TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN
-----goCQos------
BÙI THỊ HUẾ
ẢNH HƯỞNG CỦA (NH4)2S04, KNO3 TỚI
KHẢ NẢNG TẠO MÀNG BC CHO VI
KHUẨN GLUCONACETOBACTER
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐẠI HỌC • • •
•
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Ngưòì hướng dẫn khoa học:
TS. PHƯƠNG PHÚ CÔNG
HÀ NỘI, 2015
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô PGS. TS. Đinh Thị
Kim Nhung, Giảng viên chính, tố Thực vật - Vi sinh, Trường Đại hoc Sư phạm Hà
Nội 2, và thầy TS. Phương Phú Công, Cục Khảo thí - Bộ Giáo dục và Đào tạo
người đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong thời gian học tập và nghiên cứu đề
LỜI CẢM ƠN
này.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tố bộ môn Thực vật - Vi
sinh, Khoa Sinh - KTNN, trường Đại học sư phạm Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt
kinh nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN,
Trung tâm thông tin thư viện, Phòng thí nghiệm Vi sinh vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã
tạo điều kiện thuận lợi cho em, hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân, những người luôn
quan tâm, động viên, kích lệ, giúp đõ' em trong suốt quá trình học tập, lựa chọn, tiến hành và
hoàn thiện đề tài.
Em xin trân thành cảm ơn ỉ
Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2015 Sinh viên
Bùi Thị Huế
Tôi xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật.Đây là kết quả của riêng
tôi. Tất cả các số liệu trong bảng biếu và hình ảnh đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý
thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả của bất kỳ tác giả nào đã
công bố dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung và TS. Phương Phú Công
Trong đề tài, tôi có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, tôi xin phép các tác
giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình.
Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2015 Sinh viên
Bùi Thị Huế
DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH TRONG KHÓA LUẬN
Bảng
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ KNO3 đến hình thành màng BC của
chủng Gluconacetobacter ...........................................................................30
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ (NH/ị^SCU đến hình thành màng BC
của chủng Gluconacetobacter ....................................................................32
Bảng 3.3. So sánh khả năng tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên
môi trường nước dừa và môi trường nước gạo thay thế nước dừa ...........35
Hình
Hình 3.1. Ket quả nhuộm Gram của Gỉuconacetobacter ..........................................23
Hình 3.2. Gluconacetobacter trên môi trường thạch đĩa...........................................24
Hình 3.3. Gluconacetobacter trong môi trường dịch lỏng........................................24
Hình 3.4. Hoạt tính catalase của chủng vi khuấn Gluconacetobacter .....................25
Hình 3.5. Vòng phân giải СаСОз.....................................................................................25
Hình 3.6. Vi khuẩn Gluconacetobacter trên môi trường thạch nghiêng.................26
Hình 3.7. Vi khuẩn Gluconacetobacter trong môi trường nhân giống cấp 1.........27
Hình 3.8. Màng BC từ chủng Gluconacetobacter ......................................................28
Hình 3.9. Lên men tạo màng trên MT3 có sự thay đổi hàm lượng KNO 3..................29
Hình 3.10. Sau 4 ngày lên men tạo màng BC trên MT3 có sự thay đổi
hàm lượng KNO3..........................................................................................30
Hình 3.11. Lên men tạo màng trên MT3 có sự thay đối hàm lượng
(NH 4 ) 2 so 4.....................................................................................31
Hình 3.12. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SƠ4 đến khối lượng tươi
của màng........................................................................................................33
Hình 3.13. Khối lượng màng BC thu được trên môi trường nước dừa và
môi trường nước gạo....................................................................................35
DANH MỤC TÙ VIÉT TẤT
BC:
Bacterial cellulose
cs:
Cộng sự
MT:
Môi trường
STT:
Số thứ tự
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU................................................................................................................................1
1.....................................................................................................Lý do chọn đề tài
....................................................................................................................................1
2...............................................................................................Mục đích nghiên cứu
....................................................................................................................................2
3...............................................................................................Nội dung nghiên cứu
....................................................................................................................................2
4....................................................................................................Ý nghĩa của đề tài
....................................................................................................................................2
5........................................................................................Phương pháp nghiên cứu
....................................................................................................................................2
6................................................................................................Điếm mới của đề tài
....................................................................................................................................2
Chương 1. TỎNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................................3
1.1...............VỊ trí và đặc điểm phân loại Gluconecetobacter trong sinh giới
....................................................................................................................................3
7.7.7. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới ...................3
ỉ.1.2. Đặc điềm phân loại của Gluconacetobacter .........................................3
1.2................................Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuấn Gluconacetobacter
....................................................................................................................................6
1.2.1.................................................................Anh hưởng của nguồn cacbon
6
1.2.2.....................................................................Nhu cầu nitơcủa vi sinh vật
6
1.2.3...............................................Hàm lượng ethanol trong dịch lên men
7
1.3.
