Tài liệu Phân lập và nghiên cứu gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn của thực vật

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _______________________ Nguyễn Duy Phương PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _______________________ Nguyễn Duy Phương PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62420116 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS Phạm Xuân Hội 2. GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa Hà Nội – 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Phạm Xuân Hội và GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được tác giả nào công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình. Hà Nội, ngày 20 tháng 02 năm 2016 Nghiên cứu sinh Nguyễn Duy Phương LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Phạm Xuân Hội (Viện Di truyền Nông nghiệp), GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên) và TS. Narendra Tuteja (Trung tâm Kỹ thuật Di truyền và Công nghệ sinh học Quốc tế, New Delhi, Ấn Độ) là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập, thực hiện và hoàn thành bản luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, (Trường ĐH KHTN) và Ban lãnh Phòng Sau Đại học đạo Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về tất cả các thủ tục cần thiết trong quá trình học tập và thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trong Bộ môn Sinh lý thực vật - Hóa sinh (Khoa Sinh học, Trường ĐH KHTN) đã giảng dạy trong suốt khóa học và tập thể cán bộ nghiên cứu của Bộ môn Bệnh học Phân tử (Viện DTNN), nhóm nghiên cứu của TS. Narendra Tuteja và các bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến cho tôi để hoàn thành luận án tốt nghiệp này. Tôi xin được cảm ơn gia đình và người thân đã luôn ở bên cạnh tôi, quan tâm, cảm thông và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận án. Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn tới Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đã cấp kinh phí nghiên cứu thông qua Đề tài mã số 106.06-2011.69 và Trung tâm Kỹ thuật Di truyền và Công nghệ Sinh học Quốc tế (Italy) đã hỗ trợ về mặt tài chính và khoa học thông qua Chương trình học bổng “Sandwich PhD Fellowship”. Hà Nội ngày 20 tháng 02 năm 2016 Nguyễn Duy Phương MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................... 4 DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... 7 DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ 8 MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 10 Chƣơng 1: TỔNG QUAN ...................................................................................... 13 1.1. HẠN HÁN VÀ ĐẶC TÍNH CHỐNG CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT ........... 13 1.1.1. Giới thiệu chung về hạn hán .................................................................. 13 1.1.2. Ảnh hƣởng của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp ................................ 13 1.1.3. Ảnh hƣởng của hạn hán đối với thực vật ............................................... 14 1.1.4. Đáp ứng của thực vật với điều kiện hạn ................................................. 16 1.1.5. Cơ sở phân tử của đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật ........................... 19 1.2. ĐIỀU HÒA HOẠT ĐỘNG GEN TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN ........................ 25 1.2.1. Promoter cảm ứng với điều kiện hạn ..................................................... 25 1.2.2. Điều hòa hoạt động gen sau phiên mã.................................................... 27 1.2.3. Điều hòa dịch mã................................................................................... 30 1.2.4. Phân vùng mRNA trong tế bào chất ...................................................... 30 1.2.5. Điều hòa sau dịch mã ............................................................................ 