to dần. Kích thước lá thường thay đổi theo điều kiện ngoại cảnh và kỹ thuật trồng trọt. Cây sinh trưởng kém thì lá nhỏ, mỏng, cứng, hơi chếch về phía trên, màu xanh nhạt không bóng hoặc hơi vàng. Đủ dinh dưỡng, cây sinh trưởng khoẻ, lá to và mềm, phiến lá dày, chóp lá hơi cong xuống, lá xanh thẫm và bóng. Biểu hiện màu sắc và trạng thái lá thường là những chỉ tiêu để đánh giá trạng thái 4 sinh trưởng của cây. Lá cúc thường sống 70 - 90 ngày, hiệu suất quang hợp của lá mạnh nhất là ở lá thứ 4 tính từ đỉnh ngọn trở xuống [15]. Cũng theo Cockshull (1985) đã mô tả, lá cúc thường xẻ thuỳ, có răng cưa, lá đơn mọc so le nhau, mặt dưới lá được phủ bởi một lớp lông tơ, mặt trên nhẵn, gân lá hình mạng lưới. Mỗi nách lá có khả năng phát triển thành một nhánh. Phiến lá to hay nhỏ, dày hay mỏng, xanh đậm hoặc nhạt còn tuỳ thuộc vào đặc tính của các cành nhánh phía dưới để tập trung cho hoa ở phía trên sinh trưởng, phát triển tốt, tạo tán đẹp [14]. Hoa: Theo Cornish, Stevenson (1990) [16] và Okada (1994) [26] đã miêu tả cúc là hoa lưỡng tính hoặc đơn tính với nhiều màu sắc khác nhau, đường kính hoa từ 1,5 – 12 cm, có thể là đơn hay kép và thường mọc nhiều hoa trên 1 cành, phát sinh từ các nách lá. Hoa cúc chính là gồm nhiều hoa nhỏ hợp lại trên một cuống hoa, hình thành hoa tự đầu trạng mà mỗi cánh thực chất là một bông hoa. Những cánh hoa nằm phía ngoài thường có màu sắc đậm hơn và xếp thành nhiều tầng, việc xếp chặt hay lỏng còn tuỳ thuộc vào giống. Cánh có nhiều hình dạng khác nhau, cong hoặc thẳng, có loại cánh ngắn đều có loại dài, xoè ra ngoài hay cuốn vào trong. Theo Zagorski, Asches, Winder (1983) [34] hoa cúc có 4 - 5 nhị đực dính vào nhau bao xung quanh vòi nhuỵ. Vòi nhuỵ mảnh, hình chỉ chẻ đôi. Khi phấn chín, bao phấn nở tung phấn ra, nhưng lúc này nhuỵ còn non chưa có khả năng tiếp nhận hạt phấn. Bởi vậy hoa cúc tuy lưỡng tính mà thường biệt giao, nghĩa là không thể thụ phấn trên cùng hoa, nếu muốn lấy hạt giống phải thụ phấn nhân tạo. Nên trong sản xuất việc cung cấp cây con chủ yếu thực hiện bằng phương pháp nhân giống vô tính. Quả và hạt: Theo Anderson (1998) [11] đã mô tả quả là quả bế khô, hình trụ hơi dẹt chỉ chứa một hạt. Hạt có phôi thẳng và không có nội nhũ. Ishiwara (1984) [21]: Quả cúc là quả bế, khi chín các lớp vỏ quả khô không 5 nứt. Trong quả có một hoặc nhiều hạt, có thể dùng những quả này để nhân giống hữu tính cho cúc. Quả cúc rất nhỏ, dài chừng 2 - 3 mm, rộng 0,7 - 1,5 mm, trọng lượng 1000 hạt khoảng 1 g, có nhiều hình dạng khác nhau như hình kim, hình gậy, hình trứng, hình tròn dài… thẳng hoặc hơi cong, hai đầu cùng bằng hoặc một đầu nhọn, có lớp vỏ hạt rất mỏng màu đen, phôi thẳng, không có nội nhũ, chất dinh dưỡng được tích trữ ở lá mầm. 1.2. Tình hình sản xuất cây hoa cúc ở trên thế giới và Việt Nam 1.2.1. Tình hình sản xuất hoa cúc trên thế giới Cúc là cây hoa có giá trị kinh tế quan trọng trong ngành công nghiệp hoa cắt cành (sau cây hoa hồng) [30]. Hiện nay, ngành sản xuất hoa cúc trên thế giới đang phát triển mạnh và mang tính thương mại cao. Sản xuất hoa đã mang lại lợi ích kinh tế to lớn cho nền kinh tế các nước trồng hoa trên thế giới, nhất là đối với các nước đang phát triển. Hoa cúc được trồng nhiều nhất ở Nhật Bản, Pháp, Mỹ, Trung. Ở Nhật Bản, cúc được coi là quốc hoa, thậm chí ở các nhà hàng, người ta có thể trang trí một bữa ăn với toàn hoa cúc. Tiếp sau Nhật Bản, những nước trồng nhiều hoa cúc là: Hà Lan, Colombia và Trung Quốc. Hà Lan là một trong những