Tài liệu Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21 hyroxylase bằng kỹ thuật mlpa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Dương Thị Giang PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN THỂ THIẾU ENZYM 21- HYROXYLASE BẰNG KỸ THUẬT MLPA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Dương Thị Giang PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN THỂ THIẾU ENZYM 21- HYROXYLASE BẰNG KỸ THUẬT MLPA Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. BS Trần Huy Thịnh 2. PGS.TS Nguyễn Quang Huy Hà Nội - Năm 2015 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Khoa Sinh học, Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội đã hết lòng tạo điều kiện để chúng tôi có thể học tập tốt và đạt được những thành quả như ngày hôm nay. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS.BS Trần Huy Thịnh, Phó trưởng Bộ môn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội, người Thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Quang Huy, Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Trường Đại học khoa Học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã giúp đỡ và chỉ bảo cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu Gen- Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, cùng toàn thể nhân viên trong Trung tâm đã tạo điều kiện giúp đỡ cho tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Khoa Xét Nghiệm, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội, cùng các anh chị em trong Khoa đã giúp đỡ cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn. Và cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và những người bạn đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2015 Dương Thị Giang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CYP Cytochrome P450 CYP21 Cytochrome P450 21(steroid 21- hydroxylase) DNA Deoxyribonucleic acid DOC Deoxycorticosterone E Exon I Intron Ig2 Đột biến điểm ở intron 2( 656A/C →G) HLA Human leukocyte antigen KCĐ Không cổ điển MM Mất muối MHC Major histocompatibility complex MLPA Multiplex Ligation – dependent Probe Amplification NHĐT Nam hóa đơn thuần PCR Polymerase Chain Reaction Stop codon Mã kết thúc TSTTBS Tăng sản thượng thận bẩm sinh 3β- HDS 3β- hydroxysteroid dehydrogennase 17-OHP 17 – hydroxyprogesteron 21-OH 21- hydroxylase ∆8bp Mất 8bp ở exon 3 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3 1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH TSTTBS THỂ THIẾU ENZYM 21HYDROXYLASE ................................................................................................... 3 1.1. Một số nét khái quát về bệnh TSTTBS ........................................................3 1.2. Vài nét về tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS ..........................................4 1.2.1. Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS trên thế giới ................................4 1.2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS tại Việt Nam ...............................5 1.3. Tần suất mắc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh ......................................6 1.4. Cơ chế bệnh sinh của bệnh TSTTBS ............................................................7 1.5. Lâm sàng bệnh TSTTBS ..............................................................................8 2. CƠ SỞ PHÂN TỬ VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH TSTTBS ...... 