Tài liệu Nghiên cứu tình trạng methyl hóa một số chỉ thị phân tử ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng việt nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN PHI CƯỜNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TÌNH TRẠNG METHYL HOÁ MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành/chuyên ngành: Công nghệ sinh học Khoa: CNSH-CNTP Khóa học: 2016-2020 Thái Nguyên – năm 2020 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN PHI CƯỜNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TÌNH TRẠNG METHYL HOÁ MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành/chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp: 48-CNSH Khoa: CNSH-CNTP Khóa học: 2016-2020 Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Dương Văn Cường 2. ThS. Vũ Hoài Nam Thái Nguyên – năm 2020 i LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo, hướng dẫn và động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn: Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới thầy giáo: TS.Dương Văn Cường người đã trực tiếp giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp. Tôi xin cảm ơn các Thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm đã dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Vũ Hoài Nam cùng các cán bộ, các anh chị làm việc tại Viện Khoa Học Sự Sống – Đại Học Thái Nguyên đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để tôi học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Xin trân trọng cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày 20 tháng 06 năm 2020 Sinh Viên Nguyễn Phi Cường ii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Danh mục các hóa chất sử dụng trong đề tài .................................. 15 Bảng 3.2: Danh mục các trang thiết bị sử dụng trong đề tài........................... 16 Bảng 4.1: Kết quả nồng độ DNA sau khi đo quang phổ ................................ 28 iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Bản đồ tỷ lệ mắc bệnh ung thư trên thế giới ước tính năm 2018 ........................................................................................................... 5 Hình 2.2: Biểu đồ tỷ lệ mắc ung thư chuẩn theo tuổi ước tính năm 2018 ........................................................................................................... 6 Hình 2.3: Biểu đồ tỷ lệ mắc ung thư chuẩn theo giới tính ước tính năm 2018 ........................................................................................................... 7 Hình 2.4: Biểu đồ ước tính tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong chuẩn hóa theo độ tuổi ................................................................................................................ 9 Hình 2.5: Quá trình methyl hóa DNA ............................................................. 10 Hình 3.2.2.1: Kết quả tách DNA bằng phương pháp của Campos và cộng sự ............................................................................................................ 23 Hình 3.2.2.2: Kết quả tách DNA bằng phương pháp sử dụng bộ KIT ........... 23 Hình 3.2.2.3: Kết quả tách DNA bằng phương pháp NAOH 2N ................... 24 Hình 3.2.2.4: Kết quả tách DNA bằng phương pháp lysis buffer .................. 25 Hình 4.5 : Vị trí kích thước gene FLI 1 .......................................................... 31 Hình 4.6. Thiết kế mồi khuếch đại cho promoter gene FLI 1......................... 32 Hình 4.7. Vị trí kích thước gene AGRN ......................................................... 32 Hình 4.8. Thiết kế mồi khuếch đại cho promoter gene AGRN ...................... 