Tài liệu Phân loại và quan hệ di truyền nhóm ếch cây xanh rhacophorus (amphibia rhacophoridae) ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THIÊN TẠO PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH RHACOPHORUS (AMPHIBIA: RHACOPHORIDAE) Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC HÀ NỘI - 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THIÊN TẠO PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH RHACOPHORUS (AMPHIBIA: RHACOPHORIDAE) Ở VIỆT NAM Chuyên nghành: Động vật học Mã số: 60 42 10 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐẶNG TẤT THẾ HÀ NỘI - 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đặng Tất Thế (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật) đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thiện luận văn. Tôi xin trân trọng cảm ơn Lãnh đạo Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Phòng Sinh học, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên và giúp đỡ trong quá trình hoàn thiện luận văn này. Xin cảm ơn sự giúp đỡ và hợp tác hiệu quả của các đồng nghiệp ở Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật; Khoa Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội; Viện Động vật St. Petersburg, Liên bang Nga; Bảo tàng Leiden, Hà Lan; Vườn thú Cologne, Cộng hòa Liên bang Đức. Xin cảm ơn gia đình đã ủng hộ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Đề tài nghiên cứu này nhận được sự hỗ trợ kinh phí của Quỹ Học bổng Nagao – Trung tâm Nghiên cứu Tài nguyên Môi trường (CRES); Quỹ Bảo tồn Việt Nam (VCF); Chương trình Hỗ trợ dự án nhỏ (NEF) của Quỹ Nagao, Nhật Bản; Quỹ Hỗ trợ trang thiết bị nghiên cứu IdeaWild và Hội Địa lý Quốc gia Hoa Kỳ (National Geographic Society). Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2010 Học viên Nguyễn Thiên Tạo Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu, kết quả sử dụng trong luận văn này là do tôi thu thập và phân tích. Đồng thời, luận văn này chưa từng được bảo vệ trước bất cứ một hội đồng nào khác trước đây. Hà Nội, ngày tháng năm 2010. Nguyễn Thiên Tạo Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM THUẬT NGỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN BMNH Bảo tàng Lịch sử tự nhiên Anh, Luân Đôn. IEBR Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Hà Nội. KBTTN Khu Bảo tồn thiên nhiên. MNHN Bảo tàng Lịch sử tự nhiên Quốc gia Pháp, Paris. MSNG Bảo tàng Lịch sử tự nhiên Genoa, I-ta-li-a. VNMN Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Hà Nội. VNUH Bảo tàng Động vật, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. VQG Vƣờn Quốc gia. ZISP Viện Động vật Xanh Pê-tec-bua, Viện Hàn lâm Khoa học Liên bang Nga. ZMH Viện nghiên cứu và Bảo tàng Động vật, Đại học Ham-buốc, Cộng hòa Liên bang Đức. ZRC Bảo tàng Nghiên cứu Đa dạng sinh học Raffles, Đại học Quốc gia Sing-ga-po. Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 1 http://www.lrc-tnu.edu.vn NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng II.1. Danh sách và thông tin về mẫu vật nghiên cứu. Bảng II.2. Thành phần hỗn hợp PCR. Bảng II.3. Chu trình nhiệt PCR. Bảng III.1. Số đo mẫu vật loài Ếch cây chƣ yang sin Rhacophorus chuyangsinensis. Bảng III.2. Số đo mẫu vật loài Ếch cây xanh đốm Rhacophorus dennysi. Bảng III.3. Số đo mẫu vật loài Ếch cây phê Rhacophorus feae. Bảng III.4. Số đo các mẫu vật loài Ếch cây ki-ô Rhacophorus kio. Bảng III.5. Số đo mẫu vật loài Ếch cây lớn Rhacophorus maximus. Bảng III.6. So sánh các đặc điểm hình thái chính 5 loài ếch cây xanh giống Rhacophorus ở Việt Nam. Bảng III.7. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu nghiên cứu trên đoạn gen 16S rRNA. Bảng III.8. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu vật nghiên cứu trên đoạn gen Cytochromeb. Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 2 http://www.lrc-tnu.edu.vn NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Bản đồ điểm nóng đa dạng sinh học Đông dƣơng – Mi-an-ma. Hình II.1. Bản đồ các địa điểm khảo sát thực địa. Hình III.1. Ếch cây chƣ yang sin Rhacophorus chuyangsinensis thu tại Chƣ Yang Sin, Đắk Lắk. Hình III.2. Ếch cây chƣ yang sin Rhacophorus chuyangsinensis thu tại Hòn Bà, Khánh Hoà. Hình III.3. Bản đồ phân bố loài Ếch cây chƣ yang sin Rhacophorus chuyangsinensis. Hình III.4. Ếch cây xanh đốm Rhacophorus dennysi thu tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc. Hình III.5. Bản đồ phân bố loài Ếch cây xanh đốm Rhacophorus dennysi ở Việt Nam. Hình III.6. Ếch cây phê Rhacophorus feae. Hình III.7. Bản đồ phân bố loài Ếch cây phê Rhacophorus feae ở Việt Nam. Hình III.8. Ếch cây ki-ô Rhacophorus kio thu tại Nguyên Bình, Cao Bằng và tại Kon Plông, Kon Tum. Hình III.9. Bản đồ phân bố loài Ếch cây ki-ô Rhacophorus kio ở Việt Nam. Hình III.10. Ếch cây lớn Rhacophorus maximus thu tại Sơn Động, Bắc Giang. Hình III.11. Bản đồ phân bố loài Ếch cây lớn Rhacophorus maximus ở Việt Nam. Hình III.12. Đối chiếu trình tự nucleotide và axit amin từ các mẫu nghiên cứu trên gen 16S rRNA. Hình III.13. Cây phát sinh chủng loại NJ (Neighbor Joining). Hình III.14. Cây phát sinh chủng loại MP (Maximum Parsimony). Hình III.15. Đối chiếu trình tự nucleotide và axit amin từ các mẫu nghiên cứu trên gen Cytochromeb. Hình III.16. Cây phát sinh chủng loại NJ (Neighbor Joining). Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 3 http://www.lrc-tnu.edu.vn NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM Hình III.17. Cây phát sinh chủng loại MP (Maximum Parsimony), Hình III.18. Sinh cảnh loài Ếch cây chƣ yang sin ở Hòn Bà, Khánh Hoà. Hình III.19. Sinh cảnh loài Ếch cây xanh đốm ở Nguyên Bình, Cao Bằng. Hình III.20. Sinh cảnh loài Ếch cây phê ở Chƣ Yang Sin, Đắk Lắk. Hình III.21. Sinh cảnh loài Ếch cây ki-ô ở Kon Plông, Kon Tum. Hình III.22. Sinh cảnh loài Ếch cây lớn ở Sơn Động, Bắc Giang. Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 4 http://www.lrc-tnu.edu.vn NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM MỤC LỤC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ............................................ 1 DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ 2 DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................. 3 MỤC LỤC ......................................................................................................... 5 MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 7 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ........................... 10 I.1. Các nghiên cứu về phân loại nhóm ếch cây xanh ..................................... 10 I.2. Các nghiên cứu về quan hệ di truyền của nhóm ếch cây xanh ................. 13 I.3. Các nghiên cứu về sinh thái học của nhóm ếch cây xanh ........................ 14 CHƢƠNG II. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................ 