Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn ACETOBATER XYLINUM cho màng mỏng

  • Số trang: 40 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 40 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn ngµnh Vi sinh vËt häc TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ---------------------***--------------------- TRẦN THỊ THOA PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM CHO MÀNG MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học HÀ NỘI - 2007 TrÇn ThÞ Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn ngµnh Vi sinh vËt häc Lêi c¶m ¬n Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này em đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của TS. Đinh Thị Kim Nhung, các thầy cô giảng dạy bộ môn Vi sinh. Đồng thời em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Sinh - KTNN đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này. Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2007 Sinh viên thực hiện Trần Thị Thoa Lớp 29A – Khoa Sinh – KTNN TrÇn ThÞ Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn ngµnh Vi sinh vËt häc LỜI CAM ĐOAN Tôi xin khẳng định đây là kết quả nghiên cứu của riêng cá nhân tôi, đề tài nghiên cứu này không trùng với công trình nghiên cứu của các tác giả khác. Tác giả Trần Thị Thoa TrÇn ThÞ Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn ngµnh Vi sinh vËt häc MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Bản cam đoan Mục lục Danh mục bảng và hình Đặt vấn đề 5 Nội dung 7 Chương 1. Tổng quan tài liệu 7 1.1. Lược sử nghiên cứu và phân loại vi khuẩn Acetobacter ..................... 7 1.2. Đặc điểm chung của vi khuẩn Acetobacter ...................................... 10 1.3. Một số đặc điểm của các nhóm vi khuẩn Acetobacter ...................... 14 Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 18 2.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................... 18 2.2. Trang thiết bị và hóa chất ..................................................................... 18 2.3. Môi trường ........................................................................................... 19 2.4. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 19 24 Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.1. Phân lập vi khuẩn axetic từ một số nguồn nguyên liệu ..................... 24 3.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum .......................... 29 cho màng mỏng 3.3. Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum …………… 34 Chương 4. Kết luận và kiến nghị 37 4.1. Kết luận …………………………………………………………..37 4.2. Kiến nghị …………………………………………………………..37 Tài liệu tham khảo TrÇn ThÞ Thoa 38 Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn ngµnh Vi sinh vËt häc DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH Trang Bảng: Bảng 1.1. Những đặc điểm phân biệt Acetobacter và ................................. 12 Gluconobacter so sánh với Pseudomonas. Bảng 3.1. Khảo sát khả năng tạo màng của các mẫu ................................. 29 vi khuẩn axetic. Bảng 3.2. Khảo sát khả năng tạo màng của một số ……………………….. 33 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum. Hình : Hình 1. Mẫu dịch lên men giấm ………………………………………..... 24 Hình 2. Mẫu lên men dịch hoa quả ……………………………………….. 25 Hình 3. Khuẩn lạc phân lập từ giấm .......................................................... 