ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Triệu Tiến Sang
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH ADN VÀ TẾ
BÀO PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI MẸ
ĐỂ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC SINH
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Hà Nội, 2015
1
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Triệu Tiến Sang
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH ADN VÀ TẾ
BÀO PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI MẸ
ĐỂ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC SINH
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62420121
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS Trần Văn Khoa
2. PGS.TS Đinh Đoàn Long
Hà Nội, 2015
2
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu thực sự của cá
nhân, đƣợc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của PGS.TS. Trần Văn
Khoa và PGS.TS. Đinh Đoàn Long.
Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chƣa đƣợc ai công
bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.
Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Nghiên cứu sinh
Triệu Tiến Sang
3
LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc tới
PGS.TS. Trần Văn Khoa – Chủ nhiệm Bộ môn Sinh học và Di truyền y học
– Học viện Quân y, Trƣởng phòng Công nghệ Gen và Di truyền tế bào –
Trung tâm nghiên cứu Sinh Y dƣợc – Học viện Quân y và PGS.TS. Đinh
Đoàn Long – Chủ nhiệm Bộ môn Y dƣợc học cơ sở , Phó Chủ nhiệm Khoa Y
Dƣợc - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình hƣớng dẫn tôi trong quá trình
nghiên cứu để hoàn thành luận án tiến sĩ.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân – Chủ
nhiệm Bộ môn Di truyền học, các thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học và
Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà
Nội đã chỉ bảo tận tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới GS.TS. Hoàng Văn Lƣơng – Phó
giám đốc Học viện Quân y, Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Sinh y Dƣợc –
HVQY; PGS.TS Nguyễn Duy Bắc, Phó Phòng Công nghệ Gen và Di truyền
tế bào và các đồng chí, đồng nghiệp tại Bộ môn Sinh học và Di truyền y học;
cùng các đồng chí tại Phòng Công nghệ gen và Di truyền tế bào – Trung tâm
nghiên cứu Sinh Y Dƣợc học – Học viện Quân y đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo
mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm Nghiên cứu gen và protein –
Đại học Y Hà Nội, Phòng Xét nghiệm Di truyền – Bệnh Viện Từ Dũ và
Trung tâm Nghiên cứu Sinh Y Dƣợc – Học viện Quân y đã cung cấp mẫu
phục vụ cho các nghiên cứu của luận án.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và tất cả những ngƣời
thân, bạn bè đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa
qua.
Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Nghiên cứu sinh
Triệu Tiến Sang
4
CHỮ VIẾT TẮT
Nghĩa Tiếng Việt
Từ viết tắt
Nghĩa tiếng Anh
A
Adenine
Adenine
ADN
Deoxyribonucleic Acid
Acid Deoxyribonucleic
AF
Amniotic Fluid
Dịch ối
AFP
Alpha-fetoprotein
Alpha-fetoprotein
AIHW
Australian Institute of Health and Viện sức khỏe và phúc lợi Úc
Welfare
ATP
Adenosine Triphosphate
Adenosine Triphosphate
Bp
Base pairs
Cặp bazơ
C
Cytosine
Cytosine
CAH
Congenital Adrenal Hyperplasia
