Tài liệu Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy

Ketnooi.com ket noi cong dan dien tu LỜI CẢM ƠN Đe hoàn thành Đồ án này Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và M ôi trường, Phòng Đào tạo Đại học và Sau đại học niềm kính ừọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS. V ũ Ngọc Bội Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và M ôi trường - Trường Đại học N ha Trang đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Xin cám ơn: PGS. TS. Ngô Đăng Nghĩa - Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và M ôi trường, ThS. Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ m ôn Công nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng. Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ m ôn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và M ôi trường - Trường Đại học N ha Trang, Phòng thí nghiệm CNSH đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi to n g suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua. MỤC LỤC LỜI CẢM Ơ N .................................................................................................................i MỞ ĐẦU........................................................................................................................ 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN......................................................................................... 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ CELLULASE......................................................................... 3 1.1.1. Giới thiệu về cellulose.........................................................................................3 1.1.2. vsv sinh tổng hợp cellulase.............................................................................. 5 1.2..ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE...................................................... 6 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN cứu VỀ ENZYME CELLULASE............................... 8 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới..................................................................... 8 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.......................................................................9 CHƯƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu.........10 2.1. NGUYÊN VẬT L Ệ U .......................................................................................... 10 2.1.1. Rong giấy........................................................................................................... 10 2.1.2. vsv sinh cellulase.............................................................................................10 2.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh v ậ t....................................................................... 10 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u ....................................................................... 11 2.2.1. Phương pháp phân lập....................................................................................... 11 2.2.2. Phương pháp tuyển chọn chửng v s v sinh cellulase mạnh nhất.................... 13 2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp................................ 13 2.2.4. Phương pháp phân loại chửng vi sinh vật........................................................ 14 2.2.5. Kiểm tra khả năng lên men các loại đường và khả năng sinh hơi.................. 15 2.2.6. Kiểm tra khả năng chịu muối............................................................................ 15 2.2.7. Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân khác...................... 15 2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU................................................................... 16 2.4. DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM................................................................................... 16 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................... 17 iii 3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG v s v SINH CELLULASE CAO TỪ RONG GIẤY............................................................................................... 17 3.2. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG N3 VÀ N4 TUYÊN CHỌN ĐƯỢC.............................................................................................................. 19 3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian................................................................................... 19 3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ.................................................................................. 