Tài liệu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng tới quá trình lên men tạo màng biocellulose trong môi trường có bổ sung tảo xoắn spirulina

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ===o0o=== NGÔ THỊ NGỌC OANH ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN DINH DƯỠNG TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN TẠO MÀNG BIOCELLULOSE TRONG MÔI TRƯỜNG CÓ BỔ SUNG TẢO XOẮN SPIRULINA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG HÀ NỘI, 2016 LỜI CẢM ƠN Bằng tất cả tấm lòng kính trọng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này. Em xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể thầy cô trong tổ vi sinh vật, khoa Sinh – KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giảng dạy và khuyến khích em trong thời gian học tập. Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 và Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu. Cuối cùng em xin được cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã quan tâm giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian qua. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày … tháng 05 năm 2016 Sinh viên Ngô Thị Ngọc Oanh LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật. Đây là kết quả nghiên cứu của riêng em. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả đã công bố. Nếu sai em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Hà Nội, ngày … tháng 05 năm 2016 Sinh viên Ngô Thị Ngọc Oanh MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ....................................................................................... 1 2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................. 2 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn...................................................... 2 3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................. 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................... 2 4. Điểm mới của đề tài .................................................................................. 2 NỘI DUNG ................................................................................................... 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3 1.1. Giới thiệu về tảo xoắn Spirulina ............................................................ 3 1.1.1. Lịch sử ................................................................................................. 3 1.1.2. Phân loại tảo Spirulina ........................................................................ 3 1.1.3. Đặc điểm sinh học của tảo Spirulina .................................................. 4 1.2. Vị trí và đặc điểm phân loại Gluconacetobacter trong sinh giới........... 8 1.2.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới ..................... 8 1.2.2. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter ....................................... 8 1.3. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng Biocellulose ............................. 10 1.3.1. Đặc điểm cấu trúc của màng Biocellulose ........................................ 10 1.3.2. Một số tính chất của màng Biocellulose ........................................... 11 1.3.3. Cơ chế tổng hợp Biocellulose ........................................................... 12 1.4. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter ...................... 12 1.4.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon ........................................................... 13 1.4.2. Nhu cầu nitơ của vi sinh vật .............................................................. 13 1.4.3. Nguồn dinh dưỡng khoáng ................................................................ 13 1.4.4. Các chất kích thích sinh trưởng ........................................................ 14 1.5. Tình hình nghiên cứu và sản xuất màng Biocellulose hiện nay........... 14 1.5.1. Trên thế giới ...................................................................................... 