Tài liệu Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết polysaccharide từ sinh khối nấm cordyceps militaris

Khóa luận tốt nghiệp 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS. Vũ Duy Nhàn, người đã trực tiếp hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập và nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo Viện Hóa hoc – Vật liệu/ Viện Khoa học và Công nghệ quân sự và các anh chị Phòng Hóa sinh, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập và làm đề tài tại đây. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Viện Đại học Mở Hà Nội, các thầy cô đã tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình học tập tại trường và thực hiện luận văn này. Cuối cùng tôi muốn gửi lời thân thương nhất đến gia đình, bạn bè, tập thể lớp 12-02 hoa ông Nghệ Sinh ọc đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Tôi in chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 22 tháng 5 năm 2016 Sinh viên Nguyễn Thị Thắm Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH Khóa luận tốt nghiệp 2016 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................................................ 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU .................................................................................. 3 1.1. Giới thiệu về Cordycceps militaris ...........................................................................3 1.1.1. Hiện trạng và vai trò của Cordyceps militaris ..............................................3 1.1.2.Thành phần hóa học chính của Codyceps militaris .......................................5 1.1.2.1.Cordycepin ..................................................................................................5 1.1.2.2.Adenosine ...................................................................................................6 1.1.2.3. Acid cordycepic .........................................................................................6 1.1.2.4. Nucleotides ................................................................................................ 7 1.1.2.5. Protein và các axit amin .............................................................................8 1.1.2.6. Acid béo và nguyên tố đa, vi lượng ...........................................................8 1.1.2.7. Polysaccharide ...........................................................................................8 1.1.3. Các ứng dụng từ sinh khối nấm Cordyceps militaris ...................................9 1.1.3.1. Cải thiện chức năng gan ..........................................................................10 1.1.3.2. Giải độc thận ........................................................................................... 10 1.1.3.3. Giảm đường huyết....................................................................................10 1.1.3.4. Điều trị bệnh phổi ....................................................................................11 1.1.3.5. Điều trị bệnh tim mạch ............................................................................11 1.1.3.5. Tăng cường khả năng miễn dịch.............................................................. 11 1.1.3.6. Hỗ trợ điều trị ung thư .............................................................................11 1.1.3.7. Chống rối loạn tình dục ...........................................................................12 1.1.3.8. Tăng sức bền, chống mệt mỏi ..................................................................12 1.1.3.9. Chống lão hóa .......................................................................................... 13 1.2. Polisaccharide từ sinh khối nấm Cordyceps militaris ............................................13 1.2.1. Đặc điểm về các Polisaccharide trong sinh khối nấm Cordyceps militaris .......................................................................................................................................13 1.2.2. Vai trò của các Polysaccharide trong nấm Codyceps sp ............................ 14 1.3. Tình hình nghiên cứu tách chiết polysaccharide từ Cordyceps militaris ......................16 Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH Khóa luận tốt nghiệp 2016 1.3.1. Tình hình nghiên cứu polysaccharide trên thế giới..........................................16 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam .............................................................. 