10 2.1. Cơ sở phân tử của bệnh TSTTBS ...............................................................10 2.1.1 Vị trí, cấu trúc, chức năng gen CYP21 .................................................10 2.1.2 Một số đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS .............................11 2.2. Đặc điểm di truyền của bệnh TSTTBS .......................................................13 2.3. Biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng của người mang gen dị hợp tử .............14 2.4. Phát hiện người lành mang gen bệnh..........................................................15 3. CHẨN ĐOÁN BỆNH TSTTBS ........................................................................ 16 3.1. Chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng .........................................................16 3.1.1. Chẩn đoán xác định ..............................................................................16 3.1.2. Chẩn đoán phân biệt .............................................................................17 3.2. Các phương pháp sinh học phân tử phát hiện đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS ....................................................................................................18 3.2.1. Kỹ thuật PCR .......................................................................................18 3.2.2. Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA Sequencing) .....................................19 3.2.3. Kỹ thuật Souther blot ...........................................................................20 3.2.4. Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probe Aplification) 20 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 24 2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 24 2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu .............................................. 24 2.2.1. Dụng cụ và trang thiết bị .........................................................................24 2.2.2. Hoá chất ...................................................................................................24 2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................................................. 26 2.4. Đạo đức trong nghiên cứu .............................................................................. 26 2.5. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 27 2.5.1. Thiết kế nghiên cứu. . ..............................................................................27 2.5.2 Tiến hành xét nghiệm ...............................................................................27 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................... 33 3.1. Kết quả tách chiết DNA ................................................................................. 33 3.2. Kết quả phát hiện đột biến gen trên bệnh nhân và phát hiện người lành mang gen bệnh................................................................................................................. 35 KẾT LUẬN ............................................................................................................... 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tần số mắc bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH trên thế giới .............. 6 Bảng 1.2: Các đột biến gen CYP21 thường gặp gây TSTTBS cổ điển .................... 12 Bảng 3.1. Các thành viên trong gia đình bệnh nhân ................................................. 35 Bảng 3.2. Kiểu đột biến gen của bệnh nhân và thành viên gia đình ........................ 36 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ tổng hợp hormon vỏ thượng thận do thiếu hụt enzym .................... 7 Hình 1.2: Nhiễm sắc thể số 6 và vị trí gen CYP21 .................................................. 10 Hình 1.3: Cấu trúc phân tủ của gen CYP21 ............................................................. 