Tài liệu Nghiên cứu ứng dụng bức xạ gamma co 60 để chế tạo β glucan khối lượng phân tử thấp tan trong nước có hoạt tính sinh học từ bã men bia tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------Nguyễn Thành Long NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG BỨC XẠ GAMMA Co-60 ĐỂ CHẾ TẠO β-GLUCAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP TAN TRONG NƢỚC CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ BÃ MEN BIA Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 9 42 02 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2020 1 MỞ ĐẦU Luận án “Nghiên cứu ứng dụng bức xạ gamma Co-60 để chế tạo β-glucan khối lƣợng phân tử thấp tan trong nƣớ oạt t n in ọ từ n ia” được thực hiện từ tháng 11/2015 đến tháng 5/2019 tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh và Viện Sinh học Nhiệt đới. 1. Tính cấp thiết β-glucan đã được biết đến rộng rãi như là chất kích thích miễn dịch rất mạnh, làm giảm cholesterol và chất béo trung tính, điều hòa lượng đường trong máu, chữa lành vết thương, làm trẻ hóa làn da, v.v. βglucan còn có tác dụng làm gia tăng số lượng tế bào miễn dịch và hạn chế sự phát triển của khối u ở người nên có hoạt tính phòng chống rất mạnh mẽ khối u giúp nâng cao hiệu quả điều trị ung thư, và làm giảm tác dụng phụ của hóa trị, v.v. Trong chăn nuôi, β-glucan có tác dụng làm tăng cường hệ thống miễn dịch, giúp vật nuôi kháng được một số bệnh, từ đó làm tăng năng suất và chất lượng sản sản phẩm mà không cần phải dùng đến kháng sinh hoặc chất kích thích. Tuy nhiên, β-glucan có khối lượng phân tử (Mw) lớn, độ nhớt cao và khó hòa tan nên rất hấp thu kém nên gặp một số trở ngại khi ứng dụng thực tiễn. Nhiều nghiên cứu cho thấy β-glucan có Mw thấp sẽ có hiệu ứng sinh học tốt hơn β-glucan và β-glucan tan nước có Mw trong khoảng từ 1-30 kDa đã cho thấy có tác dụng tăng cường miễn dịch cao hơn so với các β-glucan có Mw cao. β-glucan Mw thấp và tan trong nước là những phân tử β-glucan dễ tan trong nước nên dễ dàng được hấp thu và có hoạt tính sinh học cao do đó được sử dụng hiệu quả hơn. Để có được β-glucan Mw thấp và tan trong nước thì cắt mạch bằng phương pháp chiếu xạ được chứng minh là rất hiệu quả với những ưu điểm nổi bật như thời gian ngắn, quy trình đơn giản, có thể điều chỉnh liều xạ để thu được β-glucan có Mw như mong muốn, sản phẩm có độ tinh khiết cao, không cần tinh chế lại và thân thiện với môi trường. β-glucan là một trong những hợp chất chính cấu tạo nên thành tế bào nấm men bia và cả nước hiện có trên 300 cơ sở sản xuất bia với công suất thiết kế 1,7 tỷ lít/năm, trong đó lượng bã nấm men là ~1%. Bã thải 2 này hiện chỉ được sử dụng một phần và số còn lại được xử lý và thải ra môi trường. Chính vì vậy, việc sử dụng nguồn bã thải nấm men bia để tách tạo β-glucan làm nguyên liệu để chế tạo chế phẩm β-glucan Mw thấp và tan trong nước có hoạt tính sinh học cao là rất hiệu quả và thiết thực nhằm tận dụng được nguồn phế thải để tạo sản phẩm có giá trị cao và góp phần giảm thiểu các nguồn gây ô nhiễm môi trường. Luận án này nghiên cứu hoàn thiện quy trình tách chiết β-glucan từ thành tế bào bã nấm men bia và thiết lập quy trình công nghệ chế tạo chế phẩm β-glucan Mw thấp và tan trong nước bằng phương pháp chiếu xạ đồng thời nghiên cứu các hiệu ứng sinh học của β-glucan sau khi cắt mạch bằng phương pháp chiếu xạ trong điều kiện in vitro và in vivo trên động vật (gà và chuột) nhằm tạo ra chế phẩm β-glucan có Mw thích hợp cho hiệu ứng sinh học cao phù hợp cho mục đích ứng dụng làm thực phẩm chức năng hoặc chế phẩm bổ sung trong chăn nuôi. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng thành công quy trình công nghệ chế tạo chế phẩm βglucan Mw thấp và tan trong nước có hoạt tính sinh học từ bã thải nấm men của các nhà máy sản xuất bia bằng phương pháp chiếu xạ. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án - Tách chiết β-glucan từ bã tế bào nấm men bia. - Cắt mạch β-glucan bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma Co-60. - Xác định hoạt tính sinh học của β-glucan cắt mạch bằng phương pháp chiếu xạ. - Hoàn thiện quy trình chế tạo β-glucan Mw thấp và tan trong nước bằng phương pháp chiếu xạ. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu tổng quan về β-glucan Phần này giới thiệu tổng quan đặc trưng về cấu trúc và nguồn thu nhận β-glucan. 1.2. Sơ lƣợc về nấm men Saccharomyces cerevisiae Phần này tổng quan về tế bào nấm men S. cerevisiae và cấu trúc của thành tế bào, trong đó nhấn mạnh β-glucan. 