Tăng sản thƣợng thận bẩm sinh
CVS
Chorionic villous sampling
Lấy mẫu gai rau
dNTPs
Deoxyribonucleotide
Deoxyribonucleotide
Triphosphate
Triphosphate
Dị tật bẩm sinh
DTBS
EDTA
FACS
Ethylene Diamine Tetra Acetic
Ethylene Diamine Tetra Acetic
Acid
Acid
Fluorescence-activated cell
Phân loại tế bào bằng hoạt hóa
sorting
huỳnh quang
FISH
Fluorescence in-situ hybridization Lai tại chỗ huỳnh quang
fNRBCs
Fetal nucleated red blood cells
Tế bào hồng cầu có nhân của
phôi thai
G
Guanine
Guanine
HCĐ
Down syndrome
Hội chứng Down
Kb
Kilo base
Kilo base
5
Khoảng sáng sau gáy
KSSG
MACS
Magnetic activated cell sorting
Phân loại tế bào hoạt hóa từ tính
Nhiễm sắc thể
NST
PCR
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng chuỗi nhờ polymerase
PUBS
Percutaneous umbilical cord
Lấy mẫu máu cuống rốn qua da
blood sampling
Quantitative fluorescence -
Phản ứng chuỗi định lƣợng
Polymerase Chain Reaction
huỳnh quang
STR
Short Tandem Repeat
Lặp lại liên tiếp đoạn ngắn
T
Thymine
Thymine
Taq –
Thermus aquaticus polymerase
QF-PCR
polymerase
TBE
Tris - Boric – EDTA
Tris - Boric – EDTA
TOP
Termination of pregnancy
Đình chỉ thai
UV
Ultra Violet
Tia cực tím
β hCG
Beta_human chronic
Beta_human chronic
gonadotropin
gonadotropin
6
DANH MỤC BẢNG
TRANG
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
Bảng 1.1. Thống kê so sánh 4 sản phẩm thƣơng mại của kỹ thuật
NIPT
Bảng 1.2. Các Kít sử dụng kỹ thuật NIPT ứng dụng tại Mỹ
Bảng 2.1. Thành phần hóa chất của bộ QIAamp ADN blood Mini
Kit
Bảng 2.2. Trình tự và kích thƣớc sản phẩm khuếch đại gen SRY
và GAPDH
Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR vòng 1 và vòng 2
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng nhân gen mồi ngoài và
mồi trong gen SRY và chu trình nhiệt nhân gen GAPDH
Bảng 2.5. Trình tự mồi và đầu dò của phản ứng định lƣợng huỳnh
quang gen DYS14 và GAPDH
Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime-PCR
Bảng 2.7. Công thức và ứng dụng của các chất gắn trên bề mặt
hạt từ tính
Bảng 2.8. Các locus STR trên các NST 13, 18, 21 và NST X, Y
Bảng 2.9. Thành phần và thể tích của phản ứng QF-PCR
Bảng 2.10. Chu trình nhiệt của phản ứng QF-PCR
Bảng 2.11. Các thành phần cho 1 mẫu điện di
Bảng 2.12. Chu trình nhiệt biến tính sản phẩm PCR cho điện di
mao quản
Bảng 2.13. Phân tích tỷ lệ các peak huỳnh quang STR
Bảng 2.14. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR
hoặc Realtime PCR
Bảng 3.1. Nồng độ ADN (ng/µl) của phƣơng pháp tách bằng
nhiệt và phƣơng pháp tách bằng bộ Kít Qiagen
Bảng 3.2. Kết quả số bản copy gen DYS14 (A: copy/ml) và nồng
độ gen DYS14/GAPDH (B: %) ở các tuần 6 đến 12 của thai kỳ
của các trƣờng hợp thai nam
Bảng 3.3. Kết quả số bản copy gen GAPDH (A: copy/ml) ở các
tuần 6 đến 12 của thai kỳ của các trƣờng hợp thai nữ
Bảng 3.4. So sánh kết quả của kỹ thuật Nested PCR, Realtime
PCR với siêu âm ở tuần thứ 16/ sau sinh (A)
Bảng 3.5. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR và
7
33
34
49
50
51
51
52
53
54
57
58
58
59
59
61
62
63
71
72
75
76
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
Realtime-PCR ở 6 tuần tuổi thai
Bảng 3.6. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR và
Realtime-PCR ở 7 tuần tuổi thai
Bảng 3.7. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR và
Realtime-PCR ở tuổi thai >8 tuần.