211 3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng............................................................. 23 3.2.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu............................................................................ 244 3.3. Sơ B ộ PHÂN LOẠI HAI CHỦNG NẤM N3 VÀ N 4 ..................................266 3.4. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HÓA CỦA N3 V À N 4....................30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN......................................................................... 34 KẾT LUẬN.................................................................................................................. 34 ĐỀ XUẤT Ý K IẾN ..................................................................................................... 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................36 TIẾNG VIỆT.................................................................. Error! Bookmark not defined. TIẾNG ANH.................................................................. Error! Bookmark not defined. PH Ụ LỤ C..................................................................................................................... 40 iv DANH MỤC BẢNG • Bảng 1.1. Một số vsv sản xuất cellulase....................................................................6 Bảng 3.1. Hoạt tính cellulase của một số chủng vsv phân lập............................... 17 Bảng 3.2. Hoạt tính cellulase của 4 chủng đã qua sơ tuyển......................................18 Bảng 3.3. Khả năng lên men các loại đường của hai chửng N3 và N4.................... 30 Bảng 3.4. Khả năng chịu muối của hai chủng N3 và N 4 ........................................311 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc không gian của phân tử cellulose................................................................3 Hlnh 1.2. Cấu trúc phân tử celulose...........................................................................................3 Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase.................................................................................... 5 Hlnh 2.1. Quá trình phân lập vi sinh vật sinh cellulase từ rong giấy......................................13 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp.............................. 14 Hlnh 3.1. Hình ảnh về hai chủng nấm sợi có khả năng sinh cellulase mạnh nhất ............... 19 Hình 3.2. Hoạt tính cellulase của hai chủng N3 và N4 trên CM C......................................... 19 Hình 3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng N 3 .... 20 Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng N 4 .... 20 Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh cellulase của chủng N3.......................22 Hlnh 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh cellulase của chủng N4.......................22 Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng đến khả năng sinh cellulase của chủng N323 Hlnh 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng đến khả năng sinh cellulase của chửng N4233 Hlnh 3.9. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh cellulase của chủng N 3..........25 Hình 3.10. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh cellulase của chủng N 4 ..... 255 Hlnh 3.11. Hình thái khuẩn lạc của chửng N3 trên đĩa petri................................................ 266 Hình 3.12. Hệ sợi nấm N3 ở các độ phóng đại 10X; 40 X .....................................................27 Hlnh 3.13. Hệ sợi nấm N3 ở các độ phóng đại 40 X và 100X............................................. 277 Hlnh 3.14. Hình thái khuẩn lạc chủng N4 trên đĩa petri.......................................................277 Hình 3.15. Hệ sợi chủng N4 ở các độ phóng đại 40 X và 100X.............................................28 Hlnh 3.16. Cuống đính bào tử của chửng N4 ở độ phóng đại 100X....................................288 Hình 3.17. Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus theo Samson và cộng sự, (1995).... 29 Hình 3.18. Một số hình ảnh về khả năng lên men đường của hai chủng N3 và N 4 .............. 