Tài liệu Tuyển chọn chủng vi khuẩn bacillus sinhenzyme cellulase

i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Đồ án tốt nghiệp Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, Phòng Đào tạo Đại học và sau Đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Minh Trí đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Đặc biệt xin ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ sinh học – Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang, Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học đã nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đồ án. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua. Chân thành cảm ơn! Sinh viên Nguyễn Thị Bảo Hiếu ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN.........................................................................................................i MỤC LỤC..............................................................................................................ii DANH MỤC HÌNH ............................................................................................... v DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. vi MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................ 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ CELLULOSE ............................................................ 3 1.1.1. Giới thiệu về cellulose........................................................................... 3 1.1.2. Tìm hiểu về cây sắn và bã sắn ............................................................... 4 1.1.3. Tình hình tận dụng bã sắn nguyên liệu .................................................. 4 1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME .................................................................. 5 1.2.1. Lịch sử phát triển enzyme học ............................................................... 5 1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme............................. 9 1.2.3. Giới thiệu về cellulase ........................................................................... 9 1.2.3.1. Cấu trúc của enzyme cellulase...................................................... 10 1.2.3.2. Tính chất của enzyme cellulase .................................................... 11 1.2.3.3. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase.......................................... 11 1.2.4. Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulose ..................................................... 12 1.2.5. Ứng dụng của enzyme cellulase ......................................................... 12 1.2.6. Tình hình nghiên cứu về enzyme cellulase .......................................... 14 1.2.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới................................................14 1.2.6.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................. 15 1.3. TỔNG QUAN VỀ BACILLUS............................................................... 15 1.3.1. Đại cương về Bacillus ......................................................................... 15 1.3.2. Một số vi khuẩn Bacillus thường gặp trong tự nhiên:.......................... 16 1.4. TỔNG QUAN VỀ VẬT LIỆU NGHIỂN CỨU...................................... 20 PHẦN II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................... 23 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU................................................................ 23 iii 2.1.1. Đối tượng ............................................................................................ 23 2.1.2. Vật liệu................................................................................................ 23 2.1.2.1. Thiết bị......................................................................................... 23 2.1.2.2. Hoá chất....................................................................................... 23 2.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật (g/ml) ................................................ 24 2.1.3.1. Môi trường NA (dùng để phân lập, giữ giống).............................. 24 2.1.3.2. Môi trường thử hoạt tính enzyme cellulose................................... 