Tài liệu Nghiên cứu tình trạng methyl hoá chỉ thị phân tử sept9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng việt nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN HOÀI NAM Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TÌNH TRẠNG METHYL HOÁ CHỈ THỊ PHÂN TỬ SEPTIN 9 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG VIỆT NAM Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2016-2020 Thái Nguyên - năm 2020 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN HOÀI NAM Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TÌNH TRẠNG METHYL HOÁ CHỈ THỊ PHÂN TỬ SEPTIN 9 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG VIỆT NAM Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Lớp : 48-CNSH Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2016-2020 Người hướng dẫn : 1. PGS.TS. Dương Văn Cường 2. Th.S.Vũ Hoài Nam Thái Nguyên, năm 2020 i LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành được khoá luận tốt nghiệp này cùng với sự nỗ lực của cá nhân, em đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo và động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình. Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS. Dương Văn Cường, TS. Hoàng Phú Hiệp, Th.S Vũ Hoài Nam, người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa CNSH - CNTP đã dạy dỗ và giúp đỡ em trong suốt thời gian vừa qua. Em xin chân thành cảm ơn đến tới các cán bộ, anh chị làm việc tại Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ tạo điều kiện để em được học tập và nghiên cứu. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ giúp đỡ em vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện bản thân. Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày tháng Sinh viên Trần Hoài Nam năm 2020 ii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Bảng liệt kê các hoá chất cần sử dụng trong quá trình thí nghiệm ...........20 Bảng 3.2. Bảng liệt kê các dụng cụ cần thiết trong quá trình thí nghiệm .................21 Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm tách chiết DNA với bốn phương pháp .........................23 Bảng 3.4. Quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde bằng phương pháp A .......................................................................................................................23 Bảng 3.5. Quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô người cố định formaldehyde bằng phương pháp B ..........................................................................................................24 Bảng 3.6. Quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô người cố định formaldehyde bằng phương pháp C ..........................................................................................................25 Bảng 3.7. Quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô người cố định formaldehyde bằng bộ Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit [Theo hướng dẫn nhà sản xuất FavorPrep] ...................................................................................................................................26 Bảng 3.8 : Bố trí thí nghiệm tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde của bệnh nhân ung thư đại trực tràng ..............................................................................28 Bảng 3.9: Bố trí thí nghiệm .......................................................................................29 Bảng 3.11: Thành phần phản ứng PCR .....................................................................31 Bảng 3.12: Bố trí thí nghiệm chạy PCR khuếch đại gene FAT1 ..............................32 Bảng 4.1: Thống kê về độ tuổi phát hiện bệnh ung thư đại trực tràng .....................34 Bảng 4.2 : Thống kê giới tính của bệnh nhân ung thư đại trực tràng .......................34 Bảng 4.3: Thống kê về giai đoạn phát hiện bệnh ......................................................35 Bảng 4.4: Thống kê tỷ lệ phát hiện bệnh khi đã bị di căn của nghiên cứu này và tỷ lệ tương tự của Hoa Kỳ (được công bố bởi Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ) .......................35 Bảng 4.5 : Kết quả đo nồng độ DNA ........................................................................38 Bảng 4.6 : Kết quả đo tỷ số OD260/280........................................................................39 Bảng 4.7 : Kết quả đo tỷ số OD260/230........................................................................40 Bảng 4.8: Kết quả mức độ nhiễm tạp chất và phenol trong mẫu DNA của bốn phương pháp ...........................................................................................................................41 Bảng 4.9: Thống kê 4 phương pháp ..........................................................................42 Bảng 4.10 : Kết quả đo nồng độ DNA ......................................................................44 iii Bảng 4.11: Kết quả đo tỷ số OD260/280.......................................................................45 Bảng 4.12: Kết quả đo tỷ số OD260/230.......................................................................45 Bảng 4.13 : Trình tự promoter trên gene SEPT9 ......................................................47 iv DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 : Hình ảnh vị trí đại tràng và trực tràng ở người .......................................13 Hình 2.2: Quá trình xác định mức độ methyl hoá của DNA ...................................17 Hình 3.1: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gene FAT1 ......................30 Hình 3.2: Chu trình nhiệt chạy PCR khuếch đại gene FAT1 ....................................31 Hình 3.3 : Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gene FAT1 ...........................32 Hình 4.1. DNA được tách chiết từ mẫu mô cố định formaldehyde được tách chiết từ bộ KIT chuẩn của công ty Clini Sciences .................................................................36 Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm DNA được tách từ 4 phương pháp A, B, C và bộ KIT ............................................................................................................................37 Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm DNA được tách chiết từ mẫu mô 14173 - U phương pháp B ..........................................................................................................43 Hình 4.4: Vị trí và kích thước của gene SEPT9 ........................................................46 Hình 4.5: Thiết kế mồi khuếch đại promoter của gene SEPT9 ...............................47 Hình 4.6: Kết quả chạy khuếch đại gene FAT1 ........................................................48 Hình 4.7: Kết quả PCR khuếch đại gene FAT1 ........................................................49 Hình 4.8: Kết quả PCR gen FAT1 ............................................................................49 v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. ii DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. iv MỤC LỤC ...................................................................................................................v Phần 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................8 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................8 1.1 Mục tiêu của đề tài ................................................................................................9 1.1.1 Mục tiêu tổng quát .............................................................................................9 1.1.2 Mục tiêu cụ thể ...................................................................................................9 1.2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn...............................................................................9 1.2.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài ...............................................................................9 1.2.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài................................................................................9 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................10 2.1. Ung thư ...............................................................................................................10 2.1.1. Khái niệm ung thư ...........................................................................................10 2.1.1. Cơ chế hình thành bệnh ung thư .....................................................................10 2.2. Ung thư đại trực tràng ........................................................................................12 2.2.1. Khái niệm ........................................................................................................12 2.2.2. Các yếu tố nguy cơ ung thư đại trực tràng ......................................................13 2.2.3. Tình hình ung thư đại trực tràng ..................... Error! Bookmark not defined. 