Tài liệu Nghiên cứu sự đa dạng và khả năng sinh cellulase của một số chủng xạ khuẩn ở xuân hòa, phúc yên, vĩnh phúc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 TRẦN THÙY DUYÊN NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN Ở XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 TRẦN THÙY DUYÊN NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN Ở XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC Chuyên ngành: Sinh thái học Mã số: 60 42 01 20 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG HÀ NỘI, 2014 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung và các thầy cô phòng Vi sinh, phòng sau đại học, khoa Sinh KTNN đã tận tình giúp đỡ em trong thời gian qua. Em xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh KTNN, các thầy cô giáo giảng dạy và hướng dẫn đã tạo điều kiện cho em thực hiện và hoàn thành luận văn. Cảm ơn tất cả các bạn học viên đã giúp đỡ tôi để hoàn thành khóa luận một cách tốt đẹp. Xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã giúp đỡ, động viên để em vững tin hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên Trần Thùy Duyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài: “Nghiên cứu sự đa dạng và khả năng sinh cellulase của một số chủng xạ khuẩn ở Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc”, là do tôi thực hiện không có sự trùng lặp với các tác giả khác. Tôi xin cam đoan những gì tôi viết trong luận văn này đều là sự thật. Đây là kết quả nghiên cứu của riêng tôi. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả đã công bố. Trong tài liệu này tôi có sử dụng tài liệu của một số tác giả, tôi xin phép tác giả để bổ sung cho luận văn của mình. Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Hà Nội, ngày tháng Học viên Trần Thùy Duyên năm 2014 MỤC LỤC Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Ký hiệu viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình MỞ ĐẦU................................................................................................................1 1. Lý do chọn đề tài ................................................................................................1 2. Mục đích nghiên cứu..........................................................................................2 3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................2 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu......................................................................2 5. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................2 6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn............................................................................3 7. Đóng góp mới của đề tài ....................................................................................3 Chương 1 ................................................................................................................4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................4 1.1. Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn .....................................................................4 1.1.1. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn .................................................................4 1.1.3. Vai trò của xạ khuẩn ..................................................................................13 1.2. Nhu cầu dinh dưỡng của xạ khuẩn................................................................14 1.2.1. Nhu cầu cacbon..........................................................................................14 1.2.2. Nhu cầu nitơ ...............................................................................................15 1.3. Cellulose và Cellulase ...................................................................................15 1.3.1. Cellulose .....................................................................................................15 1.3.2. Cellulase .....................................................................................................17 1.4. Triển vọng và ứng dụng của cellulase ..........................................................20 1.4.1. Trên thế giới ...............................................................................................21 1.4.2. Ở Việt Nam .................................................................................................22 Chương 2 ..............................................................................................................24 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................24 2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ......................................................................24 2.1.1. Vật liệu .......................................................................................................24 2.1.2. Hóa chất - Thiết bị .....................................................................................24 2.2. Môi trường ....................................................................................................24 2.2.1. Môi trường phân lập xạ khuẩn...................................................................24 2.2.2. Môi trường bảo quản và giữ giống ............................................................25 2.2.3. Môi trường thử hoạt tính enzyme ...............................................................25 2.3. Phương pháp nghiên cứu...............................................................................26 2.3.1. Phương pháp lấy mẫu ................................................................................26 2.3.