11 Hình 1.4. Quy luật di truyền gen lặn trên NST thường ............................................. 13 Hình 1.5. Phả hệ của một gia đình có con bị bệnh di truyền lặn trên NST thường (Autosome Recessive). Thế hệ I, II, không có người bị bệnh, thế hệ III có người bị bệnh. .......................................................................................... 14 Hình 1.6. Giá trị 17-OHP sau nghiệm pháp kích thích ACTH trong các thể bệnh và người mang gen dị hợp tử ....................................................................... 15 Hình 1.7. Các bước cơ bản của kỹ thuật PCR ........................................................... 19 Hình 1.8 Các giai đoạn của kỹ thuật MLPA ............................................................ 21 Hình 1.9. Sơ đồ và vị trí một số probe của Kit MLPA P050B2 .............................. 23 Hình 1.10. Hình ảnh minh họa kết quả MLPA ......................................................... 23 Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu .......................................................................... 27 Hình 2.2. Sơ đồ và vị trí một số probe của Kit MLPA P050B2 .............................. 30 Hình 3.1. Kết quả kiểm tra chất lượng DNA tách từ mẫu bệnh phẩm...................... 33 Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số...................................................... 34 Hình 3.3. Phả hệ gia đình số 01 ................................................................................ 38 Hình 3.4. Kết quả MLPA gia đình mã số 01............................................................ 39 Hình 3.5. Phả hệ gia đình số 02 ................................................................................ 40 Hình 3.6. Kết quả MLPA của gia đình mã số 02 ..................................................... 41 Hình 3.7. Phả hệ gia đình số 03 ............................................................................... 42 Hình 3.8. Kết quả MLPA của gia đình mã số 03 ..................................................... 43 Hình 3.9. Phả hệ gia đình số 04 ................................................................................ 44 Hình 3.10. Kết quả MLPA của gia đình mã số 04 ................................................... 45 Hình 3.11. Phả hệ gia đình số 05 ............................................................................. 46 Hình 3.12. Kết quả MLPA của gia đình mã số 05 ................................................... 48 Hình 3.13. Phả hệ gia đình số 06 .............................................................................. 49 Hình 3.14. Kết quả MLPA của gia đình mã số 06 ................................................... 50 MỞ ĐẦU Tăng sản thượng thận bẩm sinh - TSTTBS (congenital adrenal hyperplasia CAH) là bệnh gây ra do giảm hoặc mất hoàn toàn một trong năm enzym tham gia vào quá trình tổng hợp corticosteroid, dẫn đến rối loạn quá trình tổng hợp hormon vỏ thượng thận; trong đó, thể thiếu 21- hydroxylase (21-OH) hay gặp nhất và chiếm tỷ lệ 90 - 95%, tiếp theo là thể thiếu 11β-hydroxylase chiếm 5 - 9%, còn lại là các thể bệnh rất hiếm gặp do thiếu hụt 3-hydroxy steroid dehydrogenase (3β-HSD), 17α-hydroxylase và 20, 22- desmolase [1]. Bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu enzym 21-hydroxylase là bệnh di truyền đơn gen lặn, trên nhiễm sắc thể thường do đột biến gen CYP21A2 gây nên. Đối với thể nặng, nếu bệnh không được chẩn đoán sớm và điều trị thích hợp sẽ dẫn đến cơn suy thượng thận cấp và bệnh nhân có thể tử vong. Các thể bệnh khác có thể dẫn đến nam hóa ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ trai; do đó bệnh ảnh hưởng nặng nề đến sự phát triển thể chất, chức