Cấu trúc và sự hình thành màng BC từ vi khuẩn
Gluconacetobacter .... 7
1.3.1...........................Đặc điếm cấu trúc của m àng Bacterial cellulocse
7
1.3.2...............................Một sổ tính chất của màng Bacteriaỉ cellulocse
8
ỉ.3.3. Cơ chế tổng hợp Bacterial cellulocse .....................................................9
1.4.
Tình hình nghiên cứu vi khuấn Gluconacetobacter trên thế giới và
ở Việt Nam......................................................................................................................12
1.4.1..................................................................................................Trên thế giới
12
1.4.2..................................................................................................Tại Việt Nam
14
Chương 2. ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu.............................. 16
2.1.................................................................Đối tượng ngiên cứu và hóa chất
...........................................................................................................................16
2.1.1.....................................................................Đối tượng nghiên cứu
.....................................................................................................................16
2.7.2.......................................................................................Dụng cụ và thiết bị
16
2.1.3..........................................................................................................Hỏa chất
16
2.1.4......................................................................................................Môi trường
17
2.2...............................................................................Phương pháp nghiên cứu
...........................................................................................................................17
2.2.1................................................................Phương pháp vỉ sinh vật
.....................................................................................................................17
2.2.2......Phương pháp xác định trọng lượng tươi của m àng BC
.....................................................................................................................19
2.2.3....................................................................Phương pháp hóa sinh
.....................................................................................................................19
2.2.3.1.....................Phương pháp kiếm tra hoạt tính catalase
..............................................................................................................19
2.2.4....................................................................Phương pháp toán học
.....................................................................................................................19
2.2.5......Quá trình xử lí m àng BC từ chủng Gluconacetobacter
.....................................................................................................................20
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN..............................................23
3.1...................................Lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter
..................................................................................................................................23
3.1.1. Quan sát hình hình thái tế bào của chủng vi khuân
Gỉuconacetobacter ...................................................................................................23
3.1.2................................................Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa
23
3.1.3................................................Sinh trưởng trên môi trường dịch lỏng
24
3.1.4........................Đặc tính sinh hỏa của vi khuân Gluconacetobacter
24
3.1.5. Khảo sát khả năng lên m en tạo m àng BC từ chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter ...................................................................................................25
3.2.
Ảnh hưởng của KNO3 tới khả năng lên men tạo màng BC của
chủng vi khuẩn Gluconacetobacter ..........................................................................28
3.3.
Ảnh hưởng của (NH4)2SƠ4 tới khả năng lên men tạo màng BC của
chủng vi khuẩn Gluconacetobacter ..........................................................................31
3.4.
Khảo sát khả năng lên men tạo màng của chủng
Gluconacetobacter
trên môi trường dinh dưỡng từ nước gạo....................................................................34
KÉT LUẬN VÀ ĐÊ NGHỊ................................................................................................36
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................37
MỞ ĐÀU
1.
Lý do chọn đề tài
Màng sinh học (Bacterial cellulose; Biocellulose; BC) do vi khuẩn
Gluconacetobacter tạo ra có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose của thực vật
(gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liến kết P-1,4 glucorit). Cellulose vi
khuân khác với cellulose thực vật ở chô không chứa các hợp chất cao phân tử như:
ligin, peptin, hemicellulose, và sáp nến... Do vậy chúng có những đặc tính vượt trội
với độ dẻo dai, độ bền, chắc khỏe, độ đàn hồi.