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn từ mẫu ...................................................27 2.3.3. Phương pháp bảo quản chủng giống .........................................................27 2.3.4. Phương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn ................................................27 2.3.5. Phương pháp xác định hoạt tính Cellulase của xạ khuẩn .........................28 2.3.6. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu ......................................................29 Chương 3 ..............................................................................................................31 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................................................31 3.1. Phân lập, tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn trong cỏ khô ủ đốt tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc ........................................................................31 3.2. Đánh giá mức độ đa dạng sinh học của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu.....34 3.3. Nghiên cứu khả năng sinh cellulase của các chủng xạ khuẩn ......................38 3.4. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy của chủng xạ khuẩn X3 43 3.4.1. Đặc điểm hình thái .....................................................................................43 3.4.2. Tính chất nuôi cấy ......................................................................................45 3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính sinh cellulose của chủng xạ khuẩn X3 ............................................47 3.5.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon ...................................................................47 3.5.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ.........................................................................49 3.5.3. Ảnh hưởng của pH .....................................................................................50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................52 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................53 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BG : Bột giấy C1 : Exoglucanse Cx : Endoglucanse CMC : Cacboxyl methyl cellulose CS : Cộng sự HSCC : Hệ sợi cơ chất HSKS : Hệ sợi khí sinh ADN : Deoxyribonucelic acid ISP : International Streptomyces project MT : Môi trường ARN : Ribonucleic acid VSV : Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Các chủng xạ khuẩn phân lập từ cỏ khô ủ đốt.............................. 34 Bảng 3.2. Phân nhóm xạ khuẩn dựa theo đặc điểm của chuỗi bào tử ............ 37 Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trường chứa 1% CMC .... 40 Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trường chứa 1% BG ....... 41 Bảng 3.5. Hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn đã phân lập ............... 42 Bảng 3.6 . Khả năng đồng hóa nguồn cacbon chủng xạ khuẩn X3...................... 47 Bảng 3.7. Khả năng sinh enzyme ngoại bào chủng xạ khuẩn X3................... 47 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tự nhiên đến hoạt tính cellulase của chủng xạ khuẩn X3 ............................................................... 50 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính cellulase của chủng xạ khuẩn X3.......................................... 50 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính cellulase của chủng xạ khuẩn X3 ..................................................................................... 52 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Công thức hóa học của cellulose ................................................... 16 Hình 1.2. Tác dụng của từng enzyme trong cellulase.................................... 18 Hình 1.3. Sơ đồ quá trình thủy phân cellulose theo Erickson, 1973 .............. 19 Hình 3.1. Khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập ở môi trường Gause I độ pha loãng 10-5 .....33 Hình 3.2. Xạ khuẩn trên thạch nghiêng ........................................................ 33 Hình 3.3. Xạ khuẩn trên đĩa petri.................................................................. 34 Hình 3.4. Hình ảnh chuỗi bào tử của một số xạ khuẩn ................................. 36 Hình 3.5. Hoạt tính cellulase của chủng xạ khuẩn X3 ................................... 43 Hình 3.6. Hoạt tính cellulase của một số chủng xạ khuẩn ............................. 43 Hình 3.7. Khuẩn lạc của chủng X3 ............................................................... 44 Hình 3.8. Màu sắc hệ sợi của chủng X3 ........................................................ 45 Hình 3.9. Cuống sinh bào tử và bào tử của chủng X3.................................... 46 Hình 3.10. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng xạ khuẩn X3 .......... 