Bảng 3.8. Độ nhạy và độ đặc hiệu của 2 kỹ thuật Realtime PCR
và Nested PCR ở các tuần tuổi thai
Bảng 3.9. Kết quả nhân gen SRY (trƣớc sinh: A) và kiểm chứng
sau sinh (B) của 189 mẫu nghiên cứu tuổi thai từ 7+6 đến 9+2
Bảng 3.10. Kết quả nồng độ ADN biến thiên sau sinh
Bàng 3.11. Nồng độ ADN phôi thai tự do trong huyết tƣơng mẹ
mang thai nam bình thƣờng
Bảng 3.12. Nồng độ ADN phôi thai tự do trong huyết tƣơng mẹ
mang thai nam bất thƣờng
Bảng 3.13. Kết quả sàng lọc bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh
Bảng 3.14. Kết quả sàng lọc bệnh loạn dƣỡng cơ Duchenne
Bảng 3.15. Chu trình nhiệt của phản ứng nhân gen RhD
Bảng 3.16. Kết quả chẩn đoán nhóm máu Rh của thai nhi ở tuần
thứ 8
Bảng 3.17. Kết quả thử nghiệm trên các tế bào phôi thai tự do
8
76
77
77
85
87
98
99
107
110
111
112
116
DANH MỤC CÁC HÌNH
TRANG
STT
1
Hình1.1: Các bƣớc chình của kỹ thuật FISH
24
2
Hình 1.2: Nguyên tắc của phản ứng Nested PCR (PCR lồng)
25
3
Hình 1.3. Phƣơng pháp Real-time PCR với mẫu dò TaqMan
26
4
Hình 1.4. Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong Realtime-
27
PCR
5
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu
48
6
Hình 2.2. Trình tự đoạn gen DYS14
53
7
Hình 2.3. Trình tự đoạn gen GAPDH
53
8
Hình 2.4. Các chất gắn trên bề mặt ha ̣t tƣ̀ tính
54
9
Hình 2.5. Phân tích kết quả QF-PCR bình thƣờng
59
10
Hình 2.6. Phân tích tính kết quả tỷ lệ giữa các alen
60
11
Hình 2.7. Ảnh phân tích kết quả QF-PCR locus bị Trisomy
61
12
Hình 3.1. Ảnh điện di của gen SRY và GAPDH của các mẫu nghiên cứu
65
13
Hình 3.2. Ảnh điện di của gen SRY và GAPDH của các mẫu nghiên cứu
66
từ 811 - 825
14
Hình 3.3. Ảnh kết quả điện di của gen SRY và GAPDH của các mẫu
67
nghiên cứu từ 826 - 840
15
Hình 3.4. Phân tích đƣờng chuẩn của gen DYS14 và gen GAPDH
70
16
Hình 3.5. Ảnh điện di các mẫu ở tuổi thai 6 tuần tuổi từ mẫu 269 đến
mẫu 301
78
17
Hình 3.6. Ảnh nhân gen GAPDH ở tuổi thiai 6 tuần tuổi từ các mẫu 269
đến 297
78
18
Hình 3.7. Ảnh điện di các mẫu ở tuổi thai 7 tuần tuổi từ mẫu 269 đến
79
mẫu 321
19
Hình 3.8. Ảnh điện di các mẫu ở tuổi thai 8 tuần tuổi từ mẫu 269 đến
mẫu 321
9
80
24
Hình 3.9. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trƣờng hợp 269
81
25
Hình 3.10. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trƣờng hợp 277
82
26
Hình 3.11. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trƣờng hợp 296
83
27
Hình 3.12. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trƣờng hợp 551
84
28
Hình 3.13. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự do sau khi sinh
88
29
Hình 3.14. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu QF64
90
(tƣơng ứng mẫu nghiên cứu BT05) nam bình thƣờng
30
Hình 3.15. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu QF 61 92
(tƣơng ứng với mẫu DT 02) nam mang hội chứng Down
31
Hình 3.16. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR điện di mao
quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu DT02 với các cặp mồi extra
Marker 21
93
32
Hình 3.17. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu QF56
94
(tƣơng ứng với mẫu DT03) mang hội chứng Klinefelter
33
Hình 3.18. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu DT03
(QF56) với các mồi extra marker trên locus X, Y
95
34
Hình 3.19. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu DT08
96
mang hội chứng Edward
35
Hình 3.20. Ảnh nhuộm FISH tế bào phôi thai của mẫu số 831
101
36
Hình 3.21. Ảnh nhuộm FISH tế bào phôi thai của mẫu số 837
102
37
Hình 3.22. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu
nghiên cứu 964 với các locus trên NST giới tính X, Y
104
38
Hình 3.23. Ảnh điện di gen SRY của mẫu sàng lọc bệnh CAH tuần thai
thứ 8
106
39
Hình 3.24. Ảnh nhân gen GAPDH của các mẫu sàng lọc bệnh CAH tuần
thai thứ 8
106
40
Hình 3.25. Ảnh điện di nhân gen SRY của các mẫu sàng lọc DMD ở
tuần thứ 8
109
41
Hình 3.26. Ảnh điện điện di nhân gen GAPDH của các mẫu sàng lọc
109
10
DMD ở tuần thứ 8
42
Hình 3.27. Ảnh điện di kiểm tra nhóm máu Rh của thai nhi
112
43
Hình 3.28. Ảnh nhuộm FISH tế bào phôi thai của mẫu số DT01
114
44
Hình 3.29. Ảnh điện di sản phẩm QF-PCR của mẫu DT01 mang hội
115
chứng Down
11
MỤC LỤC
1.1.