Với những đặc tính hóa, lí ưu việt trên nên màng BC được xem như là một
nguồn polymer sinh học mới, nó thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học ngay
từ nửa sau thế kỉ XIX và được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực khác nhau như:
trong công nghiệp sản xuất giấy, màng BC được dùng đế sản xuất giấy điện tử chất
lượng cao; Trong công nghệ môi trường, màng BC làm màng phân tách để xử lý nước
và biến đổi độ nhớt của nước (Brown, 1989, Jonas và Fonah, 1998). Trong y học,
màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng,
loét da, làm mạch máu nhân tạo điều trị bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho con
người; Ngoài ra, màng BC còn được dùng làm chất mang đặc biệt cho các sợi pin và tế
bào năng lượng (Brown, 1989), làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay
thay thế thực phẩm...
Nhận thấy rằng nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng ảnh hưởng tới quá trình
sinh trưởng và phát triến của vi sinh vật. Đe tìm hiếu rõ hơn ảnh hưởng của nitơ tới
quá trình tạo màng BC mỏng, dai, có thời gian nuôi cấy ngắn nhất tôi đi đến quyết
định chọn đề tài: "Anh hưởng của (NH^ĩSOặ, KNOĩtởi khả năng tạo m àng
BCcho vi khuấnGluconacetobacter".
2.
Mục đích nghiên cứu
Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp cho lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter
3.
Nội dung nghiên cứu
1
3.1.
Lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter.
3.2. Ánh hưởng của KN0 3 tới khả năng lên men tạo màng BC của
chủng vi khuầnGluconacetobacter.
3.3. Ánh hưởng của (NH^SCUtới khả năng lên men tạo màng BC của
chủng vi khuẩn Gluconacetobacter.
3.4. Khảo sát khả năng lên men tạo màng của chủng
Gluconacetobacter trên môi trường dinh dưỡng từ nước gạo.
Ý nghĩa của đề tài
4.
4.1.
Ỷ nghĩa khoa học
Tìm được nguồn nitơ thích hợp nhất đối với khả năng tạo màng của chủng
Gluconacetobacter.
4.2.
Ỷ nghĩa thực tiễn
Tạo màng BC trong thời gian ngắn nhất và tốt nhất có triển vọng ứng dụng vào
một số lĩnh vực trong cuộc sống đặc biệt là lĩnh vực y học.
Phương pháp nghiên cứu
5.
6.
5.1.
Phương pháp vi sinh vật
5.2.
Phương pháp hóa sinh
5.3.
Phương pháp toán học
Điểm mới của đề tài
Đã lựa chọn được hàm lượng (NH4) 2S04 là 3g/l thích hợp cho lên men tạo
màng BC cho vi khuẩn Gluconacetobacter.
Chương 1 TỐNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.
Vị trí và đặc điểm phân loại Gluconecetobacter trong sinh giới
1.1.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới
Theo hệ thống
Gluconacetobacterthuộc
phân loại của
chi Acetobacter,
nhà
khoa học Bergey thì
họ
Pseudom onadaceae, bộ
Pseudom onadales, lớp Schizomm ycetes.Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn
2
acetic, là loài vi khuẩn tạo được nhiều BC nhất trong tự nhiên. Mỗi tế bào
Gluconacetobacter có thể chuyển hóa 108 phân tửglucose thành cellulose trong 1
giờ.
Ngày nay, việc phân loại vi khuẩn acetic nói chung và vi khuẩn
Gluconacetobacter nói riêng còn tồn tại nhiều quan điếm khác nhau. Vì vậy, đòi hỏi
cần nhiều nghiến cứu hơn nữa về loại vi khuấn này.
1.1.2. Đặc điếm phân loại của Gluconacetobacter
1.1.2.1.
