Tài liệu Nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm nac liên quan đến tính chịu hạn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _____________________ Phạm Thu Hằng NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG LÚA CHUYỂN GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ NHÓM NAC LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _______________________ Phạm Thu Hằng NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG LÚA CHUYỂN GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ NHÓM NAC LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62420116 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Phạm Xuân Hội Hà Nội – 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, đƣợc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của PGS.TS. Phạm Xuân Hội. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chƣa đƣợc tác giả nào công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình. Hà Nội, ngày 26 tháng 8 năm 2018 Nghiên cứu sinh Phạm Thu Hằng LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Phạm Xuân Hội (Viện Di truyền Nông nghiệp) là người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập, thực hiện và hoàn thành bản luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Phòng Sau Đại học, Ban Ch nhiệm Khoa Sinh học (Trường ĐH KHTN) và Ban lãnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi hoàn tất các th tục cần thiết trong quá trình học tập và thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trong Bộ môn Sinh lý thực vật Hóa sinh (Khoa Sinh học, Trường ĐH KHTN) đã giảng dạy trong suốt khóa học và tập thể cán bộ nghiên cứu c a Bộ môn Bệnh học Phân tử (Viện DTNN) và các bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến cho tôi để hoàn thành luận án tốt nghiệp này. Tôi xin được cảm ơn gia đình và người thân đã luôn ở bên cạnh tôi, quan tâm, cảm thông và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận án. Hà Nội ngày 26 tháng 8 năm 2018 Phạm Thu Hằng MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................... 1 DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... 6 DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ 7 MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 9 Chƣơng 1: TỔNG QUAN...................................................................................... 13 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY LÚA ..................................................................... 13 1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây lúa Oryza sativa ................................. 13 1.1.2. Ảnh hƣởng của hạn hán đối với ngành sản xuất lúa gạo ................. 14 1.1.3. Ảnh hƣởng của hạn tới cây lúa.................................................... 16 1.2. VAI TRÒ CỦA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN TỚI ĐÁP ỨNG STRESS HẠN Ở THỰC VẬT.................................................................................... 28 1.2.1. Vai trò của nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng stress hạn ở thực vật ......................................................................................................... 28 1.2.2. Nhân tố phiên mã NAC và vai trò đáp ứng stress hạn ở thực vật ..... 34 1.3. AGROBACTERIUM TUMEFACIENS VÀ CƠ CHẾ CHUYỂN GEN VÀO THỰC VẬT .................................................................................................................... 41 1.3.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn A. tumerfaciens............................... 41 1.3.2. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens ................ 42 1.3.3. Hệ thống vector/promoter dùng trong chuyển gen thực vật ............ 43 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG LÚA CHUYỂN GEN CHỐNG CHỊU HẠN ..................................................................................................................... 46 1.4.1. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chống chịu hạn trên Thế giới .................................................................................... 46 1 1.4.2. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen ở Việt Nam .......... 47 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 50 2.1. VẬT LIỆU ...................................................................................................................... 50 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................ 50 2.1.2. Chủng vi sinh vật ...................................................................... 50 2.1.3. Vector và oligonucleotide .......................................................... 50 2.1.4. Hóa chất ................................................................................... 51 2.1.5. Thiết bị .................................................................................... 52 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................. 52 2.2.1. Xử lý mẫu thực vật .................................................................... 52 2.2.2. Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA .............................................. 53 2.2.3. Nhân dòng gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 vào vector pGEM-T . 57 2.2.4. Thiết kế cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1 trong tế bào thực vật ....... 59 2.2.5. Tạo cây lúa chuyển gen biểu hiện OsNAC1 .................................. 61 2.2.6. Sàng lọc các dòng lúa chuyển gen ............................................... 63 2.2.7. Các phƣơng pháp định lƣợng sinh lý, sinh hóa ở cây lúa................ 64 2.2.8. Phƣơng pháp xử lý số liệu thống kê ............................................. 65 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THẢO LUẬN ....................................... 66 3.1. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ NHÓM NAC LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở LÚA .................................................................. 66 3.1.1. Khảo sát khả năng chịu hạn của một số giống lúa Việt Nam .......... 66 3.1.2. Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn.................................................................................... 67 2 3.1.3. Phân tích biểu hiện của OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 trong điều kiện hạn.................................................................................... 75 3.2. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNAC1 TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT 78 3.2.1. Thiết kế vector biểu hiện OsNAC1 điều khiển bởi promoter hoạt động liên tục ............................................................................. 78 3.2.2. Thiết kế vector biểu hiện OsNAC1 điều khiển bởi promoter hoạt động cảm ứng stress .......................................................................... 81 3.2. NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN OsNAC1 VÀO CÂY LÚA................................ 86 3.3.1. Biến nạp vector biểu hiện vào A. tumefaciens LBA4404 ................ 86 3.3.2. Nghiên cứu chuyển gen OsNAC1 vào lúa ..................................... 87 3.3.3. Sàng lọc các dòng lúa tái sinh đƣợc chuyển cấu trúc biểu hiện OsNAC1 ................................................................................... 91 3.3.4. Chọn lọc dòng lúa chuyển gen T1 ................................................ 94 3.3.5. Chọn lọc dòng lúa chuyển gen T2 ................................................ 96 3.4. ĐÁNH GIÁ SINH TRƢỞNG PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC DÒNG LÚA CHUYỂN GEN .............................................................. 100 3.4.1. Đánh giá sinh trƣởng, phát triển của các dòng lúa chuyển gen T2 . 100 3.4.2. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen............ 102 KẾT LUẬN ......................................................................................................... 