MỞ ĐẦU
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
KHÁI NIỆM DỊ TẬT BẨM SINH
TRANG
4
7
7
1.2.
TÌNH HÌNH DỊ TẬT BẨM SINH TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT
NAM
7
1.2.1.
Tình hình dị tật bẩm sinh trên thế giới
8
1.2.2.
Tình hình dị tật bẩm sinh ở Việt Nam
10
1.3.
MỘT SỐ DỊ TẬT BẨM SINH THƢỜNG GẶP
11
1.3.1.
Đặc điểm một số bệnh di truyền do bất thƣờng số lƣợng nhiễm sắc
thể
11
1.3.2.
Đặc điểm một số bệnh di truyền do đột biến gen đƣợc nghiên cứu
trong đề tài
14
1.4.
CÁC PHƢƠNG PHÁP SÀNG LỌC VÀ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC
SINH
16
1.4.1.
Các phƣơng pháp sàng lọc dị tật trƣớc sinh
16
1.4.2.
Các phƣơng pháp chẩn đoán dị tật trƣớc sinh
19
1.5.
TÌNH HÌNH SÀNG LỌC, CHẨN ĐOÁN TRƢỚC SINH TRÊN
THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM BẰNG PHƢƠNG PHÁP KHÔNG
XÂM LẤN
36
1.5.1.
Tình hình sàng lọc và chẩn đoán trƣớc sinh trên thế giới bằng phƣơng
36
pháp không xâm lấn
1.5.2.
Tình hình sàng lọc, chẩn đoán trƣớc sinh ở Việt Nam bằng phƣơng
pháp không xâm lấn
42
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
45
2.1.
VẬT LIỆU
45
2.1.1.
Đối tƣợng nghiên cứu
45
2.1.2.
Hoá chất và thiết bị máy móc
47
2.2.
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
48
12
2.2.1.
Phƣơng pháp tách chiết ADN tự do và phƣơng pháp nhân gen PCR
49
và Realtime-PCR
2.2.2.
Phƣơng phân lập tế bào phôi thai tự do, phƣơng pháp nhuộm tế bào
bằng kỹ thuật FISH, phƣơng pháp QF-PCR chứng minh sự tồn tại 53
của tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
63
3.1.
TÁCH CHIẾT ADN PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI
63
CỦA MẸ
3.1.1.
Tách chiết ADN tự do trong máu ngoại vi của mẹ
63
3.1.2.
PCR nhân gen SRY
64
3.1.3.
Định lƣợng số bản copy của ADN phôi thai trong máu ngoại vi của
mẹ
68
3.1.4.
Biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ
81
3.1.5.
Nhân gen SRY trên 189 bệnh nhân nghiên cứu
85
3.1.6.
Biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ
sau khi sinh
87
3.1.7.
Đối chiếu nồng độ ADN phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ với kết
quả QF-PCR
89
3.2.
PHÂN LẬP TẾ BÀO PHÔI THAI TRONG MÁU NGOẠI VI CỦA
MẸ
100
3.2.1.
Phân lập tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ
100
3.2.2.
Nhân gen SRY sau khi phân lập tế bào phôi thai trong máu ngoại vi
của mẹ
103
3.3.
ỨNG DỤNG ADN PHÔI THAI TỰ DO VÀ TẾ BÀO PHÔI THAI
TRONG MÁU NGOẠI VI MẸ
105
3.3.1.
Sàng lọc bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh từ ADN phôi thai tự do
105
3.3.2.
Sàng lọc bệnh loạn dƣỡng cơ Duchenne từ ADN phôi thai tự do
108
13
3.3.3.
Xác định sự bất đồng nhóm máu Rh giữa mẹ và thai nhi từ ADN
phôi thai tự do
111
3.3.4.
Thử nghiệm ứng dụng tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ để
chẩn đoán bất thƣờng số lƣợng nhiễm sắc thể
114
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
118
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN
120
QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
121
PHỤ LỤC
14
MỞ ĐẦU
Dị tật bẩm sinh (DTBS) đã và đang là một vấn đề y tế không chỉ thu hút sự
quan tâm của các chuyên gia sản khoa mà còn thu hút sự quan tâm của toàn xã hội.
Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (WHO), tỷ lệ DTBS khoảng 1,73% trẻ sơ
sinh. Ở Việt Nam, một số nghiên cứu trƣớc đây cho thấy tỷ lệ DTBS vào khoảng
2,4% đến 3,6%. Hiện nay, việc điều trị các DTBS vẫn còn hết sức khó khăn và phức
tạp. Các DTBS đa số đều không thể chữa khỏi hoặc kết quả điều trị rất hạn chế.
Thai nhi sau khi sinh ra kém phát triển cả về thể lực và trí lực, thiếu khả năng lao
động hay tự chăm sóc, kém hòa nhập với xã hội. Chính vì vậy, việc chẩn đoán trƣớc
sinh để tƣ vấn, dự phòng và xâm lấn vẫn là biện pháp hàng đầu, hết sức cần thiết
nhằm làm giảm tỷ lệ DTBS. Việc nghiên cứu ứng dụng các phƣơng pháp chẩn đoán
trƣớc sinh các DTBS đã đƣợc quan tâm phát triển từ lâu. Nhờ vậy, đã có nhiều
phƣơng pháp truyền thống nhƣ siêu âm sản khoa, test sàng lọc bộ ba (triple test)…
Đây là những phƣơng pháp không xâm lấn nhƣng kết quả chẩn đoán thƣờng muộn
và có độ đặc hiệu thấp [1],[3],[4],[7]. Bên cạnh đó, các phƣơng pháp nhƣ chọc hút
nƣớc ối, sinh thiết nhau thai, lấy máu cuống rốn để phân tích di truyền thai nhi… có
độ đặc hiệu cao hơn, nhƣng nhƣợc điểm là có xâm lấn, gây tỷ lệ tai biến cho thai
phụ và thai nhi nhƣ sẩy thai, rò ối, thai chết lƣu, đẻ non, …. [2],[5],[9].
Năm 1969, Walknowska và cộng sự đã phát hiện sự có mặt của tế bào phôi
thai tự do trong máu ngoại vi của ngƣời mẹ [130]. Năm 1997, Lo và cộng sự đã
phát hiện ADN tự do của thai nhi (cell free fetal DNA: ADN phôi thai tự do) trong
huyết tƣơng mẹ đƣợc coi là một phát hiện mang tính đột phá trong phát triển các
phƣơng pháp chẩn đoán trƣớc sinh mới [85]. Phát hiện này vô cùng quan trọng, mở
ra một hƣớng đầy triển vọng trong chẩn đoán trƣớc sinh bằng biện pháp không xâm
lấn. Nồng độ ADN tự do trong máu ngoại vi của mẹ có sự khác biệt giữa các tuổi
thai và phụ thuộc vào từng cá thể. Sự tồn tại của ADN phôi thai tự do ở các thời
điểm khác nhau, ảnh hƣởng rất nhiều tới chất lƣợng ADN phôi thai tự do tách đƣợc
và nó ảnh hƣởng tới các chẩn đoán dị tật di truyền khi sử dụng các vật liệu di truyền
này. Do vậy, việc nghiên cứu thời điểm thích hợp để tách đƣợc ADN hiệu quả cao
15
và sớm nhất có vai trò quyết định thành công của phép chẩn đoán sớm DTBS từ
máu ngoại vi của mẹ. Sự tồn tại ADN phôi thai tự do và tế bào phôi thai tự do trong
máu ngoại vi của mẹ sau khi sinh cũng là một vấn đề quan trọng, ảnh hƣởng tới khả
năng chẩn đoán di tật bẩm sinh ở các lần sinh sau. Hiện nay, ở Việt Nam chƣa có
nghiên cứu nào phát triển và áp dụng biện pháp chẩn đoán phân tử trên tế bào phôi
thai tự do lƣu hành trong máu mẹ và ADN phôi thai tự do lƣu hành trong máu ngoại
vi của mẹ. Vì vậy, chúng tôi tiến hành luận án: “Nghiên cứu tách chiết, phân tích
ADN và tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi mẹ để chẩn đoán trƣớc sinh”
nhằm mục đích đảm bảo hiệu quả tách ADN và tế bào phôi thai tự do trong máu
ngoại vi của mẹ ứng dụng chẩn đoán trƣớc sinh bằng phƣơng pháp không xâm lấn.
Các mục tiêu chính của đề tài gồm có:
1. Tách chiết và xác định nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại
vi của mẹ.