31 1.2.6. Vai trò điều hòa hoạt động gen của RNA không mã hóa ........................ 32 1.3. VAI TRÒ CỦA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ TRONG ĐÁP ỨNG HẠN ............... 33 1.3.1. Nhân tố phiên mã AP2/ERF .................................................................. 35 1.3.2. Nhân tố phiên mã NAC ......................................................................... 36 1.3.3. Nhân tố phiên mã WRKY ..................................................................... 37 1.3.4. Một số nhân tố phiên mã khác ............................................................... 38 1 1.4. NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA LÚA BẰNG CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN THỰC VẬT .................................................. 40 1.4.1. Nghiên cứu chuyển gen vào lúa ............................................................. 40 1.4.2. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chịu hạn ...................... 43 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 47 2.1. VẬT LIỆU...................................................................................................... 47 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................ 47 2.1.2. Chủng vi sinh vật .................................................................................. 47 2.1.3. Vector và oligonucleotide ...................................................................... 47 2.1.4. Hóa chất ................................................................................................ 49 2.1.5. Thiết bị .................................................................................................. 49 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 49 2.2.1. Xử lý mẫu thực vật ................................................................................ 49 2.2.2. Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA ........................................................ 50 2.2.3. Nhân dòng gen OsNLI-IF vào vector pGEM-T ...................................... 53 2.2.4. Thiết kế vector biểu hiện gen OsNLI-IF ................................................ 55 2.2.5. Sàng lọc gen từ thƣ viện cDNA ............................................................. 58 2.2.6. Tạo kháng thể đa dòng kháng protein OsNLI-IF tái tổ hợp .................... 65 2.2.7. Tạo cây chuyển gen biểu hiện OsNLI-IF ............................................... 68 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN C U & THẢO LUẬN ....................................... 72 3.1. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ Ở LÚA......................... 72 3.1.1. Tổng hợp thƣ viện cDNA thứ cấp .......................................................... 72 3.1.2. Phân lập gen mã hoá nhân tố phiên mã bằng kỹ thuật Y1H ................... 73 3.1.3. Nhân dòng gen mã hóa protein OsNLI-IF .............................................. 77 2 3.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN OsNLI-IF ........ 80 3.2.1. Biểu hiện của gen OsNLI-IF trong các điều kiện stress phi sinh học ...... 80 3.2.2. Hoạt tính liên kết đặc hiệu với đoạn DNA đích của OsNLI-IF ............... 84 3.2.3. Hoạt tính hoạt hóa quá trình phiên mã của OsNLI-IF ............................ 88 3.2.4. Nghiên cứu protein tƣơng tác với OsNLI-IF .......................................... 93 3.3. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNLI-IF ................................................. 98 3.3.1. Thiết kế hệ vector biểu hiện pCAMBIA1301 ........................................ 98 3.3.2. Thiết kế hệ vector biểu hiện pBI101 .................................................... 103 3.4. NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN OsNLI-IF TRONG CÂY CHUYỂN GEN ....... 