Đặc điếm hình thái, tế bào học
Gluconacetobacter là trực khuấn hình
thước khoảng 2ụm , tế bào đứng riêng lẻ hoặc
que,
xếp
thắng hay hơi cong, kích
thành từng chuỗi, không có
khả năng di động, không sinh bào tử.Các tế bào được bao bọc bởi màng nhày có bản
chất là hemicellulose, màng này bắt màu xanh khi nhuộm axit H 2SO4, bắt màu hồng
khi nhuộm fucshin.Gluconacetobacter có khả năng tích lũy 4,5% acid acetic trong
môi trường, khi nồng độ acid trong môi trường khá cao sẽ ức chế hoạt động của vi
khuẩn [4].
Khuẩn lạc của Gluconacetobacter có kích thước lớn (đường kính khuẩn lạc
đạt 2-5 mm), tròn, bề mặt nhày và trơn bóng, phần giữa khuấn lạc lồi lên, dày hơn và
sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn.
Hình 1.1.Vi khuẩn Gluconacetobacter
ỉ.1.2.2. Đặc điếm nuôi cấy
Trên môi trường thạch đĩa, vi khuấn Gluconacetobacter hình thành khuẩn lạc
nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phang hay gợn sóng, màu trắng hoặc trong
suốt, khuẩn lạc lồi lên dễ tách khỏi môi trường.
Ở điều kiên nuôi tĩnh, trong môi trường dịch thế chúng sẽ hình thành trên bề
mặt môi trường môt lớp màng cellulose, đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với
các phân tử cellulose, trong tế bào xảy ra quá trình trao đổi chất nói chung còn ở
màng cellulose xảy ra quá trình trao đối oxy và các chất dinh dưỡng.
3
Ngược lại, khi nuôi cấy trong điều kiện lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ
với kích thước không đều nhau và phân tán trong môi trương dinh dưỡng tạo ra những
đặc tính hình thái khác hắn cellulose trong điều kiện nuôi tĩnh [ 6].
1.1.2.3.
Đặc điếm sinh lí,
sinh hóa + Đặc điểm sinh lí:
Vi khuấn Gluconacetobacter phát triến ở nhiệt độ 25 - 35°c, pH: 4 - 6 .
Nhiệt độ và pH tối ưu tùy thuộc vào giống.Ở 37°c, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay
cả trong môi trường tối ưu. Tuy nhiên vẫn còn những ý kiến khác nhau và nhiều tranh
cãi về điều kiện nhiệt độ, pH tối ưu cho chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sinh
trưởng và tạo màng.
Gluconacetobacter có khả năng chịu được pH thấp nên người ta thường bổ
sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.
+ Đặc điếm sinh hóa:
Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ vào
các tiêu chuấn: khả năng oxy hoa acid acetic thành CƠ 2và H2O; hoạt tính catalase;
khả năng tăng trưởng trên môi trường Hoyer... Theo quan điếm này
Gluconacetobacterìầ. chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudom onadaceae,
bộ Pseudom onadales, lớp Schiiomm ycetes. Đặc điếm phân biệt với các chủng
khác trong cùng một chi được trình bày ở bảng 1.1 dưới đây:
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuấn Gluconacetobacter
theo Frateur (1950)
STT
Đặc điểm
1
2
Hiện tượng
-Oxy hóa ethanol thành
-Chuyến hóa môi trường chứa
acid acetic
Bromphenol Blue 0,04% từ màu
-Hoạt tính catalase
xanh sang màu vàng
-Hiện tượng sủi bọt khí
4
Kết quả
+
+
3
-Sinh trưởng trên môi
-Sinh khối không phát triển
-
trường Hoyer
4
5
6
-Chuyển hóa glycerol
-Tạo kết tử đỏ gạch trong dịch sau
thành dihydroxyaceton
lên men
-Chuyển hóa glucose thành
-Vòng sáng xuất hiện xung quanh
acid
khuấn lạc trên môi trường chứa
-Kiếm tra khả năng sinh
CaCƠ3
-Không hình thành săc tô nâu
+
+
-
sắc tố nâu
7
-Kiểm tra khả năng tổng
-Váng vi khuẩn xuất hiện màu
hợp cellulose
xanh lam
1.2.
+
Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuấn Gluconacetobacter
1.2.1. Ảnh hường của nguồn cacbon
Đe vi khuẩn sinh trưởng và phát triến tốt hơn cần cung cấp nguồn cacbon phù
hợp, tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô cơ hay hữu cơ. Giá
trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào hai yếu tố: thành phần hóa
học và tính chất sinh lí của nguồn thức ăn, đặc điếm sinh lí của từng loại vi sinh vật.