nước lớn nhất thế giới về xuất khẩu hoa nói chung và hoa cúc nói riêng. Diện tích trồng cúc ở Hà Lan chiếm 30% tổng diện tích trồng hoa tươi. Năng suất hoa tươi từ năm 1990 - 1995 tăng trung bình từ 10-15%/1 ha. Hàng năm, Hà Lan đã sản xuất hàng trăm triệu cành hoa cắt và hoa chậu phục vụ cho thị trường tiêu thụ rộng lớn gồm trên 80 nước trên thế giới. Năm 1998, Hà Lan sản xuất 866 triệu cành và năm 1999, sản xuất 1046 triệu cành cúc cắt. Một trong những nguyên nhân quan trọng góp phần tạo ra sự thành công của Hà Lan là sử dụng phương pháp nhân giống in vitro để sản xuất cây con. Sau Hà Lan là Colombia - năm 1990 thu được 150 triệu USD từ việc xuất khẩu 6 hoa cúc, đến năm 1992 đã lên đến 200 triệu USD (Murray và Robyn, 1997). Nhật Bản có nhu cầu sử dụng hoa cúc rất lớn. Diện tích trồng hoa cúc chiếm 2/3 tổng diện tích trồng hoa. Năm 1991, diện tích trồng hoa cúc ở Nhật Bản và 614 ha ngoài trời và 1150 ha nhà kính (FAO, 1998, Mae, S. O, 1993). Tuy vậy, hàng năm, Nhật Bản vẫn phải nhập một lượng lớn hoa cúc từ Hà Lan và một số nước khác trên thế giới. Năm 1996, Nhật Bản đã chọn Việt Nam là một trong những nước sẽ xuất khẩu hoa cúc cho Nhật Bản. Một số nước khác như Thái Lan, cúc đã được trồng quanh năm với số lượng cành cắt hàng năm là 50.841.500. Trung Quốc cũng là nơi có nguồn hoa cúc phong phú, việc xuất khẩu hoa cúc được chú trọng ở màu sắc hoa và hình dạng hoa. Đây cũng là nước có kĩ thuật tiên tiến trong việc sản xuất hoa cúc khô [9]. 1.2.2. Tình hình sản xuất hoa cúc ở Việt Nam Hoa cúc được du nhập vào Việt Nam từ thế kỷ 15, đến đầu thế kỷ 19 đã hình thành một số vùng nhỏ chuyên cung cấp cho nhân dân. Một phần để chơi, một phần phục vụ việc cúng lễ và một phần dùng làm dược liệu. Nếu xét về cơ cấu chủng loại tất cả các loại hoa thì trước những năm 1997 diện tích hoa hồng nhiều nhất, chiếm 31% nhưng từ năm 1998 trở lại đây diện tích hoa cúc đã vượt lên chiếm 42%, trong đó, hoa hồng chỉ còn 29,4%. Riêng ở Hà Nội, tổng sản lượng hoa cúc năm 1999 đạt 41,3 tỷ đồng, xuất khẩu sang Trung Quốc 3,6 tỷ đồng, tốc độ tăng hàng năm khoảng 10% (Nguyễn Xuân Linh và cộng sự, 2002) [5]. Hiện nay, hoa cúc được trồng khắp nước ta, nó có mặt ở mọi nơi từ núi cao đến đồng bằng, từ nông thôn đến thành thị nhưng chủ yếu tập trung ở các vùng hoa truyền thống của thành phố, khu công nghiệp, khu du lịch, nghỉ mát như Ngọc Hà, Quảng An, Nhật Tân (Hà Nội), Đằng Hải, Đằng Lâm (Hải Phòng), Hoành Bồ, Hạ Long (Quảng Ninh), Triệu Sơn, thành phố Thanh Hoá (Thanh Hoá), Gò Vấp (thành phố Hồ Chí Minh), thành phố Đà Lạt (Lâm Đồng) với tổng diện tích trồng hoa khoảng 2000 ha. 7 Riêng Hà Nội và Đà Lạt là những nơi lý tưởng cho việc sinh trưởng và phát triển của hầu hết các giống cúc được nhập từ nước ngoài (Đặng Văn Đông, 2000) [9]. 1.3. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro về cây hoa cúc trên thế giới và ở Việt Nam 1.3.1. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro về cây hoa cúc trên thế giới Năm 1952, lần đầu tiên tại Pháp, Morell và Martin đã tạo được những hoa cúc sạch bệnh nhờ nuôi cấy mô phân sinh đỉnh, cũng theo phương pháp này, Mori (1971), Asatani (1972) và Paludan (1974) đã thu được những giống sạch virut B, Veinmottle, Stunt và Comlex virues (Horst, 1990) [20]. Ngoài chồi đỉnh, nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng các bộ phận khác của cây hoa cúc để nuôi cấy như đoạn thân, mẫu lá... Kaul, Miller, Hutchison, Richards (1990) cho thấy các đoạn thân có khả năng tái