107 3.4.1. Biến nạp vector biểu hiện vào A. tumefaciens LBA4404 ..................... 107 3.4.2. Nghiên cứu biểu hiện của OsNLI-IF trong cây thuốc lá ....................... 108 3.4.3. Nghiên cứu biểu hiện của OsNLI-IF trong cây lúa chuyển gen ............ 121 KẾT LUẬN ......................................................................................................... 132 KIẾN NGHỊ ........................................................................................................ 133 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ........ 134 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 135 PHỤ LỤC............................................................................................................ 147 3 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid 3-AT 3-Amino-1, 2, 4-triazole A. thaliana Arabidopsis thaliana A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens ABA Abscisic acid ABRE Yếu tố đáp ứng acid abscisic chứa trình tự ACGT (ACGT-containing abscisic acid response element) AD (acting domain) AMP Adenosine monophosphate ADP Adenosine diphosphate ATP Adenosine triphosphate BAP 6-Benzylaminopurine BD (binding domain) BĐKH Biến đổi khí hậu bp Cặp bazơ (base pair) BSA Albumin huyết thanh bò (Bovine serum albumin) CBB Coomassie Brilliant Blue cDNA DNA Ct Chu kỳ ngƣỡng (threshold cycle) dCTP Deoxycytidine triphosphate DEPC Diethylpyrocarbonate DMSO Dimethyl sulfoxide dNTP Deoxyribonucleoside Triphosphate DRE Yếu tố đáp ứng hạn (dehydration responsive element) DREB Protein liên kết với yếu tố đáp ứng hạn DRE ung (complementary deoxyribonucleic acid) 4 (dehydration responsive element-binding protein) E. coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr Ethidium bromide HSP Protein sốc nhiệt (Heat shock protein) IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kb Kilobase LB Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Luria-Bertani LEA Protein hình thành trong giai đoạn phát triển muộn của phôi (late embryogenesis abundant) LiAc Lithium acetate đa điểm cắt (multiple cloning site) MCS MOPS Acid 3-(N-morpholino) propansulfonic mRNA Messenger ribonucleic acid MS Môi trƣờng nuôi cấy thực vật Murashige & Skoog MS-R Môi trƣờng MS nuôi cấy lúa MS-T Môi trƣờng MS nuôi cấy thuốc lá NAA 1-naphthaleneacetic acid NAC NAM/ATAF1/2/CUC2 NACRS Trình tự nhận biết protein NAC (NAC recognition sequence) NLI-IF Nhân tố tƣơng tác với yếu tố tƣơng tác LIM trong nhân (nuclear LIM interactor-interacting factor) NST Nhiễm sắc thể OD Mật độ quang học (optical density) ORF Khung đọc mở (open reading frame) PCR Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction) 5 PEG Polyethylene glycol ROS Các dạ RT-PCR Phản ứng nhân bản DNA ng (reactive oxygen species) (reverse transcription polymerase chain reaction) S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae SDM Môi trƣờng dinh dƣỡng tối thiểu (synthetic defined medium) SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Điện di gel polyacrylamide (SDS - Polyacrylamide gel electrophoresis) TAE Đệm Tris-acetate-EDTA TBE Đệm Tris-borate-EDTA TE Đệm Tris-EDTA TF Nhân tố phiên mã (transcription factor) Ti-plasmid Plasmid gây khối u (tumor inducing plasmid) -Trp/-Ura/Leu/-His/-Ade Môi trƣờng khuyết dƣỡng không có Triptophan/ Uracil/ Leucine/ Histidine/ Adenine X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside Y1H Kỹ thuật lai phân tử trong tế bào nấm men dựa trên tƣơng tác DNA-protein (yeast one hybrid) Y2H Kỹ thuật lai phân tử trong tế bào nấm men dựa trên tƣơng tác protein-protein (yeast two hybrid) YEM Môi trƣờng nuôi cấy (yeast extract – manitol) YPD Môi trƣờng nuôi cấy nấm men destrose (yeast extract peptone dextrose) 6 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Gen mã hóa nhân tố phiên mã tăng cƣờng tính chịu hạn của lúa. ........... 