33 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DNA : Deoxirybonucleic Acid PCR : Polymerase Chane Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic Axit CRC : Colorectal Cancer (Ung thư đại trực tràng) SNP : Sequence Number PDU Kb : Kilo base – Kilo bazo nito Ng : Nanogam v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... i DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ ii DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................... iv MỤC LỤC ........................................................................................................ v PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................... 2 1.2.1. Mục tiêu tổng quát .................................................................................. 2 1.2.2. Mục tiêu cụ thể ........................................................................................ 3 1.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4 2.1.Ung thư đại trực tràng ................................................................................. 4 2.1.1. Khái niệm ung thư đại trực tràng ............................................................ 4 2.1.2.Cơ chế gây ung thư .................................................................................. 4 2.1.2.Tình hình ung thư đại trực tràng trên thế giới.......................................... 5 2.1.3.Tình hình ung thư đại trực tràng tại Việt Nam ........................................ 8 2.2. Methyl hóa và ung thư đại trực tràng ......................................................... 9 2.2.1. Methyl hóa DNA là gì ............................................................................. 9 2.2.3. Bất thường methyl hóa DNA trong ung thư đại trực tràng ................... 11 2.3. Nguyên lý kỹ thuật xác định mức độ methyl hóa DNA dựa trên biến đổi bisulfite............................................................................................................ 11 2.4. Giới thiệu về kỹ thuật xác định methyl hóa DNA hiệu năng cao Illumina Infinium 450K ................................................................................................. 12 2.5. Nghiên cứu trong nước và quốc tế ........................................................... 13 2.5.1 Một số nghiên cứu trong nước liên quan về gene FLI 1 và gene AGRN ......................................................................................................................... 13 vi 2.5.2 Một số nghiên cứu quốc tế có liên quan về gene FLI 1 ......................... 13 2.5.4 Nghiên cứu quốc tế về gene AGRN....................................................... 14 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................... 15 3.1.Vật liệu ...................................................................................................... 15 3.1.1.Các hóa chất, sinh phẩm......................................................................... 15 3.1.2.Mẫu bệnh phẩm ...................................................................................... 16 3.1.3.Trang thiết bị .......................................................................................... 16 3.2.Phương pháp.............................................................................................. 16 3.2.1.Tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô cố định formaldehyde .................. 17 3.2.2.Đánh giá chất lượng DNA tách chiết ..................................................... 23 3.2.3.Giới thiệu về phương pháp biến đổi bisulfite conversion ...................... 25 3.2.4.Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hóa ................................................. 