2.3. Mối liên hệ giữa Methyl hoá DNA và ung thư đại trực tràng............................14 2.3.1. Methyl hoá DNA .............................................................................................14 2.4. Nguyên lý kỹ thuật xác định mức độ methyl hóa DNA dựa trên biến đổi bisulfite ...................................................................................................................................16 2.5. Giới thiệu về kỹ thuật xác định methyl hóa DNA hiệu năng cao Illumina Infinium 450K ..........................................................................................................................17 2.6. Nghiên cứu trong nước và quốc tế về methyl hóa của gene SEPT9 trên bệnh nhân ung thư đại trực tràng ................................................................................................17 vi Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......20 3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu ...................................................20 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................20 3.1.2. Phạm vi nghiêm cứu........................................................................................20 3.1.3. Vật liệu và dụng cụ thí nghiệm .......................................................................20 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................................21 3.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................21 3.4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................22 3.4.1. Phương pháp thu thập và đánh giá số liệu ung thư CRC ở bệnh viện K TW ..........22 3.4.2. Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde ...................22 3.4.3. Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hoá bằng phương pháp thiết kế Insilicon. ....................................................................................................................28 3.4.4. Quá trình chuyển hoá bisulfite cho mẫu DNA. ...............................................29 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................................34 4.1. Kết quả thu thập và phân tích số liệu lâm sàng trên 151 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân ung thư đại trực tràng được thu thập ngẫu nhiên tại bệnh viện K TW ............34 4.1.1. Kết quả phân tích về độ tuổi phát hiện ung thư ..............................................34 4.1.2. Kết quả phân tích về giới tính .........................................................................34 4.1.3. Kết quả phân tích về giai đoạn phát hiện bệnh ...............................................35 4.1.4. Khảo sát về tỷ lệ mức độ cả bệnh khi phát hiện ra bị ung thư đại trực tràng tại bệnh viện K TW ........................................................................................................35 4.2. Kết quả tách chiết DNA .....................................................................................36 4.2.1. Kết quả lựa chọn phương pháp phù hợp tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde .............................................................................................................37 4.2.3. Kết quả tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde bằng B đã tối ưu và phương pháp sử dụng Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit ..........................43 4.3. Kết quả thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hoá. ................................................46 4.3.1. Thu thập thông tin gene SEPT9 từ cơ sở dữ liệu database .............................46 4.3.2. Xác định trình tự promoter trên gene SEPT9 .................................................47 4.3.3. Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hóa ..........................................................47 vii 4.4. Kết quả chuyển hoá bisulfite đối với DNA được tách chiết từ mẫu mô cố định formaldehyde của bệnh nhân ung thư đại trực tràng.................................................48 4.4.1. Kết quả chất lượng DNA chuẩn bị cho quá trình biến đổi bisufite ................48 4.4.2. Kết quả chuyển đổi bisufite ............................................................................50 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................51 5.1. Kết luận ..............................................................................................................51 5.2. Kiến nghị ............................................................................................................51 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................52 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ung thư đại trực tràng (Colorectal cancer - CRC) là một trong những loại ung thư phổ biến ở người. Trên thế giới, CRC xếp thứ 3 về tỷ lệ người mắc bệnh sau ung thư phổi và ung thư tuyến tiền liệt ở nam giới, đứng thứ 2 sau ung thư vú ở nữ giới. Ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc CRC đứng thứ năm sau ung thư gan, phổi, dạ dày và vú. Tỉ lệ mắc CRC chiếm 8,7% tổng số bệnh nhân ung thư.[1] Hằng năm, có hơn 945.000 người mắc bệnh ung thư đại trực tràng trên thế giới và có khoảng 492.000 bệnh nhân tử vong, trong số đó bệnh nhân châu Á chiếm 51,3% tổng số ca mắc trên toàn thế giới. Theo dự đoán của các chuyên gia tại Hội thảo Ung thư Việt Pháp lần thứ 3 diễn ra tại Hà nội, tới năm 2025 ung thư đại trực tràng sẽ vươn lên hàng thứ hai ở nam giới và thứ tư ở nữ giới. Việc sàng lọc thường xuyên có thể giúp phòng ngừa và phát hiện sớm ung thư đại trực tràng. Theo thống kê của Hiệp hội phòng ngừa Hoa Kỳ công bố mỗi năm có khoảng 60% bệnh nhân bị ung thư đại trực tràng tử vong, nếu được sàng lọc định kỳ thường xuyên tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh có thể sống thêm 5 năm tăng từ 46% đến 73%. Vì thế việc được sàng lọc thường xuyên sẽ giúp kéo dài thời gian sống khi phát hiện kịp thời.[5] Trong số những cơ chế gây nên ung thư nói chung và ung thư đại trực tràng nói riêng, cơ chế methyl hoá DNA có vai trò quan trọng. Những biến đổi về di truyền ngoại gen (epigenetic) có liên quan tới quá trình phát sinh ung thư. Nghiên cứu tình trạng methyl hoá DNA có tiềm năng ứng dụng cao trong sàng lọc, chẩn đoán lâm sàng và theo dõi điều trị ung thư.3 Gen SEPT9 ở người là một trong những chỉ thị sinh học hàng đầu để giúp phát hiện và chẩn đoán lâm sàng một số bệnh ung thư trong đó có ung thư đại trực tràng.[5] Trên thế giới đã có những nghiên cứu về tình trạng methyl hoá ở gene SEPT9 của bệnh nhân ung thư đại trực tràng, tuy nhiên những nghiên cứu trên đa số đều nghiên cứu trên đối tượng người da trắng và người da đen. Mặt khác, methyl hoá DNA có một phần nguyên nhân phụ thuộc vào sắc tộc và môi trường sống. Hiện nay, theo tìm hiểu của chúng tôi chưa có một nghiên cứu nào nghiên cứu về tình trạng methyl hoá DNA trên gene SEPT9 của bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam. Xuất phát từ những luận điểm trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu tình trạng methyl hoá chỉ thị phân tử SEPT9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam”. 1.1 Mục tiêu của đề tài 1.1.1 Mục tiêu tổng quát Thiết lập một số kỹ thuật làm nền tảng cho nghiên cứu khảo sát mức độ methyl hóa chỉ thị SEPT9 trên khối u của bệnh nhân CRC Việt Nam. 1.1.2 Mục tiêu cụ thể - Thu thập và phân tích một số dữ liệu lâm sàng trên tập hợp 151 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân ung thư đại trực tràng được thu thập ngẫu nhiên tại Việt Nam. - Tìm và tối ưu được phương pháp thích hợp để tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde. Tách chiết khoảng 50 mẫu DNA và đánh giá được chất lượng. - Phân tích in silico cấu trúc gene SEPT9 và thiết kế được bộ mồi PCR đặc hiệu methyl hoá. - Thực hiện được kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl hóa. 1.2 . Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.2.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài Nghiên cứu tình trạng methyl hoá chỉ thị phân tử SEPT9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam tạo tiền đề cho các nghiên cứu về methyl hoá gen chỉ thị phân tử khác của các bệnh ung thư. 1.2.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Nghiên cứu tình trạng methyl hoá chỉ thị phân tử SEPT9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam mở ra những hướng nghiên cứu liên quan đến ứng dụng trong sàng lọc, chẩn đoán và hỗ trợ điều trị bệnh ung thư đại trực tràng. Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Ung thư 2.1.1. Khái niệm ung thư Ung thư là sự tăng trưởng bất thường của các tế bào. Ung thư có thể phát sinh từ bất cứ cơ quan nào trên cơ thể hoặc có thể là các tế bào nhỏ đã mất khả năng ngừng phát triển, dẫn đến cơ thể bị mất khả năng kiểm soát.[1] 2.1.2. Cơ chế hình thành bệnh ung thư Có nhiều tác nhân gây ung thư, tất cả đều làm biến đổi hoặc đột biến các tế bào trong cơ thể dẫn đến sự tăng sinh mất kiểm soát của các tế bào này. Cơ thể được cấu tạo từ rất nhiều loại tế bào, các tế bào đều có sự phát triển và phân chia một cách có kiểm soát, các tế bào sẽ chết theo chu trình được lập sẵn (chương trình Apoptosis) và thay vào là các tế bào mới mạnh khoẻ để duy trì các chức năng của cơ thể. Các tác nhân gây đột biến như hoá chất độc hại, tia phóng xạ, các virus ung thư làm cho các tế bào bình thường bị đột biến gene hoặc NST, nên tế bào mất khả năng kiểm soát sự phân chia và liên kết tế bào. Vật liệu di truyền (DNA) của một tế bào bị thay đổi hoặc hư hỏng làm tăng sinh vô tổ chức các tế bào lỗi (tế bào ung thư). Các tế bào không chết đi theo chương trình Apoptosis như các tế bào bình thường mà tăng sinh và nhân lên một cách mất kiểm soát. Các tế bào này có thể sẽ tạo thành một khối lớn gọi là khối u. Không phải khối u nào cũng là ung thư, các khối u không lây lan ra các phần khác của cơ thể là khối u lành tính, không phải ung thư. Các khối u lành tính được cắt bỏ và đa số sẽ tái phát. Các khối u có khả năng di căn sang các phần khác gọi là u ác tính hay còn được gọi là ung thư.[1] Cơ chế gây bệnh ung thư do đột biến gene làm mất kểm soát chu kỳ tế bào. Cơ thể có hai nhóm gene kiểm soát chu kỳ của tế bào: Nhóm gene quy định yếu tố sinh trưởng và nhóm gene gây ức chế khối u. Ở các tế bào bình thường hai nhóm gene này hoạt động hài hoà với nhau. Tuy nhiên khi có đột biến, cơ chế này bị phá vỡ và tế bào nhân lên không kiểm soát.[1] Các giai đoạn phát triển của ung thư [1] : - Giai đoạn khởi phát: Bắt đầu từ khi tế bào gốc tiếp xúc với các tác nhân gây đột biến và trở thành tế bào khởi phát. - Giai đoạn tăng trưởng, thúc đẩy, chuyển biến: tế bào ung thư còn ở mức độ nhỏ, cư trú ở một mô trên cơ thể - Gian đoạn lan tràn: Giai đoạn này có thể kéo dài vài tháng hoặc vài năm. Các khối u tăng sinh mạnh mẽ. - Giai đoạn tiến triển, xâm lấn, di căn: Giai đoạn này là sự tăng kích thước của các khối u. Đây là giai đoạn khối u phát triển nhanh và xâm lấn các mô tổ chức khác. Có rất nhiều nguyên nhân gây nên bệnh ung thư, như: Yếu tố di truyền, tiếp xúc với các chất hoá học, các tia phóng xạ, hút thuốc lá thường xuyên, chế độ ăn uống không lành mạnh, lười vận động …Hầu hết các ung thư lần đầu được chẩn đoán dựa vào các triệu chứng xuất hiện hoặc nhờ vào quá trình tầm soát. Qua đó không thể chẩn đoán xác định được mà phải nhờ vào sinh thiết. Một số trường hợp ung thư khác được chẩn đoán tình cờ nhờ khi đang khám hoặc điều trị bệnh khác. Triệu chứng của hầu hết các bệnh nhân ung thư đều không rõ ràng. Khi xuất hiện triệu chúng rõ ràng thường là khi bệnh đã tiến triển trầm trọng. Thông thường ung thư có thời gian ủ bệnh khá dài, khoảng 10 năm hoặc hơn nữa tuỳ vào từng thể loại ung thư. Do đó cách phòng và điều trị ung thư hiệu quả nhất được khuyến cáo là nên đi khám sức khỏe định kì 6 tháng một lần. Do ung thư là tập hợp của nhiều dạng bệnh khác nhau nên triệu chứng của ung thư rất đa dạng và khác nhau tuỳ vào từng thể loại ung thư. Nói chung, triệu chứng của ung thư được chia làm ba nhóm chính : Triệu chứng tại chỗ: Các khối u bất thường hay phù nề, chảy máu, đau hoặc loét. Chèn ép vào các mô xung quanh có thể gây ra các triệu chứng như vàng da. Triệu chứng di căn : Hạch bạch huyết lớn lên, ho ra máu, gan to, đau xương, gãy xương ở những xương bị tổn thương và các triệu chứng thần kinh. Đau có thể gặp ở ung thư giai đoạn tiến triển, nhưng thông thường đó không phải là triệu chứng đầu tiên. Triệu chứng toàn thân : Sụt cân, chán ăn, suy mòn, tiết nhiều mồ hôi, thiếu máu và các hội chứng cận u đặc hiệu, đó là tình trạng đặc biệt được gây ra bởi ung thư đang hoạt động, chẳng hạn như huyết khối hay thay đổi nội tiết tố. 2.2. Ung thư đại trực tràng 2.2.1. Khái niệm Ung thư đại trực tràng (CRC) hay còn gọi là ung thư ruột, ung thư ruột kết hoặc ung thư trực là một trong những ung thư hàng đầu trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Ung thư đại trực tràng được đánh giá là dạng ung thư đứng thứ ba ở Mỹ trên cả nam và nữ .