ứng dụng vi khuẩn nội sinh phân hủy n-acyl-l-homoserine lactones (ahls) trong phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây

  • Số trang: 27 |
  • Loại file: DOC |
  • Lượt xem: 18 |
  • Lượt tải: 0
hoanggiang80

Đã đăng 24000 tài liệu

Mô tả:

SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI TRƯỜNG THPT chuyên Hà Nội - Amsterdam ************** ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC CẤP THÀNH PHỐ LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015). Tên đề tài: ỨNG DỤNG VI KHUẨN NỘI SINH PHÂN HỦY N-ACYL-L-HOMOSERINE LACTONES (AHLs) TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN KHOAI TÂY Lĩnh vực: Sinh học tế bào và phân tử NGƯỜI HƯỚNG DẪN - TS. Hoàng Hoa Long - Đơn vị công tác: Viện Di truyền nông nghiệp, KM2, đường Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội TÁC GIẢ: 1. Vũ Văn Hiệp Lớp: 12 Hóa 1 Trường: THPT chuyên Hà Nội - Amsterdam 2. Nguyễn Chu Hải Linh Lớp: 12 Toán 1 Trường: THPT chuyên Hà Nội - Amsterdam Hà Nội, tháng 11 năm 2014 1 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT ĐẦY ĐỦ AND Acid Deoxyribo Nucleic AHLs N-acyl-L-homoserine lactones ARN Acid Ribo Nucleic CV026 Chromobacterium violaceum CFU (Colony Forming Unit) đơn vị hình thành khuẩn lạc CS Cộng sự Ecc Erwinia cartovora subsp. carotovora Ep Endophytes (vi khuẩn nội sinh) LB Môi trường Luria Bertani medium PCR Polymerase chain reaction QQ Quorum Quenching QS Quorum Sensing TB Tế bào VKNS Vi khuẩn nội sinh YPDA Yeast Peptone Dextrose Agar DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1: Mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn................................................................ Hình 2: Thí nghiệm thử khả năng sản sinh AHLs của vi khuẩn.............................. Hình 3: Phương pháp xác định VKNS phân hủy AHLs.......................................... Hình 4: Hình thái khuẩn lạc của chủng vi khuẩn gây bệnh P2.6.1 trên môi trường YPDA sau 24 giờ nuôi cấy ở 28oC.............................................................. Hình 5: Triệu chứng bệnh sau khi tái nhiễm chủng P.2.6.1 trên khoai tây sau 24h .................................................................................................................................. Hình 6: Khả năng sản sinh AHLs chuỗi ngắn của chủng vi khuẩn gây bệnh P.2.6.1...................................................................................................................... Hình 7: Các chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs chuỗi ngắn...................... Hình 8: Sản phảm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA của các chủng VKNS.............. DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Độc tính của các chủng vi khuẩn phân lập được từ củ khoai tây bị bệnh thối nhũn.................................................................................................................. Bảng 2: Khả năng sản sinh AHLs của các chủng vi khuẩn gây bệnh...................... Bảng 3: Các chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs........................................ Bảng 4: Hiệu lực phòng trừ bệnh thối nhũn của chủng VKNS 1.6.......................... MỤC LỤC MỤC LỤC.................................................................................................................. I. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI.......................................................................................... II. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ....................................................................................... 1. Mục tiêu nghiên cứu........................................................................................... 2. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................... 