26 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 28 4. Kết quả ........................................................................................................ 28 4.1.Kết quả đo hàm lượng DNA ..................................................................... 28 4.1.1.Phương pháp của campos và cộng sự .................................................... 28 4.1.2.Sử dụng bộ KIT ...................................................................................... 28 4.1.3.Phương pháp NaOH 2N ......................................................................... 29 4.1.4.Phương pháp Lysis buffer ...................................................................... 29 4.2 Phân tích in silico và thiết kế mồi ............................................................. 31 4.4.1 Gene FLI 1 ............................................................................................. 31 4.4.2. Gene AGRN .......................................................................................... 32 4.4.3. Kết quả thiết kế mồi .............................................................................. 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 35 1. Kết luận ....................................................................................................... 35 2. Kiến nghị ..................................................................................................... 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 36 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ung thư đại trực tràng là một trong những dạng ung thư hàng đầu trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Trong các cơ chế phân tử liên quan đến ung thư đại trực tràng, sự methyl hóa DNA là một trong những cơ chế có ảnh hưởng lớn. Các nghiên cứu về methyl hóa ở DNA đa phần được thực hiện trên quần thể người Châu Âu và người Châu Mỹ, hay nói cách khác là người da trắng là chính và một phần là người da đen. Các nghiên cứu trên quần thể người da vàng còn hạn chế về mặt số lượng. DNA methylation là một cơ chế epigenetics và cơ chế này không giống như cơ chế di truyền, cơ chế epigenetics có sự khác biệt bởi yếu tố môi trường. Yếu tố môi trường ở đây rất rộng, nó bao gồm các yếu tố như chủng tộc, chế độ ăn uống, chế độ sinh hoạt,… Trong những năm đầu của cuộc cách mạng sinh học phân tử, nghiên cứu ung thư chủ yếu tập trung vào thay đổi di truyền, bao gồm cả ung thư đại trực tràng. Cơ chế epigenetics là cơ chế rất cần thiết cho sự phát triển bình thường và duy trì các mẫu biểu hiện gen đặc hiệu của mô ở động vật có vú. Sự gián đoạn của quá trình biểu sinh có thể dẫn đến thay đổi chức năng gen và biến đổi tế bào ác tính.[1] Ở người, methyl hóa DNA là một trong những vấn đề được quan tâm và nghiên cứu chuyên sâu. Trong các tế bào bình thường, nó đảm bảo sự điều hòa biểu hiện gen và làm gen ổn định. Quá trình methyl hóa DNA có liên quan đến thay đổi histone và sự tương tác của các thay đổi biểu sinh, các thay đổi này rất quan trọng để điều chỉnh hoạt động của bộ gen bằng cách thay đổi cấu trúc chromatin. Quá trình methyl hóa bị hạn chế ở dư lượng cytosine và chủ yếu gặp trong dinucleotide cytosine-guanine (CG) (thường được viết tắt là CpGine). Dinucleotide này không được thể hiện trong toàn bộ bộ 2 gen, nhưng nó xuất hiện với độ dài tăng dần trong khoảng 0,3 kb và khoảng 40% gen người có chứa một đảo CpG trong vùng promoter. Việc bổ sung cộng hóa trị của một nhóm methyl thường xảy ra ở cytosine trong các dinucleotide CpG và tập trung thành các cụm lớn gọi là đảo CpG [2]. Việc phát hiện ra ung thư đại trực tràng hiện nay được xem là điều cần thiết, nhưng để phát hiện sớm không hề dễ dàng. Đặc điểm của khối u khi mới phát sinh là kích thước còn rất nhỏ, sau đó khối u tăng kích thước và bám vào thành ruột nhưng chưa đâm thủng thành ruột. Khi ở dai đoạn này, tỷ lệ sống sót của người mắc bệnh là 90%. Khối u sẽ tiếp tục tăng kích thước, đâm thủng thành ruột nhưng chưa di căn, tỷ lệ sống sót của người mắc bệnh lúc này giảm đi còn 70%. Bản thân những người mắc ung thư đại trực tràng họ thường không thể biết được những triệu chứng ban đầu của bệnh, tỷ lệ phát hiện bệnh là 39%. Khi tế bào ung thư đã di căn đến các vùng khác của cơ thể thì tỷ lệ phát hiện bệnh là 61%, lúc này tỉ lệ sống sót của người bênh chỉ còn 12% vì phát hiện quá muộn. Vì vậy, việc phát hiện sớm bệnh và tầm quan trọng của sự thay đổi methyl hóa DNA trong khối u có một ý nghĩa rất lớn đối với con người, trong tương lai methyl hóa có thể được phát triển thành một chỉ số theo dõi phác đồ điều trị ung thư. Xuất phát từ những lý do trên, chúng em tiến hành đề tài: “NGHIÊN CỨU TÌNH TRẠNG METHYL HOÁ MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG VIỆT NAM”. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1. Mục tiêu tổng quát Tìm ra những chỉ thị phân tử có mức độ methyl hóa DNA đủ lớn với tần số xuất hiện cao và đặc thù trong quần thể bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam. 3 1.2.2. Mục tiêu cụ thể - Tách chiết được DNA đạt được tiêu chuẩn từ mẫu mô bệnh nhân ung thư đại trực tràng từ mẫu cố định formaldehyde để vụ cho các nội dung thí nghiệm của đề tài. - Thiết kế được một số cặp mồi PCR đặc hiệu methyl hóa. 1.3. Nội dung nghiên cứu - Tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde của bệnh nhân ung thư đại trực tràng. - Phần tích được các đặc điểm, cấu trúc của gene trên máy tính. - Thiết kế được cặp mồi PCR đặc hiệu methyl hóa. 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.Ung thư đại trực tràng 2.1.1. Khái niệm ung thư đại trực tràng Vài thập kỷ trước, do điều kiện khoa học và cơ sở vật chất trang thiết bị chưa phát triển, bệnh ung thư đại trực tràng được chẩn là một bệnh rất mới. Ngày nay, ung thư đại trực tràng được xem là căn bệnh nguy hiểm đứng thứ tư trên thế giới với gần 900 000 ca tử vong hàng năm [3]. Ung thư ruột hay ung thư đại trực tràng là tên gọi chung của ung thư đại tràng và và ung thư trực tràng, tức là ung thư phát triển từ đại tràng hay trực tràng (là những phần của ruột già), nó được tạo nên bởi sự phát triển bất thường của các tế bào và có khả năng lan rộng ra các bộ phận khác của cơ thể. Dấu hiệu và triệu chứng bao gồm xuất hiện máu trong phân, tụt cân, đau bụng giữ dội, có sự thay đổi trong nhu động ruột và cơ thể luôn luôn cảm thấy mệt mỏi. Hầu hết các nguyên nhân gây bệnh ung thư đại trực tràng là do các yếu tố về lối sống không lành mạnh và độ tuổi, với chỉ một số ít trường hợp là do rối loạn gen di truyền. Bên cạnh vấn đề về tỷ lệ dân số già và thói quen ăn uống của các nước có thu nhập bình quân đầu người cao thì các yếu tố nguy cơ gây nên bệnh có thể kể đến ở đây bao gồm chế độ ăn không tốt, bệnh béo phì, hút nhiều thuốc lá, và ít hoạt động thể chất, lười tập thể dục. Những yếu tố về chế độ ăn làm tăng nguy cơ hình thành bệnh là nhiều người ăn thịt đỏ, thịt sống, sử dụng những sản phẩm thịt để lâu quá hạn, không đảm bảo về ăn chín uống sôi. Không chỉ thế mà vấn đề về sử dụng rượu cũng rất đáng nói, vì uống rượu nhiều cũng là yếu tố nguy cơ gây nên các bệnh về đường ruột như viêm đường ruột, trong đó bao gồm bệnh Crohn và viêm loét đại tràng [4]. 