117 KIẾN NGHỊ ........................................................................................................ 118 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ........................................................................................................... 119 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 120 PHỤ LỤC................................................................................................................ 1 3 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid ABA : Abscisic acid ABRE : Yếu tố đáp ứng acid abscisic chứa trình tự ACGT (ACGT-containing abscisic acid response element) AD : V ng tác động acting domain AMP : Adenosine monophosphate ATP : Adenosine triphosphate BAP : 6-Benzylaminopurine BD : V ng liên kết BĐKH : Biến đổi khí hậu bp : Cặp azơ (base pair) cDNA : DNA ổ sung (complementary deoxyribonucleic acid) Ct : Chu kỳ ngƣỡng (threshold cycle) DEPC : Diethylpyrocarbonate DMSO : Dimethyl sulfoxide dNTP : Deoxyribonucleoside Triphosphate DRE : Yếu tố đáp ứng hạn (dehydration responsive element) DREB : Protein liên kết với yếu tố đáp ứng hạn DRE inding domain (dehydration responsive element-binding protein) EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr : Ethidium bromide IPTG : Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kb : Kilobase LB : Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Luria-Bertani LEA : Protein hình thành trong giai đoạn phát triển muộn của phôi (late embryogenesis abundant) MCS : V ng nh n dòng đa điểm cắt (multiple cloning site) MOPS : Acid 3-(N-morpholino)propansulfonic 4 mRNA : Messenger ribonucleic acid MS : Môi trƣờng nuôi cấy thực vật Murashige & Skoog NAA : 1-naphthaleneacetic acid NAC : NAM/ATAF1/2/CUC2 NACRS : Trình tự nhận biết protein NAC (NAC recognition sequence) NST : Nhiễm sắc thể OD : Mật độ quang học (optical density) ORF : Khung đọc mở (open reading frame) PCR : Phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction) PEG : Polyethylene glycol RT-PCR : Phản ứng nhân bản DNA sao ch p ngƣợc reverse transcription polymerase chain reaction) ROS : Các chất oxy hoạt hóa (reactive oxygen species) RWC : Hàm lƣợng nƣớc tƣơng đối (relative water content) qRT-PCR : Phản ứng chuỗi trùng hợp định lƣợng thời gian thực (Real-time quantiative polymerase chain reaction) SDS : Sodium dodecyl sulfate TAE : Đệm Tris-acetate-EDTA TE : Đệm Tris-EDTA TF : Nhân tố phiên mã (transcription factor) Ti-plasmid : Plasmid gây khối u (tumor inducing plasmid) X-Gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside 5 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Chức năng của nhân tố phiên mã NAC .................................................. 40 Bảng 2.1: Trình tự cácoligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu. ......................... 50 Bảng 2.2: Thang điểm đánh giá khả năng chịu hạn của cây lúa theo IRRI ............. 52 Bảng 3.1: Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn một số giống lúa Việt Nam ........... 66 Bảng 3.2: Kết quả chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ............ 88 Bảng 3.3: Kết quả sàng lọc c y lúa tái sinh đƣợc chuyển gen OsNAC1 ....................... 91 Bảng 3.4: Kết quả xác định số lƣợng bản sao gen kháng Hygromycin trong cây lúa chuyển gen T0 ......................................................................................................... 93 Bảng 3.5: Kết quả sinh trƣởng của cây lúa chuyển gen T0 trong nhà lƣới............... 94 Bảng 3.6: Kết quả sàng lọc các dòng lúa chuyển gen T1 ........................................ 95 Bảng 3.7: Kết quả sinh trƣởng của các cây lúa chuyển gen đời T1 ......................... 96 Bảng 3.8: Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen dựa trên độ cuốn lá ..................................................................................................... 