2. Phân lập tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ.
3. Ứng dụng ADN phôi thai và tế bào phôi thai lƣu hành trong máu
ngoại vi của mẹ để:
-
Sàng lọc phát hiện giới tính thai để tƣ vấn một số bệnh di truyền
liên kết với nhiễm sắc thể giới tính.
-
Xác định sự bất đồng nhóm máu Rh giữa mẹ và con.
-
Bƣớc đầu chẩn đoán một số bất thƣờng số lƣợng nhiễm sắc thể.
Đối tƣợng và các nội dung nghiên cứu chính gồm có:
Đối tƣợng nghiên cứu của đề tài: Các mẫu máu ngoại vi của các phụ nữ mang
thai bị dị tật và mang thai không bị dị tật.
Nội dung nghiên cứu của đề tài: (i) Tách chiết và xác định nồng độ ADN phôi
thai trong máu mẹ; Nghiên cứu sự biến đổi hàm lƣợng ADN phôi thai tự do trong
máu theo thai kỳ và thời gian tồn tại của chúng sau khi sinh; Kiểm tra, đánh giá
xác định thời điểm sớm và thích hợp nhất để phân tích ADN phôi thai trong máu
mẹ; (ii) Phân lập tế bào phôi thai trong máu mẹ; Kiểm tra, đánh giá chứng minh sự
tồn tại của tế bào phôi thai trong máu mẹ; (iii) Ứng dụng ADN phôi thai và tế bào
16
phôi thai lƣu hành trong máu ngoại vi của mẹ để bƣớc đầu sàng lọc một số bệnh
nhƣ: bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh, loạn dƣỡng cơ Duchenne, xác định sự
bất đồng nhóm máu Rh giữa mẹ và con và bƣớc đầu chẩn đoán bất thƣờng số
lƣợng NST.
Kết quả của đề tài có một số đóng góp mới nhƣ sau:
-
Xác định đƣợc nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ để
ứng dụng chẩn đoán trƣớc sinh ở thời điểm thích hợp nhất trong thời gian phát
triển của thai kỳ.
-
Phân lập tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ, ứng dụng cho
chẩn đoán các DTBS.
-
Góp phần sàng lọc và chẩn đoán sớm một số bệnh di truyền trƣớc sinh bằng
biện pháp không xâm lấn thai.
Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài
-
Góp phần làm sáng tỏ sự tồn tại ADN và tế bào phôi thai tự do trong máu
ngoại vi của mẹ ứng dụng trong sàng lọc và chẩn đoán trƣớc sinh các bệnh di
truyền ở Việt Nam.
-
Cung cấp một công cụ hữu hiệu góp phần giảm thiểu các trƣờng hợp sinh
con bị bệnh di truyền, DTBS, gián tiếp giảm gánh nặng cho gia đình, xã hội và
nâng cao sức khỏe cộng đồng.
Về bố cục của luận án
Luận án gồm 135 trang, trong đó có các phần Mục lục (3 trang), Mở đầu (3
trang), Tổng quan tài liệu (38 trang), Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu (18
trang), Kết quả và bàn luận (55 trang), Kết luận và kiến nghị (2 trang). Các công
trình khoa học của tác giả liên quan đến luận án (1 trang), Tài liệu tham khảo (15
trang), với 134 tài liệu bằng 2 thứ tiếng: tiếng Việt (18 tài liệu) và tiếng Anh (116
tài liệu). Luận án có 33 bảng và 44 hình.
17
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.
KHÁI NIỆM DỊ TẬT BẨM SINH
DTBS (congenital malformation - DTBS) là tên gọi chung của các bệnh có
sẵn trƣớc khi sinh. DTBS là những bất thƣờng về cấu trúc hoặc chức năng bẩm sinh
gây khuyết tật về thể chất hoặc tinh thần. DTBS có thể do bất thƣờng di truyền, tai
biến trong tử cung hay rối loạn trong quá trình hình thành và phát triển của
phôi, thai. Nhiều DTBS vẫn không rõ nguyên nhân.
Các nhà nghiên cứu đã xác định đƣợc hàng nghìn các DTBS khác nhau.
Hiện nay, các DTBS là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu cho trẻ sơ sinh trong
năm đầu tiên của cuộc đời. Hầu hết các DTBS xảy ra trong 3 tháng đầu của thai kỳ
[1],[8].