46 Bảng 2.1: Trình tự các oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu.......................... 48 Bảng 2.2: Thành phần gel polyacrylamide chứa SDS. ........................................... 66 Bảng 2.3: Thành phần môi trƣờng MS cơ bản. ...................................................... 69 Bảng 3.1: Kết quả sàng lọc thƣ viện cDNA xử lý stress bằng kỹ thuật Y1H .......... 75 Bảng 3.2: Protein liên kết với đoạn DNA đích JRC0332 và JRC0528.................... 76 Bảng 3.3: Kết quả sàng lọc thƣ viện cDNA xử lý stress bằng kỹ thuật Y2H .......... 96 Bảng 3.4: Protein tƣơng tác với OsNLI-IF sàng lọc từ thƣ viện cDNA .................. 96 Bảng 3.5: Tỉ lệ nảy mầm của dòng thuốc lá T1 trên môi trƣờng MS. .................... 111 Bảng 3.6: Tỉ lệ nảy mầm của dòng thuốc lá T1 trên môi trƣờng có Hygromycin .... 112 Bảng 3.7: Kết quả phân tích PCR các dòng thuốc lá T1........................................ 113 Bảng 3.8: Tỉ lệ phục hồi sau xử lý stress hạn các dòng thuốc lá. .......................... 120 Bảng 3.9: Kết quả chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. ......... 123 Bảng 3.10: Kết quả sàng lọc các dòng lúa chuyển gen T1 . ................................... 124 Bảng 3.11: Tỉ lệ cây lúa chuyển gen phục hồi sau xử lý hạn. ............................... 130 7 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Mạng lƣới các nhân tố phiên mã tham gia đáp ứng stress. ...................... 34 Hình 2.1: Mô hình thí nghiệm xử lý stress hạn cây chuyển gen. ............................ 50 Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế vector pCAM-35S/OsNLI-IF ........................................... 57 Hình 2.3: Sơ đồ thiết kế vector pBI-Lip9/OsNLI-IF và pBI-Ubi/OsNLI-IF ........... 58 Hình 2.4: Sơ đồ vector HybriZAP-2.1 và vector pAD-GAL4-2.1 .......................... 59 Hình 2.5: Sơ đồ phƣơng pháp sàng lọc thƣ viện cDNA bằng Y1H......................... 62 Hình 2.6: Sơ đồ phƣơng pháp sàng lọc thƣ viện cDNA bằng Y2H......................... 64 Hình 3.1: Chuẩn hoá nồng độ thƣ viện cDNA thứ cấp ........................................... 72 Hình 3.2: Kiểm tra thƣ viện cDNA thứ cấp bằng PCR trực tiếp khuẩn lạc ............. 73 Hình 3.3: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện trong nấm men ....................................... 74 Hình 3.4: Nhân bản đoạn gen OsNLI-IF bằng kỹ thuật PCR .................................. 78 Hình 3.5: PCR và cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp pGEM/OsNLI-IF ...................... 79 Hình 3.6: Trình tự OsNLI-IF trong vector tái tổ hợp pGEM/OsNLI-IF.................... 80 Hình 3.7: Biểu hiện của OsNLI-IF trong các điều kiện môi trƣờng bất lợi ............. 82 Hình 3.8: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pAD-GAL4 ........................................... 85 Hình 3.9: PCR và cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp pAD/OsNLI-IF ......................... 86 Hình 3.10: Khả năng liên kết DNA đặc hiệu của OsNLI-IF trong nấm men........... 87 Hình 3.11: Ghép nối OsNLI-IF vào vector YEpGAP ............................................. 89 Hình 3.12: PCR và cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp YEpGAP/OsNLI-IF ................ 90 Hình 3.13: Hoạt tính hoạt hóa phiên mã của OsNLI-IF trong nấm men ................. 91 Hình 3.14: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pGBKT7 ............................................. 94 Hình 3.15: PCR và cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp pGBKT7/OsNLI-IF................. 94 Hình 3.16: Sơ đồ quá trình điều hòa hoạt động chức năng của OsNLI-IF .............. 97 Hình 3.17: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pRT101 ............................................... 99 Hình 3.18: PCR và cắt giới hạn pRT/OsNLI-IF-S và pRT/OsNLI-IF-AS ............ 