104 Bảng 3.9: Kết quả xác định hàm lƣợng nƣớc tƣơng đối trong dòng lúa chuyển gen ... 105 Bảng 3.10: Hàm lƣợng chất diệp lục a trong các dòng lúa chuyển gen ................. 107 Bảng 3.11: Hàm lƣợng chất diệp lục b trong các dòng lúa chuyển gen ................ 108 Bảng 3.12: Hàm lƣợng chất diệp lục tổng số trong các dòng lúa chuyển gen ....... 109 Bảng 3.13: Hàm lƣợng proline trong các dòng lúa ............................................... 111 Bảng 3.14: Kết quả so sánh tƣơng quan khả năng chịu hạn của các dòng lúa ....... 115 6 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Mạng lƣới các nhân tố phiên mã tham gia đáp ứng stress hạn .................... 29 Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc protein NAC ................................................................... 36 Hình 1.3: Mạng lƣới điều hòa phiên mã các gen đáp ứng stress phi sinh học của nhân tố phiên mã NAC ở lúa ................................................................................. 39 Hình 2.1: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pCAM-Rd29A/OsNAC1 và pCAMLip9/OsNAC1 ....................................................................................................... 60 Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pBI-35S/OsNAC và pBI-Ubi/OsNAC1 . 61 Hình 3.1: Tách chiết RNA tổng số từ mẫu lúa xử lý hạn ........................................ 68 Hình 3.2: Nhân bản gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 bằng kỹ thuật PCR ....... 70 Hình 3.3: Sàng lọc thể biến nạp bằng PCR trực tiếp khuẩn lạc .............................. 71 Hình 3.4: Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng PCR ................................................... 72 Hình 3.5. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn ........................... 73 Hình 3.6: Phân tích trình tự axit amin suy diễn của protein OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 của giống lúa Tẻ Đỏ.............................................................................. 75 Hình 3.7: Biểu hiện của OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 trong điều kiện hạn ...... 77 Hình 3.8: Xử lý vector pBI-Ubi, pBI-35S và pGEM/OsNAC1 bằng enzyme cắt giới hạn ........................................................................................................................ 79 Hình 3.9: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pBI-Ubi/OsNAC1 và pBI-35S/OsNAC1 80 Hình 3.10: Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pBI-Ubi/OsNAC1 và pBI-35S/OsNAC1 .. 81 Hình 3.11: Xử lý vector pCAM-Rd29A và pCAM-Lip9 bằng enzyme cắt giới hạn BamHI ........................................................................................................... 82 Hình 3.12: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pCAM-Rd29A/OsNAC1 và pCAMLip9/OsNAC1 ....................................................................................................... 83 Hình 3.13: Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pCAM-Rd29A/OsNAC1 và pCAM-Lip9 /OsNAC1 bằng PCR và cắt giới hạn ...................................................................... 84 Hình 3.14: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pCAM-Rd/OsNAC1, pBI-35S/OsNAC1, 7 pBI-Ubi/OsNAC1 và pCAM-Lip9/OsNAC1 ......................................................... 86 Hình 3.15: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pBI101 và pCAMBIA1301 .................. 87 Hình 3.16: Chuyển cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1 vào lúa .................................. 90 Hình 3.17: Biểu hiện của OsNAC1 trong các dòng lúa chuyển gen Ubi:OsNAC1.......... 98 Hình 3.18: Biểu hiện của OsNAC1 trong các dòng lúa chuyển gen Lip9:OsNAC1 . 99 Hình 3.19: Đánh giá khả năng sinh trƣởng của các dòng lúa chuyển gen .............. 101 Hình 3.20: Các dòng lúa sau 2 tuần xử lý hạn ...................................................... 