3 1.3. P ƣơng p áp t u n ận thành tế bào từ nấm men bia Phần này trình bày các phương pháp thông dụng được sử dụng để phá vỡ tế bào nấm men Saccharomyces thu nhận thành tế bào. 1.4. P ƣơng p áp tách chiết β-glucan từ tế bào nấm men bia Phần này trình bày các phương pháp phổ biến phá vỡ tế bào, chiết protein và tinh chế để thu nhận β-glucan. 1.5. Các p ƣơng p áp cắt mạch β-glucan Phần này trình bày các phương pháp thông dụng đã và đang được sử dụng để cắt mạch β-glucan. 1.6. Hoạt tính sinh học của β-glucan Trình bày đặc tính sinh học và cơ chế tác động của β-glucan. 1.7. Ứng dụng của β-glucan Trình bày ứng dụng chính của β-glucan trong các lĩnh vực khác nhau. 1.8. Ứng dụng của β-glucan Mw thấp Trình bày các ứng dụng của β-glucan Mw thấp và tan nước trong các lĩnh vực khác nhau. CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu - Bã men bia (nhà máy bia Sài Gòn Bình Dương), mẫu chuẩn β-glucan nấm men (Sigma, Mỹ), và KIT xác định hàm lượng β(1-3,1-6)-glucan (Megazyme) và các hóa chất tinh khiết khác (Meck). - Gà Lương phượng (Gallus gallus domesticus) (Đại học Nông Lâm Tp.HCM) và chuột nhắt trắng dòng Swiss (Viện Pasteur Tp.HCM), kháng thể sơ cấp Anti-mouse IgG produced in goat và thứ cấp Anti-goat IgG-Alkaline phosphatase (Sigma-Aldrich, Mỹ) và đĩa ELISA 96 giếng (Santa Cruz Biotechnology, Canada). 2.2. Nội dung và p ƣơng p áp nghiên cứu 2.2.1. Tách chiết β-glucan từ bã tế bào nấm men bia 2.2.1.1. Thu nhận thành tế bào nấm men Saccharomyces: Bã tế bào nấm men bia được ly tâm 5000 vòng/phút, rửa và tiến hành tự phân trong 20 giờ ở 50oC. Ly tâm thu nhận phần không tan. 2.2.1.2. Tách chiết β-glucan tổng số 4 a. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ: Tiến hành ở 70, 90 và 100oC. 400 g thành tế bào được khuấy với 2000 mL NaOH 3%, đun trong 9 giờ và ly tâm thu nhận phần rắn. Phần rắn được tiếp tục chiết 3 lần với 2000 mL dung dịch HCl có nồng độ lần lượt là 2,45; 1,75 và 0,94 M ở 750C trong 2 giờ. Ly tâm 7000 vòng/phút thu phần không tan, rửa 3 lần với cồn tuyệt đối và chiết 3 lần với diethyl ether. Sấy khô và tính như sau: 𝐾𝐿 𝑘ℎô 𝛽 − 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑎𝑛 𝑡ℎ𝑢 đượ𝑐 Hàm lượng β-glucan (%) = 𝐾𝐿 𝑘ℎô 𝑡ℎà𝑛ℎ 𝑡ế 𝑏à𝑜 𝑛ấ𝑚 𝑚𝑒𝑛 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢 x100 Mẫu β-glucan sau đó được kiểm tra hàm lượng protein (theo phương pháp AOAC 987.04-1997) và β-glucan (bằng kít K-YBGL). b. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaOH: Các bước được tiến hành tương tự như mục a. nhưng nồng độ NaOH thay đổi là 1, 2, 3 và 4%. c. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết: Được tiến hành tương tự mục a nhưng sử dụng nồng độ NaOH tối ưu từ mục b và thời gian chiết được khảo sát là 3, 4, 6, 9 và 12 giờ. d. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ mẫu/dung môi: Các bước cũng được tiến hành tương tự mục a nhưng thể tích dung dịch NaOH có nồng độ tối ưu (từ mục b) sử dụng là 1200, 2000 và 2800 mL, với nhiệt độ và thời gian phản ứng tối ưu đã được xác định tương ứng ở các mục a và c. 2.2.1.3. Đo phổ hồng ngoại: Mẫu β-glucan được nghiền nhỏ, trộn đều với KBr và ép tạo viên nén. Tiến hành đo mẫu trên máy quang phổ hồng ngoại model FT/IR-4700 (Jasco, Nhật Bản). 2.2.2. Cắt mạch β-glucan bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma 2.2.2.1. Chuẩn bị mẫu và chiếu xạ tạo mẫu β-glucan Mw thấp và tan trong nước: Hòa 100 g β-glucan trong 100 mL nước cất để tạo hỗn hợp huyền phù β-glucan 10% (w/v). Chiếu xạ ở các liều khác nhau trên nguồn xạ gamma Co-60 với xuất liều 3 kGy/h. 2.2.2.2. Xác định hiệu suất β-glucan tan nước sau chiếu xạ: Mẫu βglucan sau chiếu xạ được ly tâm 11000 vòng/phút để thu dịch nổi. Tủa dịch nổi với ethanol với tỷ lệ 1/9 (v/v), ly tâm thu tủa và sấy khô. Hàm lượng của β-glucan tan nước được tính theo công thức: KL 𝛽 − glucan tan Hàm lượng β-glucan tan nước (%) = KL 𝛽 − glucan sấy khô ban đầu x100 5 2.2.2.3. Đo phổ UV-vis của β-glucan tan nước: Mẫu β-glucan được đo trên máy quang phổ tử ngoại GENESY 10S UV-Vis (Thermo, Mỹ) ở nồng độ 0,025% và bước sóng từ 200-600 nm. 2.2.2.4. Xác định khối lượng phân tử của β-glucan: Mw của mẫu βglucan 0,1% (20 µL) được đo trên hệ máy GPC e2695 sử dụng cột Ultrahydrogel (Water, Mỹ) ở 40oC và tốc độ bơm là 1 mL/phút. 2.2.2.4. Đo phổ hồng ngoại: Thực hiện như mục 2.1.2.3. 2.2.2.5. Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Phổ 1H- và 13C-NMR của βglucan được đo trên máy Utrashield 500 plus (Brucker, USA) ở tầng số lần lượt là 500 MHz và 125 MHz sử dụng D2O (Cambridge, USA) với nồng độ mẫu là 5 mg/L. 2.2.3. Xác định hoạt tính sinh học của β-glucan cắt mạch bằng phương pháp chiếu xạ 2.2.3.1. Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa in vitro: Cho 1,5 mL dung dịch β-glucan 100 ppm phản ứng với 1,5 mL dung dịch DPPH 0,1 mM. Lắc đều để trong tối 30 phút. Đo OD ở bước sóng 517 nm (mẫu chứng là nước cất). Hoạt tính bắt gốc tự do được tính như sau: H (%) = (1 – A/Ao) x 100. Trong đó: A là OD của mẫu thử, Ao là OD của mẫu đối chứng ở 517 nm. 2.2.3.2. Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa in vivo trên chuột: Chuột được chia thành hai nhóm (mỗi nhóm 45 con gồm 5 NT, mỗi NT 3 con và lặp lại 3 lần): Nhóm bình thường không tiêm CCl4 và nhóm gây độc gan được tiêm phúc mô 3 lần bằng CCl4 với liều 10 mL/kg thể trọng chuột (cho nhịn đói 15 giờ trước khi tiêm cách ngày). Sau tiêm 60 phút, cho uống β-glucan (2 mg/con) liên tục 1 tuần. Chuột ĐC chỉ cho uống nước cất. Sau 8 ngày, lấy máu để định lượng AST và ALT trên máy sinh hóa BioSystem A15 (Bỉ). 2.2.3.3. Khảo sát công thức máu và miễn dịch ở chuột: Gồm 5 NT, lặp lại 3 lần. Hàng ngày chuột được cho uống 100 µL dung dịch β-glucan 2% (2 mg/con). Sau 28 ngày, lấy máu để xét nghiệm công thức máu (hồng cầu, bạch cầu tổng số (BCTS), bạch cầu trung tính (BCTT) và lympho bào), IgG và IgM. 2.2.3.4. Khảo sát hoạt tính giảm lipid và glucose máu 6 a. Tạo chuột béo phì thực nghiệm: Nhóm nuôi béo bằng ăn thức ăn giàu chất béo (HFD-high fat diet) và nhóm ăn thường được cho ăn thức ăn tiêu chuẩn (ND-normal diet) trong 8 tuần, sau đó lấy máu xét nghiệm các chỉ số glucose, cholesterol, triglycerid và LDL. b. Khảo sát các chỉ số sinh hóa trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm: Chuột béo phì được cho chuột uống hàng ngày với 100 µL β-glucan 2%. Đối chứng chỉ cho uống nước cất. Theo dõi, lấy máu, kiểm tra chỉ số sinh hóa ở 3 giai đoạn (Giai đoạn 1: Sau 20 cho uống β-glucan trong 20 ngày và vẫn cho ăn giàu chất béo; Giai đoạn 2: Tiếp tục cho uống thêm β-glucan 20 ngày (sau 40 ngày); và Giai đoạn 3: Ngừng cho chuột uống β-glucan trong 20 ngày (sau 60 ngày). Các chỉ số theo dõi: Cholesterol, triglycerid, LDL và glucose máu. 2.2.3.5. Khảo sát hiệu ứng tăng trưởng và miễn dịch ở gà: Gồm 5 NT, mỗi NT 18 con và lặp lại 3 lần. Gà được cho ăn thức ăn có bổ sung 500 ppm β-glucan có Mw khác nhau. Các chỉ tiêu theo dõi gồm: Trọng lượng bình quân (TLBQ), mức tăng trọng tuyệt đối, hệ số tiêu tốn thức ăn (FCR), tỷ lệ nuôi sống tích lũy, các chỉ tiêu về sinh hóa (BCTS/1 mm3, tỷ lệ bạch cầu lympho và BCTT), hiệu giá các kháng thể (HGKH) (kháng lại các bệnh gumboro, bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm và newcastle), và chất lượng thịt (tỷ lệ móc hàm, tỷ lệ quầy thịt, tỷ lệ ức và tỷ lệ đùi). 2.2.4. Thiết lập quy trình chế tạo β-glucan Mw thấp và tan trong nước trong khoảng liều dưới 100 kGy 2.2.4.1. Cắt mạch β-glucan bằng phương pháp chiếu xạ ở pH khác nhau: Điều chỉnh pH của hỗn hợp β-glucan 10% về 3, 5, 7 và 9 trước khi chiếu xạ như mục 2.2.2.1. 2.2.4.2. Cắt mạch β-glucan bằng phương pháp chiếu xạ ở điều kiện có H2O2: Được tiến hành như mục 2.2.4.1 nhưng nồng độ hỗn hợp huyền phù β-glucan là 5, 10 và 15% (w/v) trong 1% H2O2. 2.2.4.3. Đo giản đồ nhiễu xạ tia X: Giản đồ nhiễu xạ tia X của mẫu βglucan được đo trên máy D8 Advance ECO (Bruker, Đức) sử dụng ống phát bức xạ CuKα (lq= 1.5406 Å, U= 40 kV, I= 25 mA) ở góc từ 30100o (2θ) với kích thước bước 0,05o (2θ) và thời gian đếm là 0,5/s. 7 2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu Kết quả được xử lý bằng phần mềm Excel và thống kê theo phần mềm SPSS 16.0. Dữ liệu được phân tích bằng cách sử dụng phương pháp phân tích phương sai một chiều (ANOVA). CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết β-glucan từ tế bào nấm men bã men bia 3.1.1. Thu nhận nấm men từ bã nấm men bia từ nhà máy bia A B C D Hình 3.1. Dịch bã men bia (A), ảnh SEM dịch chưa rửa (B), mấm men bia sau khi rửa (C) và ảnh SEM tế bào nấm men sau khi rửa (D) Bã nấm men sau khi thu nhận được ly tâm 5000 vòng/phút để thu nhận tủa, rửa và ly thu nhận phần tế bào mấm men (hình 3.1). 3.1.2. Tách và thu nhận thành tế bào nấm men A B C Tế bào nấm men sau khi tự phân được tâm thu phần không tan thì chủ yếu là thành tế bào và có màu trắng Hình 3.2. Sản phẩm thành tế bào nấm men trước (A) và sau khi ly tâm (B) và ảnh SEM (C) ngà (hình 3.2). 3.1.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết βglucan từ thành tế bào nấm men Saccharomyces 3.1.