48 Hình 3.11. Môi trường chứa nguồn cacbon tự nhiên..................................... 49 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Ngày nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng ở hầu hết trong các lĩnh vực công nghiệp chế biến như: công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất phân bón, chăn nuôi, y tế... Cellulase là một trong những enzyme được sử dụng phổ biến trong nhiều nghành chế biến, đặc biệt là các chế phẩm được ứng dụng trong xử lý rác thải nhằm rút ngắn thời gian phân hủy, khép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên, đồng thời góp phần cải tảo đất và bảo vệ môi trường. [29], [30]. Cellulase được sinh tổng hợp bởi nhiều loài khác nhau như: các loài xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm mốc, nấm men và động vật nguyên sinh. Trong số các nhóm vi sinh vật nêu trên thì xạ khuẩn phân giải cellulose là một trong những đối tượng đã và đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm. Xạ khuẩn trong đất là một trong các nhóm sinh vật đất có số lượng lớn. Chúng chiếm tới 10 - 70 % số tế bào vi sinh vật trong đất. Ở môi trường trung tính xạ khuẩn phát triển mạnh nhất trong đất giàu hữu cơ và thông thoáng. Xạ khuẩn có vai trò phân giải chất hữu cơ và nhất là phân giải đường tan trong nước, hemicellulose và cellulose. Xạ khuẩn tham gia vào quá trình hình thành các acid mùn. Một vài loài xạ khuẩn có khả năng cố định nitơ tự do từ khí trời khi cộng sinh với thực vật thuộc bộ đậu. Xạ khuẩn là vi sinh vật tạo ra kháng sinh chủ yếu (tới 80 % chất kháng sinh) vì thế trong đất có nhiều xạ khuẩn cây trồng ít bị bệnh hơn [7]. Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc là khu vực có hệ sinh thái đa dạng với dạng địa hình đồng bằng xen lẫn đồi núi và hồ vực là cơ sở cho đa dạng về thành phần và số lượng các loài sinh vật, trong đó có xạ khuẩn. Đã có một số 2 tác giả nghiên cứu nhóm xạ khuẩn trong đất có khả năng phân hủy cellulose tại khu vực Xuân Hòa, như Hà Thị Thu Hằng (2013), Nguyễn Thị Minh Nguyêt (2013) [3], [4]. Tuy nhiên việc khảo sát sự đa dạng của các chủng xạ khuẩn ở đây chưa được thực hiện. Xuất phát từ những lý do trên, tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu sự đa dạng và khả năng sinh cellulase của một số chủng xạ khuẩn ở Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc". 2. Mục đích nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn, đánh giá mức độ đa dạng của các chủng xạ khuẩn và khả năng sinh cellulase của chúng tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Phân lập, tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có trong cỏ khô ủ đốt tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc. 3.2. Đánh giá mức độ đa dạng sinh học của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu. 3.3. Nghiên cứu khả năng sinh cellulase của các chủng xạ khuẩn. 3.4. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy của chủng xạ khuẩn X3. 3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính sinh cellulase của chủng xạ khuẩn X3. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4.1. Đối tượng nghiên cứu Một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose có trong cỏ khô ủ đốt. 4.2. Phạm vi nghiên cứu Tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc. 5. Phương pháp nghiên cứu 5.1. Phương pháp lấy mẫu 5.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn 5.3. Phương pháp bảo quản chủng giống 3 5.4. Phương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn 5.5. Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh lý hóa sinh của xạ khuẩn 5.6. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase của xạ khuẩn 5.7. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 6.1. Ý nghĩa khoa học Việc nghiên cứu các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy giúp tìm ra môi trường thích hợp nhất cho xạ khuẩn phát triển. Xác định được mức độ đa dạng sinh học của nhóm xạ khuẩn, vai trò của chúng với hệ sinh thái khu vực, Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính enzyme cellulase cao. Kết quả nghiên cứu này là cơ đưa ra biện pháp giảm thiểu và khắc phục ô nhiễm môi trường. 6.2. Ý nghĩa thực tiễn Góp phần đem lại cho con người những hiểu biết về đời sống tự nhiên của vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng. Tạo cơ sở cho phương thức canh tác (cày xới, cải tạo đất, bón phân, luân canh, xen canh…) theo hướng lợi dụng vi sinh vật phân giải cellulose, tăng cường phân giải các hợp chất hữu cơ làm giàu dinh dưỡng cho đất, tăng năng suất cây trồng 7. Đóng góp mới của đề tài Đây là những kết quả nghiên cứu đầu tiên khảo sát sự có mặt của một số chủng xạ khuẩn có trong cỏ khô ủ đốt và bước đầu đánh giá mức độ đa dạng sinh học của chúng tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc. 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn 1.1.1. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 1.1.1.1. Đặc điểm hình thái xạ khuẩn * Khuẩn lạc Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống sinh bào tử). Hệ thống sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng 0,2-1µm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [10], [15]. Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường rắn chắc, xù xì, có thể có dạng da, dạng phấn, dạng nhung, dạng vôi phụ thuộc vào kích thước của bào tử. Trường hợp không có HSKS khuẩn lạc thường có dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh. Kích thước và hình dạng khuẩn lạc có thể thay đổi tùy loài và điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm… Đường kính mỗi khuẩn lạc 0,5 - 2mm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1cm hoặc lớn hơn. Khuẩn lạc thường có dạng phóng xạ. Một số có dạng vòng tròn đồng tâm cách nhau một khoảng nhất định. Nguyên nhân của những vòng tròn đồng tâm là do xạ khuẩn sinh ra chất ức chế sinh trưởng. Khi sợi mọc qua vùng này chúng sinh trưởng yếu đi, qua được vùng cơ chất ức chế chúng lại sinh trưởng mạnh thành vòng tiếp theo, vòng này lại sinh ra chất ức chế sinh trưởng sát với nó khiến khuẩn ty phát triển yếu đi. Cứ như thế tạo thành các vòng tròn đồng tâm[7]. 5 Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: chất kháng sinh, độc tố, enzyme, vitamin, axit hữu cơ… có thể được tích lũy trong sinh khối tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường. *Hệ sợi Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại phát triển trên bề mặt môi trường tạo thành bề mặt của khuẩn lạc xạ khuẩn, từ đây phát sinh ra bào tử gọi là HSKS (khuẩn ty khí sinh - aerial mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng. Sợi cơ chất sinh ra sắc tố thấm vào môi trường, sắc tố này thường có màu sắc khác với màu sắc của HSKS. Đây cũng là đăc điểm phân loại xạ khuẩn quan trọng. Một số xạ khuẩn không có HSKS mà chỉ có HSCC, loại sợi này cho bề mặt xạ khuẩn nhẵn và khó tách ra khỏi môi trường khi cấy truyền. Loại chỉ có sợi khí sinh thì ngược lại, rất dễ tách toàn bộ khuẩn lạc ra khỏi môi trường. Khi nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trường dịch thể, xạ khuẩn có thể mọc thành dạng màng, hay dạng vòng trên thành bình nuôi cấy, trên bề mặt môi trường hay thành dạng bọt kết tủa kiểu vi khuẩn. Khi nuôi cấy chìm trên máy lắc hoặc nồi lên men khuấy đảo thì xạ khuẩn phát triển thành dạng sợi bông hoặc cặn xốp. Nhưng thường gặp hơn cả là xạ khuẩn phát triển thành những quả cầu nhỏ chứa đầy môi trường, kích thước từ 0,1 đến 2 - 3mm. 1.1.1.2. Cấu tạo xạ khuẩn Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập. Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng sợi, dày 10 - 20nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: lớp 6 ngoài cùng dày khoảng 60 - 120A0, khi già có thể đạt tới 150 - 200A0, lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50A0, lớp trong dày khoảng 50A0. Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N- acetylglucozamin liên kết với N - acetyl muramic bởi các liên kết 1,4-glucoside. Khi xử lý bằng lyzozyme, các liên kết 1,4-glucoside bị cắt đứt, thành tế bào bị phá huỷ tạo thành thể hình cầu (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ khi xử lý tế bào với hỗn hợp este chlorofom và các dung môi hoà tan lipid khác. Nguyên nhân là do lớp ngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipid (thành HSKS có nhiều lipid hơn so với HSCC) khác với nấm. Thành tế bào xạ khuẩn không chứa xenllulose và kitin nhưng chứa nhiều enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào [18], [19]. Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm chính [17], [7]. Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 Diaminopimelic (L - ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này. Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic (m - ADP) và glyxin. Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic. Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic, đường arbinose và galactose. Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipid và protein. Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn. Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với tế bào vi khuẩn. Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezoxom 7 và các thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm sudan III và các hạt polysaccharide bắt màu với dung dịch lugol). Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote ở chỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong ADN, thường lớn hơn 50%, trong khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 - 45% [10]. Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dương nên ngoài yếu tố di truyền trong nhiễm sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có thể tự nhân lên và được Lederberg gọi là plasmid. Các plasmid đem lại cho tế bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển gene, sản xuất các chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển chọn [16]. Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng là đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hữu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amôn… Khả năng đồng hoá các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau là khác nhau. 1.1.1.