27 Hình 4. Khuẩn lạc phân lập từ dịch hoa quả……………………………… 28 Hình 5. Ảnh vi khuẩn Acetobacter xylinum trên …………………………. 35 kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. Hình 6. Vi khuẩn Acetobacter xylinum G11 trên môi trường …………….. 36 thạch TrÇn ThÞ Thoa nghiêng. Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn ngµnh Vi sinh vËt häc ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật và công nghệ, công nghệ sinh học (CNSH) đã trở thành một ngành kinh tế chủ đạo của nhiều quốc gia trên thế giới. Là một bộ phận của ngành CNSH, công nghệ vi sinh vật học đã và đang phát triển mạnh mẽ với những ứng dụng thiết thực vào nhiều lĩnh vực của cuộc sống như: công nghiệp, nông nghiệp, y học... Bằng việc ứng dụng các quá trình lên men vi sinh vật vào sản xuất các chế phẩm chúng ta đã tận dụng và tiết kiệm được chi phí trong việc giải quyết rất nhiều vấn đề ví dụ như nông nghiệp, công nghiệp, bảo vệ môi trường… Một trong những chủng vi khuẩn được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ lên men vi sinh vật học là vi khuẩn Acetobacter (còn gọi là vi khuẩn giấm). Khi nuôi cấy loại vi khuẩn Acetobacter trên bề mặt môi trường lỏng nó tạo thành một lớp màng có bản chất là hemixenluloza trên bề mặt thoáng của dung dịch. Màng này được dùng để làm ra những sợi tơ khỏe và có độ đàn hồi cao trong môi trường nước nóng. Màng này được xem như một nguyên liệu mới có tiềm năng ứng dụng để sản xuất micro có độ chính xác cao, sản xuất thạch dừa, sản xuất giấy chất lượng cao, trong công nghiệp sản xuất đồ ăn kiêng và đồ ăn tráng miệng… [13] Trong công nghiệp, nông nghiệp vi khuẩn này được dùng để sản xuất EM (Effective Micoorganisms) có tác dụng đa hiệu trên nhiều lĩnh vực đặc biệt trong lĩnh vực xử lý rác thải: EM giúp khử mùi hôi và giảm chi phí 10 lần so với đốt rác. Trong công nghiệp sản xuất giấy chất lượng cao người ta đã sử dụng nguyên liệu là màng hemixenluloza tạo thành trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn giấm. Trong công nghiệp thực phẩm, vi khuẩn Acetobacter (chủng Acetobacter xylinum) được sử dụng để sản xuất thạch dừa - một món ăn giàu dinh dưỡng và khá phổ biến hiện nay. TrÇn ThÞ Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn ngµnh Vi sinh vËt häc Hiện nay, khi nghiên cứu về những tính năng đặc biệt của màng hemixenluloza cho thấy nó còn có thể thay thế da tạm thời. Công nghệ y học hiện đại đã công nhận nghiên cứu ứng dụng màng hemixenluloza làm da nhân tạo là một hướng nghiên cứu triển vọng và có giá trị. Nó có thể thay thế da tạm thời cho những bệnh nhân bỏng từ cấp độ 1 đến cấp độ 4. Các bác sĩ phẫu thuật tạo hình, chữa bỏng cho các bệnh nhân bỏng cấp độ 2 ; 3 ; ghép da khi bị nhiễm trùng đã sử dụng da nhân tạo này và thấy có kết quả tốt như: màng bám chắc lên bề mặt ngay khi nước bốc hơi, nó không cho nước lỏng thấm qua nhưng lại cho hơi nước và khí di chuyển qua, màng có độ trong giúp dễ dàng quan sát sự biến chuyển của vết thương. Đây là những đặc điểm quan trọng trong ứng dụng y học [13]. Có thể nói vi khuẩn giấm đã và đang được ứng dụng nhiều hơn trong cuộc sống. Với mong muốn được tìm hiểu thêm về chủng vi khuẩn Acetobacter và những ứng dụng hữu ích của nó đặc biệt là ứng dụng làm da nhân tạo trong điều trị bỏng, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng”. TrÇn ThÞ Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn ngµnh Vi sinh vËt