năng sinh sản, tâm lý của người bệnh và gia đình [6]. Sự phát triển và ứng dụng của các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, giải trình tự gen (Sequencing), MLPA (Multiplex Ligation – dependent Probe Amplification)… đã phát hiện được hầu hết các đột biến gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh, trong đó đột biến điểm chiếm tỷ lệ từ 70 - 75%, các dạng đột biến mất đoạn, thêm đoạn, lặp đoạn và đảo đoạn chiếm từ 25 - 30% các trường hợp [25]. Nhiều nghiên cứu đã tìm thấy mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình của bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh bằng cách xác định các đột biến đặc trưng của từng thể bệnh. Các đột biến gen CYP21A2 trầm trọng như: mất đoạn, đảo đoạn, chuyển đoạn gen lớn hay đột biến vô nghĩa (nonsense mutation) làm mất hoàn toàn hoạt tính enzym 21- hydroxylase gây ra những thể bệnh nặng và hay gặp ở thể mất muối. Đột biến sai nghĩa như I172N làm giảm hoạt tính enzym 21hydroxylase chỉ còn 1 - 2% so với bình thường gặp ở thể nam hoá đơn thuần hay P30L, V281L, P453S làm giảm hoạt tính enzym 21- hydroxylase chỉ còn 20 - 50% so với bình thường gặp ở thể bệnh không điển hình. Xác định chính xác các dạng 1 đột biến gen CYP21A2 đóng vai trò quan trọng giúp chẩn đoán sớm và có những biện pháp can thiệp điều trị kịp thời nhằm giảm những tác động của việc thiếu hụt enzym 21 - hydroxylase đối với bệnh nhân. Bên cạnh đó việc xác định người lành mang gen sẽ cung cấp những thông tin hữu ích cho tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh giúp giảm tỷ lệ sinh ra những đứa trẻ bị bệnh, đồng thời giúp sàng lọc sơ sinh để quản lý và chăm sóc tốt những trẻ có nguy cơ cao bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh trong cộng đồng. Các đột biến mất đoạn, lặp đoạn và đảo đoạn chiếm tỷ lệ khoảng 25 - 30%, là dạng đột biến gây ra thể bệnh nặng nên cần phải có biện pháp chẩn đoán chính xác và kịp thời. Tuy nhiên, các dạng đột biến này rất khó xác định bằng các kỹ thuật PCR thông thường. Gần đây, kỹ thuật MLPA là một phương pháp mới với thời gian tiến hành ngắn, đơn giản và độ nhạy cao đã phát hiện chính xác các dạng đột biến này trên gen CYP21A2. Việc ứng dụng kỹ thuật MLPA vẫn chưa được khai thác nhiều ở Việt Nam, đặc biệt là trong việc xác định người lành mang gen gây các bệnh di truyền. Chính vì vậy nhằm mục đích giúp quản lý tốt người mang gen và cung cấp những thông tin hữu ích cho tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21- Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA với mục tiêu: Phát hiện người mang đột biến dị hợp tử gen CYP21A2 ở các thành viên gia đình bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21 - OH. 2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH TSTTBS THỂ THIẾU ENZYM 21-HYDROXYLASE 1.1. Một số nét khái quát về bệnh TSTTBS Bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh hay còn gọi là hội chứng sinh dục- thượng thận, là một bệnh di truyền gen lặn trên NST thường, do sự thiếu hụt các enzym tham gia vào quá trình tổng hợp hormon vỏ thượng thận. Trong đó, sự thiếu hụt enzym 21- hydroxylase (21- OH) là hay gặp nhất, chiếm tỷ lệ 90 - 95%, tiếp đến là sự thiếu hụt enzym 11β- hydroxylase (11- OH), 3β- hydroxysteroid dehydrogenase (3β- HSD), 17α- hydroxylase (17- OH) và ít gặp hơn là sự thiếu hụt 20 - 22 desmolase [35]. Sự thiếu hụt enzym 21- hydroxylase dẫn đến sự tổng hợp cortisol và phần lớn aldosterron của tuyến thượng thận bị suy giảm, gây tăng tiết Adreno Corticotropin Hormon (ACTH) tuyến yên, tăng sản vỏ thượng thận và sản xuất thừa androgen. Tùy theo mức độ thiếu hụt enzym 21- hydroxylase mà lâm sàng biểu hiện ở các mức độ nặng hay nhẹ khác nhau. Thiếu hụt hoàn toàn enzym 21- hydroxylase gây bệnh cảnh lâm sàng mất muối với các triệu chứng suy thượng thận cấp và cường androgen, thiếu enzym 21- hydroxylase ở mức độ vừa phải (1 - 3%) sẽ biểu hiện triệu chứng nam hóa đơn thuần do cường androgen và khi enzym 21hydroxylase giảm nhẹ (20 - 50%) sẽ xuất hiện thể bệnh không cổ điển [15]. 