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thu nhận β-glucan Nhiệt độ (oC) Tỷ lệ sản phẩm β-glucan (%) Độ tinh khiết (%) Hà lƣợng protein (%) 70 17,11 ± 0,22 85,31 2,28 90 16,13 ± 0,11 90,89 1,41 100 14,28 ± 0,16 91,12 1,08 Kết quả bảng 3.1 cho thấy khi nhiệt độ càng tăng thì hiệu suất thu nhận sản phẩm β-glucan tách chiết được càng giảm. Ở 70oC thì hiệu suất thu sản phẩm β-glucan cao nhất với 17,11% và ở 100C hiệu suất sản phẩm là thấp nhất với 14,28%. Tuy nhiên có thể thấy khi nhiệt độ phản ứng càng cao thì hàm lượng protein còn lại trong sản phẩm càng thấp và 8 độ tinh khiết của sản phẩm càng cao và nhiệt độ chiết 90oC là thích hợp nhất. 3.1.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH: Kết quả bảng 3.2 cho thấy hiệu suất sản phẩm β-glucan thu được giảm khi tăng nồng độ NaOH, hiệu suất này là 17,55% khi tăng nồng độ NaOH lên 3% và thấp nhất (16,82%) khi sử dụng 4% NaOH. Ngoài ra ở NT xử lý NaOH với nồng độ 1 và 2% thì hàm lượng protein vẫn còn cao (trên 2%) và độ tinh khiết thấp (85,11%). Trong khi đó, ở NT xử lý NaOH với nồng độ 4%, hàm lượng protein thấp và độ tinh khiết cao nhưng hiệu suất giảm mạnh. Do đó để tách chiết β-glucan đạt hiệu suất cao, hàm lượng protein thấp và độ tinh khiết sản phẩm cao thì NaOH 3% là lựa chọn tối ưu. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hiệu suất thu nhận β-glucan Nồng độ NaOH (%) Tỷ lệ sản phẩm β-glucan (%) Độ tinh khiết (%) Hà lƣợng protein (%) 1 18,68 ± 0,29 84,98 2,30 2 18,14 ± 0,14 85,11 2,00 3 17,55 ± 0,11 91,13 1,75 4 16,82 ± 0,22 91,99 1,73 3.1.3.3. Ảnh hưởng của thời gian chiết: Kết quả bảng 3.3 cho thấy, hiệu suất thu nhận β-glucan giảm dần theo thời gian phản ứng. Khi chiết 3-12 giờ thì hiệu suất tách chiết giảm 3%, trong đó ở NT 9 giờ và 12 giờ thì hiệu suất thu được giảm đi đáng kể. Ngoài ra, hàm lượng protein còn lại trong β-glucan khi tách chiết trong thời gian từ 3-12 giờ đều dưới 2% và độ tinh khiết của sản phẩm xử lý 9-12 giờ là khá cao. Kết quả này cho thấy thời gian chiết 9 giờ là hiệu quả nhất. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu nhận β-glucan Thời gian chiết (giờ) Tỷ lệ sản phẩm β-glucan (%) Độ tinh khiết (%) Hà lƣợng protein (%) 3 17,97 ± 0,30 84,96 1,93 6 17,12 ± 0,30 86,15 1,49 9 16,13 ± 0,11 91,52 1,41 12 14,97 ± 0,10 92,08 1,34 3.1.3.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ mẫu/dung môi: Bảng 3.4 cho thấy hiệu suất β-glucan giảm khi tỉ lệ chiết tăng. Hàm lượng β-glucan thu được khi xử lý mẫu với tỉ lệ chiết 1/3 cao hơn so với tỉ lệ 1/5 và 1/7. Ở NT xử lý với tỉ lệ 1/7, hàm lượng β-glucan thu được là tương đương với NT xử lý với Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ mẫu/dung môi thủy phân đến hiệu suất thu nhận β-glucan Tỉ lệ mẫu/dung môi (g/mL) Tỷ lệ β-glucan (%) Độ tinh khiết (%) HL protein (%) 1/3 17,42 ± 0,14 85,19 1,90 1/5 16,13 ± 0,11 92,01 1,41 1/7 16,15 ± 0,08 92,98 1,34 9 tỉ lệ 1/5 (~16%). Hàm lượng protein trong sản phẩm β-glucan thu được đều dưới 2% nhưng độ tinh khiết sản phẩm khi xử lý ở tỉ lệ 1/5 và1/7 là cao hơn. Có thể thấy tỷ lệ 1/5 là tối ưu. 3.1.3.5. Hoàn thiện quy trình chế tạo β-glucan từ bã nấm men bia a. Tách chiết β-glucan từ bã nấm men bia quy mô 500 lít/mẻ: Từ kết quả Bảng 3.5. Hiệu suất tách chiết sản phẩm β-glucan từ bã men bia ở quy mô 500 lít/mẻ Lần Thể tích dịch bã KL khô tế bào chiết nấm men bia (lít) nấm men (kg) 1 500 15,89 2 500 16,10 3 500 16,51 TB 500 16,17±0,32 KL khô thành tế KL sản phẩm β- Hiệu suất bào nấm men (kg) glucan (kg) (%) 4,44 0,7122 16,02 4,35 0,7285 16,76 4,77 0,7411 15,53 4,521±0,22 0,7273±0,01 16,11±0,62 trên, quy trình tách chiết mẫu β-glucan được hoàn thiện và chế tạo thử nghiệm với số lượng bã thải nấm men bia lớn hơn (500 lít/mẻ). Kết quả thu nhận được từ 3 mẻ khác A B C nhau ở bảng 3.5 cho thấy lượng sản phẩm β-glucan thu được là 2,18 kg. Như vậy quy trình này có hiệu suất tạo sản phẩm β- Hình 3.3. Mẫu β-glucan sau khi tách chiết từ sau khi thu nhận (A), glucan từ thành tế bào nấm men thành tế bào nấm men sau khi sấy khô ở 60oC (B) và ảnh SEM (C) trung bình ~16,1% (hình 3.3). b. Xác định hàm lượng β-glucan: Hàm lượng β-glucan trong mẫu chế tạo ở bảng 3.6 cho thấy độ tinh khiết của sản phẩm β-glucan thu nhận được từ quy trình là khoảng 91,78% β-glucan và có chứa một lượng nhỏ α-glucan. Bảng 3.6. Hàm lượng các loại glucan trong mẫu tách chiết Glucan tổng số (%) α-glucan (%) β-glucan (%) 93,34 ± 0,41 1,56 ± 0,07 91,78 ± 0,34 c. Xác định đặc trưng cấu trúc mẫu β-glucan sau khi chế tạo Đặc trưng cấu trúc Sản phẩm β-glucan được khảo sát bằng phổ hồng ngoại và so sánh với mẫu chuẩn cùng loại của Sigma. Kết quả từ hình 3.4 cho thấy các đỉnh chính xuất hiện từ 400-4000 cm-1 và được liệt kê ở bảng 3.7 cho thấy đỉnh xuất hiện ở 3333 cm-1 thuộc liên kết O-H xuất có cường độ cao và vai rộng, đỉnh 2896 cm-1 có cường độ trung bình và vai hẹp cùng