Người ta sử dụng đường làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị
dưỡng. Đường đơn ở nhiệt độ cao có thế chuyến hóa thành loại hợp chất cố màu tối
khó hấp thụ. Trong môi trường kiềm sau khử trùng, đường còn dễ bị chuyến hóa làm
biến đổi pH môi trường. Đế tránh hiện tường này khi khử trùng môi trường có chứa
đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5 atm ở 110°c trong 30 phút. Từ các loại
đường đơn tốt nhất nên sử dụng phương pháp hấp gián đoạn (phương pháp Tyndal).
Đe nuôi cấy các loại vi sinh vật khác người ta sử dụng các nồng độ đường không
giống nhau, với vi khuẩn thường dùng 0,2 - 0,5% đường. Gluconacetobacter sinh
trưng chính trong môi trường có ethanol, glucose, glycerol.Có thế sinh trưởng trong
môi trường chỉ có D - mantolse.Hầu hết các chủng không sử dụng sucrose [7].
5
Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon và nitơ (pepton, nước thịt, nước chết ngô,
nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch...) có thể vừa dụng làm nguồn cacbon, vừa
sử dụng làm nguồn nitơ đối với sinh vật [7].
1.2.2. Nhu cầu nitơcủa vi sinh vật
Môi trường cơ bản cho nghiên cứu về cellulose vi khuấn là môi trường do
Hestrin và Schramm thiết lập [7], có chứa cao nấm men và peptone là nguồn hữu cơ,
(NH 4) 2S04 là nguồn nitơ vô cơ.
Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH 3 và NH 4 + .
Tuy nhiên, khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có sử dụng NH 4+ trong môi
trường sẽ tích lũy anion vô cơ (SO42 ', cr...) làm hạ thấp rất nhiều trị so pH của môi
trường. Muối anion của các acid hữu cơ ít làm chua môi trường hơn do đó có lúc được
sử dụng nhiều hơn (mặc dù dù đắt hơn).
Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với nhiều loại tảo, nấm sợi, xạ
khuẩn nhưng lại ít thích hợp với vi khuẩn, vì sau khi vi khuẩn sử dụng hết NO 3’ các
ion kim loại còn lại sẽ kiềm hóa môi trường [7]. Vi sinh vật có khả năng đồng hóa tốt
nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ, các thức ăn này vừa là nguồn cacbon vừa là nguồn
cung cấp nitơ cho sinh vật. Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp các
protein cao phân tử, chỉ có các polypeptid không chưa quá 5 gốc axit amin mới có thể
di chuyển trực tiếp qua màng tế bào chất của vi sinh vật [7].
1.2.3. Hàm lượng ethanol trong dịch lên men
Ethanol được sử dụng như một cơ chất.Hàm lượng ethanol có thế thay đối từ 2
- 10% V. Hàm lượng cao hơn sẽ làm giảm năng suất lên men. Theo Hong - J00 Son lại
công bố hàm lượng ethanol có thể thay đổi từ 0,2 - ỉ % tốt nhất là ở 0,6% [4]. Theo
Nodes, lượng ethanol duy trì trong môi trường luôn giữ ở 3 - 3,5%. Các tác giả Ebner
và Heirich, cho lượng ethanol dùng từ 7 - 10% V. Đe tránh hiện tượng oxy hóa hoàn
toàn acid acetic cần có mooti lượng ethanol sót trong sản phẩm từ 0,2 - 0,5% để ức
chế sự tổng hợp enzyme oxy hóa acid acetic và muối acetate [7]. Ngoài việc oxy hóa
6
ethanol, vi khuấn acetic còn có khả năng oxy hóa các rượu khác thành acid tương ứng.
1.3.
Cấu trúc và sự hình thành màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter
1.3.1. Đặc điểm cấu trúc của màng Bacterial celluỉocse
BC có đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực vật (PC- Plant
Cellulose). Màng BC được cấu tạo bởi chuỗi polyme ß-l,4glucopynanose mạch thẳng.