103 Hình 3.21: Ảnh hƣởng của hạn đến sự tích tụ H2O2 trong lá lúa .......................... 112 Hình 3.22: Khả năng phục hồi của các dòng lúa chuyển gen và dòng đối chứng sau xử lý hạn ............................................................................................................. 113 8 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Dƣới tác động của iến đổi khí hậu toàn cầu, tình trạng hạn hán xảy ra thƣờng xuyên hơn, với mức độ ngày càng trầm trọng, là nguyên nhân chính làm giảm sản lƣợng c y trồng. Trong khi đó, d n số toàn cầu tăng nhanh, ƣớc tính năm 2050 sẽ tăng lên 9 tỷ ngƣời, ảnh hƣởng nghiêm trọng đến an ninh lƣơng thực, tạo ra một áp lực lớn cho việc đảm ảo lƣơng thực. Vì vậy, an ninh lƣơng thực là vấn đề then chốt của nền khoa học nông nghiệp thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Lúa (Oryza sativa L.) là một trong a loại c y lƣơng thực quan trọng nhất của con ngƣời. Trên thế giới, c y lúa đƣợc xếp vào vị trí thứ 2 sau c y lúa mì về diện tích và sản lƣợng. Ở Việt Nam, cây lúa có vai trò đặc iệt quan trọng, chiếm tỉ lệ cao nhất trong tổng sản lƣợng lƣơng thực quốc gia 60% và đƣợc canh tác với diện tích lớn nhất xấp xỉ 3,8 triệu ha . Tuy nhiên, hầu hết diện tích trồng lúa đang đƣợc canh tác trong môi trƣờng ấp ênh, rất dễ ị tác động ởi các yếu tố thời tiết cực đoan, đặc iệt là hạn. Chính vì vậy, việc nghiên cứu ph n lập và đặc tính các gen đáp ứng hạn, tiến tới tạo dòng/giống lúa có năng suất cao, đồng thời chống chịu đƣợc với điều kiện ất lợi ngoại cảnh hạn có ý nghĩa quan trọng đặc iệt trong việc duy trì và tăng năng suất lúa gạo, góp phần giữ ổn định an ninh lƣơng thực quốc gia. Tốc độ tăng năng suất lúa đã có hiện tƣợng bão hòa trong những năm gần đ y chủ yếu do sự thiếu vắng những công nghệ nhân giống mới, sự giảm sút tính đa dạng di truyền các giống lúa và sự xuất hiện ngày càng nhiều côn trùng, dịch bệnh và bất lợi ngoại cảnh. Trong xu thế đô thị hóa đang diễn ra mọi nơi, nếu chỉ sử dụng các phƣơng pháp truyền thống trong việc tăng năng suất lúa thì sản lƣợng lúa gạo của Việt Nam không thể đáp ứng đƣợc tốc độ tăng d n số và nhu cầu xuất khẩu. Do đó, đã đến lúc chúng ta phải kết hợp giữa phƣơng pháp truyền thống và công nghệ sinh học trong chọn tạo giống lúa mang các tính trạng quý nhƣ chống chịu hạn, 9 mặn… Trong khi các phƣơng pháp chọn giống truyền thống vẫn là chỗ dựa chủ yếu để duy trì sự ổn định thì các phƣơng pháp công nghệ sinh học hiện đại sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc hiện thực hóa ƣớc nhảy vọt trong chọn tạo giống lúa. Tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen mà sự iểu hiện của mỗi gen liên quan chặt chẽ với quá trình phiên mã. Vì vậy, nhóm gen mã hóa nh n tố phiên mã đang là trọng t m trong các nghiên cứu chọn tạo giống chịu hạn theo định hƣớng chuyển gen. Nhóm gen mã hóa nh n tố phiên mã mặc d không tham gia trực tiếp vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn nhƣng sự iểu hiện của chúng lại có vai trò điều hòa iểu hiện của rất nhiều gen chức năng tăng cƣờng khả năng chịu hạn của thực vật. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh c y lúa chuyển gen mã hóa nh n tố phiên mã tăng cƣờng khả năng chịu hạn so với c y không chuyển gen. Nhóm gen mã hóa nh n tố phiên mã NAC là họ nh n tố phiên mã lớn nhất và đặc trƣng của thực vật. Nh n tố phiên mã NAC tham gia vào rất nhiều quá trình sinh lý, sinh hóa khác nhau trong tế ào, ao gồm các quá trình phát triển, già hóa, tạo thành tế ào thứ cấp và đáp ứng chống chịu stress môi trƣờng nhƣ hạn, mặn và lạnh của tế ào. Một số gen đáp ứng stress thuộc nhóm NAC ở lúa nhƣ SNAC1/OsNAC9, SNAC2/OsNAC6, OsNAC5 và OsNAC10 đã đƣợc chứng minh có liên quan tới quá trình đáp ứng hạn và c y lúa chuyển các gen tăng khả năng chịu hạn và năng suất cao hơn so với c y không chuyển gen trong điều kiện hạn. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài luận án tiến sĩ “Nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan đến tính chịu hạn” với mục tiêu tạo ra các dòng lúa chuyển gen chống chịu hạn, đồng thời không g y ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng, phát triển. Các kết quả thu đƣợc sẽ là nguồn vật liệu, số liệu quan trọng trong việc tạo ra các giống cây trồng chuyển gen có khả năng chống chịu tốt với điều kiện hạn. Mục tiêu nghiên cứu Ph n lập, thiết kế vector chuyển gen mã hóa nh n tố phiên mã nhóm NAC liên 10 quan tính chịu hạn từ giống lúa Việt Nam. Tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nh n tố phiên mã thuộc nhóm NAC có khả năng chống chịu hạn. Đối tƣ ng v nội dung nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của luận án: Các gen mã hóa nh n tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn của giống lúa Việt Nam. ác n i ung nghiên cứu ch nh  Nội dung 1: Ph n lập các gen mã hóa nh n tố phiên mã nhóm NAC gồm OsNAC1, OsNAC5, OsNAC10 liên quan đến tính chịu hạn từ giống lúa Việt Nam;  Nội dung 2: Thiết kế các cấu trúc iểu hiện gen OsNAC1 ở thực vật dƣới sự điều khiển của promoter hoạt động liên tục Ubiquitine, 35S và hoạt động cảm ứng stress (Lip9, Rd29A).  Nội dung 3: Nghiên cứu chuyển gen mã hóa nh n tố phiên mã OsNAC1 vào lúa.  Nội dung 4: Đánh giá sinh trƣởng, phát triển và khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen. Địa điểm nghiên cứu Luận án đƣợc thực hiện tại 3 địa điểm chính: Bộ môn Bệnh học Ph n tử, Viện Di truyền Nông nghiệp Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam ; Phòng Thí nghiệm Việt – Pháp, Viện Di truyền Nông nghiệp Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam ; Phòng Thí nghiệm tƣơng tác c y trồng - vi sinh vật thuộc Trung t m nghiên cứu vì sự phát triển tại Montpellier, Pháp. Đóng góp mới của luận án Luận án đã ph n lập đƣợc 3 gen mã hóa nh n tố phiên mã nhóm NAC gồm OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 từ giống lúa ản địa Việt Nam lúa Tẻ Đỏ . Luận án đã tạo đƣợc các hệ vector iểu hiện trong tế ào thực vật mang gen OsNAC1 đƣợc điều khiển ởi promoter hoạt động liên tục Ubiquitin và 35S) và promoter 11 hoạt động cảm ứng stress (Lip9 và Rd29A . Luận án đã tạo đƣợc một số dòng lúa chuyển gen iểu hiện gen đích, sinh trƣởng ình thƣờng trong điều kiện không xử lý hạn và có khả năng chịu hạn tốt hơn c y đối chứng không chuyển gen. Ứng dụng thực tiễn của luận án Kết quả nghiên cứu của luận án đã tạo ra đƣợc các dòng lúa T2 mang một ản sao của gen OsNAC1 ở dạng đồng hợp iểu hiện dƣới sự điều khiển của promoter hoạt động cảm ứng điều kiện stress Lip9 và promoter hoạt động liên tục Ubiquitin. C y chuyển gen có kiểu hình tƣơng đồng với c y đối chứng không chuyển gen về khả năng sinh trƣởng, phát triển và năng suất trong điều kiện ình thƣờng không có stress hạn, trong khi khả năng chịu hạn và tỷ lệ sống sót cao hơn trong điều kiện xử lý stress hạn. Đ y là kết quả quan trọng, chứng tỏ tiềm năng ứng dụng của gen OsNAC1 nói riêng và các gen mã hóa nh n tố phiên mã thuộc nhóm NAC liên quan tới đáp ứng stress nói chung trong công tác tạo giống c y chuyển gen chịu hạn. Trên cơ sở kết quả của luận án, các vector iểu hiện gen OsNAC1 do luận án tạo ra đang đƣợc nghiên cứu chuyển vào các giống c y trồng quan trọng nhƣ ngô, bông, đậu tƣơng… để tạo ra các giống c y chuyển gen chịu hạn nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết của sản xuất trong điều kiện thay đổi khí hậu toàn cầu ở Việt Nam. 12 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY LÚA 1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây lúa Oryza sativa Lúa Oryza sativa thuộc bộ Hòa thảo (Graminales), họ Hòa thảo (Graminaceae), chi Oryza. Chi Oryza phân bố rộng trên thế giới, trong đó có 23 loài hoang dã và 2 loài lúa trồng (O. sativa và O. glaberrima). Loài Oryza sativa L. (2n = 24 đƣợc trồng phổ biến trên thế giới, tập trung chủ yếu ởcác quốc gia châu Á. Dựa vào đặc