với đỉnh có cường độ yếu ở 2088 cm-1 điều thuộc liên kết C-H. Các đỉnh tại số sóng 1640 và 1079 cm-1 là đặc trưng của liên kết CO. 10 1156 TT 1 2 3 4 890 1371 1640 Abs 2896 3383 1040 1079 Trong khi đó các đặc trưng của liên kết CCH, C-O-C và CC được biểu hiện ở các đỉnh tương ứng là 1371, 1156 và 1040. Có thể thấy mẫu βglucan tách Mẫu chuẩn của Sigma chiết được có đặc trưng cấu trúc khá tương Mẫu tách chiết đồng với mẫu β- 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400 1/cm glucan cùng loại Hình 3.4. Phổ FTIR của mẫu β-glucan tách chiết tách từ thành tế bào nấm men bia và mẫu β-glucan chuẩn của Hãng Sigma của Sigma. Bảng 3.7. Các đỉnh của các nhóm chức đặc trưng cơ bản của β-glucan Đỉn ( -1) N ứ TT Đỉn ( -1) N ứ 3383 OH 5 1156 COC 2896 CH2 6 1079 CO 1640 CO 7 1040 CC 1371 CCH 8 890 CO của β-glucan d. Thiết lập quy trình tách chiết β-glucan quy mô 500 lít mẻ Hình 3.5. Sơ đồ khối quy trình tách chiết β-glucan từ dịch bã men bia quy mô 500 lít/mẻ 11 Từ những kết quả nhận được nói trên, quy trình tách chiết β-glucan từ bã thải nấm men bia được hoàn thiện như mô tả ở hình 3.5. 3.2. Cắt mạch β-glucan bằng p ƣơng p áp iếu xạ 3.2.1. Xác định hiệu suất thu nhận β-glucan tan bằng phương pháp chiếu xạ β-glucan Hình 3.6 cho thấy hàm lượng β-glucan tan thu được tăng tuyến tính theo sự gia tăng của liều xạ, Cụ thể khi chiếu xạ ở 100 kGy thì hàm lượng β-glucan tan thu nhận được là ~25,8%, tại liều 200 kGy tăng ~23,2% so với liều 100 kGy, và ở liều 300 kGy thì hàm lượng thu được là ~ 66,7%. Hình 3.6. Hiệu suất thu nhận βglucan tan nước khi chiếu xạ hỗn 3.2.2. Sự suy giảm khối lượng phân tử hợp β-glucan 10% ở các liều xạ Hình 3.7 cho thấy Mw của β-glucan tan khác nhau nước giảm dần và tỷ lệ nghịch với sự gia tăng của liều xạ. Ở khoảng liều chiếu xạ 100 kGy thì Mw của β-glucan tan nước thu được giảm mạnh (từ trên 64 kDa xuống còn ~31 kDa) và sau đó giảm chậm hơn và đạt khoảng 11 kDa ở liều xạ 300 kGy. Hình 3.7. Sự suy giảm Mw của βglucan tan theo liều xạ 3.2.3. Phân tích phổ UV Hình 3.8. β-glucan tan nước từ mẫu β-glucan 10% chiếu xạ ở các liều xạ khác nhau Hình 3.8 cho thấy các dung dịch β-glucan tan thu được sau chiếu xạ có màu sắc thay đổi Hình 3.9. Phổ UV-vis β-glucan chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ từ nâu đến nâu đậm. Kết quả từ hình 3.9 cho thấy rằng ở mẫu không chiếu xạ thì hoàn toàn không có sự xuất hiện đỉnh trong dải bước sóng từ 200-400 nm do chưa có β-glucan. 12 1079 890 1371 1731 1640 2896 1156 3383 1040 Mw thấp trong dung dịch. Trong khi đó phổ của các mẫu β-glucan chiếu xạ đều xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 273 nm. 3.2.4. Phân tích phổ FTIR Kết quả từ hình 3.10 cho thấy đối với mẫu β-glucan chiếu xạ hầu như không thay đổi số lượng và vị trí đỉnh so với mẫu không chiếu xạ. Tuy nhiên có sự xuất hiện đỉnh 1731 cm-1 biểu hiện của liên kết C=O trong phân tử sau khi cắt mạch với cường độ theo liều xạ, trong khi cường độ của đỉnh 1156 cm-1 biểu hiện Hình 3.10. Phổ IR của β-glucan chiếu xạ nồng độ 10% ở các liều xạ khác nhau của nhóm C-O-C (liên kết glucoside) của các mẫu chiếu xạ giảm giảm dần theo sự gia tăng của liều xạ. Nếu so sánh cường độ của đỉnh này và đỉnh 1040 cm-1 biểu hiện cho liên kết C-C vốn được xem là bền với bức xạ cho thấy tỷ lệ giữa cường độ đỉnh C-O-C (1156 cm-1) và cường độ đỉnh C-C (1040 cm-1) giảm khi liều xạ tăng (hình 3.11). Điều đó cho thấy sự Hình 3.11. Sự-1 thay đổi tỷ lệ cường độ đỉnh C--1 O-C (1156 cm )/cường độ đỉnh C-C (1040 cm ) cắt mạch chủ yếu ở các liên kết của trong phổ của mẫu β-glucan theo liều xạ glucoside 3.2.5. Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C Phổ NMR-1H và 13C của mẫu β-glucan tan nước có Mw~25 kDa (hình3.12a&b) cho thấy độ dịch chuyển hóa học ở 4,48; 3,43; 3,59; 3,45; 3,47 và 3.82 ppm là lần lượt chuyển biểu thị cho các liên kết H-1, H-2, H-3, H-4, H-5 và H-6 trong phân tử βglucan sau khi chiếu xạ. Trong khi độ dịch chuyển hóa học biểu Abs 300kGy 250kGy 200kGy 150kGy 100kGy 0kGy 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400 1/cm 13 thị cho các nguyên tử C-1, C-2, C-3, C-4, C-5 và C-6 quan sát được lần lượt ở 102,55; 72,32; 84,12; 68,14; 75,56 Hình 3.12. Phổ NMR- 1H (a) và 13C (b) của β-glucan tan nước có Mw~25 kDa và 60,73 ppm. Kết quả này cho thấy thành phần chính của mẫu là βglucan 3.2.6. P ân t à lƣợng β-glucan Bảng 3.8. Hàm lượng các loại glucan trong mẫu β-glucan tan nước có Mw~25 kDa Loại glucan Glucan tổng số α-glucan β-glucan Hà lƣợng trong mẫu (%) Trƣớc khi chiếu xạ Sau khi chiếu xạ 93,34 ± 0,41 97,88 ± 0,89 1,56 ± 0,07 0,91 ± 0,36 91,78 ± 0,34 96,97 ± 0,25 Kết quả bảng 3.8 cho thấy, so với mẫu không chiếu xạ thì hàm lượng glucan tổng số sau khi chiếu xạ đã tăng nhẹ (lên ~97,88%). 