24 2.1.3.3. Môi trường nuôi thu enzyme cellulase.......................................... 24 2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................. 25 2.2.1. Phương pháp phân lập ......................................................................... 25 2.2.2. Phương pháp giữ giống ....................................................................... 26 2.2.3. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn........ 26 2.2.3.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc ................................... 26 2.2.3.2. Phương pháp làm tiêu bản cố định ............................................... 27 2.2.3.3. Phương pháp nhuộm Gram .......................................................... 27 2.2.4. Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme cellulase....................... 28 2.2.5. Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme thô...................................... 28 2.2.6. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme cellulase ................................. 28 2.2.6.1. Phương pháp đục lỗ thạch ............................................................ 28 2.2.6.2.Phương pháp xác định hàm lượng đường khử ................................... 28 2.2.6.3. Phương pháp tính hoạt độ hệ enzyme cellulase............................. 29 2.2.7. Bố trí thí nghiệm ................................................................................. 31 2.2.7.1. Thí nghiệm xác định các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase.................................................................................................... 31 2.2.7.2. Thí nghiệm xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh enzyme cellulase tốt nhất ....................................................................................... 33 2.2.7.3. Ứng dụng enzyme cellulase của chủng Bacillus tuyển chọn vào việc thủy phân cellulose có trong bã sắn........................................................... 35 PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................... 37 iv 3.1. XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN THEO PHƯƠNG PHÁP MILLER......... 37 3.2. TUYỂN LỰA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP SINH ENZYME CELLULASE TỐT NHẤT .......................................................................... 38 3.2.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus từ thực phẩm lên men Natto................. 38 3.2.2. Dựa vào vòng thủy phân CMC 1% tuyển lựa chủng Bacillus sinh enzyme cellulase ........................................................................................... 38 3.2.3. Đặc điểm hình thái của 3 chủng B1, B3, B7 ........................................ 39 3.2.3.1. Hình thái khuẩn lạc ...................................................................... 39 3.2.3.2. Hình thái vi khuẩn........................................................................ 39 3.2.4. Dựa vào hoạt tính enzyme cellulase của 3 chủng B1, B3, B7 để chọn chủng sinh enzyme mạnh nhất ...................................................................... 41 3.2.4.1. Xác định định tính hoạt tính cellulase........................................... 41 3.2.4.2. Dựa vào định lượng Glucose bằng phương pháp đo quang Miller để xác định hoạt độ enzyme cellulase ............................................................ 43 3.3. ĐIỀU KIỆN ĐỂ ENZYME CELLULASE CÓ HOẠT TÍNH CAO NHẤT .......................................................................................................... 47 3.3.1. Nghiên cứu nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cellulase.... 44 3.3.2. Nghiên cứu pH ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cellulase....... 44 3.4. NUÔI CẤY THU ENZYME CELLULASE ........................................... 44 3.4.1. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase ........................................................................................................ 47 3.4.2. Nghiên cứu thời gian ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase ........................................................................................................ 