3. Phương pháp và cơ chế....................................................................................... 4. Các giai đoạn tiến hành....................................................................................... 5. Tính mới, tính thời sự của đề tài......................................................................... 6. Ý nghĩa thực tiến của đề tài................................................................................ III. QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ..................................................... 3.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu............................................................... 3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu............................................................. 3.1.2. Đối tượng nghiên cứu................................................................................ 3.1.3. Môi trường dùng trong nghiên cứu........................................................... 3.1.4. Dụng cụ, thiết bị........................................................................................ 3.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................. 3.2.1. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh thối nhũn khoai tây Ecc..... 3.2.2. Phân lập các chủng VKNS từ củ khoai tây............................................. 3.2.3. Tuyển chọn các chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs trong điều kiện in vitro và in vivo....................................................................................... 3.2.4. Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của vị khuẩn gây bệnh thối nhũn và triệu chứng bệnh trên lát cắt củ khoai tây của VKNS......................... 3.2.5. Phân loại vi khuẩn VKNS và đánh giá mức độ an toàn sinh học của các chủng VKNS................................................................................................ 3.2.6. Đánh giá khả năng tồn tại của các chủng VKNS bên trong mô cây chủ..................................................................................................................... 3.2.7. Quy trình xử lý VKNS để phòng trừ bệnh hiệu quả (đang tiến hành)..... 3.3. Kết quả nghiên cứu........................................................................................ 3.3.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn từ củ khoai tây............................................................................................................ 3.3.2. Đánh giá độc tính của tác nhân gây bệnh trên cũ khoai tây trong phòng thí nghiệm............................................................................................... 3.3.3. Khả năng sản sinh AHLs của các chủng vi khuẩn gây bệnh................... 3.3.4. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh từ củ khoai tây.... 3.3.5. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng phân hủy AHLs in vitro và in vivo............................................................................................... 3.3.6. Đánh giá khả năng ức chế bệnh thối nhũn trên lát cắt củ khoai tây của chủng VKNS 1.6................................................................................................. 3.3.7. Phân loại và đánh giá mức độ an toàn sinh học của chủng vi khuẩn nội sinh 1.6........................................................................................................ 3.3.8. Khả năng tồn tại của chủng vi khuẩn nội sinh 1.6 trong mô cây chủ..... IV. KẾT LUẬN........................................................................................................ V. TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................... I. Tài liệu tham khảo tiếng Việt............................................................................ II. Tài liệu tham khảo tiếng Anh........................................................................... I. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Cây khoai tây có tên khoa học là Solanum tuberosum, thuộc họ Solanaceae. Ngày nay, khoai tây trở thành cây lương thực quan trọng, trên khắp thế giới từ khoai tây người ta đã chế biến ra hàng trăm món ăn khác nhau, thơm ngon, rẻ tiền, rất bổ dưỡng vì trong khoai tây có chứa các vitamin, khoáng chất và phân loại của chất phytichemical như carotenoids và phenol tự nhiên... Một củ khoai tây còn vỏ có kích thước trung bình 150g, cung cấp 27 mg vitamin C (45% giá trị hàng ngày), 620 mg kali (18%), 0.2 mg vitamin B6 (10%) và một lượng rất nhỏ thiamin, riboflavin, folate, niacin, magie, photpho, sắt, kẽm… Nghiên cứu còn cho thấy khoai tây không chỉ là lương thực, mà còn là dược phẩm, có tính chất chữa bệnh. GS.Venket Rao khoa dinh dưỡng Trường đại học Y Toronto, Canada cho hay, trong khoai tây có nhiều chất chống ôxy hóa. Nó có khả năng ngăn ngừa quá trình lão hóa, hạn chế sự phát triển của ung thư, kích thích tiêu hóa và chữa viêm tuyến dịch vị và một số bệnh khác. Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy khoai tây rất giàu sterol, giúp tăng cường khả năng miễn dịch cho cơ thể. Tuy nhiên, người nông dân đang phải đối mặt với tình trạng gây hại của sâu, bệnh trên khoai tây, đặc biệt là bệnh thối nhũn khoai tây do vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora gây ra. Hiện nay, biện pháp phòng trừ bệnh chủ yếu là dựa vào các phương pháp truyền thống và sử dụng thuốc trừ sâu hóa học. Tuy nhiên, các biện pháp này đều không có hiệu quả cao và đặc biệt việc sử dụng thuốc hóa học bảo vệ thực vật đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng nông sản, sức khỏe và môi trường sống của con người. Vì vậy, đề xuất một biện pháp phòng trừ hiệu quả và thân thiện với môi trường trở thành vấn đề cấp bách hiện nay. Vi khuẩn gây bệnh E. carotovora subsp. carotovora sử dụng quorum sensing (QS) như một cơ chế trao đổi thông tin giữa các tế bào và phụ thuộc mật độ quần thể. Trong cơ chế này, N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) đóng vai trò như các chất tự cảm ứng (autoinducer) và cũng là các phân tử tín hiệu có mặt trong hầu hết các vi khuẩn gây bệnh Gram âm. Theo các nghiên cứu gần đây, một nhóm vi khuẩn có khả năng phân hủy AHLs qua cơ chế quorum quenching (QQ) đã được sử dụng trong phòng trừ sinh học bệnh thực vật. Do vậy, nhóm tác giả tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: "Ứng dụng vi khuẩn nội sinh phân hủy N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) trong phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây". II. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ 1. Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập và định danh các chủng vi khuẩn nội sinh phân hủy AHLs có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn thối nhũn từ khoai tây với hiệu quả cao và ổn định. - Thử nghiệm các chủng vi khuẩn nội sinh để phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây do vi khuẩn Ecc gây ra trên khoai tây - Tìm ra quy trình xử lý VKNS để phòng trừ bệnh hiệu quả. 2. Đối tượng nghiên cứu - Mẫu củ khoai tây bị bệnh thối nhũn. - Mẫu củ khoai tây sạch bệnh. - Các chủng vi khuẩn gây bệnh sản sinh AHLs: Erwinia cartovora subsp. carotovora (Ecc) gây bệnh thối nhũn khoai tây - Chủng vi khuẩn chỉ thị Chromobacterium violaceum CV026 có khả năng phản ứng với các phân tử AHLs và hình thành sắc tố màu tím (violacein). 3. Phương pháp và cơ chế * Phương pháp nghiên cứu - Phân lập VKNS và vi khuẩn gây bệnh theo phương pháp khử trùng bề mặt tiêu chuẩn. - Phân loại VKNS và vi khuẩn gây bệnh dựa trên xác định các đặc tính sinh lý sinh hóa và giải trình tự gen 16S rRNA. - Tuyển chọn các chủng có khả năng phân hủy AHLs in vitro và in vivo theo phương pháp đồng nuôi cấy với reporter strains Chromobacterium violaceum CV026. - Đánh giá độ an toàn sinh học của các chủng VKNS dựa trên cơ sở dữ liệu của DSMZ. * Cơ chế Đề tài tập trung khai thác tiềm năng của vi khuẩn nội sinh ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh thối nhũn, làm rõ cơ chế tương tác giữa vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn gây bệnh thông qua phá hủy mạng lưới QS. Vấn đề này không chỉ có ý nghĩa khoa học đối