Trẻ bị DTBS có thể phải phẫu thuật hoặc đƣợc điều trị bằng các biện pháp y
tế khác. Ngày nay, các bác sĩ có thể chẩn đoán nhiều DTBS trong bụng mẹ. Điều
này giúp cho các bác sĩ có thể điều trị hoặc thậm chí sửa chữa một số vấn đề trƣớc
khi em bé đƣợc sinh ra.
Nguyên nhân gây ra DTBS:
Đến nay, các chuyên gia y khoa vẫn chƣa xác định đƣợc hết các nguyên
nhân gây nên dị tật cho thai nhi. Họ chỉ có thể ghi nhận đƣợc những yếu tố liên
quan nhƣ: di truyền, rối loạn nhiễm sắc thể do các tia xạ, hóa chất…, sử dụng thuốc
không đúng cách.
Một số loại DTBS thƣờng gặp ở trẻ sơ sinh: dị tật tim bẩm sinh, chân vẹo,
môi chẻ, sứt môi, thiếu chi hoặc chân tay dị dạng, hội chứng Down...
1.2.
TÌNH HÌNH DỊ TẬT BẨM SINH TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
Dị tật bẩm sinh (DTBS) là một vấn đề lớn không chỉ đối với ngành sản
khoa mà còn thu hút đƣợc sự quan tâm của toàn xã hội. Trên phạm vi toàn thế giới
có trung tâm thông tin quốc tế và hệ thống giám sát bất thƣờng sinh sản (ICBDMS:
International Clearing – House for Birth Defects Monitoring System) thực hiện điều
18
tra về bất thƣờng sinh sản. Việt Nam cũng nhƣ các nƣớc trên thế giới đã nghiên cứu
tình hình sinh sản, các bất thƣờng sinh sản ở các khu vực khác nhau trên lãnh thổ,
tại các trung tâm y tế lớn và ở các nhà hộ sinh, trạm y tế xã, phƣờng…
1.2.1. Tình hình DTBS trên thế giới
Theo thống kê từ năm 1995 đến 1999, ƣớc tính khoảng 5% các trƣờng hợp
mang thai ở Úc và chấm dứt thai kỳ với các DTBS lớn, các trẻ bị dị tật từ 0 đến 14
tuổi chiếm khoảng 13%. Các trẻ dị tật khi sinh cũng là nguyên nhân tử vong hàng
đầu ở Úc, với khoảng 25% trẻ sơ sinh tử vong là do bị dị tật khi sinh (Viện Sức
khỏe và Phúc lợi Úc AIHW thống kê năm 2002). Trẻ dị tật khi sinh là do yếu tố di
truyền (bao gồm cả các sai lệch nhiễm sắc thể), môi trƣờng và các nguyên nhân
khác, hoặc sự kết hợp của những yếu tố này. Ngƣời ta ƣớc tính khoảng 65 đến 75%
các trẻ dị tật là không rõ nguyên nhân. Khoảng 15 - 25% các dị tật khi sinh có
nguyên nhân di truyền và khoảng 10% là do môi trƣờng (Brent, 2001) [92]. Marden
và cộng sự, 1964 tại Hoa kỳ là ngƣời đầu tiên nghiên cứu tỷ lệ DTBS trên 4.412 trẻ
sơ sinh trong ngày đầu sau sinh cho thấy tỷ lệ DTBS nhỏ là 14,7% và DTBS lớn là
2,04%. Cứ 20 trẻ mới sinh có từ hai dị tật trở lên thì 90% các trƣờng hợp này có
một hay nhiều dị tật lớn [91]. Cũng tại Hoa kỳ năm 1980, Chung và cộng sự nghiên
cứu trên 52.332 trẻ sơ sinh thấy tỷ lệ DTBS là 15,27% khi mới sinh ra và sau 1 năm
là 18,93% [47],[45]. Tại Hoa Kỳ từ năm 1999-2001 theo báo cáo của Canfield và
cộng sự năm 2006, dị tật bẩm sinh ảnh hƣởng đến khoảng 3% của tất cả các ca sinh,
là một nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho trẻ sơ sinh [41].