häc NỘI DUNG Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Lược sử nghiên cứu và phân loại vi khuẩn giấm Từ rất lâu trong lịch sử con người đã biết cách làm giấm song chưa hề nắm được cơ sở khoa học, càng không thể giải thích được bằng cách nào rượu loãng lại có thể biến thành giấm ăn. Cho đến đầu thế kỷ XIX, khi khoa học kĩ thuật phát triển, đặc biệt với sự ra đời của kính hiển vi, thế giới vi sinh vật được khám phá, con người mới biết được giấm là sản phẩm của quá trình lên men nhờ một nhóm vi sinh vật mà ngày nay người ta gọi chúng là vi khuẩn Acetobacter hay vi khuẩn axetic [4,5]. Năm 1822, Person đã tiến hành những nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn Acetobacter từ lớp màng thu được trên bề mặt các bình sản xuất giấm. Ông khẳng định đó là một loài vi sinh vật và gọi là Mycoderma aceti [7]. Năm 18, Kützing sau khi loại bỏ hết vi sinh vật trong chum làm giấm và thấy rằng giấm không được tạo thành nữa. Ông đã đưa ra nhận xét: quá trình lên men giấm nhất thiết phải có mặt vi sinh vật nếu không sẽ không diễn ra sự chuyển hóa rượu thành giấm. Cũng trong năm 18, Hansen (người Đan Mạch) đã tách được từ màng giấm ra hai loại vi khuẩn thuần khiết là Mycoderma aceti và Mycoderma pasteurianum. Từ năm 1862 đến năm 1868, Pasteur nhờ sự trợ giúp đắc lực của kính hiển vi đã chứng minh sự đúng đắn trong nhận xét của Kützing và Hansen và khẳng định bản chất của quá trình lên men giấm. Ông nghiên cứu lớp màng nhầy xuất hiện trên bề mặt bia, rượu vang và đi đến kết luận: màng đó được tạo thành do một loại trực khuẩn, và ông cũng gọi trực khuẩn đó là Mycoderma aceti. TrÇn ThÞ Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn ngµnh Vi sinh vËt häc Cùng với những nghiên cứu trên về vi khuẩn Acetobacter, các nghiên cứu khác cũng như những nghiên cứu sau này đều nhằm tìm hiểu rõ thêm và tìm cách cải thiện quá trình lên men giấm. Hiện nay, người ta đang đi vào nghiên cứu những ứng dụng mới của vi khuẩn Acetobacter bằng cách phân lập các chủng vi khuẩn thuần khiết, nghiên cứu các đặc điểm cấu tạo, sinh lý, sinh hóa của chúng nhằm tìm ra những chủng tốt nhất cho từng ứng dụng trên cơ sở đối chiếu với các tiêu chuẩn phân loại đã được đưa ra. 1.1.1. Các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn Acetobacter + Địa điểm nơi phân lập: là nơi cư trú có liên quan đến điều kiện môi trường sống. + Đặc điểm hình thái: đó là hình dạng tế bào, cách sắp xếp tế bào, khả năng di động, màu sắc, sự hình thành tiêm mao, vỏ nhày, màu sắc khi nhuộm Gram… + Đặc điểm nuôi cấy: dựa vào trạng thái vết mọc, đặc điểm vết mọc, đặc tính vết mọc (trơn, xù xì…), tính chất vết mọc (đục, trong…), màu sắc vết mọc trên môi trường thạch... Trên môi trường lỏng cần lưu ý tình trạng môi trường sau thời gian nuôi cấy (đục hay trong, có mùi hay không có mùi). + Đặc điểm sinh lý: mối quan hệ với các yếu tố nhiệt độ, pH của môi trường, khả năng hình thành sắc tố, quan hệ với oxy (thuộc loại hiếu khí hay kỵ khí…), khả năng lên men axetic, khả năng sử dụng các hợp chất vô cơ và hữu cơ. 1.1.2. Phân loại vi khuẩn Acetobacter Việc tiến hành phân loại vi khuẩn Acetobacter được thực hiện từ thế kỉ XIX. Từ năm 1898 Rothenback đã tiến hành phân loại, tiếp theo là Hoyer (1899). Cũng trong năm 1899, Beijerink đã phân loại vi khuẩn Acetobacter dựa vào hai dấu hiệu [6]: TrÇn ThÞ Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn ngµnh Vi sinh vËt häc - Một là: Khả năng sử dụng đạm amoni để thực hiện quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Acetobacter. - Hai là: Có hay không có giai đoạn di động trong quá trình phát triển. Còn Heneberg (1926) lại chia các vi khuẩn axetic thành 4 nhóm dựa vào nơi sống đặc trưng của chúng: - Nhóm 1: vi khuẩn không phát triển trên bia vì hoa Hublon độc với chúng. - Nhóm 2: vi khuẩn phát triển trên bia. - Nhóm 3: vi khuẩn phát triển trong dung dịch rượu vang. - Nhóm 4: vi khuẩn dùng để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh. Năm 1934, theo nghiên cứu của các nhà vi khuẩn học người Hoa Kỳ, vi khuẩn axetic có khả năng sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản của cacbon và nitơ nên đã kết hợp chúng vào họ Nitrobacteriaceae. Từ đó vi khuẩn axetic được gọi là Acetobacter. Năm 1936, Kenyver và Wanniel cùng Staniel đã đề xuất ý kiến ghép vi khuẩn Acetobacter vào họ Pseudomonas do chúng có hiện tượng ghép cực xoắn ở phần di động. Năm 1948, Vaught đã công bố những kết quả thu được khi quan sát sự di động của nhiều loại vi khuẩn: Acetobacter aceti, Acetobacter oxydans, Acetobacter zancens, Acetobacter melanognum, Acetobacter pasteurianum. Ông kết luận những loài trên cùng thuộc một loại có đơn mao ở cực và đã xác nhận vị trí của vi khuẩn Acetobacter ở trong họ Pseudomonas. Ngày nay, theo khóa phân loại của Bergeys (1914) và nhiều tác giả khác vi khuẩn Acetobacter và Gluconobacter – các vi khuẩn acetic - được xếp vào một họ riêng là Acetobacteriaceae. Trong khóa phân loại của Bergeys, đáng chú ý nhất là khóa phân loại các loài thuộc giống Acetobacter, ông đã phân giống Acetobacter thành hai loại: TrÇn ThÞ Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn ngµnh Vi sinh vËt häc Loại 1: Oxy hóa axit axetic thành CO2 và H2O. Loại này gồm: + Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (dung dịch Hoyer), đại diện là vi khuẩn Acetobacter aceti. + Không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất: trên bề mặt môi trường dịch thể nuôi cấy có tạo màng nhầy chứa xenluloza, điển hình vi khuẩn Acetobacter xylinum; trên bề mặt môi trường dịch thể nuôi cấy không tạo màng nhầy có chứa xenluloza, điển hình: Acetobacter zancens, Acetobacter pasteurianum, Acetobacter kneizianus. Loại 2: Không có khả năng oxy hóa axit axetic. + Tạo sắc tố nâu trên môi trường glucoza: - Sắc tố nâu đến đen nhạt: Acetobacter melanogenus. - Sắc tố hồng: Acetobacter zancens. + Không tạo sắc tố: - Nhiệt độ thích hợp nhất là giữa 30oC đến 35oC: Acetobacter suboxydan. - Nhiệt độ thích hợp nhất là giữa 18oC đến 21oC: Acetobacter oxydans. Năm 1960, Shilwel và Carr nghiên cứu về đặc trưng nuôi cấy sinh hóa của vi khuẩn Acetobacter và đưa ra kết luận không thể có sự phân loại đồng nhất vi khuẩn Acetobacter. Những nghiên cứu về đặc điểm, về sự phân loại vi khuẩn Acetobacter này đã tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo, đồng thời tạo thuận lợi cho việc ứng dụng các chủng vi khuẩn đó vào đời sống thực tiễn sau này. Hiện nay người ta đã sử dụng vi khuẩn giấm một cách rộng rãi trên quy mô công nghiệp tạo ra rất nhiều sản phẩm có ý nghĩa thực tiễn lớn. TrÇn ThÞ Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn ngµnh Vi sinh vËt häc 1.2. Đặc điểm chung của vi khuẩn Acetobacter Như đã nêu ở trên, tác nhân chính của quá trình lên men axetic là vi khuẩn Acetobacter. Dựa