15 II.1. Thời gian, địa điểm nghiên cứu ............................................................... 15 II.2. Thu thập và xử lý mẫu vật ....................................................................... 15 II.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................... 17 II.3.1. Phân tích mối quan hệ di truyền .................................................... 17 II.3.1.1. Gen nghiên cứu ....................................................................... 17 II.3.1.2. Thiết kế mồi PCR .................................................................... 18 II.3.1.3. Tách chiết DNA tổng số .......................................................... 18 II.3.1.4. Nhân bản đoạn DNA đích bằng kỹ thuật PCR ........................ 18 II.3.1.5. Giải mã và phân tích trình tự DNA ......................................... 20 II.3.1.6. Phân tích số liệu ...................................................................... 20 II.3.2. Đặc điểm hình thái ......................................................................... 21 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 23 III.1. Phân loại nhóm ếch cây xanh giống Rhacophorus ................................ 23 III.1.1. Ếch cây chƣ yang sin Rhacophorus chuyangsinensis Orlov, Nguyen & Ho, 2008 .............................................................................. 23 III.1.2. Ếch cây xanh đốm Rhacophorus dennysi Blanford, 1881 ........ 29 III.1.3. Ếch cây phê Rhacophorus feae Boulenger, 1893 ..................... 34 III.1.4. Ếch cây ki-ô Rhacophorus kio Ohler & Delorme, 2006........... 39 III.1.5. Ếch cây lớn Rhacophorus maximus Günther, 1858.................. 44 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 5 http://www.lrc-tnu.edu.vn NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM III.1.6. Khóa định loại 5 loài ếch cây xanh giống Rhacophorus ở Việt Nam ....................................................................................................... 49 III.2. Quan hệ di truyền giữa các loài ếch cây xanh ở Việt Nam .................... 50 III.2.1. Kết quả giải trình tự nucleotide trên gen 16S rRNA .................... 50 III.2.1.1. Sai khác về mặt di truyền giữa các mẫu cùng loài ................ 58 III.2.1.2. Khoảng cách di truyền giữa các loài ..................................... 59 III.2.1.3. Xây dựng cây phát sinh chủng loại........................................ 59 III.2.2. Kết quả giải trình tự nucleotide trên gen Cytochromeb ............... 61 III.2.2.1. Sai khác về mặt di truyền giữa các mẫu cùng loài ................ 67 II.2.2.2. Khoảng cách di truyền giữa các loài ...................................... 68 II.2.2.3. Xây dựng cây phát sinh chủng loại ......................................... 68 III.3. Một số đặc điểm sinh học, sinh thái của các loài ếch cây xanh giống Rhacophorus ở Việt Nam ................................................................................ 70 III.3.1. Loài Ếch cây chƣ yang sin Rhacophorus chuyangsinensis.......... 71 III.3.2. Loài ếch cây xanh đốm Rhacophorus dennysi ............................. 71 III.3.3. Loài ếch cây phê Rhacophorus feae............................................. 73 III.3.4. Loài ếch cây ki ô Rhacophorus kio .............................................. 73 III.3.5. Loài ếch cây lớn Rhacophorus maximus...................................... 