với một loại bệnh nhất định trên cây trồng mà còn giúp tạo cơ sở để nghiên cứu điều trị các bệnh trên người do vi khuẩn phụ thuộc tín hiệu QS gây ra 4. Các giai đoạn tiến hành Bước 1: Phân lập các chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn Ecc Bước 2: Phân lập các chủng VKNS từ củ khoai tây. Bước 3: Tuyển chọn các chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs trong điều kiện in vitro và in vivo Bước 4: Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh thối nhũn và triệu chứng bệnh trên lát cắt củ khoai tây của VKNS Bước 5: Phân loại, đánh giá mức độ an toàn sinh học của các chủng VKNS Bước 6: Đánh giá khả năng tồn tại của các chủng VKNS bên trong mô cây chủ Bước 7: Quy trình xử lý VKNS để phòng trừ bệnh hiệu quả (đang tiến hành) 5. Tính mới, tính thời sự của đề tài Ở Việt Nam: Hiện chưa có nghiên cứu nào vè cơ chế gây bệnh của vi khuẩn gây bệnh thối nhũn cũng như sử dụng các chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng để phân hủy AHLs của vi khuẩn gây bệnh trong phòng trừ bệnh thối nhũn do vi khuản gây hại cây trồng Trên thế giới: Đã có nhiều nghiên cứu theo hướng này. Hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng vi khuẩn đã được phân lập từ đất hoặc vi khuẩn biểu mô. Do vậy điểm mới của đè tài này là sử dụng các chủng vi khuẩn nội sinh 6. Ý nghĩa thực tiến của đề tài Ứng dụng vi khuẩn nội sinh phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây góp phần tạo ra sản phẩm nông sản an toàn, làm giảm sử dụng thuốc hóa học giúp bảo vệ môi trường, sức khỏe con người và tăng thu nhập cho người nông dân. Trên cơ sở đó có thể mở rộng ứng dụng để phòng trừ bệnh trên nhiều loài cây trồng khác nhau. III. QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 3.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian: Từ tháng 05/2014 đến nay - Địa điểm: Bộ môn Bệnh Học Phân Tử - Viện Di Truyền Nông Nghiệp 3.1.2. Đối tượng nghiên cứu - Mẫu củ khoai tây bị bệnh thối nhũn. - Mẫu củ khoai tây sạch bệnh. - Các chủng vi khuẩn gây bệnh sản sinh AHLs: Erwinia cartovora subsp. carotovora (Ecc) gây bệnh thối nhũn khoai tây - Chủng vi khuẩn chỉ thị Chromobacterium violaceum CV026 có khả năng phản ứng với các phân tử AHLs và hình thành sắc tố màu tím (violacein). 3.1.3. Môi trường dùng trong nghiên cứu + Môi trường YPDA dùng trong phân lập và nuôi cấy vi khuẩn: Cao nấm men 1,5 g; Peptone 0,3 g; Glucose 1,5 g; Nước cất 1000 ml; Agar 20 g; pH 7,2; Khử trùng 121oC trong 15 phút + Môi trường LB dùng trong nuôi cấy, thử khả năng phân hủy AHLs: Tryptone 10g; Cao nấm men 5g; NaCl 5g; Nước cất 1000 ml; Agar 20; pH 7,2; Kkhử trùng 121ºC trong 15 phút + Sữa gầy (skimmed milk) dùng trong bảo quản các chủng vi khuẩn: 10% skim milk; 0,05 % L-Glutamic Acid; khử trùng 121ºC trong 15 phút 3.1.4. Dụng cụ, thiết bị Các thiết bị và máy móc của Bộ môn Bệnh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp, bao gồm một số thiết bị chính như: tủ cấy an toàn sinh học NUAIRE (Mỹ), nồi khử trùng OMRON (Nhật Bản), máy ly tâm lạnh UNIVERSAL (Mỹ), cân điện tử AND (Anh), lò vi sóng, máy chụp ảnh gel, máy đo pH HORIBA (Nhật Bản), máy PCR, tủ lạnh giữ giống VESTROST (Đan Mạch), tủ nuôi cấy JEIOTECH (Hàn Quốc), bể điện di MUPID (Nhật Bản), tủ sấy LENTON (Anh), máy khuấy từ FISHER (Mỹ)… Dụng cụ: đĩa Petri, Pipette các loại, ống Fancol, ống nghiệm, ống eppendorf, ống đong, đèn cồn, bình tam giác (50, 100, 250 ml), bình Schott, que cấy… 3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh thối nhũn khoai tây Ecc 3.2.1.1. Điều tra và thu thập mẫu bệnh - Mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn được thu thập từ các chợ đầu mối trên địa bàn Hà Nội và trên các cánh đồng trồng khoai tây khu vực Thường Tín, Đông Anh, Sóc Sơn. - Các mẫu bệnh được thu dựa trên triệu chứng thối nhũn điển hình: mô bệnh bị thối, có màu kem đến màu nâu, ướt, nhũn. Quá trình thối bắt đầu trên bề mặt củ và ăn sâu vào bên trong. Ranh giới giữa mô bệnh và khỏe rõ ràng bởi đường viền tối màu