2.1.2.Cơ chế gây ung thư Sự hình thành ung thư đại trực tràng bắt đầu với sự biến đổi của niêm mạc biểu mô bình thường thành biểu mô tăng sinh. Những tế bào biểu mô ruột 5 tăng sinh mất tổ chức và cấu trúc của chúng và có khả năng hình thành adenomas. Adenomas sau đó có thể phát triển và xâm lấn vào vùng dưới niêm mạc và trở thành ung thư với khả năng phổ biến vào đại tràng. Chuỗi hoạt động này được gọi là chuỗi adenoma-carcinoma, từ đó có thể dẫn đến CRC. Ba cơ chế chính của sự mất ổn định di truyền: mất ổn định nhiễm sắc thể, mất ổn định kính hiển vi và kiểu hình methylator đảo CpG. Các cơ chế này có tác động đến các đường dẫn tín hiệu chính và dẫn đến mất kiểm soát sự tăng sinh tế bào, tăng trưởng tế bào không giới hạn và phát triển khối u [5]. 2.1.2.Tình hình ung thư đại trực tràng trên thế giới Theo dữ liệu của GLOBOCAN 2018, ung thư đại trực tràng (CRC) là bệnh ung thư đứng thứ tư trên thế giới và là dạng ung thư được chẩn đoán phổ biến thứ ba trên toàn cầu, bao gồm 11% trong số tất cả các chẩn đoán ung thư khác nhau. Hình 2.1: Bản đồ tỷ lệ mắc bệnh ung thư trên thế giới ước tính năm 2018 http://globocan.iarc.fr/ Khoảng 1.096.000 trường hợp ung thư ruột kết mới ước tính sẽ được chẩn đoán vào năm 2018, trong khi khoảng 704.000 trường hợp ung thư trực tràng mới được phát hiện. CRC là bệnh ung thư được chẩn đoán có tỷ lệ mắc nhiều 6 nhất ở nam giới với 10 trong số 191 quốc gia trên toàn thế giới. Còn chẩn đoán trên phụ nữ thì không có quốc gia nào có tỉ lệ cao cả [6]. Tỷ lệ mắc bệnh CRC không chỉ xảy ra nhiều ở nam giới hơn là nữ giới mà tỷ lệ đó còn gấp 3 đến 4 lần đối với các quốc gia đang phát triển. Tỷ lệ mắc bệnh chuẩn theo tuổi trên thế giới là 100.000 ca, ở cả hai giới là 19,7%, ở nam là 23,6% và ở nữ là 16,3%. Mặc dù tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi ở nam giới là 30,1%/100.000 ở các quốc gia có chỉ số HDI (chỉ số phát triển con người) cao, nhưng ở các quốc gia có HDI thấp thì tỷ lệ này giảm xuống (thống kê tương tự ở nữ là 20,9% và 5,9%). Năm 2018, khoảng 576.000 đàn ông và 521.000 phụ nữ được chẩn đoán mắc bệnh ung thư đại trực tràng [6]. Hình 2.2: Biểu đồ tỷ lệ mắc ung thư chuẩn theo tuổi ước tính năm 2018 http://globocan.iarc.fr/ Các nước phát triển là các nước có nguy cơ mắc ung thư đại tràng và trực tràng cao nhất. Đối với ung thư ruột kết, Nam Âu, Úc / New Zealand và Bắc 7 Âu là những khu vực có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất. Đối với ung thư trực tràng, các khu vực có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất là Đông Âu, Úc / New Zealand và Đông Á. Bắc Mỹ cũng là một trong những nơi có tỷ lệ mắc cao nhất đối với cả hai bệnh ung thư. Quốc gia có tỷ lệ mắc CRC cao nhất trên 100,000 dân là Hungary (70,6%) ở nam và Na Uy (29,3%) ở nữ. Tại Nhật Bản, Hàn Quốc, Ả Rập Saudi, Ô-man, Yemen, Bahrain, Qatar, Kuwait và Slovakia CRC cũng là bệnh ung thư được chẩn đoán nhiều nhất ở nam giới. Trong khi đó, tất cả các khu vực của Châu Phi, cũng như Nam Á thì CRC có tỷ lệ mắc thấp nhất đối với cả hai giới [6] . Hình 2.3: Biểu đồ tỷ lệ mắc ung thư chuẩn theo giới tính ước tính năm 2018 http://globocan.iarc.fr/ Ung thư trực tràng là một trong những bệnh gây tử vong nhiều nhất, với 310.000 ca tử vong, chiếm 3,2% tổng số ca tử vong do ung thư, ở độ tuổi từ 0 đến 74 tuổi, tử vong do ung thư đại tràng là 0,66% ở nam giới và 0,44% ở phụ 8 nữ. Nguy cơ tương tự ung thư trực tràng là 0,46% ở nam và 0,26% ở nữ. Tỷ lệ tử vong chuẩn hóa theo độ tuổi (thế giới) ở cả hai giới là 8.9% trên 100.000 ca CRC. Dự kiến đến năm 2030 gánh nặng toàn cầu về ung thư đại trực tràng sẽ tăng lên 60%, thêm hơn 2,2 triệu trường hợp mới và 1,1 triệu ca tử vong hàng năm [7]. 