3 1.2. Vài nét về tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS 1.2.1. Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS trên thế giới Theo y văn, trường hợp bệnh TSTTBS đầu tiên trên thế giới được mô tả bởi nhà giải phẫu học De Crecchico vào năm 1865. Đầu thế kỷ 19, Emil Huschke, một nhà giải phẫu và phôi thai học, đã phân biệt vỏ và tủy thượng thận, đồng thời tìm thấy mối liên quan giữa tuyến thượng thận và tuyến sinh dục [8]. Bệnh nhân TSTTBS thể mất muối đầu tiên được Butler (1939) và Wilkins (1940) mô tả. Năm 1950 - 1951, Wilkins, Bartter và cộng sự đã chứng minh rằng việc sử dụng cortisol có thể ức chế sự tổng hợp thừa androgen trong hội chứng sinh dục - thượng thận do TSTTBS [9]. Trong giai đoạn này, các nhà nghiên cứu đã xác định 6 steroid vỏ thượng thận có tác dụng sinh học, chúng được tổng hợp từ cholesterol và được chia thành 3 nhóm: (i) Steroid chuyển hóa muối gồm DOC, corticosteron và aldosteron; (ii) Steroid chuyển hóa đường gồm hydrocortisone, cortisol; (iii) Steroid sinh dục nam (androgen) gồm dehydroepiandrosteron và androstendion [10]. Từ những năm 1970, nghiên cứu và định lượng 17- OHP, một tiền chất trực tiếp tạo ra cortisol, được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán bệnh TSTTBS. Năm 1979 - 1980, Migeon và Rosenwaks hoàn chỉnh tiêu chuẩn chẩn đoán hóa sinh của bệnh TSTTBS: do thiếu enzym 21- OH gây tích tụ các tiền chất trước chỗ ứ đọng chuyển hóa bao gồm 17- OHP và progesteron, dẫn đến tăng tổng hợp testosteron ở vỏ thượng thận, nồng độ testostrron trong máu tăng và sản phẩm đào thải của testosteron trong nước tiểu là 17- Cetosteroid (17-CS) tăng. Nồng độ 17- OHP tăng cao trong máu là tiêu chuẩn có giá trị đặc hiệu để chẩn đoán TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH. Quy luật di truyền của bệnh TSTTBS đã được nhận biết từ những năm 1930 và được mô tả chi tiết bởi Knudson năm 1951, đó là bệnh di truyền đơn gen lặn, nằm trên nhiễm sắc thể thường. Năm 1977, Dupont thông báo bản đồ gen và sự liên kết gần giữa TSTTBS và phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (MHC). Sau đó, Komainami phân lập được Cytochrome P450c21 là chuỗi peptid đơn. Năm 1982 - 4 1983, O’ Neill và Fleishwicle phát hiện sự liên quan giữa gen CYP21 với MHC nhóm III gồm yếu tố B, C2, C4A, C4B [37]. Năm 1984, Hite và cộng sự đã xác định được gen CYP21A2 và giả gen CYP21A2P có kích thước 3,4 kb; nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 6, bên trong phức hợp MHC cùng với các gen C4 bổ thể [27]. Năm 1986, Higashi và cộng sự đã phân tích trình tự nucleotid toàn bộ gen CYP21A2 và giả gen CYP21A2P. Sau đó, các đột biến điển hình của gen CYP21A2 đã được tìm thấy, chúng được coi là nguyên nhân chính gây thiếu hụt enzym 21- OH [23]. Phương pháp lai Southern blot do Edward Southern đề xuất năm 1975 đã được nhiều tác giả sử dụng để phát hiện các đột biến mất đoạn gen CYP21A2 thường gặp [24]. Đến nay, nhờ kết hợp phản ứng PCR với một số kỹ thuật sinh học phân tử khác như giải trình tự gen, hầu hết các đột biến của gen CYP21 gây bệnh TSTTBS đã được phát hiện [26]. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS tại Việt Nam Ở nước ta đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh TSTTBS. Các công trình nghiên cứu có thể kể đến như: Năm 1991, Nguyễn Thu Nhạn và cộng sự đã tổng kết 36 bệnh nhân mắc hội chứng sinh dục - thượng thận trong giai đoạn 1981 - 1990, chiếm tỷ lệ 1,9% tổng số bệnh nhân nội tiết, có tỷ lệ tử vong là 5,5% [9]. Năm 1994, nhóm nghiên cứu Nguyễn Nguyệt Nga, Nguyễn Thu Nhạn đã tổng kết chẩn đoán và điều trị bệnh TSTTBS. Chẩn đoán dựa vào lâm sàng và xét nghiệm hóa sinh progesteron, testosteron, cortisol, Follice Stimulating Hormon (FSH), Luteinizing Hormon (LH), điện giải đồ, 17 Cetosteroid (17- CS) và 17 – Hydroxycetosteroid (17- OHCS); điều trị bệnh bằng prednisolone và nước muối đường với thể mất muối [8]. Năm 2000, Võ Thị Kim Huệ và cộng sự công bố nghiên cứu chẩn đoán và điều trị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH ở 43 bệnh nhân khám và điều trị tại 5 Bệnh viện Nhi Trung ương 1989 - 1997. Nghiên cứu đưa ra các dấu hiệu lâm sàng và giới hạn giá trị của 17- OHP, progesteron và testosteron giúp chẩn đoán và sử dụng Hydrocortison và Florinef điều trị bệnh thay cho Prednisolon đặc biệt tác giả đã sử dụng kỹ thuật khuếch đại gen (PCR) để phát hiện đột biến [3]. Năm 2001, Thái Thiên Nam nghiên cứu phát hiện đột biến gen cho bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH [7]. Năm 2004, Triệu Quốc Khánh đã nghiên cứu nhận thức của bố mẹ và bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thấy rằng bệnh ảnh hưởng nặng nề đến tình trạng tâm lý gia đình và bệnh nhân [2]. Năm 2006, Trần Kiêm Hảo đã nghiên cứu xác định một số đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH và phát hiện người lành mang gen bệnh [4]. Năm 2008, Nguyễn Thúy Giang đã nghiên cứu sự phát triển thể chất và một số yếu tố ảnh hưởng ở trẻ TSTTBS đang điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương nhận thấy bệnh gây ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của trẻ đặc biệt là chiều cao [1]. Nhìn chung, ở Việt Nam những nghiên cứu về lâm sàng và ảnh hưởng tâm lý của gia đình và bệnh nhân là phổ biến, chưa có nhiều nghiên cứu về bệnh học phân tử bệnh TSTTBS. 1.3. Tần suất mắc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh Tần suất mắc bệnh trên thế giới là 1/10.000 - 1/15.000. Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất ở hai quần thể người Eskimo Yupik (Alaska) và La Réunion (Pháp) với tần suất 1/282 và 1/2141, tỷ lệ mắc bệnh ở châu Âu là 1/14.000 [28]. Một nghiên cứu của Nhật tại thành phố Sapporo năm 1982 - 2005 đưa ra tỷ lệ mắc bệnh TSTTBS là 1/19.634 và tỷ lệ các kiểu hình theo thứ tự thể MM : thể NHĐT : thể không điển hình là 16 : 4 : 2. Tại Việt Nam, hàng năm có từ 50 đến 70 trẻ được chẩn đoán mới, chiếm tỷ lệ 60,7% các bệnh lý tuyến thượng thận và chiếm 2% các bệnh lý di truyền vào điều trị tại khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện Nhi TW [17]. 6 Bảng 1.1: Tần số mắc bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH trên thế giới Tên nước STT Tần suất 1 Alaska,Yupik Eskimos 1/ 280 2 Pháp (đảo Reunion) 1/2100 3 Thụy Điển 1/9800 4 Mỹ ( Bang Wisconsin) 1/11.000 5 Pháp ( thành phố Lille) 1/13.000 6 Nhật 1/18.000 7 Ý 1/18.000 1.4. Cơ chế bệnh sinh của bệnh TSTTBS Khi thiếu enzym, một hay nhiều con đường tổng hợp hormon bị tắc nghẽn và hormon dưới chỗ tắc không được sản xuất đủ, đặc biệt là cotisol. Cơ chế điều hòa ngược (feed back) kích thích tuyến yên sản xuất và bài tiết ACTH, gây tăng sản tuyến thượng thận, kích thích các tế bào chứa melanin tạo hắc tố [26]. Hình 1.1. Sơ đồ tổng hợp hormon vỏ thượng thận do thiếu hụt enzym [35] Thiếu hụt enzym 21-OH sẽ gây giảm tổng hợp cortisol, tăng các tiền thân của cortisol như 17- hydroxyprogesteron (17-OHP) và progesteron, tăng các hormon sinh dục vỏ thượng thận như dehydroepiandrosterone (DHEA), D4 7 androstenedion và testosteron (T) gây nam hóa ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ trai. Trong khi đó việc thiếu hoàn toàn enzym 21-OH gây giảm aldosteron làm mất natri qua nước tiểu, giảm khối lượng tuần hoàn (hội chứng mất muối) [35]. 