vào đặc điểm đối chiếu với các tiêu chuẩn phân loại học thấy rằng chúng thuộc vào hai giống vi khuẩn Acetobacter có chu mao hoặc không và Gluconobacter đơn mao, đó là hai giống vi khuẩn quan trọng nhất của họ Acetobacteriaceae (Lapent et al – 1990, Bergeys – 1989), chúng sống phổ biến trong tự nhiên, trên bề mặt lá, hoa quả,… có khả năng tạo ra axit axetic từ rượu etylic. Trong tế bào Gluconobacter không có chu trình Tricacbonxylic (ATC) hoạt động nên nó không thể oxy hóa axit axetic song lại có một chu trình khác thay thế (chu trình Glyoxylat), không oxy hóa axit axetic nhưng vẫn có chu trình photphoril hóa. Ngược lại trong tế bào Acetobacter xảy ra các quá trình trên. Khi so sánh vi khuẩn này với vi khuẩn thuộc giống Pseudomonas thấy chúng có những đặc điểm tương tự. Chúng chỉ khác Pseudomonas ở chỗ chịu được nồng độ axit cao hơn, khả năng chuyển hóa pepton yếu, ít di động và không sinh sắc tố. Nhiều loài vi khuẩn Acetobacter khi phát triển trên môi trường thiếu thức ăn hoặc môi trường đã nuôi cấy lâu ngày (môi trường già) dễ bị biến đổi hình thái (tế bào phình to, kéo dài hoặc phân nhánh). Tuy nhiên, cơ sở để xếp vi khuẩn axetic vào nhóm độc lập là khả năng oxy hóa rượu etylic thành axit axetic ở pH = 4,5. Ngoài ra, chúng còn thực hiện quá trình oxy hóa không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ khác (các loại đường và dẫn xuất của chúng) để tạo thành các hợp chất xeton hoặc các axit hữu cơ tương ứng. Vi khuẩn axetic chỉ phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí; nhiệt độ thích hợp từ 25oC – 30oC; pH thích hợp từ 4,5 – 6,8; hóa dị dưỡng hữu cơ. TrÇn ThÞ Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn ngµnh Vi sinh vËt häc Bảng 1.1. Những đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconobacter so sánh với Pseudomonas. Gluconobacter Đặc điểm so sánh 1. Vị trí tiêm mao Acetobacter Pseudomonas Đơn mao ở cực Chu mao hoặc Chu mao ở cực hoặc không không có 2. Phát triển ở pH: 4,5 + + _ 3. Oxy hóa etanol + + _ 4. Oxy hóa axit axetic _ + + 5. Oxy hóa Lactat _ + + 6. Glucoza→Gluconate + ± ± 7. Sử dụng Gelatin _ _ ± 8. Sử dụng tinh bột _ _ ± _ _ ± Lactose 9. Sắc tố huỳnh quang Ghi chú: Dấu (+) : có Dấu (-) : không Dấu (±) : có hoặc không Về hình dạng tế bào, vi khuẩn Acetobacter là những trực khuẩn hình que đến elip, kích thước từ 0,6 – 0,8 µm. Các tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi hoặc có loại tế bào hình cầu, có loại hình chỉ. Tùy thuộc vào điều kiện môi trường, nhiệt độ nuôi cấy một số loại có hình bán nguyệt. Vi khuẩn Acetobacter không có khả năng sinh bào tử, tạo màng nhầy, một số có khả năng di động nhờ tiêm mao, một số không có khả năng này [1], [2], [3]. Qua nhiều nghiên cứu về khuẩn lạc và màng vi khuẩn Acetobacter trên môi trường nuôi cấy cho thấy vi khuẩn Acetobacter phát triển tốt nhất trên môi trường nước bia, môi trường có chứa cao nấm men, glucoza, rượu etylic hoặc manitol. Trên môi trường đặc chúng phát triển thành những khuẩn lạc tròn, TrÇn ThÞ Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn ngµnh Vi sinh vËt häc đều đặn, đường kính trung bình là 3 mm. Một số loại như Acetobacter aceti, Acetobacter xylinum có khuẩn lạc rất nhỏ (d = 1 mm), bề mặt trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày và sẫm màu hơn các vùng xung quanh. Một số loại khác có khuẩn lạc lớn hơn (d = 4 – 5 mm), không có màu, mỏng như những