Tại Vƣơng quốc Anh, cơ quan giám sát DTBS đã hoạt động tại Burmingham
từ năm 1949 và trên toàn lãnh thổ Anh từ năm 1963 sau vụ thai nhi bị dị tật do chất
Thalidomide. Nghiên cứu của Boyd và cộng sự, 2004 trên cơ sở số liệu của 4 vùng
nƣớc Anh với số lƣợng hàng năm là 109.000, thời gian từ năm 1991-1999 cho thấy
tỷ lệ DTBS lớn là 2,1% ở trẻ mới đẻ và các bệnh viện phụ sản DTBS này gây ra tỷ
lệ chết chu sinh của trẻ từ trƣớc, trong khi snh và sau khi sinh là 2,1% [35]. Theo
kết quả thống kê của Stephensen và cộng sự năm 2002 thống kê từ năm 1990-1999
tại Iceland có 740/44.013 trẻ sinh ra bị dị tật tim bẩm sinh (1,7% trẻ đẻ sống) [119].
19
Tại Nigeria, theo Abudu và cộng sự báo cáo năm 1988 tỷ lệ DTBS khoảng
2,1% ở trẻ mới đẻ và DTBS gây ra 16% chết chu sinh [19]. Kết quả nghiên cứu của
Himmetoglu và cộng sự ở Thổ Nhĩ Kỳ năm 2002 cho thấy tần suất DTBS chung là
1,11% và tần suất dị tật ống thần kinh là 0,27% [76]. Nghiên cứu trong giai đoạn
1994 – 1998 tại Singapore, các tác giả Shi và cộng sự thấy tần suất DTBS là 1,39%
trên tổng số trẻ sơ sinh [114]. Theo thống kê của tác giả Tan và cộng sự năm 2005,
từ năm 1994 – 2000 tại Singapore, tổng cộng 7.870 trẻ sinh đƣợc báo cáo với tỷ lệ
trẻ bị dị tật vào khoảng 23,99/1.000 ca sinh sống [121]. Năm 1996, mƣời năm sau
thảm hoạ Chernobyl (1986) các tác giả Lazjuk và cộng sự nghiên cứu các số liệu
thu thập về DTBS ở các vùng bị ảnh hƣởng bức xạ ion hoá (ionizing Radiation) của
nƣớc Cộng hoà Belarut cho thấy tỷ lệ DTBS là 4,9% [82].
Phân tích về tỷ lệ mắc các dị tật bẩm sinh tại Cộng hòa Czech trong giai đoạn
2000 - 2008. Có 119.570 trẻ đẻ sống vào năm 2008 (61.326 bé trai và 58.244 bé
gái). Trong đó có 4.664 ca sinh sống với một dị tật bẩm sinh (ở độ tuổi dƣới một
năm), bao gồm 2.754 trẻ em trai và 1.910 trẻ em gái. Tỷ lệ trung bình bị dị tật là
390,06 (449,08 bé trai và bé gái ở 327,93) trên 10.000 trẻ đẻ sống. Trong 1994 2006, có 1.238.398 trẻ em đƣợc sinh ra, trong đó có hơn 42.000 trẻ mang một dị tật
bẩm sinh. Trong giai đoạn 2000 - 2006, số trẻ bị dị tật bẩm sinh từ 3.600 – 3.800
trƣờng hợp một năm, trong khi năm 2007 và 2008 năm số trẻ bị dị tật lên trên 4.600
trƣờng hợp mỗi năm. Một nguyên nhân làm tăng tỷ lệ trẻ bị dị tật bẩm sinh tại Cộng
hòa Czech đó là độ tuổi sinh đẻ của ngƣời mẹ trên 35 tuổi [117].
Dị tật bẩm sinh là nguyên nhân chính gây tử vong cho trẻ sơ sinh và trẻ dƣới
năm tuổi cũng nhƣ tật suốt đời trong số những ngƣời sống sót. Tại Thái Lan, 21%
các ca tử vong ở trẻ sơ sinh do dị tật bẩm sinh. Theo Pangkanon và cộng sự năm
2014 thống kê cho thấy 3.696/67.813 sinh ra vẫn sống bị dị tật (8.28% của tổng số
ca sinh sống ở Thái Lan) đƣợc chẩn đoán dị tật bẩm sinh. Tỷ lệ bị dị tật lớn là
26,12/1.000 ca sinh sống. Năm dị tật bẩm sinh thƣờng gặp nhất là dị tật tim bẩm
sinh, dị tật chân tay, hở hàm ếch, hội chứng Down, và não úng thủy [101].
20
- Xem thêm -
.PDF 
156 
3 
97 