Có thành phần hóa học đồng nhất với cellulose thực vật nhưng cấu trúc và đặc tính lại
khác xa nhau [16].
7
Chuỗi polyme (3-1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành
sợi nhỏ (subfibril ) có kích thước 1,5 nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn hơn-sợi
vĩ mô (m icrofibril ) (Jonas and Farah, 1998), những sợi này kết hợp với nhau tạo
thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanaka et.al 2000). Dải ribbol có chiều dài
trong khoảng từ 1-9 nm. Những dải ribbol được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với
những dải ribbol của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc lực Van Der Waals tạo
thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màn mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy.
Hình 1.2. Sợi cellulose của màng BC Hình 1.3. Sợi cellulose của thực vật
1.3.2. Một số tính chất của màng Bacterial cellulocse
Brown A. J (1886), đã nghiên cứu các lớp màng đặc đo vi khuẩn
Gluconacetobacter tạo ra trên môi nuôi cấy và thấy có bản chất là hemicellulose.
Hemicellulose là những polysaccarid không tan trong nước nhưng tan trong dng dịch
kiềm tính.
Một số tính chất của màng BC: độ tinh sạch: màng BC có độ tinh sạch tốt hơn
rất nhiều so với các cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi
hoàn toàn; Độ bền cơ học: màng BC có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng
lớn, on định về kích thước; Tính hút nước: màng BC có khả năng giữ nước đáng kể
(lên đến 99%), có tính tơi xốp, độ ẩm cao.
1.3.3. Cơ chế tổng hợp Bacterial cellulocse
Quá trình tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hòa một
cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại enzyme, phức hợp
xúc tác các loại protein điều hòa [13].
Theo tác giả Alina Krystynowics và cs có 4 enzyme tham gia xúc tác tổng hợp
cellulose ở vi khuấn Gỉuconacetobacter. Glucokinase, Phosphoglucomutase,
Glucose - 1 - phosphate uridylytransferase (ƯDPG pyrophosphorylase hay UPG),
Cellulose synthase (CS). Trong đó UPG là enzyme có vai trò quan trọng nhất.
glucose
cellulose
Hình 1.4.Con đường sinh tống hợp cenlulose ở Gluconacetobacter
Hai giai đoạn chính sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn Giai
đoạn polymer hóa
Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa chuyển
glucose thành glucose-6-phosphate.Enzyme phosphoglucomutase tiếp tục chuyển hóa
glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate thông qua phản ứng isome
hóa.Glucose-1 -phosphate nhờ enzyme UDP-glucose pyrophosphorylase chuyển hóa
thành UDP-glucose.Cuối cùng, UDP-glucose được tổng hợp nên sẽ được chuyển hóa
9
thành cellulosevà cellulose được tiết ra mội trường ngoại bào nhờ một phức hợp
protein màng là cellulose synthase.Enzym này được hoạt hóa nhờ một nucleotide vòng
là cyclic-di-GMP.
Một số chủng vi khuấn Gluconacetobacter có khả năng sử dụng đường
fructose hiệu quả hơn. Hệthống enzyme phosphotransferase sẽ chuyển fructose thành
fructose-1-phosphate.Sau đó fructose-1-phosphate sẽ chuyến hóa thành fructose-biphosphate nhờ enzym
fructose-1-
phosphatekinase.Enzyme phosphoglucose isomerase có hoạt tính cao, sẽ giúp chuyển
hóa thành fructose-6-phosphate.Glucose-1 -phosphate lại tham gia vào quá trình
chuyển hóa tương tự như trên để tạo ra cellulose.
Giai đoạn kết tinh
Các chuỗi glucan được nối với nhau nhờ liên kết -1,4-glucan. Trong đó các
chuỗi glucan kết hợp tạo thành chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van Der Waals.Lớp
chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó chúng kết hợp với nhau
bằng liên kết hidro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16 chuỗi glucan. Các sợi cơ bản tiếp
tục kết hợp với nhau tạo thành các vi sợi, sau đó các vi sợi lại tiếp tục kết hợp với
nhau tạo thành các bó sợi [12].
Ý
nghĩa
của
quá
trình
sinh
tống
hợp
cellulose
của
vi
khuấn
Gluconacetobacter
Phần lớn tế bào trong môi trường tĩnh, Gluconacetobacter khôngdi động do
chúng nằm bên trong lớp màng cellulose. Điều này làm cản trở nghiên cứu về quá
trình chuyến hóa, vận chuyến chất dinh dưỡng và oxy đến tế bào.
Lớp màng cellulose do vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra bao xung quanh
môi trường hạn chế nguồn oxy từ bên ngoài vào môi trường, điều này ngăn cản sự
cung cấp oxy cho các vi khuẩn hiếu khác, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cạnh
tranh sinh tồn của vi khuẩn Gluconacetobacter. Màng cellulose có khả năng giữ
nước nên nên giúp cho vi khuấn phân hủy các chất dinh dưỡng đế sử dụng và giúp tế
1
0
bào chống lại ảnh hưởng của tia ƯV (tia tử ngoại). Nhờ tính dẻo dai và tính thấm nước
của các lớp cellulose mà các tế bào vi khuẩn kháng lại được những thay đổi không
thuận lợi trong môi trường sống như: giảm độ ấm, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc
hại. Các vi khuẩn Gluconacetobacter có thể tăng trưởng và phát triển bên trong lớp
vỏ bao.
Thực nghiệm chỉ ra rang cellulose bao quanh tế bào vi khuấn bảo vệ chúng khỏi
tia cực tím. Khoảng 23% số tế bào Gluconacetobacter được bao bọc bởi BC sống sót
sau 1 giờ xử lý bởi tia cực tím. Khi tách BC ra khỏi tế bào, khả năng sống sót của tế
bào giảm chỉ còn khoảng 3% [6].
Mạng lưới BC là giá thể chống đỡ cho vi khuẩn Gluconacetobacter luôn ở bề
mặt tiếp giáp giữa môi trường lỏng và không khí. Chính mạng lưới này làm cho các tế
bào có thế bám chặt trên bề mặt môi trường và làm tế bào thâu nhận chất dinh dưỡng
một cách dễ dàng hơn so với khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới
cellulose [10]. Trong môi trường tự nhiên, đa số vi khuẩn tổng hợp các polysaccharide
ngoại bào để hình thành nên lớp vỏ bao quanh tế bào và màng BC là một điến hình.
Một vài nghiên cứu còn cho thấy, cellulose được tổng hợp bởi
Gluconacetobacter còn đóng vai trò tích trữ và có thế sử dụng khi vi sinh vật này bị
thiếu dinh dưỡng. Sự phân hủy cellulose được xúc tác bởi enzyme exo gluconase hay
endo glucanase. Các enzyme exo gluconase hay endo glucanase phân hủy cellulose
được phát hiện trong dịch nuôi cấy ở một và chủng Gluconacetobacter sản xuất
cellulose [10].
1.4.
Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Gluconacetobacter trên thế giới và ở
Việt Nam
1.4.1. Trên thế giới
Vi khuấn Gluconacetobacter và màng BC đã thu hút được sự chú ý của nhiều
nhà khoa học trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: công nghệ môi
trường, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, y học... Các nghiên cứu hiện nay về
1
1
màng Bc trến thế giới đã tập trung vào vấn đề đề sản xuất và ứng dụng các sản phẩm
từ màng BC vào các lĩnh vực khác nhau.
Nghiên cứu về màng BC từ vi khuấn Gluconacetobacter và những ứng dụng
của nó đã được hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown, 1999, dùng màng BC
làm môi trường phân tách cho quá trình xử lí nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho
các pin và năng lượng tế bào. Brown, Jonas và Farad, dùng màng như một chất đế biến
đối độ nhớt, đế làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học,
thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm. Đặc biệt Jay shah, Brown. M. R. (2005) đã dùng
BC làm vải đặc biệt, Barbara Surma và cộng sự (2008), Jonas và Farad (1998) dùng
màng BC để sản xuất giấy chất lượng cao, làm cơ chất đế cố định pritein thay co sắc
kí. Đặc biệt, trong y học, người ta đã chế tạo các phức chất (vật liệu composite) từ sự
kết hợp giữa cellulose và chitosan, hoặc cellulose và polyvinul, các phức chất này
được sử dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm
sạch máu điều trị các bệnh tim mạch.
Các sản phẩm chế tạo từ microbial cellulose cũng được ứng dụng trong phẫu
thuật và nha khoa. Ngoài ra, màng BC còn được sử dụng làm mặt nạ dưỡng da cho phụ
nữa, làm giấy chất lượng cao, microbial cellulose được dùng chế tạo màn hình điện tử,
vải nonwoven (vải không qua dệt), thực phấm phụ gia,...
Trong những năm gần đây có một số công trình nghiên cứu về ảnh hưởng của
nguồn cacbon dến khả năng hình thành màng cellulose; nghiên cứu chế tạo màng từ vi
khuẩn và nghiên cứu đặc tính màng, đồng thời nghiên cứu ứng dụng sản xuất giấy
điện tử chất lượng cao từ màng vi khuẩn (Jay shah, Brown. M. R., 2005); nghiên cứu
của Alexander Steinbuchel, Sang Ki Rhee (2005) về con đường hình thành cellulose ở
vi khuấn, cấu trúc sợi cellulose và đặc tính của màng cellulose, mối quan hệ giữa khả
năng hình thành cellulose và khả năng sinh axit acetic [15]; trong khi đó Alina
Krystynowicz và cộng sự (2005) đã so sánh đặc điếm sinh học phân tử của chủng
Gluconacetobacter dại (có khả năng tổng hợp cellulose) và chủng đột biến (không
1
2
có khả năng tống hợp cellulose) [16]; năm 2006 đã có các nghiên cứu về cấu trúc của
màng BC sử dụng làm monocomposit; Czafa, w. Young; Elvie Escoro Brown đã
nghiên cứu và đi đến kết luận có sự tương đồng vầ cấu trúc giữa màng BC với
colagen. Năm 2007, Neelobon và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi
cấy đến khả năng hình thành màng trong điều kiện cụ thế là nuôi tĩnh, nuôi lắc và nuôi
trong bioreactor; Sirlene M. Costa và cộng sự nghiên cứu đặc tính vật lý của màng,
cấu trúc sợi cellulose của màng trong điều kiện nuôi cấy, ứng dụng trong sản xuất
giấy; Wojciech K. và cộng sự nghiên cứu đặc tính, cấu trúc màng cellulose ứng dụng
làm da nhân tạo. Năm 2008, Barbara Surma-S'lusarska và cộng sự [17] đã đưa ra
phương pháp chế tạo màng và nghiên cứu đặc điếm màng, ảnh hưởng của nguồn
cacbon, đường glucose, manitol và xylose đến quá trình tạo màng, cấu trúc sợi
cellulose của màng và ứng dụng trong sản xuất giấy. Hầu hết các tác giả nước ngoài
nghiên cứu theo hướng sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn, ứng dụng của màng BC
trong y học, công nghiệp giấy, trong chế biến thực phẩm.
Tuy nhiên những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC là trong
ngành dược phấm và mỹ phấm. Czajt và cs (2006), sử dụng màng Bc đắp lên vết
thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt. Các tác giả Jonas và Farad (1998), Czaja
và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ.
1.4.2. Tại Việt Nam
ơ Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về Gluconacetobacter và màng
BC còn khá mới mẻ. Các công trình nghiên cứu mới chi' quan tâm tới quá trình tạo
màng, đặc tính và cấu trúc của màng, về ứng dụng thực tiễn, mới chỉ được ứng dụng
trong chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng và được ứng dụng trong sản xuất
thạch dừa [3], [5], [6], [9], [10]. Hiện nay việc nghiên cứu tìm môi trường tối ưu cho
quá trình tạo màng của vi khuẩn Gluconacetobacter chưa được thực hiện. Hầu như
có rất ít các nghiên cứu liên quan đến sự hình thành BC và ứng dụng màng BC. Năm
1997, có công trình của Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị Mùi nghiên cứu môi trường
1
3
- Xem thêm -
.DOCX 
44 
50161 
152 