75 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 76 1. Kết luận ....................................................................................................... 76 1.1. Về phân loại nhóm ếch cây xanh giống Rhacophorus ở Việt Nam .. 76 1.3. Về đặc điểm sinh học, sinh thái của các loài ếch cây xanh giống Rhacophorus ở Việt Nam ......................................................................... 77 2. Kiến nghị ..................................................................................................... 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 78 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 6 http://www.lrc-tnu.edu.vn NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM MỞ ĐẦU Việt Nam nằm trong vùng địa lý động vật Đông dƣơng–Mi-an-ma (IndoBurma), một trong những điểm nóng đa dạng sinh học của thế giới (Hình 1, Conservation International 2010)[9]. Việt Nam cũng là một trong những nƣớc có thành phần loài bò sát và ếch nhái đa dạng nhất trên thế giới với tổng số 568 loài đã đƣợc ghi nhân và khu hệ bò sát và ếch nhái có tính đặc hữu cao (Nguyen et al. 2009; Ziegler & Nguyen 2010) [23,35]. Hình 1. Bản đồ điểm nóng đa dạng sinh học Đông dƣơng – Mi-an-ma (CI 2010). Trong vài thập kỷ gần đây, nghiên cứu về sự đa dạng của các loài ếch nhái và bò sát đƣợc tiến hành ở nhiều khu vực khác nhau trên toàn quốc. Các chƣơng trình nghiên cứu đã khám phá nhiều loài mới cho khoa học, đồng thời, sự đa dạng về số loài bò sát và ếch nhái ở Việt Nam cũng tăng lên rõ rệt: từ 340 loài (năm 1996) lên 458 loài (năm 2005) và 545 loài (năm 2009). Riêng số loài ếch nhái đã tăng lên gấp đôi: từ 82 loài (năm 1996) lên 162 loài (năm 2005) và 177 loài (năm 2009) (Nguyễn Văn Sáng & Hồ Thu Cúc 1996; Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 7 http://www.lrc-tnu.edu.vn NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM Nguyễn Văn Sáng và cs. 2005; Nguyen et al. 2009) [21,22,23]. Sau khi cuốn danh lục của Nguyen et al. (2009) đƣợc xuất bản, có bốn loài mới và một ghi nhận mới đƣợc công bố, nâng tổng số loài ếch nhái hiện biết của Việt Nam lên 182 loài (Bain et al. 2009a,b,c; Rowley & Cao 2009; Rowley et al. 2010; Ziegler & Nguyen 2010)[2,3,4,29,30,35] Theo Nguyen et al. (2009), trong số các nhóm ếch nhái ở Việt Nam, họ Ếch cây (Rhacophoridae) có sự đa dạng về thành phần loài cao nhất (51 loài thuộc 9 giống) với 12 loài mới đƣợc mô tả kể từ năm 2000 trở lại đây. Trong họ này thì giống Ếch cây Rhacophorus có số loài đa dạng nhất với 17 loài đã đƣợc ghi nhận và chiếm ƣu thế là nhóm ếch cây xanh với 5 loài[23]. Hiện nay, nhóm ếch cây xanh ở Việt Nam gồm có các loài sau: Ếch cây chƣ yang sin Rhacophorus chuyangsinensis, Ếch cây xanh đốm R. dennysi, Ếch cây phê R. feae, Ếch cây ki-ô R. kio, và Ếch cây lớn R. maximus. Đây là nhóm ếch cây có kích cỡ tƣơng đối lớn với hai loài mới đƣợc mô tả gần đây: R. kio (Ohler & Delorme 2006)[24], R. chuyangsinensis (Orlov et al. 2008)[27]; loài R. maximus mới đƣợc ghi nhận ở Việt Nam (Nguyen et al. 2008)[20]; và hai loài đƣợc ghi trong Sách Đỏ Việt Nam (2007)[7]: R. feae và R. kio. Nghiên cứu về quan hệ di truyền của nhóm ếch này còn rất hạn chế, chỉ có một số công trình công bố với mẫu vật nghiên cứu thu ở Trung Quốc, Lào và Thái Lan (Wilkinson et al. 2002; Ohler & Delorme 2006; Yu et al. 2008; Li et al. 2009)[32,24,18]. Mặt khác, các loài thuộc nhóm ếch cây này có màu sắc rất đẹp, lƣng màu xanh lá cây với