1.5. Lâm sàng bệnh TSTTBS Sự thiếu hụt enzym 21- OH dẫn đến sự thiếu hụt cortisol và/hoặc thiếu hụt aldosteron cũng như thừa androgen thượng thận. Tùy thuộc vào mức độ thiếu hụt của 21- OH mà sự biểu hiện lâm sàng của TSTTBS được chia thành 3 thể khác nhau bao gồm:  Thể mất muối Bệnh nhân thiếu hụt enzym 21- hydroxylase thể cổ điển sẽ dẫn đến suy giảm trầm trọng khả năng hydroxyl hóa để chuyển progesterone thành 11deoxycorticosteron, do đó không thể tổng hợp đầy đủ aldosteron và cortisol trong máu. Ngoài ra, các tiền chất steroid trước chỗ tắc được tích lũy tăng cao là progesteron và 17- OHP có thể hoạt động như là các chất đối kháng trực tiếp các thụ thể hormon chuyển hóa muối và làm tình trạng thiếu aldosteron trầm trọng hơn [26]. Dấu hiệu xuất hiện sớm là nôn, tiêu chảy dẫn đến mất muối, mất nước và sụt cân. Nếu không được điều trị, cơn suy thượng thận nhanh chóng nặng lên với các dấu hiệu mắt trũng, da nổi vân tím, trụy tim mạch và có thể ngừng tim do kali máu tăng cao dẫn đến tử vong. Dấu hiệu nam hóa là do tăng testosteron: + Ở trẻ gái, ngay khi đẻ xuất hiện âm vật to, có khi to như dương vật, các môi có thể dính với nhau nhiều hay ít, lỗ niệu đạo có thể ở ngay dưới âm vật, làm cho dễ chẩn đoán nhầm với tật lỗ đái thấp. Nếu không được điều trị, biểu hiện nam hóa ngày càng rõ: trẻ mọc lông mu, lông nách, trứng cá, cơ bắp phát triển, lớn nhanh nhưng trẻ sẽ lùn ở tuổi trưởng thành và đạt chiều cao tối đa khoảng 140  150 cm, hình dáng đàn ông, vai rộng, hông hẹp, tuyến vú kém phát triển kèm theo rối loạn kinh nguyệt [26]. 8 + Ở trẻ trai, biểu hiện giả dậy thì sớm: mọc lông mu, lông nách, mọc trứng cá, giọng trầm, dương vật to nhanh và cương cứng, nhưng tinh hoàn vẫn nhỏ tương ứng với tuổi thực của trẻ. Chiều cao và tuổi xương phát triển nhanh và mạnh, kết thúc sớm khi trẻ khoảng 8  10 tuổi [26].  Thể nam hóa đơn thuần Bệnh nhân thiếu hụt enzym 21- OH mức độ vừa phải (1 - 3%), quá trình tổng hợp cortisol và aldosteron vẫn xảy ra. Ở trẻ gái, biểu hiện nam hóa bộ phận sinh dục ngoài (giả lưỡng tính). Do rối loạn tổng hợp các steroid xảy ra sớm từ giai đoạn bào thai vào tuần thứ 7- 8 của thai kỳ nên biểu hiện nam hóa thường ngay sau sinh: âm vật to, môi lớn dính vào nhau, lỗ niệu đạo ở ngay dưới âm vật..., sau đó các biểu hiện nam hóa ngày càng rõ nếu trẻ không được điều trị sớm. Ở trẻ trai, thường ít có biểu hiện nam hóa lúc được sinh ra (cường androgen). Cũng như trẻ gái, biểu hiện cường androgen ở trẻ nam diễn ra nhanh bắt đầu từ 2- 3 tuổi gồm các dấu hiệu dậy thì sớm như mọc lông mu, lông nách, sau đó mọc trứng cá và giọng trầm. Dương vật to nhanh, thường cương cứng, tinh hoàn nhỏ so với tuổi [8], [26].  Thể không cổ điển Đây là thể nhẹ nhất, hoạt độ enzym 21-OH chỉ giảm nhẹ, còn khoảng 2050% so với bình thường và nồng độ androgen máu tăng nhẹ nên không đủ gây nam hóa ở trẻ gái và dậy thì sớm ở trẻ trai sau sinh. Bệnh xuất hiện muộn, triệu chứng xuất hiện ở tuổi dậy thì và thường được phát hiện ở nữ do nồng độ androgen cao hơn bình thường, còn ở nam giới, ảnh hưởng này không đáng kể vì ở lứa tuổi này, nồng độ testosterol đã tăng bài tiết. Trẻ em nữ sẽ có biểu hiện: tuyến vú kém phát triển, mọc trứng cá, rậm lông, rối loạn kinh nguyệt, thiểu kinh và có thể vô kinh [8], [26]. 