18 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 21 2.1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu ...........................................................................21 2.1.1. Nguyên liệu ..................................................................................................21 2.1.2. Thiết bị và hóa chất......................................................................21 2.2. Phương pháp nghiên cứu. ......................................................................................22 2.2.1. Phương pháp tách chiết polysaccharide từ quả thể Codyceps militaris ....22 2.2.1.1.Khảo sát phương pháp chiết .....................................................................22 2.2.1.2.Khảo sát điều kiện chiết:...........................................................................24 2.2.2. Xác định hàm lượng polisaccarit theo phương pháp phenol-sulfuric của Michel. DuBois, K. A. Gilles và cs, 1956. ....................................................................24 2.2.3.Thu nhận polysaccharide bằng phương pháp kết tủa ..................................27 2.2.4.Phương pháp phân tích IR: ..........................................................................28 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................... 29 3.1.Nghiên cứu lựa chọn các điều kiện tách chiết Polysaccharide ................................ 29 3.1.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết ............................................29 3.1.2. Nghiên cứu lựa chọn dung môi chiết. .........................................................30 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu suất tách chiết .....................31 3.2.1. Nghiên cứu xác định nhiệt độ chiết ............................................................ 31 3.2.2. Nghiên cứu xác định thời gian chiết ........................................................... 31 3.2.3. Nghiên cứu xác đinh tần suất chiết ............................................................. 32 3.3. Bước đầu xây dựng quy trình tách chiết.................................................................33 3.4. Bước đầu xác định các nhóm cấu trúc của Polysaccharides tách chiết được .........37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................................ 41 Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH Khóa luận tốt nghiệp 2016 DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nội dung C. Cordyceps C. militaris Nhộng trùng thảo C.sinensis Đông trùng hạ thảo sp. Species – Một loài spp. Species plural – Nhiều loài ĐTHT Đông trùng hạ thảo EtOH Ethanol EPS Exopolysaccharide ( Extrancellular polysaccharide) polysaccharide ngoại bảo SOD Chất chống oxy hóa P1 Polysaccharide thu được từ dịch sau khi chiết với nước. P2 Polysaccharide sau khi thu được từ phần bã đã bổ sung NaOH 4% P3 Polysaccharide sau khi kết tủa Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH Khóa luận tốt nghiệp 2016 DANH MỤC HÌNH ình 1.1: Đông trùng hạ thảo Codyceps militaris ............................................... 4 Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Codycepin.......................................................... 5 Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của Adenosine .......................................................... 6 Hình 1.5: Công thức cấu tạo polysaccharide. .................................................... 13 Hình2.1 : Sản phẩm Codyceps militaris nuôi cấy tại Viện Quân sự .................. 21 Hình2.2 : Mẫu dùng tách chiết. .......................................................................... 21 Hình 2.3: Bể ổn nhiệt dùng trong quá trình chiết ............................................... 23 Hình 2.4: Máy siêu âm ........................................................................................ 24 Hình 2.5: Mẫu đo đường đường chuẩn............................................................... 26 ình 2.6: Đồ thị đường glucose (µg/ml)............................................................. 26 Hình 2.7: Máy ép KBr ......................................................................................... 31 ình 2.8: Máy đo phổ Impact 410 ...................................................................... 28 Hình 3.1: Kết quả khảo sát dung môi chiết đối với mẫu C. militaris ................. 