48 3.5. BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CELLULOSE TRÊN MÔI TRƯỜNG BÃ SẮN ......................................................................................... 50 KẾT LUẬN.......................................................................................................... 53 ĐỀ XUẤT Ý KIẾN .............................................................................................. 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................... 54 PHỤ LỤC............................................................................................................. 57 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc phân tử cellulose........................................................................ 3 Hình 1.2: Cấu trúc không gian của enzyme cellulase ............................................. 10 Hình 1.3: Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase lên cellulose ............................... 11 Hình 2.1: Sơ đồ phân lập Bacillus từ thực phẩm lên men Natto ............................. 25 Hình 2.2: Ống nghiệm giữ giống Bacillus.............................................................. 26 Hình 2.3: Sơ đồ xác định các điền kiện ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase ..............................................................................................................................32 Hình 2.4: Sơ đồ các điều kiện nuôi cấy Bacillus thích hợp để sinh tổng hợp enzyme cellulase ................................................................................................................34 Hình 2.5: Ứng dụng enzyme cellulase vào việc thủy phân cellulose trong bã sắn ..36 Hình 3.1: Đồ thị đường chuẩn glucose theo phương pháp Miller ...........................38 Hình 3.2: Cấy ria chủng Bacillus trên đĩa petri ...................................................... 38 Hình 3.3: Vòng thủy phân CMC 1% của các chủng Bacillus ................................. 38 Hình 3.4: Tiêu bản nhuộm Gram của chủng B1 ..................................................... 40 Hình 3.5: Tiêu bản nhuộm Gram của chủng B3 ..................................................... 40 Hình 3.6: Tiêu bản nhuộm Gram của chủng B7 ..................................................... 41 Hình 3.7: Vòng thủy phân cellulose của 3 chủng B1, B3, B7................................. 42 Hình 3.8: Biểu diễn hoạt độ enzyme cellulase của 3 chủng B1, B3, B7 ................. 43 Hình 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase ........................ 44 Hình 3.10: pH ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase...................................... 46 Hình 3.11: pH ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase. .............. 47 Hình 3.12: Thời gian ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase ..... 49 Hình 3.13: Ủ bã sắn với enzyme cellulase ............................................................. 50 Hình 3.14: Lượng Glucose sinh ra trong quá trình thủy phân cellulose của enzyme cellulase trên 1g môi trường bã sắn khô................................................................ 51 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần trong bã sắn.......................................................................... 4 Bảng 1.2: Một số vi sinh vật sản xuất cellulase...................................................... 12 Bảng 2.1: Xây dựng đường chuẩn glucose............................................................. 29 Bảng 2.2: Xác định hoạt độ cellulase..................................................................... 30 Bảng 3.1: Đường kính vòng thủy phân của các chủng Bacillus.............................. 39 Bảng 3.2: Đường kính vòng thủy phân của 3 chủng B1, B3, B7 ............................ 42 Bảng 3.3: Lượng Glucose (%) sinh ra khi thủy phân cellulose trong 100g bã sắn .. 