hoặc đen (Hình 1). Thường thối nhũn không có mùi trong giai đoạn đầu phân hủy, nhưng khi có sự xâm nhiễm thứ cấp có mùi rất khó chịu. Hình 1: Mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn Mẫu bệnh thu thập được để riêng biệt trong túi báo, bảo quản ở nhiệt độ 4oC cho đến khi phân lập vi khuẩn gây bệnh. 3.2.1.2. Phân lập vi khuẩn gây bệnh Phân lập vi khuẩn gây bệnh được tiến hành theo phương pháp của Furuya và cộng sự (2002) theo các bước sau: - Rửa mẫu dưới vòi nước và sau đó xịt cồn 70% trên toàn mẫu. - Cắt những miếng nhỏ (1x1cm) giữa vùng bị bệnh và vùng không bị bệnh trên 3 điểm khác nhau của mẫu bệnh, sau đó đặt vào đĩa Petri đã khử trùng. - Nhỏ 1ml nước cất đã khử trùng vào sau đó nghiền nát để lấy dịch gốc. Chuẩn bị 6 ống eppendorf 1.5ml, mỗi ống chứa 900µl nước cất khử trùng. - Hút 100µl dịch gốc nhỏ vào ống 1 trộn đều, tiếp tục hút 100µl dịch từ ống 1 nhỏ sang ống 2 và làm lần lượt cho đến ống thứ 6 để được các nồng độ pha loãng. - Lấy 100µl từ các ống eppendorf với 6 nồng độ đã được pha loãng nhỏ lần lượt vào các đĩa môi trường YPDA và trang đều trên bề mặt đĩa. - Để mẫu trong tủ 28oC, sau 24 giờ kiểm tra khuẩn lạc. Mô tả đặc điểm của các khuẩn lạc trên đĩa, sau đó chuyển cấy vào môi trường YPDA mới. - Bảo quản các chủng vi khuẩn đã phân lập được trong sữa tách béo 10% ở -20 C để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. o 3.2.1.3. Đánh giá độc tính của tác nhân gây bệnh trên củ khoai tây trong phòng thí nghiệm Độc tính của các tác nhân gây bệnh được đánh giá trong phòng thí nghiệm bằng phương pháp lây nhiễm trực tiếp lên lát cắt củ khoai tây (Nguyễn Thanh Hà và cs., 2013) theo các bước sau: - Củ khoai tây được rửa sạch dưới vòi nước chảy. Xịt cồn 70% lên bề mặt của củ. Sau đó, củ khoai tây được cắt thành những lát có chiều dầy khoảng 1cm và đặt trong đĩa petri. - Dùng đầu tăm nhọn đã khử trùng lấy nguồn khuẩn nhiễm đã được cấy trên YPDA sau 24 giờ, đâm đều xung quanh lát cắt khoai tây, mỗi lần lấy nguồn khuẩn nhiễm sử dụng cho 2-3 lỗ châm. - Đối chứng dương được sử dụng là chủng vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora ATCC175713T (Ecc), gây bệnh thối nhũn điển hình. Đối chứng âm được sử dụng với nước cất khử trùng. - Mẫu khoai tây sau khi nhiễm được đặt trên giấy thấm ẩm trong đĩa Petri và ủ ở 28oC. Quan sát triệu chứng và mức độ biểu hiện bệnh sau 24h, 48h. Mỗi chủng vi khuẩn được lây nhiễm trên 3 lát cắt. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3.2.1.4. Xác định khả năng sản sinh AHLs Khả năng sản sinh AHLs của vi khuẩn gây bệnh được tiến hành theo phương pháp đồng nuôi cấy của Molina và cộng sự (2003) (Hình 2) với một số thay đổi như sau: - Chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 và Ecc được cấy trên môi trường LB và YPDA tương ứng và ủ ở 28oC trong 48 giờ. - Các chủng vi khuẩn nghiên cứu được cấy trên môi trường YPDA và ủ ở 28 C trong 24 giờ. o - Các chủng vi khuẩn được cấy vạch thành một đường trên môi trường LB, kèm sát bên phải là chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 cũng được cấy vạch thành một đường, tạo thành 2 đường cấy song song. - Đối chứng dương gồm hai chủng Ecc và CV026 cấy sát nhau. Đối chứng âm là chủng Ecc và chủng CV026 được cấy riêng biệt. - Mẫu được để trong tủ 28 oC. Thí nghiệm được làm nhắc lại 3 lần và kết quả được thể hiện sau 24 giờ.  Cách đọc kết quả: - Dương tính (+): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 chuyển màu tím. - Sản sinh AHLs yếu (±): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 có màu tím nhạt hơn. - Âm tính (-): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 không chuyển màu tím (màu của khuẩn lạc vi khuẩn). Hình 2: Thí nghiệm thử khả năng sản sinh AHLs của vi khuẩn 3.2.2. Phân lập các chủng VKNS từ củ khoai tây 3.2.2.1. Vật liệu nghiên cứu Mẫu khoai tây sạch bệnh thu thập từ các chợ đầu mối trên địa bàn Hà Nội và các vùng trồng khoai tây ở Thường Tín, Đông Anh. 3.2.2.2. Phương pháp phân lập Phân lập VKNS được tiến hành