Ở Việt Nam, ung thư đại trực tràng là ung thư phổ biến thứ năm sau ung thư gan, phổi, dạ dày, vú.[5] Ung thư đại trực tràng thường xuất hiện phổ biến ở những người trên 50 tuổi.Tuy nhiên, những năm gần đây ung thư đại trực tràng có xu hướng xuất hiện ngày càng nhiều ở những người có độ tuổi trẻ hơn. Theo số liệu thống kê của WHO 2018, Việt Nam mỗi năm ghi nhận 15.000 ca mắc mới, tỷ lệ 13,4/100.000 dân và khoảng 7.000 ca tử vong. Trên thới giới, mỗi năm có thêm 8 triệu ca mắc mới, trong đó có 860.000 ca tử vong và con số này đang không ngừng tăng lên. Trong đó, các quốc gia châu Á chiếm 51,3% tổng ca mắc trên toàn cầu.[18] Đại tràng và trực tràng là phần cuối của hệ thống ống tiêu hóa, thường gọi là ruột già, đóng vai trò quan trọng trong việc xử lý các thức ăn không tiêu hóa được (chất xơ,...), một số vi khuẩn ở ruột già có thể sản xuất các vitamin cho cơ thể, hấp thụ thức ăn và tạo nên phân để thải ra ngoài. Đại trực tràng ở người trường thành thường có kích thước khoảng 1,5 - 1,8 m; phần ruột lớn hình chữ N gồm manh tràng, đại tràng lên, đại tàng ngang, đại tràng xuống, đại tràng sigma và trực tràng. Trực tràng là đoạn cuối của ống tiêu hóa đi từ chỗ nối đại tràng sigma cho đến đường lược, dài khoảng 15 cm. Trực tràng chia làm 3 phần: trực tràng trên cách rìa hậu môn 1218 cm, trực tràng giữa cách rìa hậu môn 6-12 cm và trực tràng rìa hậu môn dưới 6 cm.[2] Hình 2.1 : Hình ảnh vị trí đại tràng và trực tràng ở người [2] CRC là loại ung thư hay gặp đứng thứ 2 trong các loại ung thư đường tiêu hóa và là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong nếu không được chẩn đoán và điều trị sớm. CRC thường gặp là ung thư tuyến biểu mô, gây nên bởi sự phát triển bất thường của các tế bào có khả năng xâm lấn hoặc lan rộng ra các bộ phận khác của cơ thể và bắt gặp ở bất kì vị trí nào của đại trực tràng. Theo nghiên cứu của Kahamoui cho thấy 43% ung thư xảy ra ở vị trí của trực tràng, 25% là ở đại tràng sigma, đại tràng lên chỉ 18%, đại tràng ngang 9% và đại tràng xuống là 5%. 2.2.2. Các yếu tố nguy cơ ung thư đại trực tràng Có rất nhiều yếu tố nguy cơ gây nên bệnh CRC. Dựa vào thống kê có hai nhóm yếu tố chính gây bệnh[1]: Yếu tố di truyền: - Hoạt hóa các gene tiền ung thư, bất hoạt các gene ức chế khối u, sai hỏng trong sửa chữa ADN và di truyền. - Trong yếu tố di truyền, khi có thành viên trong gia đình được chẩn đoán mắc bệnh ung thư đại trực tràng thì nguy cơ mắc bệnh các thành viên khác cao gấp nhiều lần so với mức trung bình, phụ thuộc vào số thành viên mắc bệnh và độ tuổi mắc bệnh. Ngoài ra, có mối liên quan giữa các hội chứng bệnh và CRC: hội chứng Lynch, hội chứng Turcot, hội chứng Peutz-Jeghers sẽ dẫn đến bệnh CRC. Yếu tố không di truyền: - Viêm loét dạ dày lâu ngày, các tác nhân vật lý hóa học, chế độ ăn uống sinh hoạt hay do lão hóa. - Thói quen ăn uống: Chế độ ăn uống ít chất xơ, giàu đạm hay thói quen sử dụng bia rượu, hút thuốc lá thường xuyên có thể gây ra những biến đổi trong tế bào mô đại tràng dẫn đến viêm loét trực tràng và dẫn tới CRC. 2.3 . Mối liên hệ giữa Methyl hoá DNA và ung thư đại trực tràng 2.3.1. Methyl hoá DNA 2.3.1.1. Khái niệm Methyl hoá DNA là hiện tượng gắn thêm gốc methyl (-CH3) vào vị trí 5’C của nucleotide. Ở một số trường hợp, Adenine bị methyl hoá phổ biến đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bảo vệ đối với vi khuẩn. Trong khi đó ở động vật có vú, methyl hoá xảy ra ở cytosine đứng trước guanine trong phức CpG tạo thành 5 methyl Cytosine (5mC). Trong hệ gen người, đảo CpG là vùng nhiều phức CpG có kích thước từ 0,5 – 5,0 kb và thường tìm thấy ở các vùng promoter của các gen. Khi các đảo CpG bị methyl hoá, các gen không được phiên mã. Methyl hoá xảy ra ở các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen chiếm ưu thế so với các vị trí khác, bởi vậy khi đánh giá tình trạng methyl hoá DNA thường xem xét tại vùng chứa đảo CpG. Ngoài ra, methyl hoá DNA có vai trò nhất định đối với các tế bào ở trạng thái bình thường như in dấu gen, duy trì trạng thái dị nhiễm sắc, duy trì trạng thái bất hoạt một gen nhiễm sắc thể X ở động vật có vú. Ở tế bào bình thường, các Cytosine trong phức CpG không bị methyl hoá trong quá trình phát triển và biệt hoá mô, tuy nhiên các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen có thể