2.1.3.Tình hình ung thư đại trực tràng tại Việt Nam Tổng tỷ lệ mắc ung thư của tất cả các bệnh ung thư là trên 100.000 người, được Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IACR) đưa ra vào năm 2012, trong đó có 173 trường hợp đối với nam và 114,3 trường hợp đối với nữ. Những số liệu thống kê mới cho thấy tỷ lệ mắc ung thư cả hai giới ở các quốc gia là 125.000 trường hợp mới mỗi năm. Ước tính của IARC cho thấy tỷ lệ tử vong do ung thư là 148 trên 100.000 trường hợp đối với nam giới, 76.3 trên 100.000 trường hợp đối với nữ và 94.700 người chết vì ung thư mỗi năm. Năm bệnh ung thư thường gặp nhất tại Việt Nam ở cả nam và nữ là ung thư gan (17,6% trường hợp mới), ung thư phổi (17,5% trường hợp mới), ung thư dạ dày (11,4% trường hợp mới), ung thư vú (8,9% trường hợp mới) và đại trực tràng (7% tất cả các trường hợp mới). Từ những số liệu thống kê trên, sự thay đổi về tỷ lệ mắc các bệnh ung thư tại Việt Nam như sau. Chúng ta có tỷ lệ tương đối cao đối với ung thư gan và ung thư phổi, xếp sau đó là ung thư dạ dày, cuối cùng là ung thư vú và ung thư đại trực tràng. Tỷ lệ mắc bênh ung thư đại trực tràng tại Việt Nam là thấp nhất đối với các loại ung thư khác. Nguyên nhân ở đây là vì người dân Việt Nam đặc biệt là nam giới sử dụng rất nhiều thuốc lá gây ảnh hưởng rất lớn đến phổi, không những thế nhiều người dân điển hình như công nhân tiếp xúc rất nhiều với chất gây ung thư từ công việc, nghề nghiệp. Sự lão hóa của người cao tuổi, rượu bia và béo phì do lối sống không lành mạnh [8]. 9 Hình 2.4: Biểu đồ ước tính tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong chuẩn hóa theo độ tuổi (Thế giới) năm 2018, Việt Nam, cả hai giới, độ tuổi 0-74 http://globocan.iarc.fr/ 2.2. Methyl hóa và ung thư đại trực tràng 2.2.1. Methyl hóa DNA là gì Di truyền học là một lĩnh vực nghiên cứu về những thay đổi có thể xuất hiện trong hoạt các động hoặc chức năng của gen do sự thay đổi trực tiếp của chuỗi DNA. Những thay đổi này gồm đột biến, xóa, chèn và dịch. Ngược lại, biểu sinh học là lĩnh vực nghiên cứu về những thay đổi có thể xuất hiện trong hoạt động hoặc có trong chức năng gen mà không liên quan đến bất kỳ thay đổi nào của trình tự DNA. Mặc dù hầu hết tất cả các tế bào trong một sinh vật sống đều chứa cùng một thông tin di truyền, nhưng không phải tất cả các gen đều được biểu hiện đồng thời bởi tất cả các loại tế bào. Xét về ý nghĩa rông hơn, thì các cơ chế biểu sinh là cầu trung gian cho các sự biểu hiện gen đa dạng trong nhiều loại tế bào và mô của các sinh vật đa bào. Trong bộ gen của động vật có vú, quá trình methyl hóa DNA là một cơ chế biểu sinh liên quan đến việc 10 chuyển một nhóm methyl vào vị trí C5 của cytosine để tạo thành 5methylcytosine. Quá trình methyl hóa DNA này có vai trò điều chỉnh biểu hiện gen bằng cách thu thập các protein liên quan đến ức chế gen hoặc ức chế sự gắn kết của các yếu tố phiên mã với DNA. Trong lịch sử, quá trình methyl hóa DNA được phát hiện ở động vật có vú ngay khi DNA được xác định là vật liệu di truyền ( Avery et al , 1944 ; McCarty và Avery, 1946 ). Năm 1948, Rollin Hotchkiss lần đầu tiên phát hiện ra cytosine đã biến đổi trong một chế phẩm của tuyến ức ở loài bò, mà cụ thể là con bê non bằng phương pháp sắc ký giấy. Quá trình methyl hóa DNA được xúc tác bởi một họ methyltransferase DNA (Dnmts) chuyển một nhóm methyl từ S - adenyl methionine (SAM) sang carbon thứ năm của cytosine để tạo thành 5mC. Dnmt3a và Dnmt3b có thể xây dựng lên một bản sao methyl hóa mới để DNA chưa được sửa đổi thực hiện sửa đổi, do đó nó được gọi là de novo Dnmt (Hình a). Mặt khác, Dnmt1 hoạt động trong quá trình sao chép DNA, mục đích là sao chép mẫu methyl hóa DNA từ chuỗi DNA mẹ lên chuỗi DNA con mới được tổng hợp. Hình 2.5: Quá trình methyl hóa DNA 11 Tất cả ba Dnmts đều tham gia sâu rộng vào sự phát triển của phôi. Khi đạt thời điểm ngừng, các tế bào biểu hiện Dnmt sẽ giảm đi nhiều. Điều này cho thấy rằng mô hình methyl hóa DNA trong các tế bào postmitotic là ổn định. Tuy nhiên, các tế bào thần kinh postmitotic trong não động vật có vú trưởng thành vẫn có sự xuất hiện đáng kể của tế bào biểu hiện Dnmts, điều này làm tăng khả năng methyl hóa Dnmts và DNA có thể nó đóng một vai trò mới trong não ( Goto et al , 1994 ; Feng et al , 2005 ) [1]. 