sinh chồi cao hơn các mẫu lá. Năm 1990, Kenneth và Toress [23] đã nuôi cấy thành công từ giai đoạn thân và lá của giống hoa cúc tím trên môi trường MS. Tỉ lệ hình thành chồi đạt 100% và trung bình các cây nuôi cấy mô này sau 3 - 4 tháng là ra hoa. Việc sử dụng đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy in vitro cũng được thực hiện thành công bởi Sussex (1989) [29], kết quả thí nghiệm cho thấy phương pháp tối ưu, để mẫu có tỷ lệ sống sót và tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất là bảo quản chồi đỉnh cúc trước nuôi cấy 2 ngày trong điều kiện lạnh dần từ 0,2 oC đến 4oC với 10% Dimethyl sulfoxide và 3% Glucose, có nhiều giống đã đạt các tỉ lệ này tới 100% ha. Năm 1990, khi nghiên cứu về ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng, Lunegent và Wardley [24] đã kết luận khi đoạn thân cúc cao 1 - 2 cm và cho phát triển trong môi trường nuôi cấy Benziladenin thì chúng hình hành 2 - 3 chồi so với mẫu bản và không có rễ bất định, còn trong môi trường 0,1 - 0,2 mg/l Indolebutylic axit thì hình thành 1 - 2 chồi và có rễ bất định. 8 Để hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô hoa cúc, việc nghiên cứu giai đoạn cuối cùng là đưa cây in vitro ra ngoài đất cũng rất quan trọng. Năm 1990, Robert và Smith [28] đã nghiên cứu bảo vệ rễ bằng chất đệm Cellulose sorbarods trong môi trường nuôi cấy dạng lỏng đã làm giảm bớt thiệt hại trong quá trình đưa cây ra ngoài và cho vào 1 lít môi trường ra rễ dạng lỏng 0,5 - 4 mg Paclobutrazol thì sẽ giảm được độ héo của cây khi ra ngoài sản xuất làm thân ngắn hơn, rễ to nhiều và tăng diệp lục trên 1 đơn vị diện tích lá. 1.3.2. Tình hình nghiên cứu in vitro về cây hoa cúc ở Việt Nam Theo Nguyễn Quang Thạch, thì khả năng tái sinh và nhân giống của cây cúc là rất cao, từ 4 10 đến 6 10 lần trong một năm. Nguồn cấy mô ban đầu là các đỉnh sinh trưởng, các mầm bất định ở nách lá, mô lá.., ngoài ra việc nuôi cấy mô cũng có thể dùng đoạn thân, lá, đài, cánh hoa, nhị,… làm mẫu cấy. Việc khử trùng mẫu cấy cây hoa cúc thường dùng HgCl 2 0,1% với thời gian khử trùng từ 5 - 10 phút hoặc sử dụng Ca(OCl)2 5 - 7% trong khoảng 15 - 20 phút, hoặc sử dụng H2O2 10% trong 5 - 15 phút. Môi trường dinh dưỡng chính trong nuôi cấy mô cây hoa cúc là MS, tuỳ vào mô nuôi cấy và giai đoạn của quá trình nuôi cấy mà có thể bổ sung hàm lượng chất kích thích sinh trưởng khác nhau như IAA, IBA, NAA, hoặc BAP, Kinetin. Nguyễn Bá Nam và cs (2012) [7] đã nghiên cứu ảnh hưởng của các loại mẫu cấy và điều kiện chiếu sáng đến khả năng tái sinh chồi cây hoa cúc, trong nghiên cứu này, các nguồn chiếu sáng khác nhau được sử dụng để nghiên cứu tác động của chúng đến khả năng tái sinh chồi từ các mẫu cấy lá và lớp mỏng tế bào thân cắt dọc của cây Cúc (Chrysanthemum morifolium Ramat. cv. “Jimba”) in vitro. Hai nguồn mẫu này được cấy trên môi trường MS có bổ sung 30 g/l saccarozơ, 8 g/l agar, 0,5 mg/l NAA và 2 mg/l BA và nuôi cấy dưới các điều kiện chiếu sáng khác nhau: 100 % LED đỏ, 100 % LED xanh, 50 % LED đỏ + 50 % LED xanh, 70 % LED đỏ + 30 % LED xanh, 80 % 9 LED đỏ + 20 % LED xanh, 90 % LED đỏ + 10 % LED xanh, ánh sáng đèn huỳnh quang (Neon) và trong tối. Kết quả thu được sau bốn tuần nuôi cấy cho thấy, 70% ánh sáng LED đỏ kết hợp với 30 % ánh sáng LED xanh là tỉ lệ phù hợp cho sự tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu lá và gián tiếp từ lớp mỏng tế bào thân cây cúc so với các điều kiện chiếu sáng còn lại. Những chồi thu được dưới điều kiện chiếu sáng này là nguồn mẫu thích hợp phục vụ cho quy trình nhân giống cây cúc. Nguyễn Thị Nhật Linh và cs (2012) [4] đã nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính (AC) đến khả năng định hướng rễ ở cây hoa cúc và cây Hồng môn. Trong nghiên cứu này, tác giả đã tiến hành cấy các chồi vào môi trường được phân thành 2 phần, một phần không có AC và phần còn lại bổ sung các nồng độ AC tối ưu đã khảo sát ở hai đối tượng cây cúc (3 g/l AC) và Hồng môn (2 g/l AC) bằng cách thay đổi vị trí lớp AC trong môi trường nuôi cấy (trên, giữa hoặc dưới). Kết quả cho thấy, hầu hết các rễ phát sinh trong lớp môi trường có AC (trên 80% rễ). Ngoài ra, các kết quả cũng cho thấy sự định hướng rễ của cây Hồng môn phụ thuộc vào vị trí lớp AC nhiều hơn ở cây cúc. Vị trí lớp môi trường có AC ở dưới là tối ưu cho sự phát triển của cây và rễ in vitro của cả cây cúc và cây Hồng môn. Mặt khác, những cây sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện in vitro cũng sinh trưởng và phát triển tốt ở điều kiện ex vitro; điều này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu nhân giống vô tính cây trồng. 1.4. Tình hình nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước mẫu và phương thức cấy mẫu đến sinh trưởng của cây in vitro Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự ảnh hưởng của kích thước mẫu và phương thức cấy mẫu đến quá trình nhân nhanh trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật. Tuy nhiên những nghiên cứu về phương diện này trên cây hoa cúc là rất ít, các nghiên cứu chủ yếu mới chỉ dừng lại ở mức xây dựng 10 quy trình nhân giống in vitro các giống hoa cúc. Năm 2007, khi nghiên cứu về ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng và kích thước mẫu cấy (cánh hoa cúc) đến sự phát sinh mô sẹo và sự phát sinh chồi ở cây hoa cúc, Nahid và cs [22] đã kết luận rằng, trong các kích thước mẫu và môi trường nuôi cấy mà tác giả đề cập thì ở kích thước mẫu là 7 mm nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA thì tỉ lệ phát sinh mô sẹo là cao nhất (96,00%), và ở kích thước mẫu 7 mm nuôi cấy trên các môi trường MS bổ sung 2 mg/l BAP + 0,1 mg/l KI; 1 mg/l KI + 0,1 mg/l NAA thì tỉ lệ phát sinh chồi là cao nhất (83,33%). Năm 2013, Mazri đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của 3 nhóm kích thước mẫu: < 3 cm; 3 – 4 cm và 4,5 – 6 cm lên sự tạo chồi của cây Chà là (Phoenix dactylifera L.) trên môi trường MS bổ sung 1 g/l Polyvinyl pyrrolidone + 0,5 mg/l NAA + 0,5 mg/l Ki và nhận thấy rằng, sau 3 tháng nuôi cấy, ở nhóm chiều cao 4,5 – 6 cm cho chồi mới có chiều cao trung bình cao nhất (14,2 cm) [25]. Cùng năm ấy, Boullani cũng tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của 4 nhóm kích thước mẫu: 1 cm; 1 - 1,5 cm; 1,5 – 2 cm và > 2 cm đến sự tạo chồi của cây Atisô. Tác giả đã tiến hành khử trùng hạt và nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 1 mg/l IBA + 0,1 mg/l GA 3 sau đó cắt lấy chồi và nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 1 mg/l Ki + 0,1 mg/l NAA. Kết quả cho thấy, tỉ lệ tạo chồi cao nhất đạt được ở kích thước mẫu 1 – 1,5 cm với 17 chồi/mẫu [27]. Vào năm 2001, Elizabete và cs khi nghiên cứu về cây Phyllanthus stipulatus (1 cây thuộc họ Diệp hạ châu) đã đưa ra kết luận: đối với phương thức cấy thẳng đứng, tạo mô sẹo tốt nhất ở môi trường MS bổ sung 0,5 µM NAA (điều kiện có ánh sáng) hoặc đối với phương thức cấy nằm ngang là môi trường MS có bổ sung 0,5µM NAA hoặc 1,25 – 5µM BA (điều kiện trong 11