14 1.5.2. Tại Việt Nam ..................................................................................... 15 Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................. 17 2.1. Đối tượng nghiên cứu và hóa chất ...................................................... 17 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu........................................................................ 17 2.1.2. Thiết bị và hóa chất ........................................................................... 17 2.1.3. Môi trường ........................................................................................ 18 2.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 18 2.2.1. Phương pháp vi sinh .......................................................................... 18 2.2.2. Phương pháp hóa sinh ....................................................................... 20 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường, nitơ, dinh dưỡng khoáng đến khả năng tạo màng Biocellulose ........................ 21 2.2.4. Thử nghiệm khả năng tạo màng Biocellulose trên môi trường đã chọn .................................................................................................. 23 2.2.5. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng Biocellulose ...... 23 2.2.6. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả ............................................ 23 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 25 3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh màng Biocellulose trên môi trường có bổ sung dịch tảo xoắn Spirulina.......... 25 3.1.1. Phân lập Gluconacetobacter có khả năng sinh màng Biocellulose .. 25 3.1.2. Nghiên cứu khả năng tạo màng Biocellulose của một số chủng Gluconacetobacter ............................................................................ 29 3.1.3. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng Biocellulose dai, mỏng........................................................................................... 31 3.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng G. xylinus T1 ........... 33 3.2.1. Hình thái và tế bào học chủng vi khuẩn G. xylinus T1 ..................... 33 3.2.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa .............................................. 34 3.2.3. Sinh trưởng trên môi trường lỏng ..................................................... 34 3.2.4. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn G. xylinus T1 .................................. 35 3.3. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng tới khả năng tạo màng Biocellulose trong môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina ............... 37 3.3.1. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose tới khả năng lên men tạo màng Biocellulose ............................................................................. 37 3.3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ tới khả năng lên men tạo màng Biocellulose ....................................................................................... 39 3.3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 tới khả năng lên men tạo màng Biocellulose từ chủng vi khuẩn G. xylinus T1 ........................ 41 3.3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O tới khả năng lên men tạo màng Biocellulose từ chủng vi khuẩn G. xylinus T1 .................. 43 3.3.5. Thử nghiệm khả năng tạo màng Biocellulose trên môi trường đã chọn ................................................................................................... 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................... 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 48 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình dạng tảo Spirulina dưới kính hiển vi ................................... 4 Hình 1.2. Sợi cellulose của màng Biocellulose ........................................... 