hạt sương nhỏ, dễ dàng dùng que cấy gạt ra khỏi môi trường. Có loại tạo thành khuẩn lạc ăn sâu vào môi trường, khó lấy ra bằng que cấy. Trên môi trường lỏng vi khuẩn Acetobacter chỉ phát triển trên bề mặt môi trường tạo thành những màng dày nhẵn và trơn, khi lắc thì chìm xuống đáy bình và thay vào đó là một lớp màng mới được hình thành, dịch dưới màng này thường trong suốt. Khi nghiên cứu màng này thấy có sợi xenluloza giống như sợi bông. Loại thứ hai màng mỏng như giấy xelofan, một số khác trên bề mặt của màng không nhẵn mà nhăn nheo, một số nữa thì tạo màng mỏng dễ vỡ, bám trên thành bình và dịch nuôi cấy không trong [8]. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacter đối với nguồn cacbon, nitơ và các chất kích thích sinh trưởng là rất đa dạng. Chúng sử dụng chủ yếu đường glucoza hoặc saccaroza, rượu etylic và các axit hữu cơ khác làm nguồn cacbon; muối amoni làm nguồn nitơ; muối photphat làm nguồn photpho. Ngoài ra, trong quá trình phát triển chúng còn có nhu cầu với một số loại axit amin như: valin, alanin, prolin,… và một số chất kích thích sinh trưởng như: para-aminobenzoic, axit nicotinic, axit pantoneic, biotin,… các chất này có vai trò quan trọng trong sinh trưởng của vi khuẩn Acetobacter [9]. Một số vi khuẩn Acetobacter có khả năng tự tổng hợp polisaccarit phân tử lớn như: xenluloza, đextran và người ta ứng dụng khả năng này trong công nghiệp. Một số ít loài vi khuẩn Acetobacter có thể tổng hợp được những sợi xenluloza giống như bông, điển hình là Acetobacter xylinum. Một số loài tổng TrÇn ThÞ Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn ngµnh Vi sinh vËt häc hợp được đextran giống như Leuconostoc mesenteroides khi môi trường thiếu đextran hoặc xenluloza. Vi khuẩn Acetobacter có khả năng oxy hóa gluxit theo 4 hướng sau: - Hướng thứ nhất: không có sự photphoril hóa cơ chất với sự tham gia của các enzym đặc hiệu. - Hướng thứ hai: oxy hóa các hợp chất đã được photphoril hóa trong con đường Pentose phosphate - Hướng thứ ba: theo sơ đồ Enter – Doudroff. - Hướng thứ tư: theo chu trình Crep ( Krebs) hoặc Glyoxylat. 1.3. Một số đặc điểm của các nhóm vi khuẩn Acetobacter 1.3.1. Acetobacter aceti Trực khuẩn ngắn, kích thước 0,4 - 0,8 x 1 – 1,2 µm, không di động được, thường xếp thành chuỗi dài, bắt màu Gram âm, màu vàng với thuốc nhuộm iôt. Khuẩn lạc to, sáng trên Gelatin với dịch lên men chứa 10% đường saccaroza tạo thành màng nhầy, nhẵn. Chúng có khả năng phát triển trên môi trường có nồng độ rượu cao (11%) và có thể tích lũy đến 6% axit axetic trong môi trường. Chúng thường phát triển trên môi trường bia với nhiệt độ thích hợp là 30oC. 1.3.2. Acetobacter xylinum Trực khuẩn hình que, kích thước khoảng 2 µm, tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành từng chuỗi, không di động được, các tế bào được bao bởi chất nhầy tạo váng nhăn và dày: váng có chứa hemixenluloza nên khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm iôt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemixenluloza), chúng có thể tích lũy 4,5% axit axetic trong môi trường. Chúng thường sống chung với nấm men trong “nấm chè” còn gọi là “thủy hoài sâm”, “hải bảo” hay “vị bảo” - một loại nước chua có vị thơm dùng để pha nước giải khát trong gia TrÇn ThÞ Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn ngµnh Vi sinh vËt häc đình, trên bề mặt nước có một váng vi sinh vật dày được nuôi sống bằng nước chè đường. 