theo phương pháp của Furuya và cộng sự (2002) với một số thay đổi như sau: Mẫu củ khoai tây được rửa sạch dưới vòi nước để phục vụ cho việc phân lập. Ngâm củ khoai tây trong cồn 70% trong 3 phút và dung dịch Sodium hypochlorite (3% Cl-) trong 5 phút. Sau đó rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng. Nghiền mẫu trong đĩa petri khử trùng. Nhỏ 1ml nước cất đã khử trùng vào dịch nghiền và trộn đều để tạo dịch gốc. Chuẩn bị 6 ống pendorf 1.5ml, mỗi ống chứa 900µl nước cất khử trùng. Hút 100 µl dịch gốc nhỏ vào ống 1 trộn đều, tiếp tục hút 100 µl dịch từ ống 1 nhỏ sang ống 2 và làm lần lượt cho đến ống thứ 6 để được các nồng độ pha loãng. Lấy 100 µl từ các ống pendorf với 6 nồng độ đã được pha loãng nhỏ lần lượt vào các đĩa môi trường YPDA và trà đều trên bề mặt đĩa. Để mẫu trong tủ 28oC, sau 24h kiểm tra khuẩn lạc. Mô tả đặc điểm của các khuẩn lạc trên đĩa, sau đó chuyển cấy vào môi trường YPDA mới. Bảo quản các chủng VKNS phân lập được trong sữa gầy (skimmed milk) 10% ở -20 oC để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.3. Tuyển chọn các chủng VKNS có khả năng phân hủy AHLs trong điều kiện in vitro và in vivo Khả năng phân hủy AHLs của vi khuẩn gây bệnh được tiến hành theo phương pháp đồng nuôi cấy của Molina và cộng sự (2003) (Hình 3) với một số thay đổi như sau: - Chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 và chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn Ecc được cấy trên môi trường LB và YPDA tương ứng và ủ ở 28oC trong 48h. - Các chủng VKNS được cấy trên môi trường YPDA và ủ ở 28 oC trong 24h. - Các chủng VKNS được cấy vạch thành một đường trên môi trường, kèm sát hai bên là chủng vi khuẩn Ecc và chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 cũng được cấy vạch thành một đường, tạo thành 3 đường cấy song song. - Đối chứng dương chỉ gồm hai chủng Ecc và CV026 cấy sát nhau; Đối chứng âm là chủng Ecc và chủng CV026 được cấy riêng biệt - Mẫu được để trong tủ 280C. Lưu ý: Thí nghiệm được làm nhắc lại 3 lần và kết quả được thể hiện sau 24h.  Cách đọc kết quả: - Dương tính (+): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 có màu tím sẫm - Phân hủy AHLs một phần (±): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 có màu tím nhạt - Âm tính (-): vạch cấy của chủng vi khuẩn chỉ thị không màu (màu của khuẩn lạc vi khuẩn) (Hình 3). Hình 3: Phương pháp xác định VKNS phân hủy AHLs 3.2.4. Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của vị khuẩn gây bệnh thối nhũn và triệu chứng bệnh trên lát cắt củ khoai tây của VKNS 3.2.4.1. Chuẩn bị lát cắt củ khoai tây - Rửa củ khoai tây dưới vòi nước chảy cho hết bùn đất và để ráo nước. - Cắt lát khoai tây và khoan một lỗ trên mỗi lát cắt khoai tây (sử dụng khoan đục lỗ thạch). - Khử trùng bề mặt lát cắt khoai tây với cồn 70% trong 3 phút, tiếp theo NaClO (3% Cl-) + 1 - 2 giọt Tween 20 trong 5 phút. Tráng sạch bằng nước cất khử trùng 3 lần. - Thấm khô bằng giấy thấm khử trùng. Đặt mỗi lát cắt khoai tây vào mỗi đĩa Petri. 3.2.4.2. Chuẩn bị dịch vi khuẩn - Chuẩn bị ống eppendorf (1.5ml) chứa 1000µl nước cất khử trùng. Dùng que cấy lấy 1 - 2 đầu que cấy vi khuẩn (VKNS và vi khuẩn gây bệnh Ecc) đã nuôi trên đĩa Petri cho vào ống nước cất, trộn kỹ trên máy vortex cho đến khi tạo thành dịch khuẩn đục (khoảng 108-109 cfu/ml) 3.2.4.3. Lây nhiễm Phương pháp lây nhiễm được tiến hành như mô tả của Molina và cs (2003).  Phươn pháp 1: nhiễm trộn VKNS và Ecc Ba lát cắt khoai tây cho mỗi chủng vi khuẩn thử nghiệm, đặt trong 3 đĩa Petri riêng biệt. Chuẩn bị hỗn hợp dịch khuẩn: 25µl dịch vi khuẩn nội sinh và 25µl vi khuẩn gây bệnh Ecc trộn đều vào nhau. Đối chứng âm: 50µl nước cất vô trùng; Đối chứng vi khuẩn gây bệnh Ecc: 25µl nước cất vô trùng + 25µl dịch khuẩn Ecc. Đĩa thí nghiệm: Dùng hỗn hợp dịch khuẩn nhỏ đều xung quanh thành lỗ khoan. Ủ mẫu trong 28oC và kiểm tra sau 24h.  