29 Hình 15: Kết quả khảo sát phương pháp chiết ................................................... 30 Hình 3.4: Kết quả khảo sát nhiệt độ ................................................................... 31 Hình 3.5: Kết quả khảo sát thời gian chiết đối với mẫu C. militaris .................. 32 Hình3.8: phổ hồng ngoại IR của mẫu CM-jd-CPS2 chuẩn ................................ 37 Hình 3.9: Phổ hồng ngoại IR của mẫu P1 .......................................................... 38 Hình 3.10: Phổ hồng ngoại IR của mẫu P2 ........................................................ 38 Hình 3.11: Phổ hồng ngoại IR của mẫu P3………………………………………...41 Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH Khóa luận tốt nghiệp 2016 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại khoa học........................................................................................................ 3 Bảng 1.2: Hàm lượng của một số loại đường có trong polysaccharide của quả thể và sợi nấm Codyceps militaris. .............................................................................................................. 14 Bảng 1.3: Khả năng kháng khối u của một số polysaccharide được thu nhận từ một số loại nấm................................................................................................................................................. 15 Bảng 2.1: Thiết bị dùng trong thí nghiệm .................................................................................. 22 Bảng 2.3: Các dung môi có độ phân cực tăng dần theo tham số Snyder lực của dung môi . 23 Bảng 2.4: Xây dựng phương trình đường chuẩn glucose......................................................... 25 Bảng 3.1: Hàm lượng polysaccharide từ Cordyceps militaris ................................................. 36 Bảng 3.2: So sánh phổ IR giữa các mẫu .................................................................................... 39 Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH Khóa luận tốt nghiệp 2016 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây rất nhiều loài nấm được quan tâm đến như nguồn nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng phục vụ chăm sóc sức khỏe con người ngày một tăng lên. Ngoài ra chúng được các nhà nghiên cứu y dược học hết sức chú ý vì sự đa dạng về các hợp chất sinh học có trong mỗi loại. Đông trùng hạ thảo là một dạng sản phẩm cộng sinh giữa các loài nấm như Codyceps sinensis ( Berk.) hoặc Codyceps militaris (L. ex Fr.)Link lên ấu trùng của một loài côn trùng thuộc chi Hepialus. Thường gặp nhất là ấu trùng của loài Hepialus armoricanus. Là một loại nấm dược liệu quý hiếm từ lâu đã được cả thế giới biết đến, đông trùng hạ thảo cùng tam thất, linh chi, nhân sâm tạo thành bộ tứ thần dược. Sách y học cổ truyền Trung Quốc từ xa xưa đã coi Đông trùng hạ thảo là vị thuốc để bồi bổ sức khỏe người và hỗ trợ điều trị hàng loạt bệnh như cải thiện chức năng phổi và thận chống ung thư điều hòa miễn dịch và tác dụng hạ huyết áp. Mặt khác các nghiên cứu y học cổ truyền hiện đại đều xác định. Đông trùng hạ thảo hầu như không có tác dụng phụ đối với cơ thể người. Polysaccharide là một trong những thành phần có hoạt tính sinh học chính của Đông trùng hạ thảo cũng như nhiều loài nấm dược liệu khác, trong đó đã được chứng minh như chống ung thư, điều hòa miễn dịch và tác dụng chống oxy hóa đáng lưu ý. Việc nghiên cứu các đặc tính chống oxy hóa của polysaccharide từ Cordyceps militaris đã được nghiên cứu rộng rãi. Như vậy việc tách chiết, tinh sạch làm tăng cường tác dụng dược lý của các hoạt chất polysaccharide từ nguồn quả thể Cordyceps militaris (L. ex Fr) Link là rất quan trọng trong điều kiện hiện nay. Khi đó sẽ giải quyết một phần nào trong công tác chăm sóc sức khỏe cho con người. Từ đó có thể ứng dụng để sản xuất sản phẩm thực phẩm chức năng từ các nguồn nguyên liệu polysaccharide là rất cần thiết. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết polysaccharide từ sinh khối nấm Cordyceps Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 1 Khóa luận tốt nghiệp 2016 militaris” với các mục tiêu sau: Xác lập được quy trình tách chiết polysaccharide từ nguồn Cordyceps militaris nuôi trồng được. Nội dung nghiên cứu chủ yếu cần giải quyết: Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết polysaccharide từ sinh khối nấm Cordyceps militaris. Bước đầu xác định một số nhóm chức cơ bản trên các mẫu polysaccharide phân lập được. Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 2 Khóa luận tốt nghiệp 2016 PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về Cordycceps militaris 1.1.1. Hiện trạng và vai trò của Cordyceps militaris Đông trùng hạ thảo là một dạng sản phẩm cộng sinh giữa các loài nấm như Cordyceps sinensis ( Berk.) hoặc Cordyceps militaris (L. ex Fr.)Link lên ấu trùng của một loài côn trùng thuộc chi Hepialus. Thường gặp nhất là ấu trùng của loài Hepialus armoricanus. Vào mùa đông bào tử nấm bắt đầu ký sinh và sử dụng các chất dinh dưỡng của ấu trùng Hepialus armoricanus để sinh trưởng và phát triển thành sợi nấm. Mùa hè đến khi các điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng thích hợp quả thể nấm bắt đầu hình thành và vươn ra khỏi thân xác ấu trùng và phát triển nhanh thành quả thể trưởng thành. Đầu của quả thể nấm là một thể đệm (stroma) hình trụ thuôn nhọn. Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên được phát hiện vào mùa hè, phân bố tập trung ở các cao nguyên cao hơn mặt biển từ 3500 đến 5000m. Đó là các vùng Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hi, Cam Túc, Vân Nam [11,14]. Bảng 1.1: Phân loại khoa học Giới Nấm Ngành Ascomycota Phân ngành Ascomycotina Lớp Ascomycetes/ Pyrenomycetes Bộ Hypocreales Chi Cordyceps Loài Cordyceps militaris Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 3 Khóa luận tốt nghiệp 2016 Hình 1.1: Đông trùng hạ thảo Codyceps militaris Đông trùng hạ thảo có hơn 350 loài khác nhau tuy nhiên hai loài chính người ta đi sâu nghiên cứu và đưa vào nuôi trồng là Codyceps sinensis và Codyceps militaris. Loài nấm Cordyceps sinensis phân bố chủ yếu ở vùng núi cao thuộc dẫy núi Hymalaya có độ cao trên 4000m so với mực nước biển như vùng Tây Tạng (Trung Quốc), một số vùng thuộc Nepan và Butan. Loài Nấm Cordyceps militaris, phân bố ở vùng núi thấp hơn có độ cao từ 2000-3000m so với mực nước biển, có hàm lượng các hoạt chất có hoạt tính sinh học trong quả thể như cordycepin, mannitol, cordypolysaccharide, superoxide dismutise và nhiều thành phần khác tương đương, thậm chí còn cao hơn của loài Cordyceps sinensis. Nhờ các hợp chất hóa học này giá trị dược liệu chính của loại nấm Cordyceps militaris được các nhà khoa học thống kê như sau: kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thư máu (Kim et al., 2006, Lee H.et al.,2006, Park C.et al.,2005), ung thư phổi, ung thư vú (Ahn Y.J. et al., 2001). Nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh nấm có hiệu quả trong chữa trị rối loạn chức năng của gan (Nan J.X et al. 2001), sự lão hoá, các chứng viêm tấy (Won S.Y and Park E.H., 2005). Ngoài ra còn có tác dụng kìm hãm sự oxy hoá của lipid, lipoprotein và lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig J.E và Kamendulis L.M., 2004, Balaban R.S et al., 2005) [14,16]. Hiện nay trên thế giới mỗi năm sản lượng nấm dược liệu đạt được lên tới hơn 10 triệu m³, trong đó Codyceps sinensis (Berk.) Sacc. Và Cordyceps militaris (L. ex Fr.) Link.. Trong 2 năm gần đây, tại Việt Nam Codyceps Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 4 Khóa luận tốt nghiệp 2016 militaris (L. ex Fr) Link bắt đầu được nuôi quy mô công nghiệp ở một số địa phương như: Hà Nội, Tam Đảo, Thành phố Hồ Chí Minh. Hàm lượng hoạt chất adenosine trong sản phẩm đạt bình quân là 0,33 – 1,45mg/g và Cordycepin là 39mg/g. Trong hai năm vừa qua, Viện Hóa học – Vật liệu, Viện Khoa học và Công nghệ Quân sự/BQP cùng với một số đơn vị trong cả nước như Viện Bảo vệ thực vật.. đã nghiên cứu thành công công nghệ nhân giống, nuôi trồng quy mô công nghiệp đối với chủng Cordyceps militaris (L. ex Fr) Link và đã triển khai chuyển giao cho nhiều cơ sở ở Hà Nội, Đà Lạt, Nha Trang, Thành phố Hồ Chí Minh. 1.1.2.Thành phần hóa học chính của Codyceps militaris Codyceps militaris có chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học nhưng quan trọng nhất là adenosine, codycepin, polysaccharide. Ngoài ba thành phần trên khi phân tích nấm người ta còn phát hiện rất nhiều hợp chất có giá trị như các ribonucleotid, mannitol, các protein, polyamin, vitamin (E, A, B1, B2, B12…) và rất nhiều khoáng chất (K, Na, Ca, Mg, Cu, Mn, Zn, Se, Si…)..[4]. 1.1.2.1.Cordycepin Cordycepin lần đầu tiên được tách ra từ C.militaris năm 1950 do Cunningham và cộng sự thực hiện, sau đó chúng được tìm thấy ở C. sinensis và C. kyushuensis. Mặc dù cordycepin có thể được tổng hợp hóa học nhưng chỉ cho sản lượng thấp. Các loài Cordyceps sp tự nhiên chứa lượng codycepin vào khoảng 0,006 – 6,36 mg/g. Các nhà khoa học cho biết khi thu nhận trong tự nhiên nồng độ cordycepin trong quả thể C. militaris cao hơn C. senisis với hàm lượng lần lượt là 2,65 và 1,64 mg/g [4]. Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Codycepin Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 5 Khóa luận tốt nghiệp 2016 Cordycepin là một dẫn xuất của nucleoside mà tại vị trí 3’ không có O khác với thực thể ribose. Trọng lượng phân tử của cordycepin C10H13N5O3 là 251, có nhiệt độ nóng chảy là 230 - 231ºC, độ hấp thụ cao nhất ở 259nm. Cordycepin có thể hòa tan trong saline, cồn ấm hoặc methanol nhưng không tan trong benzen, ether hoặc chloroform, các nhà khoa học thường sữ dụng saline khử trùng và và đệm phosphates để hòa tan cordycepin [3]. Cordycepin có khả năng kháng nấm, kháng ung thư và kháng vius. Phát hiện gần đây hơn, cho thấy khả năng điều hòa sản phẩm của interleukins trong tế bào lympho T. Cordycepin phát huy tác dụng gây độc tế bào thông qua methyl hóa acid nucleic, ức chế sự phát triển của Clostridium và Clostridium perfringens, nhưng không có tác động naog tới Bifidobacterium spp. Và Lactobacillus spp. Do Ahn và cộng sự đã chứng minh năm 2000 [4]. 1.1.2.2.Adenosine Adenosine xuất hiện khá nhiều trong quả thể vào được cho là phong phú ở hầu hết các loài Cordyceps với hàm lượng dao động từ 0,28 tới 14,15 mg/g. Khi thu nhận nấm Cordyceps trong tự nhiên, nồng độ adenosine là 2,45±0,03mg/g trong quả thể và ở nấm C.militaris cao hơn ở C.sinensis hàm lượng chỉ có 1,643±0,03mg/g, trong khi đó hàm lượng trong sợi nấm C.militaris lên men là 1,592±0,03mg/g gần tương tự C.senisis trong tự nhiên. Adenosine được cho là có tác dụng điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch [17]. Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của Adenosine 1.1.2.3. Acid cordycepic Theo dược điển củaTrung Quốc, axit cordycepic hay D-mannitol, một đồng phân của axit quinic với cấu trúc polyol được sinh tổng hợp trong quá trình phát triển Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 6 Khóa luận tốt nghiệp 2016 của nấm C. militaris và được sử dụng như là một dấu hiệu trong kiểm soát quá trình nuôi. Axit cordycepic được tách ra từ C.militaris từ những năm 1957, chứng minh có tác dụng lợi tiểu và phòng ngừa biến chứng sau phẫu thuật cắt thận, làm giảm ho và hen suyễn. Đặc biệt axit cordycepic có thể cung cấp sự bảo vệ hiệu quả và trong điều trị cho các bệnh nhân sau nhồi máu não và chấn thương, cải thiện vi tuần hoàn não và lưu lượng máu não, thúc đẩy phục hồi thần kinh và bảo tồn các khu vực thiếu máu cục bộ, giảm điều tiết áp lực nội sọ, giảm sự hình thành dịch não tủy và não mô hàm lượng nước. Mặc dù axit cordycepic là an toàn cho bệnh nhân xuất huyết nội sọ, tuy nhiên vẫn được khuyến cáo không nên sử dụng ở các những bệnh nhân suy thận, suy thận mãn tính và bệnh tiểu đường. Ngoài ra, một số nghiên cứu cho rằng axit cordycepic có thể điều trị bệnh viêm màng não. Các nghiên cứu gần đây cho thấy axit cordycepic có thể nâng cao hiệu quả của các tế bào mô đệm sau khi xuất huyết trong não và gia tăng hình thành tế bào mới xung quanh các xuất huyết trong não [3,17] 1.1.2.4. Nucleotides Các nucleotide là một trong những thành phần có hoạt tính trong C.militaris, tuy nhiên thông thường adenosine, cordycepin được sữ dụng là loại hoạt chất dùng để đánh giá chất lượng của đông trùng hạ thảo còn nhiều loại nucleotid khác như uridin, 2’-3’ – dideoxyadenosin [17] 1.1.2.4. Sterol Ergosterol là sterol duy nhất của nấm và là chất thiết yếu của vitamin D2, có giá trị dược liệu quan trọng. hàm lượng ergosterol trong quả thể nhân tạo của Cordyceps rất cao (10,68mg/g) cao hơn nhiều so với hệ sợi nấm chỉ có 1,44 mg/g [17]. Ergosterol trong C.sinensis có thể được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (High Performace Liquid Chromatography) do Li và cộng sự thực hiện năm 1991, được cho là chất ophiocordin, ở C.puseudomilitaris là chất bioxanthracenes và tập hợp bốn exopolysaccharide với các trọng lượng phân tử thay đổi từ 50 kDa tới 2260 kDa tìm thấy ở C.militaris. Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 7 Khóa luận tốt nghiệp 2016 1.1.2.5. Protein và các axit amin Nấm Cordyceps có hàm lượng protein thô trong khoảng 29,1 – 33%. Protein này bao gồm 18 loại aminoacid gồm có aspartic, threonine, serine, glutamate, proline, glycine, valine, methionine, isoleucine, leucine, tyrosine, phenylalanine, lysine, histidine, cytine và trytophan. Hàm lượng amino acid sau khi thủy phân hầu hết là 20 -25%, lượng thấp nhất là 5,53%, cao nhất là 39,22%. Hàm lượng cao nhất là glutamate, tryptophan và tyrosine. Các chủng Cordyceps spp.cũng chứa các loại protein, peptides, polyamines và tất cả các amino acid thiết yếu. Thêm nữa, Cordyceps spp cũng chứa các loại dipeptide vòng hiếm gặp có vòng gồm có cyclo-[Gly-Pro], cyclo-[Leu-Pro], cyclo-[Val-Pro], cyclo[AlaLeu], cyclo-[Ala-Val] và cyclo[Thr-Leu]. Một lượng nhỏ polyamines như 1,3diamino propane, cadavarine, spermidine và putrescine cũng được tìm thấy [3,17]. 1.1.2.6. Acid béo và nguyên tố đa, vi lƣợng Axit béo bao gồm carbon, hydro và oxy là thành phần chính của lipid, phospholipid và glycolipid, chúng được phân loại thành acid béo no và không no ở Cordyceps, lượng acid béo no được tìm thấy là 57,84% gồm có C16:1, C17:1, C18:1, C18:2. Acid linoleic chiểm hàm lượng cao nhất 38,44% bao gồm C14, C15, C16, C17, C18, C29 và C22. Acid palmitic và acid octadecanoic chiếm hàm lượng cao nhất lần lượt là 21,86% và 15,78%. Các acid béo không no có chức năng giảm lipid máu và bảo vệ chống lại bệnh tim mạch. Chứa một loạt các hợp chất dinh dưỡng như acid amin thiết yếu, vitamin E và K, các vitamin tan trong nước như B1, B2, B12 và các nguyên tố đa lượng và vi lượng (K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Al, Si, Ti, Cr, Ga, V [17]. 1.1.2.7. Polysaccharide Codyceps militaris có chứa rất nhiều loại đường bao gồm mono-, di- và các oligosachride, và nhiều polysaccharides phức tạp gồm có cyclofurans ( đường 5C, mạch vòng, chưa rõ chức năng), beta-glucans, beta-mannans, và Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 8 Khóa luận tốt nghiệp 2016 phức hợp polysaccharides có cả đường 5 và 6C cùng tham gia vào các chuỗi nhánh, dùng cả cầu nối alpha- và beta-. Các polysaccharides chính trong nấm là một dạng glucans với các mối liên kết glycoside chứa các liên kết (1/3) – (1/6) – β glucans và (1/3) – 1 – glucans. Mặc dù, vách tế bào nấm là nguồn cung cấp chính của polysaccharides đã được chứng minh kháng khối u, trong khi polysaccharide thu nhận từ thực vật lại không có đặc điểm này, điều này chỉ có thể giải thích được thông qua sự khác nhau trong cấu trúc hóa học của polysaccharide. Các polysaccharide có khả năng chống lại hoạt động của các tế bào ung thư chúng bao gồm homopolyme có cấu tạo đơn giản đến phức tạp bao gồm glucose, galactose, mannose, xylose, arabinose, fructose, ribose và các acid glucuronic. Trong một số loài nấm, polysaccharide liên kết với các protein hoặc peptide tạo thành các hệ polysaccharide – protein hoặc polysaccharide – peptide cấu trúc có hoạt tính kháng u mạnh hơn. Cấu trúc 1/3 – β – glucans có khả năng kháng khối u được biết đến nhiều nhất, theo các nghiên cứu cho biết những glucans có được hoạt tính sinh học này là trong cấu tạo các phân tử có dạng mạch thẳng hoặc phân nhánh với cấu trúc chính là phân tử đường glucose liên kết với các đơn vị như acid glucuronic, xylose, galactose, mannose, arabinose hoặc ribose. Heteroglycans là một nhóm lớn polysaccharides lớn hoạt tính sinh học đa dạng được phân loại là galactans, fucans, xylans và mannans [17]. 1.1.3. Các ứng dụng từ sinh khối nấm Cordyceps militaris Các nhà y học cổ truyền trong và ngoài nước đã nghiên cứu sữ dụng nấm ĐTHT Cordyceps militaris để điều trị thành công các chứng bệnh như rối loạn máu, viêm phế quản mãn và hen phế quản, viêm thận mãn tính và suy thận, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mãn tính, ung thư phổi (có tác dụng hỗ trợ) và thiểu năng sinh dục. viện nghiên cứu nội tiết Thượng Hải ( Trung Quốc) cũng đã dùng nấm ĐTHT để điều trị cho các bênh nhân bị liệt dương, kết quả đạt được khá tốt. Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 9 Khóa luận tốt nghiệp 2016 1.1.3.1. ải thiện chức năng gan Các nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu thực hiện trên 70 bênh nhân viêm gan B mãn tính và xơ gan, khi sữ dụng nấm ĐTHT hoặc là hỗn hợp thảo dược với thành phần chính là nấm linh chi, kết quả cho thấy có 68% người bệnh có nhóm phản ứng lâm sáng tốt (với nhóm sử dụng ĐTHT) và chỉ có 57% phản ứng tốt (với nhóm hỗn hợp thảo dược chứa nấm linh chi). Điều này cho thấy nấm đông trùng hạ thảo tốt hơn nấm linh chi trong việc triều trị bệnh gan hay xơ gan cho người. Thí nghiệm cũng được thực hiện trên 22 bệnh nhân xơ gan ở liều lượng 6g/ngày cũng cho thấy kết quả rất khả quan khi thử nghiệm các chức năng gan sau thời gian điều trị bằng Đông trùng hạ thảo [13] 1.1.3.2. Giải độc thận Bác sĩ y học cổ truyền cho rằng nấm ĐTHT có tác dụng làm tăng chức năng thận rất nhiều. rất nhiều công trình y học hiện đại xác nhận là nhờ nấm có khả năng làm tăng những loại hoocmon ở tuyến thượng thận và tuyến sinh dục tiết. thực hiện trên 51 bệnh nhân bị hỏng thận mãn tính, theo liệu trình điều trị từ 3-5g ĐTHT/ngày, kết quả cho thấy chức năng thận được cải thiện đáng kể. Mặt khác chức năng của hệ miễn dịch cũng được nâng cao hơn so với nhóm đối chứng. Một nghiên cứu khác trên 57 bệnh nhân bị hỏng thận do sữ dụng gentamixin, người ta quan sát thấy bệnh nhân có sữ dụng nấm ĐTHT với lượng 4,5g/ngày thì thận được bảo vệ tốt hơn, 89% chức năng thận được phục hồi, giảm tác dụng gây độc của kháng sinh so với nhóm đối chứng khi dùng giả dược hay sử dụng biện pháp khác chỉ cho kết quả 45%. Thử nghiệm trên 69 bệnh nhân ghép thận, kết quả là nấm ĐTHT đã làm giảm độc tính của Cyclosporine trên thận [6]. 1.1.3.3. Giảm đường huyết Nấm ĐTHT có hiệu quả với hệ thống chuyển hóa glucose trong máu. Các nhà khoa học nghiên cứu ngẫu nhiên có đến 95% bệnh nhân được cải thiện chỉ số đường huyết khi sử dụng 3g nấm/ngày. Hiệu quả này đạt được là do tác dụng Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 10 Khóa luận tốt nghiệp 2016 của nấm ĐTHT trong việc tăng độ nhạy của chất insulin, và các enzyme chuyển hóa glucose gan, glucokinase. Kết quả này khẳng định rằng việc sử dụng nấm ĐTHT trong việc kiểm soát chỉ số đường huyết mà không gây ra các phản ứng phụ [6]. 1.1.3.4. Điều trị bệnh phổi Tác dụng điều trị bệnh về đường hô hấp của ĐTHT đã được Y văn cố ghi nhận từ hàng nghìn năm nay bao gồm bệnh hen, bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính (COPD) và bệnh viêm phế quản. Nghiên cứu lâm sàng tại trường đại học Y Bắc Kinh trên 50 bệnh nhân hen suyễn khi được điều trị bằng nấm ĐTHT nhận thấy tình trạng bênh nhân đã được cải thiện có khoảng 81,3% số bệnh nhân sau khi sữ dụng nấm 5 ngày so với nhóm điều trị bằng các thuốc kháng histamine thông thường [11] 1.1.3.5. Điều trị bệnh tim mạch Đông trùng hạ thảo có tác dụng làm giảm những mạch máu, làm tăng lượng tuần hoàn não và tim thông qua cơ chế hưng phấn thực thể M ở cơ trơn thành mạch. Mặt khác, đông trùng hạ thảo còn có khả năng điều chỉnh lipit máu, làm giảm choesterol và lipoprotein, hạn chế quá trính tiến triển của tình trạng xơ vỡ động mạch. Đông trùng hạ thảo làm hạ huyết áp ở người cao huyết áp, có tác dụng hạ đường huyết, chống rối loạn những nhịp tim và điều tiết khí oxy cho máu. Chống lại hiện tượng thiếu máu ở cơ tim, giữ ổn định nhịp đập của tim. Vì vậy giúp phòng ngừa những bệnh liên quan đến tim mạch [10]. 1.1.3.5. Tăng cường khả năng miễn dịch Thí nghiệm ở 61 bệnh nhân bị bệnh lupus trong 5 năm kết quả cho thấy việc dùng nấm đông trùng hạ thảo với liều 3 g/ngày và chất Artesmisinine với lượng 0,6g/ngày đã làm giảm căn bệnh trên. 1.1.3.6. ỗ trợ điều trị ung thư Nhiều nghiên cứu lâm sàng được tiến hành tại Trung Quốc và Nhật bản trên những bệnh nhân ung thư cho kết quả khả quan. Nghiên cứu trên 50 bệnh Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 11 Khóa luận tốt nghiệp 2016 nhân ung thư phổi đã được uống 6g nấm ĐTHT/ngày, cùng với liệu pháp vật lý trị liệu thì khôi u đã giảm đi ở 23 bệnh nhân chiếm 46%. Nghiên cứu trên một số các bệnh nhân bị các dạng ung thư khác nhau, khi sử dụng nấm ĐTHT trong hai tháng với liều lượng là 6g/ngày, kết quả cho thấy có cải thiện về triệu chứng trên đa số bệnh nhân. Số lượng tế bào máu trắng bằng hoặc cao hơn 3000 mm³ ngay cả khi sử dụng liệu pháp chiếu xạ hay hóa chất thì các tham số miễn dịch cơ thể đã không bị thay đổi đáng kể trong khi kích thước khối u giảm đi nhiều trên một nữa bệnh nhân. Như vậy kết hợp sữ dụng nấm Đông trùng hạ thảo với các liệu pháp hóa trị cho kết quả khả quan giảm giảm tác dụng phụ của các liệu pháp trên [6,7] 1.1.3.7. hống rối loạn tình dục Nấm ĐTHT dùng để điều trị rối loạn tình dục ở cả nam giới và nữ giới bao gồm giảm ham muốn, lảnh cảm hoặc liệt dương. Nghiên cứu được tiến hành tại trung quốc với 756 bệnh nhân bị suy giảm ham muốn, sau 40 ngày sữ dụng 3g ĐTHT/ngày, thì có 64,8% bệnh nhân đã cải thiện được tình trạng tình dục công trình nghiên cứu khác trên các đối tượng người cao tuổi, cả nam và nữ đều có triệu chứng giảm ham muốn, liệt dương và các bệnh suy giảm sinh lý khác, sử dụng 3g/ngày tỏng vòng 40 ngày, các chỉ số đo được như thời gian sống của tinh trùng, số lượng tinh trùng đã tăng lên, còn tỷ lệ khiếm khuyết cuat tinh trùng giảm xuống đối với đa số các đối tượng, hơn gấp đôi số người bị liệt dương cũng như ghi nhận có cải thiện về tình trạng tình dục. đối với nữ giới, chứng đa khí hư, tình trạng rối loạn kinh nguyệt, ham muốn tình dục cũng được cải thiện [6,10]. 