52 1 MỞ ĐẦU Vi sinh vật trong tự nhiên rất phong phú và đa dạng. Chúng ở xung quanh ta: trong đất, nước, không khí, thậm chí trong cơ thể con người. Chúng có thể gây ra các bệnh khôn lường như bệnh lao, dịch hạch, dịch tả, đại dịch cúm ở người và gia cầm, lở mồm, long móng ở bò lợn... nhưng chúng cũng đem lại cho ta nguồn lợi vô cùng to lớn nếu ta biết hiểu chúng và biết sử dụng chúng có mục đích sẽ giúp cuộc sống của con người tốt đẹp hơn. Từ xa xưa, con người đã biết ứng dụng những hoạt tính có lợi của vi sinh vật phục vụ cho đời sống của mình như tạo ra các loại rượu quý nhờ quá trình lên men của vi sinh vật, những bài thuốc chữa bệnh từ vi sinh vật... Ngày nay chúng ta đang sống trong thế kỷ 21, thế kỷ của khoa học công nghệ và đặc biệt là công nghệ vi sinh càng chứng tỏ ưu thế của mình. Hiện nay đã có nhiều chất có hoạt tính sinh học khác nhau đã được tổng hợp từ vi sinh vật đã được đưa vào sản xuất ở mức độ công nghiệp để phục vụ cho nghiên cứu, công – nông nghiệp, y học và đời sống của con người. Các chủng vi khuẩn như: Bacillus, LactoBacillus... đã và đang được sử dụng trong các chế phẩm sinh học để phục vụ cho các nghành sản xuất như: rượu, bia, công nghệ dệt, y học, bổ sung vào thức ăn gia súc, thức ăn trong nuôi trồng thủy sản, phế thải hữu cơ làm sạch môi trường nuôi trồng thủy sản... là nhờ khả năng sinh ezyme thủy phân amylase, protease, cellulase... của chúng. Các nhà máy chế biến thực phẩm được hình thành và phát triển ngày càng nhiều. Bên cạnh đó, các chất thải được thải ra môi trường ngoài với một lượng lớn. Điển hình như nhà máy chế biến tinh bột từ củ sắn, vào vụ thu hoạch có khoảng 100 – 150 tấn bã sắn được thải ra hằng ngày. Lượng bã sắn tồn đọng là nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường. Với mong muốn tận dụng lại nguồn bã sắn để làm thức ăn chăn nuôi cho gia súc: bằng cách sử dụng enzyme cellulase phân lập từ vi sinh vật để phân giải cellulose thành các sản phẩm dễ tiêu hóa như đường... kết hợp bổ sung các chất phụ gia khác như cám gạo, rỉ đường... tăng thành phần dinh dưỡng. Nhờ 2 đó, ta chuyển phế liệu thành một sản phẩm có ích trong chăn nuôi sẽ giảm thiểu nạn ô nhiễm môi trường. Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: ‘‘Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinh enzyme Cellulase” Nội dung - Tuyển lựa chủng Bacillus sinh enzyme cellulase. - Xác định một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của enzyme thu được. - Sơ bộ đánh giá khả năng sinh enzyme của chủng vi khuẩn Bacillus phân lập được. Đề tài được thực hiện trong thời gian ngắn là 3 tháng không tránh khỏi hạn chế và thiếu sót. Tôi rất mong nhận được các ý kiến bổ ích của những ai quan tâm đến đề tài để hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! 3 PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ CELLULOSE 1.1.1. Giới thiệu về cellulose Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật. Ngoài ra người ta thường thấy chúng có nhiều ở tế bào của một số loài vi sinh vật. Ở tế bào thực vật và một số tế bào vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi. Cellulose không có trong tế bào động vật. Chúng là một homopolimer mạch thẳng, được cấu tạo bởi các β-Dglucose-pyranose. Các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết glucose, liên kết các glucose này với nhau bằng liên kết α-1,4glucoside. Các gốc glucose trong glucose thường lệch nhau một góc 1800C và có dạng như một chiếc ghế bành. Cellulase thường chứa 10.000 – 14.000 gốc đường và được cấu tạo như Hình 1.1. Hình 1.1: Cấu trúc phân tử cellulose Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy. Người và hầu hết động vật không có khả năng phân hủy cellulose. Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sản phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thải hữu cơ. Tuy nhiên nhiều chủng VSV bao gồm nấm, xạ khuẩn có khả năng phân hủy cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase [5]. 4 1.1.2. Tìm hiểu về cây sắn và bã sắn Cây sắn Cây sắn trồng rất nhiều ở nước ta chủ yếu để lấy củ, cây có chiều cao 1 – 3m, thân có 3 lõi đơn hoặc phân nhánh, các lá có thùy sâu, dạng chân vịt. Củ sắn có kích thước trung bình dài 25 – 38cm. Tùy theo giống, điều kiện đất đai và thời gian thu hoạch mà củ sắn có kích thước lớn hơn hoặc nhỏ hơn trị số trung bình. Cấu tạo củ sắn gồm 4 phần chính: vỏ gỗ, vỏ thịt, thịt sắn và lõi sắn. Bã sẵn Hiện nay ở nước ta có trên 60 nhà máy tinh bột sắn với tổng công suất khoảng 38 triệu tấn củ sắn tươi/năm. Theo ước tính một nhà máy chế biến tinh bột sắn có công suất 30 – 100 tấn/ngày sẽ sản xuất được 7,5 – 25 tấn tinh bột, kèm theo đó là 12 – 48 tấn bã bao gồm 2 loại:  Loại 1: Bã thải do quá trình rửa và bóc vỏ gỗ chiếm tỉ trọng ít và thành phần chủ yếu là cellulose, hemixenlulose và cát, sạn.  