1.3.3. Acetobacter pasteurianum Có hình dạng tương tự như Acetobacter aceti nhưng váng vi khuẩn có dạng khô và nhăn nheo, bắt màu xanh với thuốc nhuộm iôt, tế bào xếp dời nhau thành chuỗi, đôi khi bắt gặp tế bào có dạng hình chùy phồng lên, di dộng không thường xuyên. Khuẩn lạc trên Genlatin nhỏ, tròn. Nhiệt độ thích hợp để phát triển là 30oC. 1.3.4. Acetobacter acetosum Trực khuẩn có khích thước 0,4 – 0,8 x 1 µm. Các tế bào xếp riêng rẽ thành từng chuỗi, không di động được. Nhiệt độ thích hợp nhất cho chúng phát triển là 30oC – 36oC. 1.3.5. Acetobacter kützingianum Có màng nhầy, nhẵn ở mép và được nâng cao lên theo thành bình. Tế bào dạng trực khuẩn, ngắn, to, thô, không di động. Khuẩn lạc trên Gelatin với dịch lên men nhớt, nhỏ tạo thành màng xếp nếp to trên môi trường ẩm. Thích hợp phát triển ở 30oC. 1.3.6. Acetobacter shiitzenbacchii Trực khuẩn khá dài, kích thước khoảng 0,3 – 0,4 x 1,0 – 3,6 µm, thường xếp đôi hoặc đứng riêng rẽ, có thể tạo váng nhày và không bền vững. Có khả năng tích lũy trong môi trường đến 11,5% axit axetic do đó thường được sử dụng để chuyển hóa rượu thành giấm theo phương pháp Đức (phương pháp nhanh). 1.3.7. Acetobacter lindreni Trực khuẩn xếp riêng rẽ tạo chuỗi, thỉnh thoảng có tế bào phồng to như hình cầu, không di động. Khuẩn lạc trên Gelatin với dịch lên men tròn, nhỏ, TrÇn ThÞ Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn ngµnh Vi sinh vËt häc màu vàng; trên môi trường lỏng tạo váng màu nâu, nhớt. Thích hợp phát triển ở 25oC. 1.3.8. Acetobacter orleanense Trực khuẩn dài trung bình, không di động, gặp điều kiện nhiệt độ cao có thể sinh ra tế bào dị hình kéo dài hoặc phình to ra. Tạo váng vi khuẩn rất dày trên môi trường lỏng. Có thể phát triển trong môi trường có nồng độ rượu cao (10% - 12%) và tích lũy đến 9,5% axit axetic. Thường được dùng để chuyển hóa rượu vang thành giấm theo phương pháp Pháp (phương pháp chậm hay phương pháp Orleans). Thích hợp phát triển ở 25oC – 30oC. 1.3.9. Acetobacter suboxydans Có dạng hình que ngắn, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi ngắn, không có khả năng di động, tạo thành những váng mỏng ,dễ vỡ. Có khả năng chuyển hóa glucoza thành axit gluconic, oxy hóa rượu sobit thành socboza – dùng để sản xuất axit ascorbic – vitamin C. Loại vi khuẩn này muốn phát triển bình thường cần được cung cấp một số chất sinh trưởng: axit paraaminobenzoic, axit patoneic, axit nicotinic. 1.3.10. Acetobacter hoshigakii Trực khuẩn có kích thước 0,7 – 0,9 x 1,5 – 1,8 µm, thường xếp riêng rẽ không di động. Khuẩn lạc trên thạch với chất chiết rút từ đậu nành nhỏ, tròn, dạng hạt xám sau đó chuyển thành màu nâu. Khuẩn lạc trên thạch với dịch lên men tròn, màu trắng sữa, về sau phần giữa khuẩn lạc hóa nâu, phía ngoài màu vàng nhạt. Có khả năng tạo thành axit gluconic. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là từ 30oC – 35oC. 1.3.11. Acetobacter ascendens Trực khuẩn không di động, các khuẩn lạc trên glucoza, genlatin khô trắng với vành sáng chói. Trên môi trường lỏng tạo thành màng nhày chắc, nâng lên theo thành bình. Thích hợp phát triển ở 25oC. TrÇn ThÞ Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn ngµnh Vi sinh vËt häc 1.3.12. Acetobacter oxydans Trực khuẩn có kích thước 0,8 – 1,2 x 2,4 – 2,7 µm, các tế bào rời nhau hoặc xếp thành chuỗi. Quan sát trong chuỗi thấy có tế bào phồng to lên, di