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa của xạ khuẩn Xạ khuẩn là một nhóm cơ thể dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu, acid hữu cơ, lipid, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác làm nguồn cacbon. Còn nitrat, nitrit, muối amon, ure, pepton, cao thịt… để làm nguồn nitơ. Các loài khác nhau thì cách hấp thụ các hợp chất này là khác nhau. Phần lớn xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, nhiệt độ cho sinh trưởng và phát triển là 25 - 300C. Đa số xạ khuẩn phát triển tốt trong môi trường có pH là 6,8 - 7, một số ít có khả năng phát triển tốt trong môi trường kiềm [1]. Một trong những đặc điểm đáng lưu ý của xạ khuẩn là chúng không bền vững về mặt di truyền và thường xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử ADN. Điều này gây ra tính đa dạng của hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa 8 của xạ khuẩn (khả năng đồng hóa nguồn cacbon, nitơ, hoạt tính kháng sinh, tính kháng thuốc, khả năng phân giải cellulose…) [1]. 1.1.2. Một số phương pháp trong phân loại xạ khuẩn 1.1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy Dựa vào đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy, XK được chia thành 4 nhóm chính: Nhóm 1: XK mang bào tử rõ rệt. Đặc trưng của nhóm này là sinh sản bằng bào tử và phân bố thành hệ sợi khí sinh và hệ sợi cơ chất. Nhóm 2: XK có bào tử nang. Đặc trưng của nhóm này là hệ sợi phân chia theo các hướng vuông góc với nhau tạo ra cấu trúc tương tự mang bào tử. Nhóm 3: XK dạng Nocardia, sinh sản bằng cách phân đốt sợi. Nhóm 4: XK dạng tương tự Corynebacterium và dạng cầu, tế bào có hình chữ V, T hoặc dạng cầu thông thường không có sợi. Dựa vào nghiên cứu các xạ khuẩn trên các môi trường khác nhau người ta chia hình chuỗi bào tử thành 6 kiểu: + Kiểu S (Spira): chuỗi bào tử xoắn. + Kiểu SRA (Spira Rectinaculum Apertum): chuỗi bào tử xoắn có dạng móc câu hay xoắn không hoàn toàn. + Kiểu SRF (Spira Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử xoắn, cong đến thẳng. + Kiểu RA (Rectinaculum Apertum): chuỗi bào tử có móc có khóa. + Kiểu RA – RF (Rectinaculum Apertum - Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử có móc hay xoắn không hoàn toàn. + Kiểu RF (Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử thẳng đến lượn sóng. Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là những dữ liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên, như ta đã biết xạ khuẩn rất không bền vững về mặt di truyền, thường xuyên xảy ra sự sắp xếp lại trong trong phân tử DNA. Trong cùng một loài có thể biểu hiện 9 khác nhau về hình thái hay những loài khác nhau có thể giống nhau về mặt hình thái. Vì vậy, để phân loại được chính xác, ngày nay người ta cần nghiên cứu thêm các chỉ tiêu khác bổ sung như đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học hay sinh học phân tử [28]. 1.1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (chemotaxonomy) Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau: + Typ thành tế bào chủ yếu dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần peptid và đường trong thành tế bào hay các polysaccarit gắn vào thành tế bào. + Typ Peptidoglucan (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu trúc của mạch tetrapeptid của PG, cầu nối peptid và các liên kết giữa các mắt xích của PG. Năm 1974 Steiner đã chia các PG thành hai nhóm cơ bản là A và B. + Menaquinon: XK giống vi khuẩn Gram dương ở chỗ tổng hợp menquinon và dimetylmenaquinon, không tổng hợp ubiquinon. Phần lớn các chi của XK có thành phần menaquinon xác định. + Phospholipid: Năm 1997, Lechevalier đã sử dụng đặc điểm của phospholipid để phân XK có 5 typ phospholipid: (PI, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần đặc trưng và có ý nghĩa cho phân loại XK [25]. 1.1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Khi phân loại XK đến loài người ta sử dụng các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzyme. Các chỉ tiêu khác cũng được xác định như mối quan hệ với pH, nhiệt độ, khả năng chịu muối và các yếu tố môi trường khác, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của XK. 10 1.1.2.4. Phân loại số Để phát hiện những loài mới trên cơ sở sự khác nhau về đặc điểm sinh lý, sinh hóa người ta còn sử dụng các kết quả dựa trên phân loại số. Phương pháp này dựa trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau giữa các VSV theo một số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa. Để so sánh các chủng xạ khuẩn với nhau từng đôi một, người ta căn cứ vào hệ số giống nhau (hệ số S - Similarity). Công thức của Jacard (Sj): Sj(AB) = NS * 100 / (NS + Nd) Trong đó: Sj(AB): Mức độ giống nhau giữa hai chủng A, B (%). NS: Tổng số các đặc điểm dương tính (giống nhau) của hai chủng so sánh. Nd: Tổng số các đặc điểm khác nhau (tổng số các đặc điểm dương tính của chủng này và âm tính của chủng kia). Kết quả cuối cùng của phân loại số là vẽ được sơ đồ phân nhánh (kiểu rễ cây) của các thông số. Ở sơ đồ này những chủng giống nhau nhiều nhất sẽ được xếp vào một nhóm [27]. 1.1.2.5. Phân loại xạ khuẩn Một số chi trường gặp trong phân loại xạ khuẩn: Chi Actinopolyspora: Hệ sợi phân nhánh, hình thành rất nhiều sợi khí sinh có đường kính khoảng 1 μm. Sợi cơ chất hầu hết không đứt đoạn. Cuống sinh bào tử chứa 20 hoặc hơn bào tử dạng que ngắn hoặc dạng cầu với vỏ nhẵn hình thành trên sợi khí sinh theo chiều hướng gốc. Sợi cơ chất không sinh bào tử. Gram dương. Nhuộm kháng acid. Thành tế bào chứa meso-DAP, arabinose và galactose. Không chứa acid mycolic. Hiếu khí. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 64,2%.