Loại 2: Phần bã còn lại sau khi tách tinh bột gọi là bã sắn. Bảng 1.1: Thành phần trong bã sắn Thành phần Protein Chất béo Tro DNF (%DM) Tinh bột Cacbohydrat Độ ẩm Hàm lượng (%) 1,82 – 2,03 0,09 – 0,2 1,61 – 2,38 31,2 60,84 – 65,9 72,19 – 79,51 80,16 – 85,5 1.1.3. Tình hình tận dụng bã sắn nguyên liệu Bã sắn nguyên liệu chứa độ ẩm cao và một số chất như tinh bột, chất béo... rất dễ bị vi khuẩn phân hủy gây ra mùi hôi thối gây ô nhiễm môi trường. Từ Bảng 1.1 trong thành phần bã sắn tươi còn chứa một số chất dinh dưỡng do đó ta có thể tận dụng để biến phế liệu thành một sản phẩm khác có ích hơn phục vụ cho những mục đích nhất định. 5  Ở Việt Nam - Làm thức ăn cho động vật nhai lại. - Sản xuất thức ăn chăn nuôi có giá trị cao. - Sản xuất cồn sinh học.  Thế giới - Tạo chất kết dính cho sản xuất diêm. - Dùng làm phân bón. - Dùng làm thức ăn gia súc. - Sản xuất etanol sinh học. - Vấn đề nghiên cứu nhiên liệu sinh học thay thế cho xăng cũng được nhiều nước trên thế giới quan tâm. Thái Lan là nước sản xuất thành công etanol sinh học từ bã sắn, thành công này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng vì nước này phải nhập 2/3 nguồn năng lượng từ nước ngoài. Bã sắn đã được tận dụng trong rất nhiều lĩnh vực để giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên ở Việt Nam thì điều này còn hạn chế. Với đề tài phân lập Bacillus có hoạt tính cellulase. Và bước đầu ứng dụng chủng Bacillus phân hủy cellulose trong bã sắn để làm thức ăn trong chăn nuôi. Tôi muốn góp một phần nhỏ bé trong công cuộc bảo vệ môi trường ở nước ta. 1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME 1.2.1. Lịch sử phát triển enzyme học [9] Enzyme là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học với mức độ đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp. Enzyme có trong tất cả các tế bào sống, là chất xúc tác sinh học. Enzyme có đầy đủ các tính chất của chất xúc tác, nhưng enzyme có hiệu xuất xúc tác lớn hơn tất cả các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác. Ezyme không những có thể xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong cơ thể sống, mà sau khi tách khỏi hệ thống sống, ở những điều kiện nhất định chúng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác. 6  Trước thế kỷ XVII Việc sử dụng enzyme có tính chất kinh nghiệm thuần túy. Người cổ xưa đã biết dùng vi sinh vật như là nguồn enzyme trong các quá trình lên men: Làm rượu vang, sản xuất giấm, làm bánh mỳ…  Thế kỷ XVII đến nửa đầu thế kỷ XVIII Đã đề ra được khái niệm enzyme. Vanhemon (Vanhemont) người Hà Lan, lần đầu tiên đã quan sát được hiện tượng tạo thành chất khí khác không khí trong quá trình lên men. 1659, Silvius lần đầu tiên nêu lên rằng, về cơ bản tất cả các quá trình sống đều là những quá trình hóa học.  Nửa cuối thế kỷ XVIII Đã có những thí nghiệm đầu tiên về enzyme: Công trình nghiên cứu khả năng tiêu hóa thịt trong dạ dày. Công trình này do Reaumur (người Pháp) bắt đầu và sau đó được Spallanzani (người Ý) mở rộng. Năm 1986, Schwann đã gọi chất làm tiêu hóa thịt này là pepsin. Từ năm 1800, người ta cũng đã cho rằng, trong ruột có một enzyme phân giải protein khác. Sau đó Kuhne đặt tên là trypsin. Protease thực vật được sử dụng khá sớm, từ năm 1700 người dân ở các đảo Thái Bình Dương đã biết sử dụng đu đủ để làm mềm thịt.  Nửa đầu thế kỷ XIX Người ta đã tách được một số chế phẩm từ nhiều nguồn nguyên liệu khác có tác dụng thủy phân các chất tương ứng, và bước đầu tách được các chất tạo nên quá trình lên men. Mở đầu là công trình nghiên cứu của Kiecgiop (người Nga, 1814), nước chiết từ hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành đường từ 400C – 600C. Năm 1833, Payen và Pesso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu được kết tủa có khả năng phân giải tinh bột thành đường, đặt tên là diastate. Người ta cũng đã tách được nhiều enzyme khác ở dạng kết tủa. 7  Nửa cuối thế kỷ XIX Đã tinh sạch được một số enzyme và nghiên cứu một số tính chất cơ bản của enzyme. Trong thời kỳ này đã có những thông báo về cơ chế tác dụng của enzyme: Wurtz (1880) đã chỉ ra rằng, papain tạo thành hợp chất không tan với fibrin trước khi thủy phân nó.  