1.1.3.8. Tăng sức bền, chống mệt mỏi Theo báo cáo điện tử thì khi sữ dụng mỗi ngày 3g nấm ĐTHT thì kết quả làm gia tăng năng lượng cơ thể cho người cao tuổi bị các bệnh mãn tính. Năm 2004, tại Mỹ các nhà khoa học đã thí nghiệm cho người 40 – 70 tuổi, nếu sữ dụng nấm ĐTHT trong 12 tuần thì có sự gia tăng sức bền thể lực. sự gia tăng swucs mạnh được thể hiện ở cả hai yếu tố đó là gia tăng Adenosine Triphophate Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 12 Khóa luận tốt nghiệp 2016 (ATP) và giải phóng năng lượng trong ty lạp thể của tế bào cũng như hệ số sữ dụng hiệu quả oxy của tế bào trong quá trình giải phóng năng lượng [6,10]. 1.1.3.9. hống lão hóa Nấm ĐTHT chứa nhiều chất SOD (Superoxide Dismutase) là chất chống oxy hóa cao, nên nó có tác dụng làm chậm quá trình lão hóa của cơ thể. 1.2. Polysaccharide từ sinh khối nấm Cordyceps militaris 1.2.1. Đặc điểm về các Polysaccharide trong sinh khối nấm Cordyceps militaris Polysaccharides là các polyme ngưng tụ được hình thành từ một lượng lớn monosaccharide được liên kết với nhau bởi O-glycosidic. Một liên kết glycosidic được hình thành từ một nửa là glycosyl của hemiacetal (hoặc hemiketal) kết hợp với nhóm hydroxyl của mono khác để hình thành nên một đơn vị glycosyl trong chuỗi polysaccharide. Polysaccharides có cấu trúc mạch thẳng hoặc phân nhánh, tuy theo số lượng các monome chứa trong polysaccharides mà được chia thành hai nhóm: homopolysaccharides chỉ bao gồm một loại monosaccharide và heteropolysaccharides được hình thành từ hai hay nhiều chủng loại monosaccharide. Hình 1.5: công thức cấu tạo polysaccharide. Các glycosidic liên kết với nhau tại các vị trí, như liên kết α - (1/2), (1/3), (1/4) hay β - (1/2), β - (1/3), β - (1/4). Cả hai homopolysaccharides và heteropolysaccharides có thể chứa các liên kết dạng α, β phụ thuộc vào đơn vị hình thành lên chúng. Các heteropolysaccharides không chỉ khác nhau về đơn vị cấu tạo, số lượng và trình tự của các đơn vị monosaccharide mà chúng cũng khác nhau về trình tự của các mối liên kết glycosidic. Điều này dẫn đến một đa dạng gần như vô hạn trong cấu trúc của các polysaccharide. Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 13 Khóa luận tốt nghiệp 2016 Các polysaccharides chính trong nấm Cordyceps có một số dạng glucans với các mối liên kết glycosidic được hình thành từ liên kết (1/3) - (1/6) – β glucans và (1/3) - 1 - glucans. Mặc dù, vách tế bào nấm là nguồn cung cấp chính của polysaccharides được chứng minh kháng khối u, trong khi với polysaccharide thu nhận từ thực vật lại không có đặc điểm này, điều này chỉ có thể được giải thích được thông qua sự khác nhau trong cấu trúc hóa học của các polysaccharide. Bảng 1.2: Hàm lượng của một số loại đường có trong polysaccharide của quả thể và sợi nấm Codyceps militaris. [15] Một số loại đƣờng Hàm lƣợng (mg/g khối lƣợng khô) Quả thể Sợi nấm Arabinose 11.38 ± 0.97 Nd Fuctose 21.23 ± 3.48 7.31 ± 1.44 Mannitol 117.66 ± 2.23 112.55 ± 3.08 Ribose 86,76 ± 8.79 Nd Sucrose Nd 53.07 ± 9.10 Trechalose 23.61 ± 1.02 16.89 ± 0.72 Tổng 260.64 ± 16.49 189.82 ± 10.68 (nd: không phát hiện được) 1.2.2. Vai trò của các Polysaccharide trong nấm Codyceps sp Polysaccharide đã được các nhà khoa học khẳng định có hiệu quả trong việc hỗ trợ điều trị các bệnh mãn tính, nan y như: chống lại sự hoạt động của tế bào ung thư. Polysaccharide thư thường có cấu tạo từ đơn giản đến phức tạp chứa các đường glucose, galactose, mannose, xylose, arabinose, fucose, ribose và axit glucuronic. Trong một số loài nấm, polysaccharides liên kết với các protein hoặc peptide tạo thành các hệ polysaccharide - protein hoặc polysaccharide - peptide cấu trúc này có hoạt tính kháng khối u mạnh hơn. Ngoài cấu trúc 1/3 - β -glucans có khả năng kháng khối u đã được chứng minh trên cơ sở nghiên cứu lâm sàng, các nghiên cứu đã chỉ ra glucans có được hoạt tính sinh học này là trong cấu tạo của mình các Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 14