31 Hình 3.19. Khả năng chịu muối của chủng N3 và N4 ở nồng độ 6%.....................................32 Hình 3.20. Khả năng sinh tổng họp các enzyme thủy phân của chủng N3 và N4.................. 32 1 MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: công nghiệp, chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế... Các enzyme đang được sử dụng phổ biến protease, amylase, pectinase, glucooxydase, ... Cellulase là một trong số các enzyme được ứng dụng phổ biến trong công nghệ thực phẩm, công nghiệp dệt, bia - rượu, bột giặt, sản xuất phân bón hữu cơ, y tế, xử lý môi trường, ... Đặc biệt hiện nay cellulase được toàn thế giới quan tâm nghiên cứu và phát triển nhằm ứng dụng trong công nghệ chế tạo nhiên liệu sinh học. Đây là nguồn nhiên liệu thân thiện với môi trường và có thể giải quyết được vấn đề thiếu nhiên liệu khi các nguồn nhiên liệu truyền thống đang ngày càng cạn kiệt. Tuy vậy, hiện nay enzyme cellulase được sử dụng trong các ngành công nghiệp ở Việt Nam chủ yếu được nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao. Nước ta là một nước sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme cellulase là rất phong phú. Vì thế, việc nghiên cứu sản xuất ra các enzyme từ vi sinh vật phân lập từ tự nhiên tại Việt Nam hiện nay đang là một đòi hỏi cấp thiết. Việc tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sản xuất enzyme nhất là cellulase từ tự nhiên không những giúp tận dụng các nguồn gen quý hiếm có sẵn từ tự nhiên mà còn góp phàn bảo tồn gen, cải tạo các chủng vi sinh vật công nghiệp đã bị thoái hóa giống sau một thời gian sử dụng. Xuất phát từ lý do trên và tình hình nghiên cứu tại Việt nam, chứng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một số chủng vỉ sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulose từ rong giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang” với mục tiêu: thu thập các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase có thể thủy phân rong giấy với họat tính cao làm cơ sở cho việc sản xuất enzyme cellulase, ứng dựng trong sản xuất cồn từ rong biển một hướng đang được toàn thế giới quan tâm. 2 Nội dung của đề tài: 1) Phân lập và tuyển chọn được chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase cao từ rong giấy thu tại Hòn Chồng-Nha Trang; 2) Sơ bộ phân loại các chủng vi sinh vật sinh cellulase cao phân lập được; 3) Xác định một sổ yểu tổ ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng vi sinh tuyển chọn được. Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo không thể tránh được các hạn chế. Em rất mong nhận được các ý kiến góp ý của những ai quan tâm đến vấn đề này, để cho báo cáo thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cám ơn. 3 CHƯƠNG I. TÔNG QUAN l ễl ễ TỎNG QUAN VỀ CELLULASE 1.1.1. Giói thiệu về cellulose Cellulose là thành phàn cơ bản của thực vật. Ngoài ra, người ta còn thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật (VSV). Ở tế bào thực vật và một số tế bào vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi. Hình 1.1. Cấu trúc không gian của phân tử cellulose Cellulose không có trong tế bào động vật. Chúng là một homopolimer mạch thẳng, được cấu tạo bởi các P-D-glucose-pyranose. Các thành phàn này liên kết với nhau bởi liên kết glucose, liên kết các glucose này với nhau bằng liên kết a-1,4 glucoside. Các gốc glucose trong cellulose thường lệch nhau một góc 180° và có dạng như một chiếc ghế bành. Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc đường và được cấu tạo như hình 1.1 và hình 1.2. Hình 1.2. Cấu trúc phân tử celulose Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy. Người và hầu hết động vật không có khả năng phân hủy cellulose. Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sản phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thải hữu cơ. Tuy nhiên nhiều chủng v s v bao gồm nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn có khả 4 năng phân hủy cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007). Cellulase là phức hệ enzyme thủy phân cellulose tạo thành các phân tử đường P-glucose. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, cellulose bị phân hủy dưới tác dụng hiệp đồng của phức hệ cellulase bao gồm ba enzyme là Exo-Ị3-(l,4)glucananse hay enzyme Cl, Endo-P- glucananse hay endocellulase còn gọi là enzyme CMC-ase hay Cx và P-(l,4)-glucosidase hay cellobioase: • Exo-l,4-gluconase (hay cellobiohydrolase, Cl EC 3.2.1.91) giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC nhưng tác dụng mạnh lên cellulose vô định hình hoặc cellulose đã bị phân giải một phàn. Tác dụng lên cellulose kết tinh không rõ nhưng khi có mặt endoglucanase thi có tác dựng hiệp đồng rõ rệt. • Endo-l,4-glucanase (hay CMC-ase, Cx, EC 3.2.1.4) thủy phân liên kết J3-l,4glucoside và tác động vào chuỗi cellulose một cách tùy tiện, sản phẩm của quá trình thủy phân là cellobiose và glucose. Do thủy phân CMC hoặc cellulose theo kiểu tùy tiện nên endo-l,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi cellulose và tăng chậm các nhóm khử, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin. Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose. • /3-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21) thủy phân cellobiose và các cellodextrin khác hòa tan ừong nước sinh ra, chứng có hoạt tính cao trên cellobiase, còn cellodextrin thì hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên. Chức năng của /3-glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng của cellulase. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân cellulose thành cellobiose và cuối cùng thành glucose. Sự phân giải cellulose dưới tác dựng của hệ enzyme cellulase xảy ra theo 3 giai đoạn chủ yếu sau: 5 Trong giai đoạn thứ nhất, dưới tác dụng của tác nhân Cl, cellulose bị thủy phân thành cellulose hòa tan. Trong giai đoạn thứ hai, cellulose hòa tan sẽ bị thủy phân dưới tác dụng xúc tác của hệ enzyme cxtạo thành đường cellobiose. Ở giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của enzyme /3-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21), cellobiose bị thủy phân thành glucose. HO —ị HO—I C ellob io se or C e llo te tro s e Hình 1.3. Cff chế tác dụng của cellulase Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase ừong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loài phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm. 1.1.2. vsv sinh tổng họp cellulase Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vsv cả trong điều kiện vsv thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose, số lượng các loài vsv tham gia sinh tổng hợp enzyme hiếu khí và yếm khí. Các loài có ừong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số trường hợp các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia quá trình phân giải này. Bảng 1.1 dưới đây là một số loại học nghiên cứu kỹ nhất. vsv được các nhà khoa 6 Bảng 1.1. Một số vsv sản xuất cellulase Nâm sợi Xạ khuân Vi khuân Aspergillus nỉger Actinomyces aureus Preudomonas A.oryzae Act.ceỉlulose Fluorescens A.terreus Act.diastaticus B.megaterium A.syndoviỉ Act. roseus B. mensentero ides A. flavus Act.griseus Clostridium sp. Fusarium culmorum Act. melamocylas Acetobacter xylinum Fusarium oxysporum Act.coelicolor Vi khuẩn dạ cỏ Mucor pusiỉus Act.candỉdus Ruminoccus albus Perl, notatum Act. chromogenes Ruminobacter parum Penicillium spp Act. hygroscopicus Bacteroides Trichoderma lignorum Act.griseofulvin Amylophillus sp. Trỉchoderma reeseỉ Act.ochroleucus Clos.butiricum Trỉchoderma vỉride Act. thermofulcus Clos. locheheadil Trichoderma konongi Act.xanthostrums Cellulosemonas Thermonospora curvata 1.2. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE Hiện nay, enzyme cellulase được ứng dụng mạnh mẽ trong các ngành công nghiệp khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất bia rượu, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp dệt, sản xuất bột giặt, sản xuất giấy, trong nông nghiệp ... ứ n g dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật, đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ em. Một số nước đã dùng cellulase để xử lý các loại rau quả như bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo, m ỳ... hay xử lý 7 chè và các loại tảo biển... Hay trong công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, cellulase cùng với hemicellulase được ứng dụng nhằm làm tăng khả năng hấp thu các chất từ thức ăn. Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó có cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và quá trình đường hóa. Trong sản xuất agar-agar, sử dụng cellulase xúc tác để xử lý rong thu agaragar có chất lượng cao hom so với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào. Mặt khác khi sử dụng cellulase để xử lý rong thu agar-agar lại giúp hạn chế ô nhiễm môi trường so với phương pháp sử dụng acid vốn gây ô nhiễm môi trường. Cellulase ứng dụng trong xử lý môi trường: enzyme cellulase đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc phân hủy cellulose có trong chất thải, sự có mặt của enzyme cellulase sẽ giúp cho sự phân hủy cellulose trong tự nhiên dễ dàng và hiệu quả hơn. Hiện nay enzyme cellulase là thành phần quan trọng của chế phẩm sinh học (các chế phẩm EM) trong xử lý ô nhiễm môi trường. Trong nông nghiệp, cellulase được dùng để phân hủy cellulose từ các phế phụ phẩm để sản xuất phân bón hữu cơ thay thế cho các loại phân bón hóa học truyền thống làm giảm ô nhiễm môi trường cững như sự thoái hóa đất. Trong ngành công nghệ sản xuất bột giặt enzyme cellulase được sử dụng như một tác nhân nhằm làm hoàn thiện cho bột giặt (tẩy sạch vết bẩn, vải rờ mịn tay, sợi vải sáng bóng hơn và không làm hại da tay). Cellulase được ứng dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Sự phá vỡ màng tế bào là một việc đòi hỏi các kỹ thuật công phu và tốn kém. Người ta có thể thu nhận các tế bào tràn bằng phương pháp xử lý qua enzyme cellulase. Khi đó ta sẽ thu được tế bào trần của thực vật (protoplast) và tế bào trần nấm men (spheroplast). Chế phẩm cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền. Trong kỹ thuật tạo tế bào tràn ịprotoplas), người ta thường dùng chế phẩm cellulase tinh khiết để phá vỡ thành tế bào thực vật. ứ ng dụng cellulase phá vỡ thành tế bào thực 8 vật không làm tổn thương các cơ quan bên trong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn các nhân tố di truyền. Ngoài ra, việc sản xuất enzyme cellulase có hoạt độ cao để phân hủy cellulose thành các nguồn nhiên liệu sinh học đang được quan tâm đặc biệt trong ngành công nghiệp năng lượng sạch của toàn thế giới. 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN c ứ u VỀ ENZYME CELLULASE 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Nghiên cứu và ứng dụng của cellulase bắt đầu từ những năm 1950. Cuối thế kỷ XIX đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng tổng họp cellulase từ các loại vi sinh vật. Một số nghiên cứu về cellulase từ nấm của một sồ tác giả n h ư : Trichoderma reseii (Ogawa và cộng sự, 1991), Aspergillus sp. (Lusta và cộng sự, 1999), Schizophillum commune (Wilick & Seligy, 1985), Fusarium ỉini, Peniciỉlỉum funiculosum (Fogarty & Kelly, 1990). Năm 2000, Mawadza và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulase từ các loại nấm có tính đặc hiệu cao bao gồm phức hệ 3 enzyme: endoglucanase, cellobihydrolase và P-glucosidase thủy phân hoàn toàn cellulose. Trong số những nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của vi khuẩn thì Bacillus là chủng có khả năng sản sinh cellulase ngoại bào với số lượng lớn, và được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả đặc biệt là: B.subtilis (Park và cộng sự, 1991), B.polymxa, B.cereus (Robson & Chambliss, 1989), B.pumỉlus (Christakopoulos và cộng sự, 1999), Bacillus sp. KMS-330 (Ozaki & Ito, 1991) và KMS-635 (Ito và cộng sự, 1989). Do cellulase có nhiều ứng dụng, cho nên rất nhiều nghiên cứu về enzyme cellulase như: nghiên cứu về các tính chất hóa lý của chúng như xác định khối lượng phân tử của Macarrón và cộng sự (1993); Sang và cộng sự (1995); Henriksson và cộng sự (1999); Karisson và cộng sự (2001); Coral và cộng sự (2002); Hiroshi và cộng sự (2005), xác định nhiệt độ tối ưu của Isabel và cộng sự (1992); Macarrón và cộng sự (1993); Coral và cộng sự (2002), xác định pH tối ưu 9 (Macarrón và cộng sự, 1993; Coral và cộng sự, 2002), xác định ảnh hưởng của ion kim loại (Sang và cộng sự, 1995). 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Trong những năm gàn đây ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về vi sinh vật phân hủy cellulose và cellulase (Đặng Minh Hằng, 1999; Hoàng Quốc Khánh và cộng sự, 2003; Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007; Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự, 2006). Những nghiên cứu này chủ yếu đề cập vấn đề phân lập các chủng vi sinh vật và đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng họp cellulase như: tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng họp cellulase và tinh sạch, đánh giá tính chất hóa lý của cellulase từ chửng penicillỉum sp. DTQ - HK1 (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007). Nghiên cứu phân loại và xác định hoạt tính cellulase của chủng xạ khuẩn ưa nhiệt XKS2 (Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự, 2006). Từ các phân tích ở trên cho thấy hiện ở Việt Nam chưa có công tìn h nào công bố về việc phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh enzyme celluase từ rong giấy. Vì thế việc “Phân lập và tuyển chọn một sổ chủng vỉ sinh vật cỏ khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang” là cần thiết nhằm thu thập các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase có thể thủy phân rong giấy với họat tính cao làm cơ sở cho việc sản xuất enzyme cellulase ứng dựng trong sản xuất cồn từ rong biển - một hướng đang được toàn thế giới quan tâm. 10 CHƯƠNG II. NGUYÊN VẶT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1. Rong giấy: Mầu rong giấy mục được lấy từ bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang. Rong Giấy có tên khoa học là: Ulva retieulata, Thuộc ngành: Chỉorophyta, lóp: Chỉorophyceae, bộ: Uỉvales. 