100 Hình 3.19: Ghép nối cấu trúc 35S:OsNLI-IF vào pCAMBIA1301 ....................... 101 Hình 3.20: PCR và cắt giới hạn pCAM/OsNLI-IF-S và pCAM/OsNLI-IF-AS..... 102 Hình 3.21: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pBI-Ubi và pBI-Lip9 ......................... 104 8 Hình 3.22: PCR khuẩn lạc mang pBI-Ubi/OsNLI-IF và pBI-Lip9/OsNLI-IF ....... 104 Hình 3.23: PCR và cắt giới hạn pBI-Ubi/OsNLI-IF và pBI-Lip9/OsNLI-IF ........ 105 Hình 3.24: PCR khuẩn lạc mang pCAM/OsNLI-IF-S và pCAM/OsNLI-IF-AS .... 107 Hình 3.25: PCR khuẩn lạc mang pBI-Lip9/OsNLI-IF và pBI-Ubi/OsNLI-IF ....... 108 ấu trúc gen 35S:OsNLI-IF vào cây thuốc lá ......................... 109 Hình 3.27: PCR kiểm tra các dòng thuốc lá tái sinh ............................................. 110 Hình 3.28: Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực Ni-NTA ............... 114 Hình 3.29: Kiểm tra kháng thể IgG tinh sạch ....................................................... 115 Hình 3.30: Biểu hiện của OsNLI-IF trong các dòng thuốc lá chuyển gen T1 ........ 116 Hình 3.31: Khả năng sinh trƣởng của các dòng thuốc lá chuyển gen T1 ............... 118 Hình 3.32: Khả năng chống chịu hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen .............. 119 ấu trúc biểu hiện gen OsNLI-IF vào lúa ............................... 122 Hình 3.34: Biểu hiện của OsNLI-IF trong các cây lúa chuyển gen T1 .................. 126 Hình 3.35: Hình thái của cây lúa chuyển gen T1 giai đoạn 3 lá non ...................... 128 Hình 3.36: Khả năng phục hồi sau xử lý stress hạn của cây lúa chuyển gen T1 .... 129 9 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Hạn là yếu tố môi trƣờng gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sản xuất nông nghiệp, làm giảm năng suất, sản lƣợng cây trồng và dẫn tới tình trạng mất an ninh lƣơng thực. Đặc biệt, trong bối cảnh biến đổi khí hậu toàn cầu, tình trạng hạn hán xảy ra ngày càng thƣờng xuyên hơn, với mức độ ngày càng trầm trọng, nhiều lúc vƣợt quá tầm kiểm soát của con ngƣời. Chính vì vậy, việc nghiên cứu các gen liên quan tới tính chịu hạn để tiến tới tạo giống cây trồng biến đổi gen có khả năng chịu hạn có ý nghĩa đặc biệt quan trọng đối với việc duy trì và tăng sản lƣợng nông nghiệp, góp phần giữ ổn định an ninh lƣơng thực quốc gia. Tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen và sự biểu hiện của các gen liên quan chặt chẽ với quá trình phiên mã. Các nhà khoa học đã chứng minh đƣợc chức năng quan trọng của nhóm gen điều khiển trong việc tăng cƣờng tính chịu hạn ở thực vật. Do đó, việc nghiên cứu phân lập và đặc tính gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến chịu hạn đang trở thành xu hƣớng triển vọng và nhận đƣợc sự quan tâm đặc biệt. Hàng loạt gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn đã đƣợc xác định và chuyển vào các giống cây trồng khác nhau. Các gen mã hóa nhân tố phiên mã mặc dù không tham gia trực tiếp vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn nhƣng sự biểu hiện của chúng lại có vai trò điều hòa biểu hiện của rất nhiều gen chức năng khác, dẫn tới làm tăng cƣờng khả năng chịu hạn của thực vật. Nhiều cây trồng chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã đã đƣợc chứng minh tăng cƣờng khả năng chịu hạn so với cây không chuyển gen. Ở Việt Nam, trong khoảng 10 năm trở lại đây, các nghiên cứu về phân lập gen chịu hạn mục tạo giống cây trồng chống chịu hạn bằng công nghệ chuyển gen thực vật đã đƣợc một số phòng thí nghiệm quan tâm. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu về gen chống chịu stress môi trƣờng nói chung và chống chịu hạn nói riêng đều sử dụng các nguồn gen từ nƣớc ngoài hoặc các gen đã đƣợc công bố bởi các nhóm nghiên cứu khác trên thế giới. Cho đến nay, chúng ta vẫn 10 chƣa có một nghiên cứu cơ bản hoàn chỉnh nào về phân lập và nghiên cứu chức năng gen liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật, đặc biệt là nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã. , chúng tôi tiến hành đề tài luận án tiến sĩ “Phân lập và nghiên cứu gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn của thực vật”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập và xác định trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNLI-IF điều khiển tính chịu hạn từ lúa. - Nghiên cứu một số đặc tính của gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNLI- IF phân lập đƣợc trên cây lúa chuyển gen mô hình. 3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu của luận án là gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNLI-IF liên quan tới đáp ứng chống chịu hạn của lúa Oryza sativa L. (Pusa Basmati 1). nội dung - chính: Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNLI-IF liên quan đến chống chịu điều kiện bất lợi ở lúa. - Nghiên cứu đặc điểm chức năng của protein OsNLI-IF. - Thiết kế các hệ vector biểu hiện gen OsNLI-IF trong tế bào thực vật. - Nghiên cứu biểu hiện OsNLI-IF trong cây chuyển gen mô hình. 4. Địa điểm nghiên cứu Các nghiên cứu của luận án đƣợc thực hiện tại 3 địa điểm chính: - Bộ môn Bệnh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam). - e . - Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật thuộc Trung tâm Kỹ thuật di truyền và Công nghệ sinh học Quốc tế (Ấn Độ). 11 5. Đóng góp mới của luận án Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam thực hiện một cách có hệ thống về nghiên cứu cơ bản theo định hƣớng ứng dụng gen OsNLI-IF chƣa đƣợc xác định chức năng. Gen OsNLI-IF đƣợc chứng minh mã hóa một nhân tố phiên mã hoạt động cảm ứng với điều kiện ngoại cảnh bất lợi nhƣ hạn, mặn, lạnh, nhiệt độ cao và có khả năng tăng cƣờng tính chịu hạn trong các cây chuyển gen mô hình (thuốc lá/ lúa). Ngoài ra, các vector biểu hiện gen OsNLI-IF đƣợc điểu khiển bởi các promoter hoạt động liên tục (35S và Ubiquitin) và hoạt động trong điều kiện stress (Lip9) đã đƣợc chuyển vào cây mô hình để nghiên cứu biểu hiện gen. 6. Ứng dụng thực tiễn của luận án Kết quả nghiên cứu của luận án lần đầu tiên đã chứng minh vai trò tăng cƣờng tính chịu hạn của gen OsNLI-IF trong các dòng cây chuyển gen. Trên cơ sở kết quả của luận án, các vector biểu hiện gen OsNLI-IF do luận án tạo ra đang đƣợc nghiên cứu chuyển vào các giống cây trồng quan trọng nhƣ ngô, đậu tƣơng, bông… để chọn tạo các giống cây chuyển gen chịu hạn nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết của sản xuất trong điều kiện thay đổi khí hậu toàn cầu. 12 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1. HẠN HÁN VÀ ĐẶC TÍNH CHỐNG CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT 1.1.1. Giới thiệu chung về hạn hán Nƣớc là thành phần cơ bản nhất của sự sống, tất cả mọi sinh vật đều cần có nƣớc để duy trì sự sống . Chính vì vậy, nguồn nƣớc trong môi trƣờng sống rất quan trọng đối với đời sống của sinh vật. Đặc biệt đối với thực vật, nƣớc có vai trò sống còn, quyết định sự tồn tại và phát triển của thực vật. Nhu cầu về nƣớc của thực vật phụ thuộc vào từng loài và từng giai đoạn phát triển của chúng. Hạn đối với thực vật là khái niệm đƣợc dùng để chỉ trạng thái thiếu nƣớc do môi trƣờng gây nên trong suốt quá trình sống hay trong từng giai đoạn cụ thể, làm ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của thực vật. Trong nông nghiệp, hạn hán đƣợc xác định khi đất không có đủ độ ẩm và lƣợng mƣa không đủ cung cấp cho mùa màng, làm cho cây trồng không đủ độ ẩm để duy trì sự tăng trƣởng và sản lƣợng trung bình. Ảnh hƣởng của hạn hán trong nông nghiệp rất khó ƣớc lƣợng vì tính phức tạp trong sự tăng trƣởng cây trồng và khả năng xuất hiện của các nhân tố khác nhƣ sâu bọ, cỏ dại, đất kém màu mỡ và sự ô nhiễm môi trƣờng cũng ảnh hƣởng tới sự sinh trƣởng và năng suất của cây trồng [20]. Các yếu tố gây hạn của môi trƣờng nhƣ thành phần thổ nhƣỡng, thời tiết, khí hậu, nhiệt độ, gió nóng… gây nên hiện tƣợng thiếu nƣớc của cây, nguyên nhân chính là do sự mất cân bằng áp suất thẩm thấu giữa tế bào và môi trƣờng, dẫn đến sự thiếu hụt nƣớc trong tế bào. Tùy theo mức độ, hạn đƣợc chia ra thành ba loại: hạn không khí, hạn đất và hạn toàn diện. Đối với mỗi loại sẽ gây ra những ảnh hƣởng khác nhau, nhẹ thì giảm năng suất, nặng thì có thể dẫn đến tình trạng hủy hoại cây trồng, mùa màng... [20, 105]. 1.1.2. Ảnh hƣởng của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp Trong các yếu tố bất lợi của môi trƣờng, hạn hán là nhân tố chính và phổ biến nhất gây ảnh hƣởng tiêu cực đến sản xuất nông nghiệp. Do biến đổi khí hậu (BĐKH) toàn cầu, hiện nay các vùng canh tác phải đối mặt với hạn hán chiếm khoảng 1% tổng diện tích đất nông nghiệp và đƣợc dự báo sẽ tăng lên 30% vào cuối 13 thế kỉ 21 [126]. Mức độ ảnh hƣởng của hạn hán trong nông nghiệp phụ thuộc vào tần suất, cƣờng độ, tính khắc nghiệt và tính nhạy cảm của đối tƣợng cây trồng. Ảnh hƣởng của hạn hán đối với nông nghiệp có thể diễn ra theo chu kỳ hoặc thậm chí là mãi mãi, do tác động tới chất lƣợng sản phẩm, giảm năng suất, tăng nguy cơ nhiễm bệnh và các dịch hại do sâu bọ, tăng chi phí tƣới tiêu, dẫn tới làm mất sản lƣợng cây trồng và giảm thu nhập của ngƣời nông dân. Tác động của hạn hán làm sản lƣợng lúa gạo tụt giảm; lƣợng gạo dự trữ thấp đã buộc các quốc gia xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới (trong đó có Việt Nam) phải áp dụng chính sách hạn chế xuất khẩu để đảm bảo an ninh lƣơng thực quốc gia, trong khi nhu cầu nhập khẩu gạo của các quốc gia khác (đặc biệt là Trung Quốc) tăng cao. Đây chính là nguyên nhân tạo ra cơn sốt gạo năm 2008, đẩy giá gạo lên mức cao kỷ lục mới (>1.000 USD/tấn) và gây ra những tác động tiêu cực đến đời sống kinh tế [3, 134]. Việt Nam với nền kinh tế chủ yếu dựa vào sản xuất nông nghiệp cũng là một trong số các quốc gia nằm trong vùng chịu ảnh hƣởng nặng nề của hiện tƣợng BĐKH. Theo dự báo của FAO, do tác động của hạn hán, sản lƣợng lúa gạo hai vụ xuân và vụ mùa trên khắp cả nƣớc, đặc biệt là vùng đồng bằng sông Hồng sẽ có xu hƣớng giảm dần, có thể giảm tới 12,5% vào năm 2050 và 16,5% vào năm 2070. Hệ quả của các tác động này là áp lực ngày càng tăng đối với giá lúa gạo trên thị trƣờng thế giới do Việt Nam là một trong những nƣớc xuất khẩu gạo quan trọng nhất trên thế giới. Chính vì vậy, các chính sách tăng trƣởng xanh và toàn diện trong ngành nông nghiệp để đối phó với hạn hán phải đƣợc chính phủ xem là vấn đề trọng tâm cần giải quyết và cần có sự tham gia của tất cả các thành phần trong xã hội [135]. 1.1.3. Ảnh hƣởng của hạn hán đối với thực vật Môi trƣờng khô hạn gây ra hàng loạt những tác động tiêu cực tới thực vật ở tất cả các cấp độ, từ hình thái tới phân tử và ở tất cả các giai đoạn phát triển [38]. Hạn hán khi xảy ra sẽ gây ảnh hƣởng đầu tiên tới quá trình trao đổi nƣớc với môi trƣờng và quá trình kiểm soát hàm lƣợng nƣớc trong cơ thể của thực vật. Đây là quá trình đƣợc điều hòa bởi nhiều yếu tố khác nhau nhƣ lƣợng nƣớc dự trữ trong 14 mô, thế nƣớc của lá, khả năng hoạt động của khí khổng, tốc độ bay hơi nƣớc, nhiệt độ lá và tán lá... Khi tiếp xúc với hạn hán, thế nƣớc trong lá, hàm lƣợng nƣớc trong cơ thể, tốc độ thoát hơi nƣớc và độ dẫn của khí khổng đều bị giảm, trong khi nhiệt độ lá tăng lên. Một số loài thực vật duy trì hiệu quả sử dụng nƣớc (tỉ số giữa trọng lƣợng khô và lƣợng nƣớc tiêu thụ) trong giai đoạn hạn hán bằng cách giảm sự mất nƣớc. Tuy nhiên, khi hạn hán xảy ra trong phạm vi rộng và quy mô lớn, hiệu quả sử dụng nƣớc của phần lớn các loài thực vật đều giảm rõ rệt [16, 38]. Sự mất cân bằng trao đổi nƣớc trong điều kiện hạn làm giảm sức trƣơng tế bào, dẫn tới những