Nửa cuối thế kỷ XX: Đã phát hiện được CoEnzyme (Harde và Young, 1906); nghiên cứu động học phản ứng enzyme; kết tinh được enzyme và xác định được bản chất hóa học của enzyme là protein, xác định được một số hệ thống enzyme xúc tác cho quá trình đường phân… Việc xác định cấu trúc enzyme là vấn đề có tính chất cốt lõi để làm sáng tỏ nhiều vấn đề trong nghiên cứu enzyme, enzyme đầu tiên được kết tinh là urease, tinh thể urease bao gồm protein, khi hòa tan trong dung môi sẽ có hoạt tính enzyme. Công trình này mở ra một giai đoạn mới, một bước ngoặc quan trọng trong lịch sử nghiên cứu enzyme.  Những thành tựu chính về nghiên cứu enzyme và công nghệ enzyme trong nửa cuối thế kỷ XX Đã áp dụng thành công các phương pháp hiện đại trong nghiên cứu enzyme: hoàn thiện phương pháp xác định cấu trúc bậc I phân tử enzyme ; nghiên cứu liên quan giữa cấu trúc và chức năng của phân tử. Lần đầu tiên đã phân loại và cách gọi tên enzyme một cách có hệ thống. Phát hiện các restrictase (enzyme giới hạn). Tổng hợp hóa học enzyme. Đến nay người ta đã tổng hợp được enzyme từ nguyên liệu ban đầu là các chất phân tử thấp như các cyclodextrin, sau đó gắn thêm các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme. Với phương pháp tổng hợp này đã tổng hợp nhân tạo enzyme có hoạt tính phân giải ester giống chymotripsin nhưng có độ bền lớn hơn. 8 Thành tựu khác là thiết kế enzyme có hoạt tính hay đặc tính mới bằng cách ghép một enzyme vào một bộ khung cấu trúc khác. Phát hiện reverse transcriptase. Phát hiện một số phân tử sinh học thuộc các nhóm chất có hoạt tính sinh học khác cũng có hoạt tính xúc tác như enzyme: kháng thể, rybozyme. Đã hình thành ngành Công nghệ sản xuất enzyme, sản xuất các chế phẩm enzyme không tan và sử dụng chúng trong thực tế. Tạo được các enzyme tái tổ hợp và thiết kế các enzyme có tính năng mới. Thành tựu lớn khác là tạo được mô hình của một số enzyme gắn được với màng.  Phương hướng nghiên cứu công nghệ enzyme hiện nay và trong tương lai Nghiên cứu, áp dụng các kỹ thuật, công nghệ mới hiên đại để: Sàng lọc, tuyển chọn hoặc tạo nguồn nguyên liệu giàu ezyme mong muốn. Thu nhận chế phẩm enzyme có hiệu suất, hoạt độ và độ bền cao, giá thành ngày càng thấp. Nghiên cứu liên quan giữa cấu trúc và chức năng của phân tử, cơ chế điều hòa của phân tử và hệ thống enzyme. Phát triển nghiên cứu tổng thể bộ protein/enzyme, sinh học enzyme trong tổng thể của hệ thống sống: sự phân bố, quan hệ tương tác, quá trình trao đổi, tác dụng, chức năng sinh lý, các dạng tồn tại của chúng trong hệ thống sống. Mô hình hóa phân tử, hệ thống enzyme trong tế bào và cơ thể sống. Cải biến định hướng phân tử enzyme, thiết kế các phân tử enzyme mới với những đặc tính mong muốn và có hiệu quả sử dụng cao trong thực tế. Phát triển nghiên cứu proteome góp phần giải thích cơ chế các quá trình bệnh lý ở mức độ phân tử. Mở rộng phạm vi ứng dụng enzyme trong thực tế. Nghiên cứu tạo các chip enzyme. 9 1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme [9]. - Ảnh hưởng của nồng độ enzyme. - Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất. - Ảnh hưởng của các chất kiềm hãm - Ảnh hưởng của các ion kim loại. - Ảnh hưởng của các anion. - Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa khác. - Ảnh hưởng của pH đến phản ứng enzyme. - Ảnh hưởng của nhiệt độ. 1.2.3. Giới thiệu về cellulase Cellulase là phức hệ thuỷ phân cellulose tạo thành các phân tử đường βglucose. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, cellulose bị phân hủy dưới tác dụng hiệp đồng của phức hệ enzyme bao gồm ba enzyme là Exo-β-(1,4)-glucananse hay enzyme C1, Endo-β-glucananse hay Endocellulase còn gọi là enzyme CMC-ase hay Cx và β-glucosidase hay cellobioase:  Exo-1,4-gluconase (hay cellobiohydroase, C1 EC 3.2.1.91) giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC nhưng tác dụng mạnh lên cellulose vô định hình hoặc cellulose đã bị phân giải một phần. Tác dụng lên cellulose kết tinh không rõ nhưng khi có mặt endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt.  