bị methyl hoá dẫn đến tình trạng ức chế quá trình phiên mã của gen. Methyl hoá DNA được hình thành trong quá trình biệt hoá tế bào, làm tế bào mất một phần hoặc mất hoàn toàn khả năng phân chia tế bào. Methyl hoá DNA có tính đặc hiệu với các mô trong cơ thể và vai trò của hiện tượng này ở các tế bào khác nhau là không giống nhau. Ở tế bào bình thường, promoter mang các đảo CpG không bị methyl hoá có chức năng duy trì cấu trúc nhiễm sắc thực, đây là cấu trúc cho phép gen được biểu hiện. Tuy nhiên, trong quá trình phát sinh ung thư, CpG vùng promoter nhiều gen bị methyl hoá gây ức chế biểu hiện gen do thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể thực thành cấu trúc dị nhiễm sắc.[8] 2.3.1.3. Bất thường methyl hoá DNA trong ung thư đại trực tràng Ở người, methyl hóa một số vị trí CpG nhất định trong vùng promoter của gene ức chế khối u có thể dẫn đến gene không hoạt động và mất chức năng ức chế khối u dẫn đến sự bắt đầu phát triển của ung thư. Sự thay đổi bất thường của methyl hóa này đã được tìm thấy phổ biến trong ung thư đại trực tràng. Dựa trên các nghiên cứu đã công bố, methyl hóa bất thường xảy ra phổ biến ở giai đoạn đầu của bệnh và nếu kiểm tra tình trạng gene sẽ có thể phát hiện sớm tình trạng di căn ác tính của ung thư. Việc phát hiện methyl hóa trong các chất dịch của cơ thể như máu, nước tiểu, phân và mô đang là xu hướng nghiêm cứu của các nhà khoa học trên thế giới.[9] Gene O6-methyl Quanin-DNA methyl transferase (MGMT) mã hóa cho enzyme MGMT có chức năng sửa chữa DNA theo cơ chế loại bỏ các chất gây đột biến và gây độc từ O6-guanine trong DNA. Quá trình methyl hóa MGMT có liên quan đến việc thiếu biểu hiện mRNA đồng thời mất hàm lượng protein và hoạt động của enzyme. Sự thay đổi di truyền trong O6-methyl Quanin-DNA methyl transferase (MGMT), làm suy giảm khả năng của protein MGMT để loại bỏ nhóm alkyl hóa khỏi guanine O6 và do đó làm tăng tỷ lệ và nguy cơ gây ung thư.[6] Nhiều cơ chế điều hòa biểu hiện DNA mà không làm thay đổi trình tự nucleotide. Sự điều hòa biểu hiện thông qua quá trình methyl hóa các vùng kích thích gene là phổ biến ở ung thư đại trực tràng và cũng quan trọng như đột biến DNA trong việc làm bất hoạt các gene ức chế khối u. Quá trình methyl hóa liên quan đến sự liên kết cộng hóa trị của một nhóm methyl với vị trí 5 của cytosine và diễn ra trong các đảo CpG lặp đi lặp lại hoặc các đoạn DNA nhiều CpG trong vùng promoter. CpG gắn các cytosine (C) theo sau là guanosine (G), với một liên kết phosphodiester (p).[6] Trong các tế bào bình thường, đảo CpG thường được duy trì ở trạng thái không được methyl hóa. Trong trường hợp không bị methyl hóa, gene được thể hiện bình thường. Với sự hiện diện của quá trình methyl hóa, gen không được điều hòa phiên mã (tức là im lặng). Sự im lặng của gene ức chế khối u có thể là kết quả của quá trình methyl hóa liên quan đến cả hai bản sao của gene ức chế khối u, hoặc sự kết hợp mất một alen thông qua việc xóa hoặc đột biến kết hợp với im lặng của alen khác thông qua quá trình methyl hóa.[6] 2.4. Nguyên lý kỹ thuật xác định mức độ methyl hóa DNA dựa trên biến đổi bisulfite Xác định mức độ biến đổi trong quá trình methyl hoá DNA ngày càng trở nên quan trọng trong nghiên cứu y sinh và đặc biệt là trong nghiên cứu ung thư, vì các dấu ấn sinh học có vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán ung thư. Một số phương pháp được sử dụng để phân tích mức độ methyl hoá DNA, từ các kỹ thuật xác định các CpG, đến giải trinh tự gen hoặc lai với các microarrays. Nhiều kỹ thuật phân tích dựa trên các nguyên lý chung để xử lý DNA bằng bisulfite. Natri bisulfite chuyển đổi các cytosine không bị methyl hoá sang uracil, sau đó từ uracil chuyển hoá thành thymine sau khi đã qua quá trình khuếch đại phản ứng polymerase. Ngược lại các cytosine bị methyl hoá sau khi qua quá trình bisulfite sẽ không bị ảnh hưởng. Vì lý do độ nhạy, bước khuếch đại sẽ được xử lý sau quá trình bisulfite. Do phép đo các cytosine bị methyl hoá được đếm sau khi đã khuếch đại mà không phải DNA ban đầu, nên độ chính xác của PCR ảnh hưởng lớn tới độ chính xác của phân tích.