2ềl ề2ề vsv sinh cellulase: Bao gồm cả nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn hiện diện trên rong giấy. 2ềl ẽ3ề Môi trường nuôi cấy vỉ sinh vật * Môi trường phân lập VSV: các loại môi trường sử dụng: thạch thường, capek, ISP4, các môi trường đường (glucose, maltose, manitol, D-frucrose, sucrose, lactose) đều của Merck - Đức cung cấp. * Môi trường ISP - 4 (g/1): K2H P04.3H20 l g M gS04.7H20 1g CaC03 2g (NH4)2so 4 2g Tinh bột tan 10 g NaCl 1g Agar 15 g Nước 1 lít pH 6 -7 * Môi trường Capek - dox (g/1): NaNOa 3g k h 2p o 4 1g MgS04.7H20 0,5 g KC1 0,5 g Saccarose 30 g Agar 20 g 11 Nước cất 1 lít pH 5 -6 * Môi trường thạch thường (g/1): Nước mắm 10 ml Pepton 10g Agar 15 - 20 g Nước 1 lít pH 7 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u v s v có khả năng sinh enzyme cellulase cao là những chủng có khả năng phân giải tốt cơ chất cellulose. Vì thế các chủng v s v sinh enzyme cellulase cao thường hiện diện ở những nơi giàu nguồn cellulose như: rơm rạ mục, lá cây mục, gỗ mục, mùn cưa mục hay hiện diện trên thân rong... VI thế chúng tôi tiến hành phân lập và tuyển chọn những v s v sinh enzyme cellulase trên rong giấy và tuyển chọn các chửng sinh cellulase cao theo các bước sau: - Thu rong giấy đã ủ mục tại bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang. - Phân lập và tuyển chọn các chửng vsv trên môi trường thạch đặc trưng (chọn chửng v s v có vòng phân giải CMC lớn nhất là chửng có khả năng sinh cellulase cao nhất). - Sơ bộ phân loại các chủng vsv được tuyển chọn bằng phương pháp truyền thống. - Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng họp cellulase của chủng v s v được tuyển chọn. 2.2.1. Phưong pháp phân lập Tiến hành phân lập các mẫu rong như sau: Lấy 10 g rong đã ủ mục cho vào bình tam giác chứa 90 ml nước cất đã vô trùng, lắc đều rồi tiến hành pha loãng ở các nồng độ khác nhau. Pha loãng mẫu theo các nồng độ từ 10'1 - 10'8. Lấy 1 ml ở bình tam giác sau khi lắc đều cho vào ống nghiệm thứ nhất chứa 90 ml nước cất, lắc đều rồi lại lấy 1 ml cho vào ống nghiệm thứ hai, cứ làm như vậy cho đến khi được nồng độ thí nghiệm (để có số khuẩn lạc 12 trên đĩa phù họp, mẫu thường được pha loãng. Do hiếm khi biết trước được nồng độ v s v trong mẫu, người ta dùng nhiều nồng độ khác nhau). Tùy vào số lượng v s v nhiều hay ít mà ta cho nồng độ cấy thích họp (thường từ 10'3 - 10'8). Dùng môi trường thạch thường để phân lập các chủng vi khuẩn, môi trường Capek để phân lập các chửng nấm và môi trường ISP4 để phân lập các chửng xạ khuẩn. Các môi trường được hấp khử trùng rồi phân phối vào các đĩa peptri. Dừng pipet man hút 0.1 ml dịch đã pha loãng nhỏ vào đĩa thạch đã ghi tên mẫu, nồng độ và ngày phân lập. Dùng que cấy tran trang đều dịch mẫu trên mặt thạch. Sau đó cất và nuôi cấy mẫu phân lập ở 37°c. Sau khoảng 24 h vi khuẩn đã phát triển trên đĩa thạch tiến hành quan sát, tách và thuần khiết khuẩn lạc đối với vi khuẩn. Sau 2 - 3 ngày đối với nấm và 5 - 7 ngày đối với xạ khuẩn. + Đối với vi khuẩn: bề mặt nhẵn, ướt, khi dùng que gạt không còn lại trong thạch. + Đối với xạ khuẩn: bề mặt khô xù xì, có hình tròn. + Đối với nấm: có hệ sợi. Tách và thuần khiết khuẩn lạc: Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa peptri cấy rồi cấy vào ống nghiệm, mỗi khuẩn lạc cấy vào một ống (ghi kí hiệu đầy đủ để cho các bước nghiên cứu tiếp theo), đặt vào tủ ấm 37°c. Sau các khoảng thời gian thích họp cấy ziczac ra đĩa petri để tinh sạch các chủng v s v , tiến hành tinh sạch nhiều lần. Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy, kiểm tra độ thuần chủng của các khuẩn lạc và kiểm tra tế bào dưới kính hiển vi. Khi được khuẩn lạc thuần nhất và tách rời trên đĩa thạch thì cấy vào ống nghiệm giữ giống (hình 2.1). Phương pháp giữ giống và cấy chuyền: Sau khi tinh sạch xong ta chọn khuẩn lạc mọc riêng rẽ cấy vào ống nghiệm thạch nghiêng. Tiến hành cấy ziczac trên ống thạch nghiêng để được giống thuần khiết. Giống thuần khiết được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4°c, thời gian tốt nhất là 1 tháng. Sau 1 tháng tiến hành cấy chuyền định kì để đảm bảo dinh dưỡng cho vi sinh vật. Trước khi sử dụng chủng thuần khiết cần được hoạt hóa. 13 Phường pháp phân lập M ẩu rong Gạt đèn ÒHS! th ạ ch nsỉiiẻns €'E pspsr Tù iin Hình 2ểl ể Quá trình phân lập vỉ sinh vật sinh cellulase từ rong giấỹ Lưu ý: Mọi thao tác trên phải được tìiực hiện trong điều kiện vô trùng: • Tay và bề mặt tiệp xúc trong tủ cấy được khử trùng bằng cồnỄ • Không khí trong tủ cấy được khử trùng bằng tia u v . • Dụng cụ phải được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn. 2.2.2. Phương phảp tuyển chọn chủng v s v sinh cellulase mạnh nhất v s v được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng, ừong môi tmờng dịch thể. Sau 24 h đối với vi khuẩn, 36 - 48 h đối với nấm và 72 h đồi với xạ khuẩn tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút hoặc lọc thu dịch enzyme rồi đem xác định hoạt tính cellulase theo phương pháp Miller (phụ lục 02), (Miller, 1959). 2ẳ2ẳ3. Bế trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp • Phương pháp xác định thời gian nuôi cấy thích hựp Nấm mốc được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút ở các khoảng thời gian: 6; 12; 18; 24;30; 36; 42; 48; 54 và 60 h. Sau đổ lọc thu sinh khối và xác định hoạt độ enzyme. • Phương pháp xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp Nấm mốc được nuôi cấy trên môi trường bán rắn ở các nhiệt độ: 25; 30; 35; 40; 45; 50°c. Sau 36 - 48 h sấy ở nhiệt độ 50°c, đem nghiền mịn bằng máy nghiền bi rồi cho vào đó một lượng nước gấp 4 - 5 lần khối lượng canh trường để hòa tan 14 protein-enzyme từ khối canh trường nấm sợi. Sau đỏ đem xác định hoạt độ enzyme cellulase bằng phương pháp đổ dịch. * Phương pháp xác định nồng độ chất cảm ứng thích hợp Nấm mốc được nuôi cấy lỏng lắc 200 vòng/phút trong môi trường có chứa nồng độ chát cảm ứng (rơm và rong) ở các nồng độ từ 1% ~ 8%. Sau 36 - 48 h thu dịch lọc và xác định hoạt tính enzyme cellulaseỄ * Phưtmg pháp xác định pH môi trường nuôi cấy thích họp Nấm mốc được nuôi cấy lỏng lắc 200 vòng/phút trong môi trường có pH là : 3,4,5,6,7,8 ở nhiệt độ phòngỄSau 36 - 48 h đem xác định hoạt tính enzyme. Hình 2 2 ề Sơ đồ bấ trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấỹ thích họp 2.2.4. Phương pháp phân loại chủng vsv (phân loại theo phương truyền thống) Phân loại theo phương pháp truyền thống là phương pháp phân loại chủng v s v dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóaẺDựa vào đổ người ta phân pháp 15 loại chúng và các chi. Đối với nấm sợi chúng tôi tiến hành phân loại bằng phương pháp quan sát đặc điểm hình thái đặc trưng trên kính hiển vi. Nguyên lý: Nấm thường được nhận diện bằng các đặc điểm hình thái đặc trưng quan sát được dưới kính hiển vi. Tế bào nấm thường phát triển thành hệ sợi gọi là khuẩn ty thể. Sợi nấm có thể có hay không có vách ngăn. Khuẩn ty mọc lên trên bề mặt cơ chất thường là những cấu trúc mang bào tử. Cuống mang bào tử có thể phân nhánh hay không phân nhánh. Bào tử vô tính của nấm sợi thường tập trung trong hai nhóm là bào tử kín và bào tử trần. • Cách tiến hành: - Quan sát hình thái khuẩn lạc, màu sắc sợi nấm trên đĩa petri. - Lấy một miếng băng dính trong suốt, đặt mặt dính nhẹ lên khuẩn lạc nấm, sau đó lấy ra và áp sát vào phiến kính sao cho băng dính dính chặt vào phiến kính. - Quan sát phiến kính dưới kính hiển vi. 2.2.5. Kiểm tra khả năng lên men các loại đường và khả năng sinh hoi Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc cần kiểm ừa cấy vào mỗi ống nghiệm có chứa từng loại đường riêng biệt, để tủ ấm 37°c. Sau 24 - 72 h lấy ra đọc kết quả: Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng và ngược lại; v s v có khả năng sinh hơi khi có bọt khí trong ống duhaml. 2.2.6. Kiểm tra khả năng chịu muối Cấy vi sinh vật lên đĩa peptri chứa môi trường đặc trưng với các nồng độ muối khác nhau từ 1 - 11%, giữ trong tủ ấm 37°c. Sau 1 - 5 ngày lấy ra đọc kết quả, nếu v s v mọc được ta kết luận chúng có khả năng chịu muối và ngược lại. 2.2.7. Kiểm tra khả năng sinh tổng họp các enzyme thủy phân khác (protease và amylase) Nấm sợi được nuôi cấy trên môi trường capek lỏng, lắc 200 vòng/phút, sau 36 - 48 h tiến hành thu dich lọc và xác định hoạt tính các enzyme theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch chứa cơ chất đặc trưng (casein với protease và