Endo-1,4-glucanese (hay CMC-ase, Cx, EC 3.2.1.4) thủy phân liên kết β-1,4glucoside và tác động vào chuỗi cellulose một các tùy tiện, sản phẩm của quá trình thủy phân là cellobiose và glucose. Do thủy phân CMC hoặc cellulose theo kiểu tùy tiện nên endo-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi cellulose và tăng chậm các nhóm khử, enzyme tác động mạnh lên cellodextrin. Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose.  β-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21) thủy phân cellobiase và các cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase, 10 còn cellodextrin thì có hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên. Chức năng của β-glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng cellulase. 1.2.3.1 Cấu trúc của enzme cellulase Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là acid amin, các acid amin được nối với nhau bởi liên kết peptid-CO-NH. Ngoài ra, trong cấu trúc còn có những thành phần phụ khác. Cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme nhóm Endo-glucanase và Exo-glucanase giống nhau trong hệ cellulase của nấm sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này xúc phát từ trung tâm xúc tác và được gắn thêm vùng glycosin hóa, cuối đuôi là vùng gắn kết với cellulose. Vùng này có vai trò tạo liên kết với cellulose tinh thể. Trong quá trình phân hủy cellulose có sự tương quang mạnh giữa khả năng xúc tác phân giải cellulose của các enzyme và ái lực của enzyme này đối với cellulose. Hơn nữa, hoạt tính của cellulase dựa vào tinh thể cellulose và khả năng kết hợp của CBD (cellulose binding domain) với cellulose. Sự có mặt của CBD sẽ hỗ trợ cho enzyme cellulase thực hiện việc cắt đứt nhiều lần liên kết trong cellulose tinh thể. Vùng gắn kết với cellullose có cấu tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay đổi chiều dài của vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme. Hình 1.2: Cấu trúc không gian của ezyme cellulase. 11 1.2.3.2. Tính chất của enzyme cellulase Cellulase thủy phân cellulose trong tự nhiên ở các dẫn xuất như carboxymethyl cellulase (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC). Cellulase cắt liên kết β-1,4-glucidase trong cellulose, lichenin và các β-D-glucan của ngũ cốc. Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau. Cellulase hoạt động ở các pH từ 3 – 7, nhưng pH tối thích trong khoảng pH = 4 – 5. Nhiệt độ tối ưu từ 40 – 500C. Hoạt tính của cellulase bị phá hủy hoàn toàn ở 800C trong 10 – 15 phút. Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose và bị ức chế hoàn toàn bởi Hg. Ngoài ra, cellulase còn bị ức chế bởi các ion kim loại khác như Mn, Ag, Zn nhưng ở mức độ nhẹ. 1.2.3.3. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase Cellulase là một hệ phức tạp xúc tác sự thủy phân cellulose thành cellobiose và cuối cùng thành glucose. Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của enzyme cellulase xảy ra theo 3 giai đoạn chủ yếu sau: - Trong giai đoạn thứ nhất, dưới tác dụng của tác nhân C1, cellulose bị thủy phân thành cellulose hòa tan. Trong giai đoạn thứ hai, cellulose hòa tan sẽ bị thuỷ phân dưới tác dụng xúc tác của hệ enzyme Cx tạo thành đường cellobiose. - Ở giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của enzyme 1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21), cellobiose bị thủy phân thành glucose. Hình 1.3: Cơ chế tác dụng của ezyme cellulase lên cellulose 12 Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển mạnh, có loài phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm. 1.2.4. Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulose Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vi sinh vật cả trong điều kiện hiếu khí và yếm khí. Các loài vi sinh vật thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose. Số lượng các loài tham gia sinh tổng hợp enzyme có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc loại nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số trường hợp các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia vào quá trình phân giải này. Bảng 1.2 là một số loài vi sinh vật được các nhà nghiên cứu kỹ nhất. Bảng 1.2: Một số vi sinh vật sản xuất cellulase. Nấm sợi Aspergillus niger A. oryzae A. terreus A. syndovii A. flavus Fusarium culmorum Fusarium oxysporum Mucor pusilus P. Notatum Penicillium spp Trichoderma lignorum Trichoderma reesei Trichoderma viride Trichoderma konongi Xạ khuẩn Actinomycea ureus A. cellulose A. diastaticus A. roseus A. griseus A. melamocylas A. coelicolor A. candidus A. chromogenes A. hygroscopicus A. griseofulvin A. ochroleucus A. thermofulcus A. xanthostrums Thermonospora curvata Vi khuẩn Preudomonas Fluorescens B.megaterium B.mensenteroides Clostridium sp Acerobacte xylinum Vi khuẩn dạ cỏ bò Ruminoccus albus Ruminobacter parum Bacterioides Amylophillus sp C. butiricum C. locheheadil Cellulosemonas 1.2.5. Ứng dụng của enzyme cellulase Trong công nghiệp thực phẩm Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật, vì vậy nó có mặt trong mọi rau quả cũng như trong các nguyên liệu, phế liệu của các nghành trồng trọt và lâm nghiệp. Nhưng người và động vật không có khả năng phân giải cellulose. Nó chỉ có 13 giá trị làm tăng tiêu hóa, nhưng với số lượng lớn nó trở nên vô ích hay cản trở tiêu hóa. Chế phẩm cellulase thường dùng để:  Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc.  Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật. Ứng dụng của cellulase trong chế biến thực phẩm là dùng nó để tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm các loại thực phẩm đặc biệt trong thức ăn cho trẻ em. Dùng cellulase để xử lý các loại rau quả, bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo..., các loại chè, tảo biển và lương thực như gạo. Trong sản xuất bia Dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó có cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và quá trình đường hóa. Trong sản xuất agar Cellulose làm tăng chất lượng của agar hơn là với phương pháp dùng acid phá vỡ thành tế bào. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy Bổ sung endoglucanase trong công đoạn nghiền bột giấy sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình sợi cellulase, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học. Trước khi nghiền hóa học, gỗ được xử lý với endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ Bổ sung cellulase trong giai đoạn đường hóa của quá trình sản xuất ethanol giúp phá hủy thành tế bào cellulose, giúp tăng lượng đường và đẩy nhanh tốc độ phản ứng của tinh bột và amylase dẫn đến hiệu suất thu hồi rượu tăng. 14 Trong công nghệ sử lý rác thải và phân bón vi sinh Rác thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trường dẫn đến mất cân bằng sinh thái và phá hủy môi trường sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống con người. Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose nên việc sử dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trường rất hiệu quả. Enzyme này có khả năng phân giải rác thải chứa cellulose, chuyển hóa các hợp chất kiểu lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các sản phẩm giàu năng lượng khác. Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ xử lý rác thải thì việc tạo ra các chế phẩm vi sinh có các vi sinh vật được nghiên cứu và sản xuất. Phức hợp cellulase được sử dụng để xử lý nguồn nước thải do các nhà máy giấy thải ra. Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao). Sinh khối này chứa nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysacchatide quan trọng quyết định tới số lượng, chất lượng giấy là cellulose. Vì vậy, nước thải của các nhà máy, cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc khi bổ sung các chế phẩm chứa phức hệ cellulase đem lại hiệu quả cao. Ngoài ra, việc sản xuất enzyme cellulase có hoạt độ cao để phân hủy cellulase thành các nguồn nhiên liệu sinh học đang được quan tâm đặc biệt trong ngành công nghiệp năng lượng sạch trên toàn thế giới. Đặc biệt ứng dụng trong việc xử lý rác thải hữu cơ và phân bón vi sinh. 1.2.6. Tình hình nghiên cứu về cellulase 1.2.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Nghiên cứu và ứng dụng của cellulase bắt đầu từ những năm 1950. Cuối thế kỷ XIX đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulase từ vi sinh vật. Một số nghiên cứu về cellulase từ nấm như: Trichoderma reseii [13], Schizophillum commune [19], Fusarium lini, Penicillium funiculosum. Năm 2000, đã nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp cellulase từ các loại nấm có tính đặc hiệu cao bao gồm phức hệ 3 enzyme: endoglucanase, cellobihydrolase và –glucosidase thủy phân hoàn toàn glucose.