11 Hình 3.1. Qui trình phân lập vi khuẩn Gluconacetobacter ....................... 255 Hình 3.2. Vòng phân giải CaCO3 .............................................................. 277 Hình 3.3. Chuyển hóa ethanol thành acid acetic của vi khuẩn acetic ....... 277 Hình 3.4. Khuẩn lạc vi khuẩn Gluconacetobacter .................................... 299 Hình 3.5. Hình thái tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter khi nhuộm Gram × 1000 trên kính hiển vi quang học .............................. 299 Hình 3.6. Hình ảnh màng Biocellulose do chủng vi khuẩn T1 và T2 tạo ra trên môi trường lỏng ............................................................. 30 Hình 3.7. Khả năng tạo cellulose của các chủng G. xylinus ....................... 30 Hình 3.8. Hoạt tính catalase ...................................................................... 311 Hình 3.9. Màng Biocellulose sinh ra từ vi khuẩn Gluconacetobacter ...... 322 Hình 3.10. Chủng vi khuẩn G. xylinus T1 trên môi trường thạch nghiêng .................................................................................... 333 Hình 3.11. Kết quả nhuộm Gram của G. xylinus × 1000 trên kính hiển vi quang học ............................................................................ 333 Hình 3.12. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn G. xylinus trên môi trường thạch đĩa ............................................................................................ 344 Hình 3.13. Chủng vi khuẩn G. xylinus trên môi trường lỏng ................... 344 Hình 3.14. Hoạt tính catalase .................................................................... 355 Hình 3.15. Khả năng oxy hóa acetat của vi khuẩn G. xylinus .................. 366 Hình 3.16. Kết quả nhuộm màng Biocellulose ......................................... 366 Hình 3.17. Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 tới độ dày của màng Biocellulose . 40 Hình3.18. Ảnh hưởng của MgSO4. H2O tới độ dày của màng Biocellulose ............................................................................. 455 Hình 3.19. Màng Biocellulose thu được ở môi trường MT3 và môi trường đã chọn ........................................................................ 466 DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ Bảng 1.1. Thành phần hóa học của Spirulina ............................................... 5 Bảng 1.2. Thành phần vitamin trong Spirulina............................................. 6 Bảng 1.3. Thành phần khoáng trong Spirulina ............................................. 7 Bảng 1.4. Thành phần acid amin trong Spirulina ......................................... 7 Bảng 1.5. Các chất màu trong Spirulina ....................................................... 8 Bảng 1.6. Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter theo Frateur ............................................... 10 Bảng 3.1. Một số đặc tính của màng Biocellulose .................................... 311 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến khả năng tạo màng Biocellulose cho chủng G. xylinus T1 .................................... 377 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến khả năng tạo màng Biocellulose cho chủng G. xylinus T1 .................................... 422 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O đến khả năng tạo màng Biocellulose cho chủng G. xylinus T1 .......................... 444 Biểu đồ 3.1. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến khả năng tạo màng Biocellulose cho chủng G. xylinus T1 ..... 388 Biểu đồ 3.2.Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4 đến khả năng tạo màng Biocellulose cho chủng G. xylinus T1 .............................................................................................. 40 Biểu đồ 3.3. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến khả năng tạo màng Biocellulose cho chủng G. xylinus T1 ..... 422 Biểu đồ 3.4. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O đến khả năng tạo màng Biocellulose cho chủng G. xylinus T1. ........................................................................................... 444 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 1. ADP : adenozin diphosphate 2. ATP : Adenosine triphosphate 3. CS : Cellulose synthase 4. G. xylinus : Gluconacetobacter xylinus 5. MT1 : Môi trường giữ giống 6. MT2 : Môi trường nhân giống 7. MT3 : Môi trường lên men 8. MT4 : Môi trường đã chọn 9. NADP : Nicotinamit adenozin đinucleotit phosphate 10. pABA : p-aminobenzoic acid 11. UGP :Glucose - 1 - phosphate uridylytransferase MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Màng Biocellulose được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn, có bản chất là cellulose được liên kết với các tế bào vi khuẩn, màng này vừa có cấu trúc và đặc tính cơ học rất giống với cellulose của thực vật, nhưng lại có một số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền cơ học và khả năng thấm hút nước cao; đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, khả năng polymer hóa lớn. Trên thế giới, màng Biocellulose đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá trình xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng Biocellulose đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điều trị các bệnh tim mạch: làm mặt nạ dưỡng da cho con người [6]. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng Biocellulose còn là vấn đề khá mới mẻ, chỉ mới được quan tâm gần đây. Các nghiên cứu và công bố về vấn đề này còn rất khiêm tốn. Các nghiên cứu hiện mới dừng ở nghiên cứu quá trình tạo màng Biocellulose ứng dụng trong sản xuất thạch dừa, làm giá thể gắn kết tế bào vi khuẩn và làm màng trị bỏng [11]. Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Vi sinh khoa Sinh KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 phân lập, tuyển chọn được chủng Gluconacetobacter xylinus (G. xylinus) có khả năng tạo màng Biocellulose với năng suất và chất lượng tốt trên các nguồn nguyên liệu như: nước dừa, nước gạo... Hiện nay, đang tiến hành lên men tạo màng Biocellulose trên môi trường tảo xoắn Spirulina để ứng dụng vào việc làm mặt nạ dưỡng da cho con người. Tuy nhiên, do chưa có được nguồn dinh dưỡng thích hợp cho quá trình tạo màng Biocellulose trong môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina. 1 Nhằm tìm ra nguồn dinh dưỡng phù hợp nhất cho quá trình tạo màng Biocellulose của vi khuẩn G. xylinus trong môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina, tôi quyết định tiến hành thực hiện đề tài: “Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng tới quá trình lên men tạo màng Biocellulose trong môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina”. 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng đến quá trình hình thành màng Biocellulose trong môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina. Từ đó, tìm ra nguồn dinh dưỡng thích hợp cho quá trình lên men tạo màng Biocellulose trong môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3.1. Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn G. xylinus có khả năng lên men tạo màng Biocellulose trong môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina. Kết quả nghiên cứu là dữ liệu góp phần bổ sung cho các nghiên cứu và ứng dụng của chủng vi khuẩn G. xylinus trong đời sống. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Tạo màng Biocellulose trên môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina có triển vọng ứng dụng vào trong cuộc sống đặc biệt là lĩnh vực thẩm mỹ dưỡng da. 4. Điểm mới của đề tài Tìm được nguồn dinh dưỡng thích hợp cho quá trình lên men tạo màng Biocellulose dai, mỏng và nhẵn trong môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina gồm: Nguồn cacbon phù hợp là glucose 10-15 (g/l). Nguồn nitơ: (NH4)2SO4 1,0-1,5 (g/l). Nguồn khoáng: KH2PO4 0-0,5 (g/l); MgSO4. 7H2O 1,0-1,5 (g/l). 