điểm hình thái, Kato và cộng sự 1928 đã đề nghị phân chia lúa Oryza sativa L. thành 2 loài phụ là Oryza sativa L. indica (lúa Indica) và Oryza sativa L. japonica (lúa Japonica). Lúa Indica thƣờng phân bố ở vĩ độ thấp nhƣ Ấn Độ, Việt Nam, Indonexia… cây cao, lá nhỏ xanh nhạt, bông xòe, hạt dài, vỏ trấu mỏng, cơm khô, nở nhiều,… Lúa Japonica thƣờng phân bố ở vĩ độ cao nhƣ: Nhật Bản, Bắc Trung Quốc, ch u Âu… cây thấp, lá to xanh đậm, bông chụm, hạt ngắn, vỏ trấu dày, cơm dẻo, ít nở…[28]. Lúa có kiểu hình đa dạng, đƣợc trồng ở cả hệ sinh thái vùng cao và vùng thấp. Tuy nhiên, khoảng 76% sản lƣợng gạo toàn cầu đƣợc sản xuất từ lúa nƣớc ở hệ sinh thái v ng đất trũng. Theo IRRI (2002), sự phát triển của c y lúa đƣợc chia thành a giai đoạn, bao gồm: sinh dƣỡng (vegetative), sinh sản (reproductive) và chín (ripening). Tiềm năng năng suất lúa đƣợc hình thành/xác định trong giai đoạn sinh dƣỡng. Chiều cao cây, khả năng đẻ nhánh liên quan đến số lƣợng bông), sự phát triển của rễ, diện tích lá là những đặc điểm chính của giai đoạn sinh trƣởng. Kích thƣớc và hình thái ông đƣợc quyết định trong giai đoạn sinh sản, trong khi kích thƣớc hoặc khối lƣợng của hạt đƣợc quyết định trong giai đoạn chín. Giai đoạn sinh sản đƣợc xác định là giai đoạn cây lúa nhạy cảm nhất với stress sinh học và phi sinh học, ảnh hƣởng trực tiếp đến năng suất hạt sau này [71]. Thời gian sinh trƣởng của c y lúa đƣợc tính từ lúc nảy mầm cho đến khi chín, dao động từ 90 - 180 ngày tùy theo giống và điều kiện ngoại cảnh. Trong canh 13 tác lúa hiện đại, thời gian sinh trƣởng của các giống lúa đƣợc các nhà nông học quan tâm đặc biệt do liên quan trực tiếp đến năng suất và cơ cấu thời vụ, luân canh. Giống lúa có thời gian sinh trƣởng quá ngắn hoặc quá dài có năng suất thấp do sinh trƣởng dinh dƣỡng bị hạn chế đối với giống lúa có thời gian sinh trƣởng quá ngắn), dễ bị lốp đổ và chịu nhiều tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh đối với giống lúa có thời gian sinh trƣởng quá dài). Ngƣợc lại, các giống có thời gian sinh trƣởng trung bình trong khoảng 120 - 135 ngày có khả năng cho năng suất cao hơn nhiều. Giống lúa sinh trƣởng dài ngày tạo ra lƣợng chất khô lớn nhƣng tỷ lệ hạt/rơm rạ thấp, riêng các giống lúa có thời gian sinh trƣởng từ 130 - 150 ngày, tỷ lệ hạt/rơm rạ đạt cao nhất [78]. Đẻ nhánh là tính trạng số lƣợng, có hệ số di truyền thấp cho đến trung bình và chịu ảnh hƣởng rõ rệt của điều kiện ngoại cảnh. Trong quá trình sinh trƣởng, nhánh lúa đƣợc hình thành từ các mầm trên thân. Các giống lúa khác nhau có thời gian đẻ nhánh khác nhau. Khả năng đẻ nhánh có ý nghĩa đáng kể đối với năng suất sau này của cây lúa [69]. Chiều cao cây lúa cũng là một chỉ tiêu hình thái có liên quan đến một số chỉ tiêu sinh trƣởng khác, đặc biệt là khả năng chống đổ của cây lúa. Các nhà khoa học ở Viện nghiên cứu lúa quốc tế IRRI đã chứng minh các giống lúa lùn có nguồn gốc từ Trung Quốc mang gen lùn là gen lặn không ảnh hƣởng đến chiều dài bông lúa, có ý nghĩa rất quan trọng trong công tác chọn tạo giống [69]. 1.1.2. Ảnh hƣởng của hạn hán đối với ngành sản xuất lúa gạo Lúa gạo là c y lƣơng thực chính của ngƣời dân châu Á. Mặc dù năng suất lúa gạo đã tăng lên theo thời gian sau cuộc cách mạng xanh. Những năm gần đ y, do tác động của biến đổi khí hậu đặc biệt là hạn hán thƣờng xuyên xảy ra làm ảnh hƣởng không nhỏ đến sự tăng năng suất lúa gạo. Ít nhất 23 triệu ha trồng lúa (20% tổng diện tích trồng lúa) ở châu Á chịu ảnh hƣởng của hạn hán [105]. Hạn hán đã gây ra sự thiếu hụt lƣơng thực ở nhiều mức độ khác nhau, dẫn đến nạn đói xảy ra ở các khu vực khác nhau của châu Á và châu Phi. Ở Ấn Độ, hạn hán những năm 14 1918, 1957 - 1958 và 1965 đã dẫn đến nạn đói trong thế kỷ XX [46]. Hạn hán năm 1987 đã ảnh hƣởng đến gần 60% tổng diện tích trồng trọt và 285 triệu ngƣời trên khắp Ấn Độ [132]. Tƣơng tự, khu vực bị ảnh hƣởng hạn hán hàng năm trung ình ở Trung Quốc trong giai đoạn 1978 - 2003 đƣợc