3.3. Hoạt tính sinh học của β-glucan tan nƣớc chế tạo bằng p ƣơng pháp chiếu xạ Hoạt tính kháng oxy hoá, % 3.3.1. Hoạt tính kháng oxi hóa của β-glucan chiếu xạ trong điều kiện in vitro 70 Kết quả hình 3.13 cho thấy hoạt tính 60 kháng oxi hóa của β-glucan tăng khi Mw 50 của β-glucan giảm. Ở cùng nồng độ 100 40 30 ppm, hoạt tính kháng bắt gốc tự do DPPH 20 của mẫu β-glucan có Mw > 64, 48, 25 và 10 11 kDa đạt lần lượt là 5,2; 47,6; 58,2 và 0 0 10 20 30 40 50 60 70 60,7%. Mẫu β-glucan không chiếu xạ (Mw Mw, kDa > 64 kDa) có hoạt tính kháng oxy hóa thấp Hình 3.13. Hoạt tính kháng oxi của β-glucan có Mw khác nhau hơn 9-12 lần so với β-glucan cắt mạch bức xạ. 3.3.2. Khả năng bảo vệ gan của β-glucan chiếu xạ trong điều kiện in vivo 14 3.3.2.1. Ảnh hưởng của β-glucan chiếu xạ lên chỉ số men gan AST ở chuột gây tổn thương gan: 200 (a) Chuột thường ĐC 160 120 80 40 ĐC >64 48 Mw, kDa 25 11 >64 Mw, kDa 48 25 11 0 Mức thay đổi SVĐC, % Chỉ số AST, U/L Chuột gây độc gan -20 -40 -60 Chuột thường Chuột gây độc gan (b) -80 Hình 3.14. Chỉ số AST giữa các nghiệm thức (a) và mức thay đổi chỉ số này SVĐC (b) ở nhóm chuột thường (không tiêm CCl4) và chuột gây độc gan được cho uống β-glucan có Mw khác nhau Hình 3.14a cho thấy chỉ số AST trong máu chuột ở các nghiệm thức không gây độc là 58,47-84,24 U/L. Chỉ số AST trong máu chuột khi cho uống β-glucan chiếu xạ đều có sự khác biệt có ý nghĩa. Chuột cho uống β-glucan tan trong nước có Mw~25 và 11 kDa có chỉ số AST giảm mạnh nhất (hình 3.14b). β-glucan tan trong nước có Mw~25 đã có tác dụng làm giảm chỉ số AST trong máu chuột thấp nhất với 61,81 U/L (tương đương nhóm ĐC không gây độc gan). 3.3.2.2. Ảnh hưởng của β-glucan chiếu xạ lên chỉ số men gan ALT ở chuột gây tổn thương gan: Kết quả hình 3.15a cho thấy β-glucan chiếu xạ cũng đã làm hạ chỉ số ALT và ở nhóm cho uống β-glucan có Mw~25 kDa có chỉ số này thấp nhất. Ở nhóm gây độc gan, kết quả từ hình 3.15b cho thấy chỉ số ALT có xu hướng giảm tỷ lệ thuận với Mw của β-glucan. NT cho uống β-glucan tan trong nước có Mw~25 và 11 kDa có chỉ số ALT thấp tương đương với nhóm chuột ĐC không gây độc gan. 130 Chuột thường ĐC 90 70 50 30 ĐC >64 48 Mw, kDa 25 11 >64 Mw, kDa 48 25 11 0 Chuột gây độc gan Mức thay đổi SVĐC, % Chỉ số ALT, U/L (a) 110 -10 -20 -30 -40 -50 Chuột thường Chuột gây độc gan (b) -60 Hình 3.15. Chỉ số AST giữa các nghiệm thức (a) và mức thay đổi chỉ số này SVĐC (b) ở nhóm chuột thường (không tiêm CCl4) và chuột gây độc gan được cho uống β-glucan có Mw khác nhau 3.3.3. Ảnh hưởng của β-glucan chiếu xạ đến chỉ số miễn dịch ở chuột 15 3.3.3.1. Công thức máu và các tế bào miễn dịch: Bảng 3.9. Số lượng hồng cầu, bạch cầu tổng số, lympho bào và bạch cầu trung tính trong máu chuột khi cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác nhau Mw β-glucan Hồng cầu (106 tế BCTS 103 tế bào Lympho bào (%) BCTT (%) (kDa) bào/mm3) /mm3) b ĐC 5,44±0,22 4,95 ±0,18 57,23b±2,18 10,08b±1,04 > 64 5,46±0,12 5,05ab±0,13 59,92ab±1,91 14,70a±0,52 48 5,64±0,24 5,20ab±0,12 62,55ab±0,98 15,73a±1,43 25 5,6±0,28 5,50a±0,15 65,97a±1,84 16,37a±0,66 11 5,48±0,28 5,40b±0,16 64,42a±2,86 15,22a±0,67 ns    Trong cùng 1 cột với các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê. : P<0,05; ns: không khác biệt; ĐC không bổ sung β-glucan Kết quả từ bảng 3.9 cho thấy số lượng hồng cầu hầu như không khác biệt giữa các lô, tuy nhiên số lượng bạch cầu tổng số (BCTS) thì có sự khác biệt. Chuột cho uống bổ sung β-glucan chiếu xạ có BCTS cao hơn và đạt cao nhất khi cho uống bổ sung β-glucan tan nước có Mw~25 kDa (5,5x10 3 tế bào /mm3). 3.3.3.2. Yếu tố miễn dịch dịch thể (IgG và IgG): Kết quả hình 3.16 cho thấy giá trị OD đo được ở 405 nm của các lô có cho uống bổ sung βglucan chiếu xạ có Mw từ 11-25 kDa cao hơn so với lô ĐC không cho uống bổ sung và các lô khác. 1.0 0.4 (a) (b) 0.3 OD405nm OD405nm 0.9 0.8 0.7 0.2 0.1 0.6 0.0 ĐC >64 48 Mw, kDa 25 11 ĐC >64 48 Mw, kDa 25 11 Hình 3.16. Hàm lượng IgG (a) và IgM (b) trong trong máu chuột cho uống bổ sung β-glucan 3.3.4. Khả năng hạ mỡ máu và đường huyết của β-glucan chiếu xạ trong điều kiện in vivo trên chuột 3.3.4.1. Tạo mô hình chuột béo phì thực nghiệm Bảng 3.10. Thể trọng 2 nhóm chuột sau 8 tuần nuôi theo chế độ dinh dưỡng khác nhau Tuần 0 (g/con) Tuần 8 (g/con) Mức tăng trọng lượng (%) Mức tăng của nhóm HFD (%) Nhóm ND Nhóm HFD 19,45 ± 0,28 19,54 ± 0,23 32,53 ± 0,95 48,87 ± 0,71 ↑ 67,23 ↑ 150,15 ↑ 124,24 Bảng 3.11. Một số chỉ số sinh hóa của chuột sau 8 tuần nuôi Chỉ số Cholesterol toàn phần (mg/dL) Triglyceride (mg/dL) LDL (mg/dL) Nhóm ND 78,79±4,21 71,85±3,04 20,28±1,32 Nhóm HFD 145,04±6,21 121,78±6,27 31,73±2,69 Mứ tăng ủa nhóm HFD (%) ↑ 84,08 ↑ 69,48 ↑ 56,49 16 Glucose (mg/dL) 102,79±8,86 165,46±7,39 ↑ 60,97 Kết quả từ bảng 3.10 và hình 3.17 cho thấy nhóm chuột HFD có trọng lượng tăng 29,33 g/con (150,15%) và lớn hơn chuột nuôi thường là 16,34 g/con (tăng 124,24%). Kết quả xác định chỉ tiêu lipid máu như cholesterol tổng số, triglyceride, LDL và glucose trong máu chuột ở bảng 3.11 cho thấy ở các lô chuột ăn thức ăn có hàm lượng chất béo cao đều có chỉ số lipid máu cao hơn hẳn lô chuột ăn thức ăn bình thường. Hình 3.17. Nhóm chuột HFD (A) Cụ thể là nồng độ cholesterol máu tăng84,1%, và ND (B) sau 8 tuần nuôi triglyceride máu tăng 69,5%, LDL tăng 56,5% và glucose máu tăng 61%. 3.3.4.2. Ảnh hưởng của β-glucan chiếu xạ lên thể trọng và các chỉ số lipid và glucose: Kết quả bảng 3.12 cho thấy sau 20 ngày thử nghiệm bằng Bảng 3.12. Trọng lượng chuột trước và sau 20 ngày cho uống β-glucan có Mw khác nhau Mw β-glucan (kDa) Trƣớc khi thử nghiệm (g/con) Sau 20 ngày (g/con) Mứ t ay đổi (%) ĐC1 33,41 ± 0,71 34,84a ± 0,77 ↑ 4,35a c ĐC2 45,12 ± 1,43 51,73 ± 1,03 ↑ 15,17b > 64 44,51 ± 1,01 47,51b ± 1,34 ↑ 6,72a b 48 44,85 ± 1,07 47,48 ± 0,7 ↑ 6,14a 25 45,10 ± 0,78 47,16b ± 1,06 ↑ 4,53a 11 44,71 ± 1,21 46,51b ± 1,02 ↑ 4,22a ns   β-glucan chiếu xạ và vẫn được cho ăn theo chế độ béo thì khối lượng chuột ở tất cả các nghiệm thức đều tăng so với ban đầu. Tuy nhiên mức thay đổi trọng lượng chuột ở các nghiệm thức uống β-glucan thấp hơn rất nhiều so với NT ĐC2 (chuột béo phì). Kết quả bảng 3.13 cho thấy các chỉ số mỡ máu ở nhóm chuột ĐC2 đều tăng đáng kể và cholesterol lên đến 198,15 mg/dL, trong khi đó ở nhóm chuột được cho uống β-glucan chỉ Bảng 3.13. Các chỉ số lipid và glucose trong máu chuột sau 20 ngày cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác nhau Sau 20 ngày thử nghiệm Mw β-glucan (kDa) Cholesterol (mg/dL) Triglyceride (mg/dL) LDL (mg/dL) Glucose (mg/dL) ĐC1 89,18a ± 5,44 85,27a±3,86 23,85ab±1,55 126,01b±6,92 d b c ĐC2 198,15 ±5,46 164,82 ±6,32 38,53 ±2,80 212,31c±6,44 > 64 129,05c±2,96 90,16a±4,00 28,9b±2,82 139,74b±4,56 17 103,64b±4,01 79,62a±4,95 20,68a±2,06 124,72b±7,19 89,79a±3,54 83,10a±4,80 18,9a±1,69 106,8a ± 2,17 109,28b±4,29 88,68a ± 4,40 26,35ab±3,23 127,66b±6,63     ĐC1: Chuột thường không cho uống β-glucan, ĐC2: Chuột béo phì không cho uống β-glucan. 48 25 11 89,79-129,05 mg/dL. Chuột ở NT được cho uống β-glucan tan nước có Mw~25 kDa cho chỉ số cholesterol thấp nhất và gần bằng so với chuột Bảng 3.14. Các chỉ số lipid và glucose trong máu chuột sau 40 ngày cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác nhau Sau 40 ngày thử nghiệm Mw β-glucan (kDa) Cholesterol (mg/dL) Triglyceride (mg/dL) LDL (mg/dL) Glucose (mg/dL) ĐC1 88,14ab ± 5,62 86,67b ± 4,10 ĐC2 > 64 48 25 11 d c 210,74 ± 9,05 119,54c ± 4,55 91,5ab ± 3,26 75,97a ± 2,36 96,08b ± 6,28  190,41 ±10,79 78,85ab ± 4,12 69,53a ± 1,77 62,58a ± 3,15 77,77ab ± 3,01  22,76b ± 1,62 c 38,48 ± 1,14 22,06b ± 1,56 19,09ab ± 1,23 17,25a ± 0,79 21,31ab ± 1,63  127,28c ± 7,77 239,74d±13,02 134,11c ± 6,03 97,98ab ± 2,42 86,13a ± 2,94 114,25bc ± 3,43  Mức thay đổi chỉ số cholesterol, % thường. Kết quả hình 3.18 và bảng 3.14 cũng cho thấy NT sử dụng βglucan có Mw~25 kDa vẫn cho kết quả giảm 45 20 ngày 40 ngày 60 ngày cholesterol tốt nhất sau 40 ngày thử 25 nghiệm và ngang với chỉ số 5 cholesterol của chuột thường.ước có -15 Mw~25 kDa cho chỉ số cholesterol thấp nhất và gần bằng so với chuột -35 thường. Kết quả hình 3.18 và bảng -55 ĐC1 ĐC2 >64 48 25 11 Mw, kDa 3.14 cũng cho thấy NT sử dụng βHình 3.18. Mức thay đổi chỉ số cholesterol glucan có Mw~25 kDa vẫn cho kết trong máu chuột so với trước khi cho uống bổ quả giảm cholesterol tốt nhất sau 40 sung β-glucan có Mw khác nhau. ĐC1: Chuột thường không cho uống β-glucan, ĐC2: Chuột ngày thử nghiệm và ngang với chỉ số béo phì không cho uống β-glucan. cholesterol của chuột thường. Bảng 3.15. Các chỉ số lipid và glucose trong máu chuột sau 60 ngày cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác nhau Sau 60 ngày thử nghiệm Mw β-glucan (kDa) Cholesterol (mg/dL) Triglyceride (mg/dL) LDL (mg/dL) Glucose (mg/dL) a ĐC1 93,83 ± 3,87 98,61b ± 2,94 24,55b ± 2,49 135,24b ± 3,04 c c c ĐC2 212,92 ± 7,71 195,43 ± 8,66 41,38 ± 1,03 245,39c ± 9,07 > 64 122,79b ± 3,80 82,79a ± 2,91 24,04ab ± 2,61 137,54b ± 3,68 48 99,78a ± 3,53 77,73a ± 3,74 19,76ab ± 1,46 110,81a ± 4,12 18 25 11 89,67a ± 3,18 