động. Khuẩn lạc trên gelatin tròn sau trở thành dạng không cân đối với sự phân nhánh đặc trưng. Nhiệt độ thích hợp từ 18oC – 21oC. 1.3.13. Acetobacter plicatum Trực khuẩn có kích thước 0,4 – 0,6 x 1,4 – 1,6 µm, không di động. Khuẩn lạc trên gelatin rượu vang tròn trịa, hơi nhô lên, sáng, ẩm ướt, nhớt. Nhiệt độ thích hợp từ 25oC – 30oC [4]. Hầu hết các loài Acetobacter thường phát triển tốt nhất ở 25oC – 30oC, đều có khả năng sử dụng muối photphat, đa số đòi hỏi cung cấp thêm vitamin, chúng có khả năng oxy hóa rượu thành axit và trong quá trình sinh trưởng, phát triển chúng tạo ra một lớp màng dày có bản chất hemixenluloza trên bề mặt môi trường nuôi cấy. Với những nghiên cứu hiện nay cho thấy lớp màng này có thể được ứng dụng vào rất nhiều nghành quan trọng có ý nghĩa thực tiễn trong cuộc sống. Đồng thời khả năng tạo màng của các chủng vi khuẩn trên rất khác nhau vì vậy cần phải tuyển chọn ra những chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng tốt nhất và phù hợp với mục đích sử dụng của từng loại màng. TrÇn ThÞ Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn ngµnh Vi sinh vËt häc Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi khuẩn thuần khiết được phân lập từ màng các nguồn nguyên liệu là giấm, dịch hoa quả loãng trong phòng thí nghiệm Vi sinh, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Từ các chủng phân lập được tuyển chọn ra những chủng có khả năng cho màng dai, mỏng, trong. 2.2. Trang thiết bị và hóa chất 2.2.1. Trang thiết bị Khi tiến hành nghiên cứu cần có những thiết bị và dụng cụ như: hộp lồng, ống nghiệm, bàn trang thủy tinh, phễu thủy tinh, cốc thủy tinh, que cấy, đèn cồn, lam kính, lamen, bình cầu, bình thủy tinh, bình tam giác, pipet, nồi hấp cao áp Autoclave, buồng cấy vô trùng, tủ sấy, cân phân tích, kính hiển vi quang học… 2.2.2. Hóa chất - Các loại đường chuẩn: glucoza, saccaroza, fructoza, mantoza, manitol. - Một số hợp chất hữu cơ: rượu etylic (C2H5OH), axit axetic (CH3COOH), pepton, agar-agar, dịch chiết nấm men (cao nấm men), axit xucxinic, axit lactic, phenolphtalein. - Một số hợp chất vô cơ: K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, Na2HPO4.12H2O, CaCO3, NaOH chuẩn. - Một số loại thuốc nhuộm: tím Gentian, dung dịch Fucshin, dung dịch Lugol, thuốc nhuộm iôt và H2SO4. TrÇn ThÞ Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chuyªn ngµnh Vi sinh vËt häc 2.3. Môi trường Chúng tôi đã sử dụng một số môi trường có thành phần như sau: Thành phần Môi trường Môi trường Môi trường số 3 Môi trường số 1 số 2 số 4 Nước máy 1000ml 1000ml 1000ml 0 (NH4)2SO4 8g 8g 0 0 (NH4)2HPO4 2g 2g 0 0 K2HPO4 5g 5g 0 0 KH2PO4 2g 2g 0 0 C6H12O6 20g 20g 20g 0 MgSO4.7H2O 2g 2g 0 0 CaCO3 10g 0 0 0 Agar-agar 20g 20g 0 0 Pepton 0 5g 5g 0 Na2HPO4.12H2O 0 0 5g 0 Dịch chiết nấm 0 0 5g 0 0 2ml 4ml 0 C2H5OH 2ml 2ml 2ml 0 Nước dừa 0 0 0 1000ml men CH3COOH Chú ý: Axit axetic (CH3COOH) và rượu etylic (C2H5OH) bổ sung sau khi hấp môi trường lần thứ ba [6], [8], [9]. 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phân lập vi khuẩn Acetobacter theo phương pháp của Vinogradski Để có được những chủng vi khuẩn Acetobacter, chúng tôi tiến hành phân lập từ các nguồn nguyên liệu là giấm, dịch hoa quả theo phương pháp phân lập của Vinogradski. Trước hết thực hiện quá trình lên men giấm trên các TrÇn ThÞ Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN
- Xem thêm -