Phương pháp 2: nhiễm VKNS trước 24h và nhiễm Ecc sau Đối chứng âm: 50µl nước cất vô trùng, sau 24h thêm 50µl nước cất vô trùng; Đối chứng Ecc: 50µl nước cất vô trùng, sau 24h thêm 50µl Ecc. Đĩa thí nghiệm: Nhỏ trước 50µl VKNS và sau 24h sau tiến hành nhỏ tiếp 50µl Ecc vào thành lỗ khoan. Ủ mẫu 28oC và kiểm tra sau 48h.  Phương pháp 3: nhiễm Ecc trước 24h và nhiễm VKNS sau Đối chứng âm: 50µl nước cất vô trùng, sau 24h thêm 50µl nước cất vô trùng; Đối chứng Ecc: 50µl Ecc, sau 24h thêm 50µl nước cất vô trùng. Đĩa thí nghiệm: Nhỏ trước 50µl Ecc và sau 24h sau tiến hành nhỏ tiếp 50µl VKNS vào thành lỗ khoan. Ủ mẫu 28oC và kiểm tra sau 48h. 3.2.4.4. Đọc kết quả - Đọc kết quả sau 48h ủ ở 28oC. - Đánh số các đĩa 1, 2, 3 (mỗi chủng 3 đĩa). Cân từng miếng khoai tây đã lây nhiễm và ghi kết quả. - Rửa nhẹ dưới vòi nước chảy để loại bỏ hết phần thối. Cân lại trọng lượng lát cắt khoai tây sau khi rửa và ghi kết quả. 3.2.4.5. Phân tích kết quả Nhập kết quả trọng lượng lát cắt củ khoai tây vào Excel và tính trọng lượng của mô thối đã rửa. Xử lý số liệu phân tích phương sai ANOVA bằng phần mềm Statview version 5.0.1 (SAS Institute Inc.) để tìm ra mức độ sai khác có ý nghĩa thống kê của trọng lượng mô thối của lát cắt khoai tây xử lý VKNS và không xử lý VKNS. 3.2.5. Phân loại vi khuẩn VKNS và đánh giá mức độ an toàn sinh học của các chủng VKNS 3.2.5.1. Phương pháp phân loại các chủng VKNS Phản ứng nhân gen PCR và giải trình tự gen sử dụng primer F27 5’AGAGTTTATCMTGGCTCAG-3’ và R1492 5’-GRTACCTTGTTACGACTT3’. Giải trình tự gen 16S rRNA trực tiếp từ phản ứng PCR sử dụng hỗn hợp Big Dye và tiến hành trên máy ABI Sequence Detector System SDS 7700. Trình tự gen 16S rRNA được phân tích bằng chương trình BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) dựa vào cơ sở dữ liệu của NCBI (National Center for Biotechnology Information). 3.2.5.2. Phương pháp đánh giá độ an toàn sinh học của các chủng VKNS Đánh giá độ an toàn sinh học của các chủng vi khuẩn nội sinh dựa trên Phân nhóm Prokaryotes (Vi khuẩn và vi khuẩn cổ) thành các nhóm nguy cơ (risk group) trong Các quy định kỹ thuật đối với tác nhân sinh học (Technical Rules for Biological Agents-TRBA466) công bố bởi Ủy ban về các tác nhân sinh học của Cộng hòa LB Đức (TRBA 466, 2010) và theo Hướng dẫn số 2000/54/EC của Hội đồng và Nghị viện Châu Âu về bảo vệ người lao động khỏi nguy cơ khi tiếp xúc với các tác nhân sinh học. (Directive 2000/54/EC of the European Parliament and Council of 18.09.2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work). Theo Thông tư số 07 /TT-BYT ngày 14 tháng 5 năm 2012) Danh mục vi sinh vật gây bệnh truyền nhiễm theo nhóm nguy cơ và cấp độ an toàn sinh học phù hợp kỹ thuật xét nghiệm. Các loài vi khuẩn được phân thành 4 nhóm nguy cơ trong đó: Nhóm 1: Không gây bệnh cho người Nhóm 2: Có thể gây bệnh cho người nhưng không thể lan truyền trong cộng đồng, thường có biện pháp điều trị nếu nhiễm phải. Nhóm 3: Có thể gây bệnh cho người và tiềm ẩn nguy cơ lan truyền trong cộng đồng, có biện pháp điều trị nếu nhiễm phải. Nhóm 4: Gây bệnh nặng cho người và có nguy cơ cao lan truyền trong cộng đồng, chưa có biện pháp điều trị thích hợp. Dựa vào kết quả phân loại vi khuẩn ở trên, nếu xác định loài vi khuẩn không thuộc nhóm nguy cơ nào hoặc thuộc nhóm 1 thì tiếp tục sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo; nếu các loài vi khuẩn thuộc nhóm nguy cơ 2, 3 và 4 thì ngừng sử dụng và tiêu hủy các chủng này bằng khử trùng ở nhiệt độ cao 2 lần liên tiếp sau 24 giờ. 3.2.6. Đánh giá khả năng tồn tại của các chủng VKNS bên trong mô cây chủ 3.2.6.1. Chuẩn bị củ khoai tây - Rửa củ khoai tây dưới vòi nước chảy cho hết bùn đất và để ráo nước; khử trùng bề mặt củ khoai tây với cồn 70% trong 3 phút và tráng sạch bằng nước cất khử trùng 3 lần. - Để củ khoai tây khô tự nhiên, sau đó đặt các củ khoai tây vào rổ nhựa lưới và để ở nhiệt độ phòng. 3.2.6.2. Chuẩn bị dịch vi khuẩn - Chuẩn bị 500ml dịch huyền phù vi khuẩn nội sinh (mật độ khoảng 10 6107 cfu/ml). 