ƣớc tính là 14 triệu ha và chi phí kinh tế trực tiếp xử lý hạn hán chiếm khoảng 0,5% - 3,3% GDP của ngành nông nghiệp Trung Quốc. Ở Thái Lan, hạn hán năm 2004 ƣớc tính đã ảnh hƣởng đến 2 triệu ha diện tích trồng và hơn 8 triệu ngƣời [22]. Mới đ y, Bộ Nông nghiệp Mỹ đã công ố số liệu cho thấy, lƣợng gạo tồn kho tại ba quốc gia xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới là Thái Lan, Ấn Độ và Việt Nam sẽ giảm xuống còn khoảng 19 triệu tấn vào cuối năm 2016. Đ y là mức giảm lớn nhất kể từ năm 2003 trở lại đ y. Việc nguồn cung không đƣợc đảm bảo sẽ tác động đến an ninh lƣơng thực của 7,2 tỷ ngƣời trên thế giới. Gánh nặng này càng tăng nếu dân số thế giới tăng lên 9,6 tỷ ngƣời vào năm 2050. Điều này đồng nghĩa với việc sản xuất nông nghiệp cần phải tăng 70% để đáp ứng nhu cầu thực phẩm của ngƣời dân. Liên hợp quốc cảnh báo, nếu nguồn cung lƣơng thực không đƣợc đảm bảo, thế giới sẽ có thêm 60 triệu ngƣời nữa bị thiếu ăn cùng với gần 1 tỷ ngƣời suy dinh dƣỡng vào năm 2020 [162]. Việt Nam là một trong số các quốc gia bị tác động nặng nề nhất bởi biến đổi khí hậu. Sự xuất hiện thƣờng xuyên của hạn hán tiếp tục đe dọa nghiêm trọng đến nền sản xuất lúa gạo trong nƣớc [134]. Theo dự báo của FAO, do tác động của hạn hán, sản lƣợng lúa gạo hai vụ xuân và vụ mùa trên khắp cả nƣớc, đặc biệt là v ng đồng bằng sông Hồng sẽ có xu hƣớng giảm dần, có thể giảm tới 12,5% vào năm 2050 và 16,5% vào năm 2070. Hệ quả của các tác động này là áp lực ngày càng tăng đối với giá lúa gạo trên thị trƣờng thế giới do Việt Nam là một trong những nƣớc xuất khẩu gạo quan trọng nhất trên thế giới. Chính vì vậy, các chính sách tăng trƣởng xanh và toàn diện trong ngành nông nghiệp để đối phó với hạn hán phải đƣợc chính phủ xem là vấn đề trọng tâm cần giải quyết và cần có sự tham gia của tất cả các thành phần trong xã hội [163]. 15 1.1.3. Ảnh hƣởng của hạn tới cây lúa Cây lúa đòi hỏi lƣợng nƣớc lớn hơn rất nhiều so với các c y trồng khác trong suốt chu kỳ sống. Trung ình để sản xuất 1 kg hạt lúa cần 3.000 – 5.000 lít nƣớc, trong khi để sản xuất 1 kg hạt lúa mỳ hoặc ngô thì lƣợng nƣớc chỉ cần khoảng ½. Chính vì vậy, hạn hán luôn là mối đe dọa nghiêm trọng đối với nền sản xuất lúa gạo. Hạn ảnh hƣởng tiêu cực đến c y lúa ở tất cả các đặc điểm, ao gồm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân tử. Qua đó, hạn ảnh hƣởng tới năng suất c y lúa [144]. 1.1.3.1. Ảnh hưởng của hạn tới đặc điểm hình thái C y lúa khi tiếp xúc với hạn ị giảm khả năng hấp thu nƣớc ở rễ, đồng thời tăng tỷ lệ thoát hơi nƣớc, dẫn tới suy giảm quá trình sinh trƣởng, phát triển và cuối cùng là giảm năng suất. Khi hạn xảy ra, cây lúa phản ứng ằng cách làm chậm hoặc ngừng sinh trƣởng. Đ y là phản ứng ình thƣờng giúp cây lúa giảm sự mất nƣớc, đóng vai trò nhƣ một cơ chế sống sót. Khi đó, c y lúa có những thay đổi hình thái linh hoạt nhằm giảm thiểu sự mất nƣớc, đồng thời duy trì lƣợng nƣớc hấp thụ vào cơ thể. Ở mức độ hình thái, lá và rễ là hai cơ quan ị ảnh hƣởng nặng nề nhất và cả hai cơ quan này đều có vai trò quan trọng đối với khả năng thích nghi điều kiện hạn của cây lúa. Chính vì vậy, sự iến đổi kiểu hình trong điều kiện hạn của cây lúa thể hiện rõ nhất ở hai ộ phận này. Lá đòng đóng vai trò quan trọng duy trì sự tổng hợp và vận chuyển sản phẩm quang hợp trong điều kiện hạn ở c y lúa. Dƣới điều kiện hạn, năng suất và đặc điểm lá đòng có mối tƣơng quan dƣơng. Chính vì vậy, các đặc điểm nhƣ diện tích, hàm lƣợng nƣớc tƣơng đối, hàm lƣợng chlorophyll,... của lá đòng đƣợc đề xuất trong chọn tạo giống lúa chống chịu hạn [39]. Cuốn lá là một trong những đáp ứng ở c y lúa trong điều kiện hạn. Nếu sức trƣơng tế ào duy trì dƣới điều kiện thiếu nƣớc thì độ cuốn lá diễn ra chậm. Tuy nhiên, dƣới điều kiện thiếu nƣớc nghiêm trọng, độ cuốn lá tăng, dẫn đến ngăn ngừa sự thoát hơi nƣớc và mất nƣớc, giúp duy trì thế nƣớc trong tế ào. Do đó, cuốn lá là một phản ứng thích nghi của c y lúa dƣới điều 16