những đốm trắng hoặc sọc sáng màu ven sƣờn hay giữa lƣng, bụng màu xám hoặc trắng đục, màng bơi màu tím nhạt hay đen xen lẫn với màu cam. Do vậy, chúng đƣợc coi là nhóm sinh vật cảnh đƣợc ƣa chuộng và là đối tƣợng bị khai thác mạnh ngoài tự nhiên phục vụ mục đích buôn bán. Gần đây, một số loài thuộc nhóm ếch cây này đã đƣợc nhân nuôi sinh sản Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 8 http://www.lrc-tnu.edu.vn NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM thành công tại Trạm nhân nuôi sinh sản các loài bò sát và ếch nhái của Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật (Nguyen et al. 2009)[19]. Để góp phần cung cấp dẫn liệu đầy đủ hơn về hệ thống phân loại và phát sinh chủng loại của các loài thuộc giống ếch cây Rhacophorus cũng nhƣ làm cơ sở khoa học cho các chƣơng trình bảo tồn, nhân nuôi các loài ếch nhái quý hiếm, đề tài này tiến hành nghiên cứu về quan hệ di truyền, hình thái, phân loại cũng nhƣ tìm hiểu một số đặc điểm sinh học và sinh thái của nhóm ếch cây xanh ở Việt Nam. Mục tiêu của đề tài là: 1. Nghiên cứu phân loại 5 loài nhóm ếch cây xanh giống Rhacophorus dựa trên các đặc điểm hình thái. 2. Phân tích mối quan hệ di truyền và tiến hoá ở mức độ phân tử dựa trên kết quả giải mã trình tự DNA. 3. Bƣớc đầu tìm hiểu một số đặc điểm sinh học và sinh thái của các loài ếch cây xanh trên. Căn cứ vào mục tiêu trên, đề tài thực hiện các nội dung nghiên cứu sau: 1. Mô tả đặc điểm hình thái, bổ sung địa điểm phân bố và xây dựng khoá định loại cho 5 loài ếch cây xanh thuộc giống Rhacophorus ở Việt Nam. 2. Đánh giá mối quan hệ di truyền, xây dựng cây phát sinh chủng loại và xác định sự sai khác về mặt di truyền của 5 loài ếch cây xanh, đồng thời xem xét sự sai khác giữa các mẫu vật cùng loài nhƣng thu thập ở các địa điểm khác nhau ở Việt Nam dựa trên kết quả giải trình tự DNA của gen 16S rRNA và gen Cytochromeb. 3. Cung cấp thông tin về một số đặc điểm sinh học, sinh thái của các loài ếch cây xanh thông qua quan sát trực tiếp trong tự nhiên và trong điều kiện nuôi nhốt. Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 9 http://www.lrc-tnu.edu.vn NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM CHƢƠNG I. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU I.1. Các nghiên cứu về phân loại nhóm ếch cây xanh Trên thế giới, họ Ếch cây Rhacophoridae hiện biết có 320 loài thuộc 13 giống, phân bố ở Châu Á gồm Trung Quốc (bao gồm cả Đài Loan), các nƣớc Đông Nam Á, Nhật Bản, Philippin, Ấn Độ và Châu Phi (Frost 2010)[11]. Ở Việt Nam họ này có 51 loài thuộc 9 giống bao gồm Aquixalus, Chiromantis, Feihyla, Kurixalus, Nyctixalus, Philautus, Polypedates, Rhacophorus và Theloderma; trong đó giống Rhacophorus có 17 loài (Nguyen et al. 2009; Ziegler & Nguyen 2010) bao gồm: Rhacophorus annamensis Smith, 1924; R.appendiculatus (Günther, 1859 “1858”); R.baliogaster Inger, Orlov et Darevsky, 1999; R.calcaneus Smith, 1924; R.chuyangsinensis Orlov, Nguyen và Ho, 2008; R. dennysii Blanford, 1881; R. dorsoviridis (Bourret, 1937); R.duboisi Ohler, Marquis, Swan et Grosjean, 2000; R.dugritei (David, 1872); R.exechopygus Inger, Orlov et Darevsky, 1999; R.feae Boulenger, 1893; R.hoanglienensis Orlov, Lathrop, Murphy et Ho, 2001; R.kio Ohler et Delorme, 2006; R.hungfuensis (Liu et Hu, 1961); R.maximus Günther, 1859 “1858”; R.orlovi Ziegler et Köhler, 2001 và R.rhodopus Liu et Hu, 1960. Dubois (1986) coi họ ếch cây chỉ là một phân họ (Rhacophorinae) của họ Ếch nhái Ranidae. Tuy nhiên, theo quan điểm phân loại của đa số các nhà nghiên cứu hiện nay thì giống Ếch cây Rhacophorus thuộc họ Ếch cây Rhacophoridae, Bộ Không đuôi Anura, Lớp Ếch nhái Amphibia (Orlov et al. 2008; Li et al. 2009; Nguyen et al. 2009; Yu et al. 2009; Frost 2010)[10,27,23,34,11]. Theo phân loại của Dubois (1986) thì các loài ếch cây xanh ghi nhận ở Việt Nam nằm trong hai nhóm dƣới đây: Nhóm 1) Nhóm Rhacophorus Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 10 http://www.lrc-tnu.edu.vn NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM reinwardtii (Schlegel, 1840) gồm: Rhacophorus bipunctatus Ahl, 1927; Rhacophorus dulitensis Boulenger, 1892; Rhacophorus georgii Roux, 1904; Rhacophorus maximus Gunther, 1859; Rhacophorus nigropalmatus Boulenger, 1895; Rhacophorus prominanus Smith, 1924; Rhacophorus reinwardtii (Schlegel, 1840); và Rhacophorus rhodopus Liu & Hu, 1959. Nhóm 2) Nhóm Rhacophorus dennysi Blanford, 1881 gồm: Rhacophorus dennysi Blanford, 1881 và Rhacophorus feae Boulenger, 1893[10]. Trong tài liệu của Bourret (1942) mô tả một loài ếch cây xanh là Rhacophorus nigropalmatus với 4 phân loài: R. nigropalmatus maximus, R. nigropalmatus nigropalmatus, R. nigropalmatus feae và R. nigropalmatus dennysi. Trong số đó, chỉ có phân loài R. nigropalmatus feae ghi nhận ở Sa Pa, Lào Cai, Việt Nam[6]. Nguyễn Văn Sáng và Hồ Thu Cúc (1996) ghi nhận tổng số 19 loài ếch cây, trong đó có duy nhất một loài ếch cây xanh là Rhacophorus nigropalmatus (hiện nay đƣợc định loại lại gồm 2 loài là R. feae và R. kio)[21]. Orlov et al. (2001) ghi nhận 20 loài ếch cây ở vùng núi Hoàng Liên, tỉnh Lào Cai, trong đó có 8 loài ghi nhận mới cho khu hệ ếch nhái Việt Nam và mô tả thêm một loài mới Rhacophorus hoanglienensis. Các tác giả cũng tổng hợp danh sách 40 loài ếch cây có ở Việt Nam thuộc 5 giống, trong đó hai loài P.dennysi và P.feae đƣợc xếp thuộc giống Polypedates[25]. Đến năm 2002, Orlov et al. ghi nhận 42 loài trong họ Rhacophoridae ở Việt Nam, trong đó có 3 loài ếch cây xanh thuộc hai giống là Polypedates và Rhacophorus là Polypedates dennysi, P. feae và Rhacophorus reinwardtii[26]. Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 11 http://www.lrc-tnu.edu.vn NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM Tài liệu của Nguyễn Văn Sáng và cs. (2005) ghi nhận tổng số 45 loài ếch cây, trong đó cũng ghi nhận 3 loài ếch cây xanh thuộc hai giống là Polypedates dennysi, P. feae và Rhacophorus reinwardtii[22]. Ohler & Delorme (2006) mô tả loài ếch cây xanh Rhacophorus kio ở khu vực Đông dƣơng, dựa trên các mẫu vật thu đƣợc ở Việt Nam, Lào và Thái Lan trƣớc đây đƣợc định loại là Rhacophorus reinwardtii[24]. Năm 2007, Bordoloi et al. đã nghiên cứu về phân loại các loài ếch cây màng chân đỏ thuộc giống Rhacophorus và mô tả một loài ếch cây mới R. suffry ở Ấn Độ. Các tác giả so sánh đặc hình thái và xây dựng khóa định loại của 8 loài các loài ếch cây có màng chân đỏ bao gồm Rhacophorus bipunctatus, R. kio, R. malabaricus, R. pseudomalabaricus, R. reinwardtii, R. rhodopus, R. suffry, và R. yaoshanenis. Loài R. kio đƣợc xếp chung cùng nhóm với loài R. reinwardtii[5]. Chou et al. (2007) sắp xếp các loài sau thuộc nhóm Rhacophorus maximus: R. dennysi, R. feae, R. maximus, và R. tuberculatus. Nhóm này có chung các đặc điểm hình thái sau: tay có màng bơi hoàn toàn hoặc ít nhất các ngón phía ngoài có màng bơi hoàn toàn, không có nếp da phía trên hậu môn hay gót chân, mút mõm tròn hay hơi nhọn, không có gờ da bên lƣng, không có riềm da ở mép ngoài cổ chân[8]. Orlov et al. (2008) mô tả loài ếch cây xanh mới với mẫu chuẩn thu tại VQG Chƣ Yang Sin, tỉnh Đắc Lắc và đặt tên loài mới là Rhacophorus chuyangsinensis. Các tác giả cũng cập nhật danh sách 49 loài thuộc 11 giống trong họ Ếch cây ở Việt Nam và chuyển hai loài R.dennysi và R.feae thuộc giống Rhacophorus[27]. Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 12 http://www.lrc-tnu.edu.vn NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM Cũng trong năm 2008, Nguyen et al. lần đầu tiên ghi nhận loài Rhacophorus maximus ở Việt Nam dựa trên bộ mẫu thu ở Yên Tử, Bắc Giang[20]. I.2. Các nghiên cứu về quan hệ di truyền của nhóm ếch cây xanh Wilkinson et al. (2002) đã tiến hành đánh giá mối quan hệ di truyền của họ ếch cây ở Châu Á và Châu Phi. Các tác giả giải trình tự DNA của gen 12S và 16S rRNA để so sánh và xây dựng cây chủng loại phát sinh dạng MP (Maximum Parsimony) và ML (Maximum Likelihood) cho đại diện của 12 giống thuộc họ ếch cây Rhacophoridae. Kết quả cho thấy loài Polypedates dennysi nằm trong nhóm các loài thuộc Rhacophorus và các tác giả này đề nghị chuyển loài P. dennysi sang giống Rhacophorus[32]. Ohler & Delorme (2006) đã so sánh các đặc điểm hình thái kết hợp với phân tích di truyền phân tử giữa các mẫu vật ếch cây xanh đƣợc định tên là Rhacophorus nigropalmatus và R. reinwardtii. Kết quả cho thấy các mẫu vật thu đƣợc ở Lào, Việt Nam, và Thái Lan (trƣớc đây đƣợc định tên là R. reinwardtii) có đặc điểm khác biệt và nằm ở nhánh tiến hoá khác hẳn so với 2 loài R. nigropalmatus và R. reinwardtii nói trên. Do đó, các tác giả đã mô tả loài mới đặt tên là Rhacophorus kio với vùng phân bố kéo dài từ Nam Trung Quốc qua Việt Nam và Lào đến Thái Lan và kết luận loài R. reinwardtii không phân bố ở Việt Nam[24]. Yu et al. (2008) nghiên cứu quan hệ di truyền các loài thuộc họ ếch cây Rhacophoridae, tập trung vào các loài phân bố ở Trung Quốc. Nhóm nghiên cứu này đã giải trình tự một đoạn gen ty thể 12S và 16S rRNA của 23 loài ếch cây đại diện 4 trong 8 giống trong họ ếch cây của Trung Quốc. Kết quả cho Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 13 http://www.lrc-tnu.edu.vn NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM thấy loài R. reinwardtii thuộc nhánh tiến hoá cùng với loài R. rhodopus, khác biệt hẳn so với hai loài Rhacophorus feae và R. dennysi[33]. Yu et al. (2009) đã kiểm tra lại sự phát sinh chủng loại và tiến hoá của các loài thuộc họ ếch cây Rhacophoridae dựa trên nghiên cứu DNA của các gen 12S rRNA, 16S rRNA và Cytochromeb và ba đoạn DNA trong nhân mã hóa protein (Rag-1, Rhodopsin 1, và exon tyrosinase 1). Số liệu nghiên cứu cho thấy loài R. dennysi thuộc một nhánh tiến hoá riêng có quan hệ gần gũi với các loài R. feae, R. maximus, R. chenfui, và R. nigropunctatus[39]. Li et al. (2008, 2009) đánh giá quan hệ di truyền trong họ Ếch cây Rhacophoridae dựa trên 5 gen nhân (brain-derived neurotrophic factor, proopiomelanocortin, recombination activating gene 1, tyrosinase, rhodopsin và 3 gen ty thể (12S, 16S rRNA, và t-RNA) với những bình luận về sự tiến hóa về hình thức sinh sản. Kết quả nghiên cứu cũng xác nhận lại loài R. dennysi có mối quan hệ gần gũi với các loài R. feae và R. nigropunctatus[17,18]. I.3. Các