2 NỘI DUNG Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về tảo xoắn Spirulina 1.1.1. Lịch sử Spirulina do nhà tảo học Deurben (người Đức) đặt năm 1827, dựa trên hình thái của tảo là dạng sợi xoắn ốc (spiralis) [30]. Cũng vào năm 1827, Turpin lần đầu tiên phân lập được tảo Spirulina từ nguồn nước tự nhiên. Năm 1963, giáo sư Clement (người Pháp) đã nghiên cứu thành công việc nuôi Spirulina ở qui mô công nghiệp. Do hình dạng “lò xo xoắn” với khoảng 5-7 vòng đều nhau không phân nhánh dưới kính hiển vi nên được gọi là Spirulina với tên khoa học là tảo Spirulina platensis (bắt nguồn từ chữ spire, spiral có nghĩa là “xoắn ốc”) và trước đây được coi là thuộc chi Spirulina. Thực ra, đây không phải là sinh vật thuộc tảo (algae) vì tảo thuộc sinh vật có nhân thật (Eukaryota). Spirulina thuộc vi khuẩn lam (Cyanobacteria) nên chúng thuộc sinh vật nhân sơ hay nhân nguyên thủy (Prokaryote) [30]. 1.1.2. Phân loại tảo Spirulina Tảo là một nhóm vi sinh vật, nhưng chúng khác với vi khuẩn và nấm men ở chỗ chúng có diệp lục và có khả năng tổng hợp các chất hữu cơ từ chất vô cơ dưới tác dụng ánh sáng mặt trời. Tảo chia làm 9 ngành: tảo lam (Cyanophyta); tảo lục (Chorophyta); tảo silic (Diatomea); tảo vàng ánh (Chysophyta); tảo giáp (Pynophyta); tảo mắt (Euglenophyta); tảo roi lệch (Hererocontac); tảo đỏ (Rhodophyta); tảo nâu [5], [11]. Tảo Spirulina thuộc: Bộ: Oscillatoriales Ngành: Cyanophyta Họ: Oscillatoriaceae Lớp: Cyanophyceae Giống: Spirulina 3 1.1.3. Đặc điểm sinh học của tảo Spirulina Tảo Spirulina có dạng xoắn lò xo khoảng 5-7 vòng đều nhau không phân nhánh. Đường kính xoắn khoảng 35-50 micromet, bước xoắn 60 micromet, chiều dài thay đổi có thể đạt 0,25mm. Nhiều trường hợp tảo xoắn Spirulina có kích thước lớn hơn. Tảo là trung gian giữa vi khuẩn và tảo nhân thực. Người ta cho rằng tảo Spirulina giống với vi khuẩn hơn, do đó tảo Spirulina còn có tên là vi khuẩn lam [5], [11]. Hình 1.1. Hình dạng tảo Spirulina dưới kính hiển vi [30] 1.1.3.1. Đặc điểm cấu tạo tế bào của tảo Spirulina Là tảo lam đa bào dạng sợi, gồm nhiều hình trụ xếp không phân nhánh. Mỗi tế bào của sợi có chiều rộng 5 μm, dài 2mm. Không có lục lạp mà chỉ chứa thylacoid phân bố đều trong tế bào. Không có không bào. Không có nhân điển hình, vùng nhân không rõ, trong đó có chứa DNA (Hedeskog và Hifsten A.1980). Thành tế bào tảo gồm các lớp lipopolysaccharide, các sợi nhỏ protein và các phân tử peptidoglucan. Màng tế bào nằm sát ngay dưới thành tế bào và nối với màng quang hợp thylacoid tại một vài điểm. Spirulina có chứa 3 nhóm sắc tố chính: Chlorophyll hấp thụ ánh sáng lam và đỏ. Carotenoid hấp thụ ánh sáng lam và lục. Phycobillin hấp thụ ánh sáng lục, vàng và da cam. 4 1.1.3.2. Sinh sản của tảo Spirulina Spirulina có phương thức sinh sản vô tính, từ một cơ thể mẹ trưởng thành (gọi là trichome), tự phân chia thành nhiều mảnh, mỗi mảnh gồm một số vòng xoắn (2-4 tế bào, gọi là hormogonia). Để tạo thành các hormogonia, sợi Spirulina sẽ hình thành các tế bào chuyên biệt cho sự sinh sản (gọi là đoạn necridia). Các necridia hình thành các đĩa lõm ở hai mặt và tạo ra hormogonia bởi sự chia cắt tại vị trí các đĩa. Khi đã phát triển, dần dần phần đầu hormogonia bị tiêu giảm và trở nên tròn nhưng vách tế bào vẫn có chiều dày không đổi. Các hormogonia phát triển, trưởng thành và chu kì sinh sản lặp lại để đảm bảo vòng đời của Spirulina [10], [11], [22]. 1.1.3.3. Thành phần hóa học của tảo Spirulina Spirulina chứa hàm lượng protein rất cao và chứa đầy đủ các vitamin. Spirulina có giá trị dinh dưỡng cao vì chứa hàm lượng protein cao và các chất có hoạt tính sinh học khác. Giá trị protein trung bình của Spirulina là 65%, cao hơn so với nhiều loại thực phẩm. Bảng thành phần hóa học của Spirulina được liệt kê trong bảng 1.1: Bảng 1.1. Thành phần hóa học của Spirulina [11],[29] STT Thành phần Số lượng (% chất khô) 1 Protein tổng số 60 ÷ 70 2 Glucid 13 ÷ 16 3 Lipit 7÷8 4 Acid nucleic 4,29 5 Diệp lục 0,76 6 Carotene 0,23 7 Tro 4÷5 5 Spirulina là nguồn giàu vitamin B12 nhất. Ngoài ra, Spirulina còn chứa các vitamin khác như A, B1, B2, B6, E và H (Fox, 1986). Spirulina cung cấp 21% thiamin và riboflavin so với nhu cầu hàng ngày. Thành phần vitamin của Spirulina được liệt kê trong bảng 1.2: Bảng 1.2. Thành phần vitamin trong Spirulina [24],[29] Vitamin Trên 10g Nhu cầu hàng ngày % so với nhu cầu hàng cho phép (µg) ngày cho phép Vitamin A (β-carotene) 23000 IU 5000 460 Vitamin B1 (Thiamine) 0,31 µg 1,5 21 Vitamin B2 (Riboflavin) 0,35 µg 1,7 21 Vitamin B3 (Niacin) 1,46 µg 20 7 Vitamin B6 (Pyridoxine) 80 µg 2,0 4 Vitamin B12 (Cyanocobalamine) 32 µg 6,0 533 Citamine E (α-tocoferol) 1 IU 30 3 Folacin 1 µg 400 0,04 Panthothenic acid 10 µg 10 1 Biotin 0,50 µg - - Inositol 6,40 µg - - Spirulina giàu sắt và calcium, hỗ trợ tốt cho máu, cho xương và răng. Lượng calcium của Spirulina cao hơn trong sữa. Lượng sắt trong Spirulina cao hơn 12 lần so với trong các loại thực phẩm khác. Thành phần khoáng của Spirulina được liệt kê trong bảng 1.3: 6 Bảng 1.3. Thành phần khoáng trong Spirulina [24], [29] Khoáng Trên 10 g Nhu cầu hàng ngày % so với nhu cầu hàng ngày Calcium 100 µg 1000 µg 10 Iron 15 µg 18 µg 83 Zinc 300 µg 15 µg 2 Phosphorous 90 µg 1000 µg 9 Magnesium 40 µg 400 µg 10 Copper 120 µg 2 µg 6 Sodium 60 µg 2 – 5 µg 1 Potassium 160 µg 6 µg 3 Manganese 500 µg 3 µg 17 Selenium 2 µg 100 µg 2 Tảo xoắn Spirulina chứa 18 trong số 20 loại amino acid được biết (Fox, 1986). Thành phần acid amin của tảo Spirulina được liệt kê trong bảng 1.4: Bảng 1.4. Thành phần acid amin trong Spirulina [11], [29] Acid amin thiết Hàm lượng yếu trong 10 g Phenylalanine 280 µg Threonine % tổng Các Acid amin Hàm lượng khác trong 10 g 4,5 % Glycine 320 µg 5,2 % 320 µg 5,2 % Histidine 100 µg 1,6 % Tryptophan 90 µg 1,5 % Proline 270 µg 4,3 % Valine 400 µg 6,5 % Serine 320 µg 5,2 % Isoleucine 350 µg 5,6 % Tyrosine 300 µg 4,8 % Leucine 540 µg 8,7 % Alanine 470 µg 7,6 % Lysine 290 µg 4,7 % Arginine 430 µg 6,9 % Methionine 140 µg 2,3 % Aspartic Acid 610 µg 9,8 % Cystine 60 µg 1,0 % Glutamic Acid 910 µg 14,6 % 7 % tổng Các chất màu trong Spirulina: Spirulina có màu xanh lam-lục là do Spirulina chứa nhiều sắc tố với hàm lượng cao như chlorophyll, phycocyanin, β-caroten. Các chất màu trong Spirulina được thể hiện trong bảng 1.5: Bảng 1.5. Các chất màu trong Spirulina [11], [29] Chất màu Màu sắc Hàm lượng trong 10 g % Spirulina Phycocyanin Xanh da trời 1400 µg 14 % Chlorophyll Xanh lá cây 100 µg 1,0 % Carotenoids Màu vàng cam 47 µg 0,47 % Như vậy, chúng ta nên sử dụng tảo xoắn Spirulina cho hướng nghiên cứu tìm hiểu về nguồn dinh dưỡng lên men tạo màng Biocellulose. 1.2. Vị trí và đặc điểm phân loại Gluconacetobacter trong sinh giới 1.2.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới Đã có rất nhiều công trình phân loại vi khuẩn acetic như Rothenback 1898, Beijerinck 1898, Hoyer 1899, Hansen 1911, Heneberg 1926, Fraterur 1950... Thuật ngữ “Gluconacetobacte” được dùng đầu tiên cho cấp độ phân loại giống phụ trong giống Acetobacter khi Yamada và Kondo (1984) nhận thấy các thành phần ubiquinone chính trong thành phần màng tế bào vi khuẩn sinh acetic khác nhau. Gluconacetobacter thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonasdaceae, bộ Pseudomonasdales, lớp Schizomycetes. Ngày nay, việc phân loại vi khuẩn acetic nói chung và vi khuẩn Gluconacetobacter nói riêng còn tồn tại nhiều quan điểm khác nhau. Vì vậy, đòi hỏi cần nhiều nghiên cứu hơn nữa về loại vi khuẩn này. 1.2.2. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter Đặc điểm hình thái - tế bào học Chủng Gluconacetobacter có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích 8 thước khoảng 2 μm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động, không sinh bào tử. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo váng nhăn và dày. Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm iôt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemicellulose), chúng có thể tích luỹ 4,5% acid acetic trong môi trường. Khi nồng độ acid acetic cao vượt giới hạn cho phép, nó ức chế hoạt động của vi khuẩn. Đặc điểm nuôi cấy Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn Gluconabacter hình thành khuẩn lạc nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường. Vi khuẩn Gluconacetobacter khi nuôi cấy trong môi trường dịch thể ở điều kiện tĩnh, chúng sẽ hình thành trên bề mặt một lớp màng cellulose, đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với các phân tử cellulose, trong tế bào xảy ra quá trình trao đổi chất nói chung còn ở màng cellulose xảy ra quá trình trao đổi oxy và các chất dinh dưỡng [5], [20]. Ngược lại trong điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng nhỏ với kích thước không đều nhau và phân tán trong môi trường dinh dưỡng tạo ra những đặc tính hình thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa Đặc điểm sinh lý Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25 - 35oC, pH = 4 6. Nhiệt độ và pH tối ưu tùy thuộc vào giống. Ở 37oC, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay cả trong môi trường tối ưu. Gluconacetobacter có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm acid acetic và môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ. Đặc điểm sinh hóa Năm 1950, Fruteur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ 9 vào các tiêu chuẩn: khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt tính catalase; Gluconacetobacter là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadaceae, lớp Schizomycetes. Đặc điểm phân biệt với các chủng khác trong cùng một chi được trình bảng dưới đây: Bảng 1.6. Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter theo Frateur Đặc điểm TT Hiện tượng Kết quả Oxy hóa ethanol thành acid acetic 1 Chuyển hóa môi trường chứa Bromphenol Blue 0,04% từ màu + xanh sang màu vàng 2 Hoạt tính catalase Hiện tượng sủi bọt khí + 3 Sinh trưởng trên môi trường Hoyer Sinh khối không phát triển - Chuyển hóa glycerol thành Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau dihydroxyaceton lên men Chuyển hóa glucose thành acid Vòng sáng xuất hiện xung quanh 4 khuẩn lạc trên môi trường chứa 5 + + CaCO3 6 7 Kiểm tra khả năng sinh sắc tố nâu Không hình thành sắc tố nâu Kiểm tra khả năng tổng hợp Váng vi khuẩn xuất kiện màu lam cellulose + 1.3. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng Biocellulose 1.3.1. Đặc điểm cấu trúc của màng Biocellulose Màng Biocellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β - 1,4 glucopyranose mạch thẳng. Nó có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính của nó lại khác xa nhau. Chuỗi polyme β - 1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn hơn - sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối 10 cùng tạo dải lớn. Những dải lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với những dải lớn của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc vandesvan tạo thành dạng sệt (gel) hay một lớp màng mỏng. Kích thước bên của màng tăng lên khi quần thể vi khuẩn sinh trưởng [8], [9], [23]. Màng Biocellulose có cơ chế kết tinh khác hẳn cellulose của thực vật ở chỗ chúng không có sự kết hợp hemixellulose, lignin hay những thành phần phụ khác mà được cấu tạo từ các sợi microfibil tạo nên những bó sợi song song cấu thành mạng lưới cellulose [1]. Hình 1.2. Sợi cellulose của màng Biocellulose 1.3.2. Một số tính chất của màng Biocellulose Chung và Shyu (1999) đã nghiên cứu tính chất của Biocellulose như độ cứng, độ dính, độ dai và ảnh hưởng của dung dịch đường, muối... lên tính chất của Biocellulose [20]. Các mảnh Biocellulose có độ cứng là 3,68 kg/cm2. Độ cứng của các miếng Biocellulose giảm khi chúng được nhúng vào dung dịch đường và độ cứng tăng lên khi được nhúng bằng dung dịch muối. Sản phẩm của cellulose vi khuẩn có một số tính chất sau: Độ bền hóa học, độ bền cơ học và sức căng cao. Khả năng giữ nước và độ ẩm cao, do đó có thể điều chỉnh độ xốp. Có thể theo dõi, kiểm soát lý tính của cellulose do cấu trúc của cellulose vi khuẩn có khả năng biến đổi trong quá trình nuôi cấy. Kiểm soát được kích thước, cấu trúc và chất lượng của cellulose (kiểm 11