ảnh hƣởng về sinh trƣởng và phát triển của thực vật. Ở thực vật bậc cao, khi cây bị thiếu nƣớc nghiêm trọng, quá trình kéo dài tế bào bị ức chế do dòng nƣớc từ xylem dẫn tới các tế bào đang trong quá trình nguyên phân bị cản trở. Hệ quả là thực vật bị giảm chiều cao, giảm diện tích che phủ của lá và cuối cùng dẫn tới giảm khả năng sinh trƣởng và tích lũy sinh khối [16, 38]. Ở các loài thực vật bậc cao, sự thiếu hụt nƣớc trong môi trƣờng đất thƣờng làm giảm khả năng sử dụng, hấp thụ, vận chuyển và trao đổi chất dinh dƣỡng. Khi bị hạn hán, rễ không thể hấp thu và vận chuyển chất dinh dƣỡng tới thân, do đó ảnh hƣởng tới quá trình trao đổi chất của tế bào. Ngoài ra, tốc độ thoát hơi nƣớc giảm trong điều kiện hạn cũng làm giảm khả năng hấp thụ và hiệu quả sử dụng chất dinh dƣỡng của thực vật. [16, 38]. Để giảm sự thoát hơi nƣớc trong điều kiện môi trƣờng khô hạn, thực vật thƣờng có một số cơ chế thích nghi nhƣ đóng khí khổng, giảm tiết diện lá, thu hẹp độ che phủ tán lá hay tăng tính nhạy cảm của lá non. Tuy nhiên, đây lại là những yếu tố gây ảnh hƣởng trực tiếp tới bộ máy quang hợp vì ngăn cản dòng CO2 đi vào lá và làm giảm quá trình cố định cacbon, dẫn tới sự giảm khả năng tổng hợp và tích lũy sinh khối của thực vật. Ngoài ra, do bị thiếu nƣớc, thể tích tế bào giảm, độ nhớt của tế bào chất tăng làm tăng tính tƣơng tác giữa các phân tử và ảnh hƣởng tới hoạt động chức năng của các enzyme và các thành phần sắc tố của bộ máy quang hợp [16, 38]. Ngoài ra, sự ức chế phản ứng phosphoryl hóa và tổng hợp ATP từ ADP cũng là một yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình quang hợp. Cùng với đó, 15 sự thay đổi khả năng sử dụng CO2 của diệp lục (do đóng khí khổng) cũng là một nguyên nhân làm giảm hoạt động bộ máy quang hợp [38]. Khả năng đồng hóa CO2 giảm trong điều kiện môi trƣờng khô hạn dẫn tới hệ quả làm tăng tính nhạy cảm của thực vật với những tổn thƣơng do ánh sáng mặt trời gây nên. Đồng thời, khi quá trình quang hợp bị ảnh hƣởng còn gây ra sự dƣ thừa điện tử, là nguyên nhân chính làm sản sinh các dạng oxy tế bào, bao gồm các gốc anion superoxide, (ROS) gây độc hydroxyl, hydro peroxide, alkoxy (RO) và oxy nguyên tử. ROS đƣợc hình thành theo cả hai cơ chế phụ thuộc và không phụ thuộc enzyme. ROS có thể đƣợc tạo ra dƣới dạng sản phẩm phụ trong chuỗi truyền điện tử của lục lạp, ti thể và màng tế bào chất. Bên cạnh đó, trong tế bào có rất nhiều enzyme tham gia vào các phản ứng sinh ROS nhƣ xanthine oxidase, superoxide dismutase, peroxidase, catalase, amino acid oxidase, glucose oxidase... Sự tích lũy ROS trong điều kiện hạn có thể gây ra rất nhiều các tổn thƣơng cho tế bào: peroxide hóa lipid gây tổn thƣơng màng tế bào, oxy hóa và phân giải protein, bất hoạt enzyme, phân giải DNA… [38]. Hô hấp cũng là một quá trình sinh lý bị ảnh hƣởng bởi những tác động của hạn hán. Khi môi trƣờng đất trở nên khô hạn, bộ máy hô hấp của các tế bào rễ (nơi tiêu thụ sản phẩm cacbon đƣợc cố định từ quá trình quang hợp nhiều nhất trong cơ thể thực vật) tăng cƣờng hoạt động rất mạnh nhằm duy trì sự sinh trƣởng, tích lũy sinh khối và thực hiện các hoạt động chức năng quan trọng của rễ. Tuy nhiên, tốc độ quang hợp thƣờng bị giới hạn do ảnh hƣởng của sự khô hạn, chính điều này đã gây nên hiện tƣợng mất cân bằng các nguồn cacbon trong cơ thể thực vật, dẫn tới giảm quá trình tổng hợp ATP và tăng sản sinh ROS gây độc tế bào [38]. 1.1.4. Đáp ứng của thực vật với điều kiện hạn Trong môi trƣờng tự nhiên, thực vật đối phó với điều kiện khô hạn hán bằng rất nhiều đáp ứng khác nhau để duy trì sự sống. Đối với cây trồng, “chịu hạn” đƣợc định nghĩa là khả năng sinh trƣởng, ra hoa và cho sản lƣợng cao trong điều kiện nguồn cung cấp nƣớc không đầy đủ. Môi trƣờng khô hạn làm xuất hiện hàng loạt các phản ứng không đặc trƣng trong tế bào, dẫn tới hàng loạt các tổn thƣơng cho cơ 16