9 2. CƠ SỞ PHÂN TỬ VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH TSTTBS 2.1. Cơ sở phân tử của bệnh TSTTBS 2.1.1 Vị trí, cấu trúc, chức năng gen CYP21 Vị trí gen CYP21 Gen CYP21 gồm có 2 bản sao CYP21A2 và giả gen CYP21A2P, cả hai cùng nằm bên trong phức hợp hòa hợp mô chủ yếu MHC trên cánh ngắn của NST số 6 vùng 6p21.3. Trong vùng này, gen CYP21A2 và CYP21A2P nằm xen kẽ với hai gen mã hóa cho bổ thể C4A và C4B mã hóa cho thành phần của C4 bổ thể [18], [40]. Hình 1.2. Nhiễm sắc thể số 6 và vị trí gen CYP21 [19] Cấu trúc gen CYP21 Gen mã hóa cho enzym 21- OH của vỏ thượng thận là gen CYP21A2, có kích thước 30 kb và cùng với giả gen không chức năng (nonfunctional pseudogene), CYP21A2P, nằm trên cánh ngắn, nhiễm sắc thể số 6 (6p21.3), trong vùng phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (major histocompatibility complex-MAC) (cạnh gen HLA). Gen CYP21A2 và gen tương đồng của nó, CYP21A2P, nằm xen kẽ với hai gen mã hóa cho bổ thể C4A và C4B. Mỗi gen CYP21A2 và CYP21A2P bao gồm 10 exon trình tự nucleotide của hai gen này tương đồng 98% trong các exon và khoảng 96% trong các intron do vậy trong quá trình phân bào giảm nhiễm có thể do sự đột biến mất đoạn giữa hai allen hoặc nhân đoạn một cách hoàn toàn dẫn đến thay đổi cấu trúc của gen CYP21A2 bị thay thế một đoạn của giả gen CYP21A2P hoặc gây mất 10 đoạn của gen CYP21A2P. Các thay đổi này gây nên sự bất hoạt của gen CYP21A2 bình thường và gây nên tình trạng bệnh lý [26],[41]. Hình 1.3. Cấu trúc phân tủ của gen CYP21 [18] Chức năng gen CYP21 Gen CYP21 mã hóa cho enzym 21-OH gồm 494 acid amin, có vai trò phiên mã tổng hợp ARNm tiền thân. Phân tử này trải qua quá trình cắt các intron nối chính xác các exon với nhau và tạo ra phân tử ARNm hoàn chỉnh. Phân tử này sẽ được sử dụng làm khuôn dịch mã tổng hợp enzym 21-OH [20]. 2.1.2 Một số đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS Hai gen CYP21A2 và CYP21A2P có trình tự tương đồng nhau. Trình tự của gen giả CYP21A2P có các loại đột biến thường thấy trên bệnh nhân TSTTBS. Điều này có thể giải thích là do quá trình phân bào giảm nhiễm, sự bắt chéo không đồng đều giữa các cặp nhiễm sắc thể dẫn tới việc các trình tự ở vùng gen giả CYP21A2P chuyển sang CYP21A2 gây nên đột biến gen CYP21A2. Theo thống kê, 95% các đột biến trên gen CYP21A2 là do chuyển đoạn từ gen giả CYP21A2P, 5% còn lại là do gen CYP21A2 bị đột biến. Các đột biến thường gặp trên gen CYP21A2 là xóa đoạn hoặc chuyển đoạn lớn (Large deletion/convertion), IVS- 13A/C → G, I172N. Ngoài ra còn có các đột biến Q138X, R365W, R473W, P30L, del- 8 bp cũng có tỷ lệ tương đối cao [28]. 11 Bảng 1.2: Các đột biến gen CYP21 thường gặp gây TSTTBS cổ điển [4],[35],[39] Đột biến Vị trí nucleotide Exon/Intron Mất đoạn gen Tỷ lệ % Kiểu hình 25-30 MM Pro30Leu 89C→T exon 1 5-10 KCĐ I2g 656A/C→G I2 20-25 MM- NHĐT Mất 8bp ∆708-715 E3 5-10 MM Ile 172Asn 1001T→A E4 5-10 NHĐT Ile236Asn, 1382T→A, E6 5-10 MM Val237Glu, 1385T→A, Met239Lys 1391T→A Val281Leu 1685G→T E7 5-10 KCĐ Phe306+1nt 1759+T E7 <5 MM Gln318Stop 1996C→T E8 5-10 MM Arg356Trp 2110C→T E8 10 MM Các nucleotid được đánh số bắt đầu từ nucleotid A trong mã ATG đầu tiên của trình tự mã hóa. Các intron cũng được tính.  Mất đoạn và chuyển đoạn gen lớn 30kb Thông thường các mất đoạn có chiều dài khoảng 30kb từ vị trí giữa exon 3 và 8 của gen CYP21A2P xuyên qua gen C4B đến vị trí tương ứng ở trên gen CYP21A2. Kết quả là gen đơn CYP21A2 còn lại với đầu tận cùng 5’ tương ứng CYP21A2P và đầu 3’ tương ứng CYP21A2. Mất đoạn ngăn cản sự tổng hợp protein và phá hủy tất cả hoạt tính enzym 21- hydroxylase [25]. Trao đổi chéo không tương xứng có thể xảy ra bất cứ vị trí nào bên trong đơn vị RCCX (kích thước 30 kb) bao gồm gen RP, C4, CYP21A2, TNX và tạo nên các nhiễm sắc thể có 1 hoặc 3 bản sao đơn vị 30 kb này. Các vị trí trao đổi chéo nằm trong hay ở đầu 3’ của CYP21A2 gây thiếu hụt enzym 21- hydroxylase. 12