[8] Sự khuếch đại DNA của kỹ thuật PCR sau khi đã được xử lý qua quá trình bisulfite thường làm đa dạng có chọn lọc các các alen không bị methyl hoá, hiện tượng đó được gọi là sai lệch PCR, do có thể đánh giá không chính xác mức độ methyl hoá. Tuy nhiên mức độ sai lệch PCR rất khó dự đoán. Một số phương pháp đã được đưa ra để giải quyết các điều kiện thí nghiệm cho sự khuếch đại không sai lệch. Một trong những phương pháp đấy là sử dụng các cặp mồi PCR được thiết kế đặc biệt trong đó có chứa các dinucleotide CpG (thường là 1 hoặc 2). Sử dụng cặp mồi đặc hiệu các tác dụng tạo điều kiện cho cặp mồi gắn được vào các alen bị methyl hoá và do đó có thể tránh được việc khuếch đại các alen không cần thiết. Để tránh sai lệch PCR, người ta thường tối ưu hoá các điều kiệu PCR như: nhiệt độ, thời gian, … Tuy nhiên phương pháp này tốn nhiều thời gian và công sức, vì vậy đã có một phương pháp khác được đưa ra. Thay vì điều chỉnh các điều kiện của phản ứng PCR người ta sẽ thay đổi một cách thích hợp các kết quả thu được sau khi khuếch đại. Để đạt được mục đích này, cần một quá trình phân tích xác định được mức độ methyl hoá của các mẫu DNA song song với việc chạy PCR mẫu DNA. So sánh và đưa ra độ lệch chuẩn chính xác cho kết quả .[8] Hình 2.2: Quá trình xác định mức độ methyl hoá của DNA bằng phương pháp chuyển hoá bisulfite.[8] 2.5. Giới thiệu về kỹ thuật xác định methyl hóa DNA hiệu năng cao Illumina Infinium 450K Khi phân tích sự thay đổi methyl hóa DNA trong đảo CpG, phương pháp điều chỉnh bisulfile natri để phân biệt giữa DNA bị methyl hóa và không methyl hóa kết hợp với sử dụng các enzyme hạn chế nhạy cảm với methyl (ví dụ R. Hpa II) và specific (ví dụ R. Mcr BCI) hoặc sử dụng thuốc thử đặc hiệu có ái lực cao cho methyl hóa (ví dụ kháng thể kháng 5meC hoặc polypeptide gắn methyl tái tổ hợp). Tuy nhiên, các kỹ thuật này đòi hỏi trình độ chuyên môn cao, chi phí lớn và mất thời gian. Trong khi đó methyl hoá DNA người Illumina Infinium 450K (Illumina Infinium Human Methylation 450K BeadChip) được phát triển để đánh giá định lượng methyl hóa trên bộ gene người hiệu quả trong xác nhận chức năng sinh học và chức năng methyl hóa của ung thư đại trực tràng. Áp dụng kĩ thuật này để xác định các vị trí methyl hóa mới có thể tương quan với sự hiện diện của CpG hoặc dẫn đến việc làm “im lặng gene”.[19] 2.6. Nghiên cứu trong nước và quốc tế về methyl hóa của gene SEPT9 trên bệnh nhân ung thư đại trực tràng a. Trên thế giới Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về ứng dụng methyl hóa của gene SET9 trên ung thư đại trực tràng. Năm 2017, Lele Song, Jia Jia ,Xiumei Peng, Wenhua Xiao và Yuemin Li công bố công trình nghiên cứu “Hiệu suất của xét nghiệm methyl hóa gen SEPT9 và so sánh với các xét nghiệm sàng lọc CRC khác” chỉ ra rằng xét nghiệm phát hiện ctDNA để sàng lọc ung thư đại trực tràng và phát hiện sớm cho thấy có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Tại Trung quốc, các nhà khoa học đã chỉ ra rằng bệnh nhân ung thư đại trực tràng có nồng độ methyl hoá trên gene SEPT9 dương tính và độ methyl hoá trên gene SEPT9 định lượng có liên quan chặt chẽ với các thông số bệnh lý lâm sàng. Xét nghiệm methyl hoá trên gene SEPT9 là một công cụ chẩn đoán chính xác và nhanh chóng cho bệnh nhân ung CRC Trung Quốc, nó có thể cho chúng ta biết thêm thông tin có giá trị về giai đoạn khối u hiện tại và có khả năng theo dõi tái phát CRC [ Xue Yang et al., 2019]. Cho đến nay, đã có 25 nghiên cứu độc lập được thực hiện để điều tra hiệu suất của xét nghiệm methyl hóa gen SEPT9 trong phát hiện CRC, trong đó hầu hết các nghiên cứu là nghiên cứu trường hợp hoặc đối chứng, trong khi chỉ có một nghiên cứu sàng lọc đa trung tâm ngẫu nhiên và hai nghiên cứu sàng lọc cơ hội được thực hiện để điều tra hiệu suất của nó trong dân số có nguy cơ trung bình và dân số có nguy cơ cao. Gần đây nhất, ngày 18/4/2020, hai nhà nghiên cứu Rohit Harihara và Mark Jenkins đã phân tích dữ liệu từ 19 nghiên cứu đã chỉ ra rằng: xét nghiệm mSEPT9 có khả năng sàng lọc CRC dân số với khả năng phát hiện khoảng hai phần ba trường hợp CRC và loại trừ 92% trường hợp không mắc.[10] b. Trong nước Nghiên cứu về methyl hóa trong ung thư ở Việt Nam còn rất hạn chế. Theo tìm hiểu của chúng tôi, chỉ có một vài công bố liên quan đến cơ thế methyl hóa chỉ thị các gene trên bệnh nhân ung thư ở người. Vũ Tràng Lan và cộng sự năm 2018 nghiên cứu methyl hóa BRCA1, RASSF1A và GSTP1 ở phụ nữ Việt Nam bị ung thư vú đã chỉ ra rằng sự methyl hóa trong các mô khối u của BRCA1, RASSF1A và lần lượt là 58,23%, 74,68% và 59,49% và ở các mô lân cận tương ứng là 51,90%, 63,29% và 35,44% .[11]