2.2.3. Bất thường methyl hóa DNA trong ung thư đại trực tràng Methyl hóa DNA là một trong những biểu sinh học có thể điều chỉnh biểu hiện của gen. Ở người, quá trình methyl hóa DNA xảy ra ở cytosine, nó được gọi là dinucleotide CpG (liên kết C-phosphodiester-G). Phần lớn các dinucleotide CpG trong bộ gen của con người đều bị methyl hóa, tuy nhiên ở trên gen có các khu vực tập chung nhiều CpG, những khu vực đó được gọi là đảo CpG và thường không được methyl hóa trong các tế bào khỏe mạnh bình thường. Các đảo CpG được tìm thấy ở các vùng promoter của ~ 40 406060% gen ức chế khối u. Chúng thường dài khoảng 200 B20002000 bps, có hàm lượng CG>50% và tham gia vào quá trình điều hòa biểu hiện gen. Dinucleotide methyl hóa CpG thường được tìm thấy trong gen, trong centromeres, trong các yếu tố retrotransCPon và trong các trình tự LINE-1, SINE / Alu, v.v. Theo một nghĩa nào đó, quá trình methyl hóa bình thường này về cơ bản được đảo ngược như quá trình của các tế bào ung thư [9]. 2.3. Nguyên lý kỹ thuật xác định mức độ methyl hóa DNA dựa trên biến đổi bisulfite Trong những năm qua, biến đổi bisulfite đã trở thành phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để phân tích methyl hóa DNA. Đó là cách thuận tiện và hiệu quả nhất để xây dựng lên một tấm bản đồ methyl hóa DNA cho từng cá nhân người bệnh. Là bước đầu tiên trong kỹ thuật phân tích của nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác, điều cực kỳ quan trọng là quá trình biến đổi bisulfite được 12 hiểu và áp dụng rất tốt trong thực tế. Chuyển đổi bisulfite là một quá trình tương đối khắc nghiệt, nó sẽ thay đổi đáng kể tính chất hóa học và tính chất vật lý của mẫu DNA. Trong quá trình biến đổi, DNA của chúng ta sẽ chuyển từ các phân tử sợi kép lớn và ổn định sang một loạt các phân tử sợi đơn bị phân mảnh ngẫu nhiên. Ngoài ra, hầu hết các cytosine đã được chuyển đổi thành uracil. Về cơ bản, sau khi trải qua sự biến đổi lớn như vậy thì DNA của chúng ta không còn giống DNA gốc nữa, nên ta sẽ phải lưu ý thực hiện một số điều chỉnh sao cho phù hợp với mục đích tiếp theo [10]. 2.4. Giới thiệu về kỹ thuật xác định methyl hóa DNA hiệu năng cao Illumina Infinium 450K Có hơn 28 triệu vị trí CpG (còn gọi là các điểm dinucleotide CpG) trong bộ gen của con người. Do sự ảnh hưởng ngày càng tăng trong nghiên cứu biểu sinh, quá trình methyl hóa DNA nói riêng, các nhà nghiên cứu khoa học họ cần một cơ sở dữ liệu tham khảo nơi có thể tìm thấy thông tin về các vị trí CpG. Thay vì sử dụng các cơ sở dữ liệu công cộng đang phát triển để cung cấp chính xác. Illumina đã phát triển một phương pháp nhất quán chỉ định vị trí CpG dựa trên thực tế hoặc trình tự tóm lược của từng vị trí CpG riêng lẻ. Phương pháp Illumina tận dụng các chuỗi bên cạnh một vị trí CpG để tạo ra một cụm vị trí CpG đặc biệt. Các số liệu này dựa trên những thông tin trình tự duy nhất và không bị ảnh hưởng bởi các phiên bản bộ gen khác. Illumina được chuẩn hóa thành thuật ngữ cũng tương đương với thuật ngữ chuỗi TOP / BOT thường được sử dụng để chỉ định chuỗi SNP. Ưu điểm của phương pháp này là nó sẽ luôn chỉ biểu thị định danh và định hướng cùng một số vị trí CpG giống nhau ngay cả khi cơ sở dữ liệu công cộng và bộ genome thay đổi. Điều này sẽ cho phép tất cả các nhà nghiên cứu khoa học dễ dàng nghiên cứu các điều tương quan đến vị trí CpG được xác định với nghiên cứu [10].