103,95a±5,14  70,59a ± 3,17 79,52a ± 3,96  18,85a ± 0,92 21,82ab ± 1,16  105,90a ± 2,71 119,81a ± 3,01  Mức thay đổi chỉ số LDL, % Mức thay đổi chỉ số triglyceride, % Sau 20 ngày tiếp theo, ngừng cho uống β-glucan (chỉ cho uống nước cất) kết quả từ hình 3.18 và bảng 3.15 cũng cho thấy sau 60 ngày, NT cho uống β-glucan tan nước có Mw~25 kDa vẫn cho hiệu quả tốt nhất, cholesterol chỉ còn 89,67 mg/dL. Bảng 3.13 và hình 3.19 cho thấy, sau 20 ngày, chỉ số triglyceride ở các NT cho uống β- glucan giảm 25,2733,14%, trong khi các nghiệm thức ĐC uống nước cất vẫn tăng18,62% ở lô chuột thường và 35,84% ở lô chuột béo phì. Sau 40 ngày, chỉ số triglyceride vẫn giảm đáng kể. Chuột chỉ uống nước cất, chỉ số cholesterol cao hơn 3 lần so với các NT cho uống β- glucan. Sau 60 ngày, chỉ số triglyceride là 70,59-82,79 mg/dL ở các NT đã thử nghiệm với β-glucan. Qua đó cho thấy dù ngưng cho uống β-glucan thì hiệu quả hạ triglyceride vẫn được duy trì. Trong các giai đoạn thử nghiệm, chỉ số triglyceride giảm nhiều nhất ở NT cho uống β-glucan tan nước có Mw~25 kDa. Đối với chỉ số LDL, sau 20 ngày, NT cho uống β-glucan có Mw~48 và 25 kDa cho khả năng giảm chỉ số LDL tốt nhất. Chỉ số 20 ngày 40 ngày 60 ngày 60 LDL ở các NT thử nghiệm với glucan 40 chỉ còn 18,9-28,9 md/dL, trong khi NT 20 0 ĐC2 chỉ số này tăng tới 38,53 mg/dL. -20 Sau 40 ngày, chỉ số LDL tại các NT -40 cho uống β-glucan tiếp tục giảm gần -60 bằng so với chuột thường. Khi ngừng ĐC1 ĐC2 >64 48 25 11 Mw, kDa cho uống β-glucan 20 ngày tiếp theo thì Hình 3.19. Mức thay đổi chỉ số triglyceride kết quả thu được vẫn còn hiệu quả trong máu chuột so với trước khi cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác nhau. (bảng 3.15). Mức giảm LDL tốt nhất 40 20 ngày 40 ngày 60 ngày quan sát được ở 2 nghiệm thức cho 20 uống β-glucan với Mw~48 và 25 kDa 0 (hình 3.20). Kết quả bảng 3.13 và hình 3.21 còn chỉ ra rằng ở các nhóm cho -20 uống bổ sung β-glucan, nồng độ -40 glucose trong máu chuột giảm15,62-60 ĐC1 ĐC2 >64 48 25 11 34,12% so với trước khi thử nghiệm. Mw, kDa Trong đó, NT sử dụng β-glucan tan Hình 3.20. Mức thay đổi chỉ số LDL trong 19 Mức thay đổi chỉ số glucose, % máu chuột so với trước khi cho uống bổ nước có Mw~25 kDa cho khả năng sung β-glucan có Mw khác nhau. giảm chỉ số glucose máu cao nhất 80 20 ngày 40 ngày 60 ngày (34,12%) nhưng không khác biệt so với 60 NT sử dụng β-glucan có Mw~11 và 48 40 20 kDa. Sau 40 ngày sau thử nghiệm, chỉ 0 số này tiếp tục giảm ở các lô cho uống -20 β-glucan, trong khi NT ĐC2, chỉ số này -40 tăng cao đạt 239,74 mg/dL. Ở giai đoạn -60 ĐC1 ĐC2 >64 48 25 11 60 ngày sau thử nghiệm, chỉ số glucose Mw, kDa tăng nhẹ so với 40 ngày và đạt 105,9 - Hình 3.21. Mức thay đổi chỉ số glucose trong máu chuột so với trước khi cho uống bổ sung β137,54 mg/dL tại các nghiệm thức cho glucan có Mw khác nhau uống β-glucan có Mw khác nhau. 3.3.5. Hiệu ứng của β-glucan chiếu xạ lên sự tăng trưởng và miễn dịch ở gà Lương phượng Bảng 3.16 cho thấy TLBQ của lô có bổ sung β-glucan tan nước có Mw~11-25 kDa đạt cao nhất (1260 & 1256 g/con) và lô ĐC thấp nhất với chỉ 1013 g/con. Mức tăng trọng tuyệt đối ở gà nuôi có bổ sung βglucan tan nước có Mw~11-25 kDa vẫn đạt cao nhất. Lượng thức ăn tiêu thụ và hệ số tiêu tốn thức ăn (FCR) ở lô bổ sung β-glucan tan nước có Mw~25 kDa là thấp nhất nhưng chất lượng thịt lại đạt cao nhất (hình 3.22).. Bảng 3.16. Ảnh hưởng của β-glucan có Mw khác nhau lên sự tăng trọng và chất lượng thịt ở gà sau 8 tuần cho ăn bổ sung Chỉ số ĐC > 64 kDa 49 kDa 25 kDa 11 kDa Tỷ lệ sống (%) 61,1b ± 3,2 66,7b±6,4 72,2b ± 5,5 94,4a ± 5,6 94,4a ± 5,6  Mức tăng trọng tuyệt đối 16,3d±0,5 17,8cd±0,3 18,8bc±0,2 20,6ab±0,7 20,7± 0,9  Lượng thức ăn sử dụng 491,1a±5,4 508,3a±1,7 480,4ab±9,2 453,3b±4,4 479ab±15,7  FCR (kg thức ăn/kg tăng trọng) 4,8b±0,7 3,8ab±0,4 3,7ab±0,2 3,1a±0,2 3,4a±0,2  Thể trọng (g/con) 1012,7d±10,3 1096c±6,7 1152,3b±17,1 1255,7a±5,7 1259,7a±21,1  Trong cùng 1 hàng, các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05. Bảng 3.17. Ảnh hưởng của Mw β-glucan có Mw khác nhau lên các chỉ số miễn dịch ở gà sau 8 tuần cho ăn bổ sung Chỉ số ĐC > 64 kDa 49 kDa 25 kDa 11 kDa BCTS (103/mm3) 29,3 ± 0,3 30,4 ± 0,1 30,4 ± 0,5 30,9 ± 0,3 31,1 ± 0,5 BCTT (%) 62,3 ± 1,2 61,0 ± 1,2 63,0 ± 1,2 63,7 ± 1 63 ± 1,2 Lymphocyte (%) 25 ± 1,2 28,7 ± 2 25,3 ± 3 30,7 ± 3,7 29,7 ± 2,2 HGKT Gumboro (Unit) 7980±12 13366±14 11903±35 14770±35 5613±22 HGKT viêm thanh khí quản 131,5±33,6 151,7±33,3 175,8±56,5 181,9 ± 7,3 156 ± 47,9 truyền nhiễm (Unit) HGKT Newcastle (Unit) 13,3 ± 2,7 21,3 ± 5,3 21,3 ± 5,3 26,7 ± 5,3 21,3 ± 5,3