3.2.6.3. Lây nhiễm - Đối chứng âm: củ khoai tây được ngâm trong 500ml nước cất vô trùng trong 30 phút. - Thí nghiệm: củ khoai tây được ngâm trong 500ml dịch khuẩn nội sinh trong 30 phút; Mỗi chủng nội sinh sử dụng 3 củ khoai tây, đặt trong rổ nhựa lưới và giữ ở nhiệt độ phòng. 3.2.6.4. Đánh giá kết quả thí nghiệm - Mỗi củ khoai tây được khử trùng bề mặt bằng cồn 70% trong 3 phút và rửa 3 lần với nước cất vô trùng trong box cấy. - Từ mỗi củ khoai tây cắt 3 miếng có kích thước 2,0x2,0 cm và cân trọng lượng của 3 lát cắt, sau đó dùng dao mổ cắt thành từng miếng nhỏ trong 1ml nước cất vô trùng. - Chuẩn bị 3 ống eppendorf, mỗi ống cho 900µl nước cất vô trùng. Sau khi nghiền mẫu, hút 100µl dịch gốc nhỏ vào ống 1 trộn đều, tiếp tục hút 100µl dịch từ ống 1 nhỏ sang ống 2 và làm lần lượt cho đến ống thứ 3 để được các nồng độ pha loăng. Lấy 100µl từ các ống eppendorf ở 3 nồng độ đã được pha loãng nhỏ lần lượt vào các đĩa môi trường YPDA và trà đều trên bề mặt đĩa. Để mẫu trong tủ 280C, sau 48h kiểm tra và đếm số lượng khuẩn lạc. 3.2.7. Quy trình xử lý VKNS để phòng trừ bệnh hiệu quả (đang tiến hành) 3.3. Kết quả nghiên cứu 3.3.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn từ củ khoai tây Từ 10 mẫu khoai tây bị bệnh thối nhũn điển hình được thu thập từ các chợ đầu mối trên địa bàn Hà Nội và các vùng trồng khoai tây ở Thường Tín, Đông Anh, Sóc Sơn, phân lập được 98 chủng vi khuẩn. Các chủng vi khuẩn phân lập được có hình thái khuẩn lạc và màu sắc đa dạng (Hình 4) Hình 4: Hình thái khuẩn lạc của chủng vi khuẩn gây bệnh P2.6.1 trên môi trường YPDA sau 24 giờ nuôi cấy ở 28oC Các chủng vi khuẩn này được đặt tên theo thứ tự mẫu bệnh thu được ở các đợt khác nhau và được làm thuần bằng cách cấy truyền các khuẩn lạc tách rời nhau khi phát triển trên môi trường YPDA. Sau 3 lần cấy truyền liên tiếp từ một khuẩn lạc thu được chủng vi khuẩn thuần. Bảo quản các chủng vi khuẩn gây bệnh phân lập được trong sữa tách béo 10% ở -20oC để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 3.3.2. Đánh giá độc tính của tác nhân gây bệnh trên cũ khoai tây trong phòng thí nghiệm Sau khi lây nhiễm 98 chủng vi khuẩn trên củ khoai tây sạch bệnh để đánh giá độc tính của chúng, thu được 10 chủng thể hiện độc tính mạnh trên lát cắt củ khoai tây (Bảng 1). Các chủng vi khuẩn này được bảo quản bằng sữa tách béo 10% ở nhiệt độ -20oC để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Bảng 1: Độc tính của các chủng vi khuẩn phân lập được từ củ khoai tây bị bệnh thối nhũn STT Chủng vi khuẩn Độc tính Sau 24h Sau 48h 1 P.1.3 ++ +++ 2 P.1.5 + ++ 3 P.2.4.5 ++ +++ 4 P.2.5.1 ++ +++ 5 P.2.5.3 ++ +++ 6 P.2.6.1 + ++ 7 P.4.5.5 ± + 8 P.4.5.6 ++ +++ 9 P.4.6.2 ++ +++ 10 P.4.6.3 - ± Chú thích: 1. Không có biểu hiện bị bệnh: 2. Biểu hiện bệnh yếu: ± 3. Biểu hiện bệnh nhẹ: + 4. Biểu hiện bệnh nặng: ++ 5. Biểu hiện bệnh rất nặng: +++ Hình 5: Triệu chứng bệnh sau khi tái nhiễm chủng P.2.6.1 trên khoai tây sau 24h 3.3.3. Khả năng sản sinh AHLs của các chủng vi khuẩn gây bệnh Trong số 98 chủng vi khuẩn phân lập, thu được 6 chủng có khả năng sản sinh AHLs (Bảng 2). Hai chủng P.2.5.1 và P.2.6.1 vừa có khả năng sản sinh AHLs vừa thể hiện độc tính mạnh trên lát cắt củ khoai tây. Chủng P.2.6.1 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo (Hình . Bảng 2: Khả năng sản sinh AHLs của các chủng vi khuẩn gây bệnh STT Chủng vi khuẩn Độc tính trên lát cắt củ khoai tây Khả năng sản sinh AHLS chuỗi ngắn 1 P.2.5.1 +++ + 2 P.2.6.1 ++ + 3 P.2.6.3 - + 4 P.3.4.7 - + 5 P.3.5.1 - + 6 P.4.5.5 + + 7 P.4.5.6 +++ - 8 P.8.6.5 - - Chú thích: ( + ): Khả năng sản sinh AHLs mạnh ( ± ): Khả năng sản sinh AHLs yếu ( - ) : Không có khả năng sản sinh AHLs Hình 6: Khả năng sản sinh AHLs chuỗi ngắn của chủng vi khuẩn gây bệnh P.2.6.1 3.3.4. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh từ củ khoai tây Từ 25 mẫu củ khoai tây sạch bệnh được thu thập từ các chợ đầu mối trên địa bàn Hà Nội và một số vùng trồng khoai tây ở Thường Tín, Đông Anh, chúng tôi đã phân lập, tuyển chọn được 100 chủng vi khuẩn có hình thái khuẩn lạc và màu sắc đa dạng.
- Xem thêm -