nghiên cứu về sinh thái học của nhóm ếch cây xanh Năm 2008, Hà Thị Tuyết Nga nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái và kỹ thuật nhân nuôi loài chang xanh đốm (Polypedates dennysi) trong điều kiện nuôi nhốt. Kết quả nghiên cứu cung cấp các thông tin về sinh học, sinh thái, tập tính, sinh sản và bệnh dịch cũng nhƣ kỹ thuật nuôi nhốt loài chàng xanh đốm trong điều kiện nuôi nhốt tại trại thực nghiệm sinh học Cổ Nhuế Từ Liêm, Hà Nội[13]. Năm 2009, Lê Vũ Khôi và cộng sự đã công bố những dẫn liệu về sinh trƣởng và phát triển của chàng xanh đốm Polypedates dennysi (Blanford, 1881) trong điều kiện nuôi nhốt[16]. Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 14 http://www.lrc-tnu.edu.vn NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM CHƢƠNG II. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1. Thời gian, địa điểm nghiên cứu Các chuyến khảo sát thực địa đƣợc tiến hành vào tháng VI năm 2008, tháng V và VI năm 2009 tại KBTTN Tây Yên Tử (tỉnh Bắc Giang); tháng IV năm 2009 tại VQG Chƣ Yang Sin (tỉnh Đắk Lắk); tháng V năm 2010 tại Bắc Quang (tỉnh Hà Giang); tháng IX năm 2010 tại khu vực Nguyên Bình, huyện Trùng Khánh (tỉnh Cao Bằng); tháng VI năm 2010 tại Hƣơng Sơn (tỉnh Hà Tĩnh) và VQG Phong Nha - Kẻ Bàng (tỉnh Quảng Bình); tháng X năm 2010 tại KBTTN Xuân Liên (tỉnh Thanh Hóa). Đề tài cũng sử dụng mẫu vật thu thập từ các chuyến khảo sát tại khu vực rừng Kon Plông và núi Ngọc Linh (tỉnh Kon Tum) vào tháng V và VI năm 2006, núi Hoàng Liên thuộc huyện Phong Thổ và Tam Đƣờng (tỉnh Lai Châu) vào tháng XI và XII năm 2006, Kim Hỷ (tỉnh Bắc Kạn) vào tháng VI năm 2010, Mƣờng Khƣơng và Sa Pa (tỉnh Lào Cai) vào tháng VI năm 2009, núi Tam Đảo (tỉnh Vĩnh Phúc) vào tháng VIII năm 2010, Quế Phong (tỉnh Nghệ An) tháng V năm 2009 (Hình II.1). II.2. Thu thập và xử lý mẫu vật Thu thập mẫu vật: Mẫu vật chủ yếu đƣợc thu thập dọc theo ven suối và một số ao hoặc vũng nƣớc đọng trong rừng thƣờng xanh, nơi sinh sống và địa điểm đẻ trứng của các loài ếch nhái. Thời gian khảo sát từ 19:00 đến 24:00. Mẫu vật ếch nhái đƣợc thu thập bằng tay; một số ổ trứng cũng đƣợc thu thập để theo dõi quá trình biến thái và phát triển trong điều kiện nuôi nhốt. Xử lý mẫu vật: Sau khi chụp ảnh, mẫu vật thu đƣợc xử lý gây mê bằng hóa chất ethylacetate hoặc cồn 15% trong vòng 24 giờ sau khi thu. Mẫu DNA đƣợc lấy trƣớc khi cố định mẫu, là một mẩu cơ đùi hoặc gan, ngâm trong cồn 95%. Mẫu ếch nhái đƣợc cố định bằng cồn 80% trong vòng 24 giờ sau đó Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 15 http://www.lrc-tnu.edu.vn NGUYỄN THIÊN TẠO: PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN NHÓM ẾCH CÂY XANH Ở VIỆT NAM chuyển sang ngâm trong cồn 70% để bảo quản lâu dài, các mẫu đều đƣợc đánh số hiệu e - ti - két và ghi chép thông tin cụ thể các mẫu trong sổ thực địa. Mẫu vật ngâm hiện đang đƣợc lƣu giữ tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (IEBR); Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam (VNMN); Bảo tàng Động vật, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội (VNUH); và Viện Động vật Xanh-pê-tec-bua, Viện Hàn lâm Khoa học Nga (ZISP). Tổng số có 45 mẫu vật đã đƣợc thu thập trong các chuyến khảo sát để phân tích các đặc điểm hình thái và 17 mẫu cơ sử dụng để phân tích DNA (Bảng II.1). Hình II.1. Bản đồ các địa điểm khảo sát thực địa. Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn