Tài liệu Nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex pcr xác định nhanh đồng thời bacillus anthracis và yersinia pestis

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐINH THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI Bacillus anthracis VÀ Yersinia pestis LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC Hà Nội - 2017 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐINH THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI Bacillus anthracis VÀ Yersinia pestis Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Nguyễn Thái Sơn Học viện Quân y 2. PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh Viện Nghiên cứu hệ gen Hà Nội - 2017 LỜI CẢM ƠN Trên con đường khoa học đầy vinh quang nhưng cũng không ít những chông gai và hoàn thành luận án này mới chỉ là bước khởi đầu, tôi thấy mình thật may mắn bởi luôn có những người thầy, cộng sự, người thân đã đồng hành cùng tôi. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới PGS. TS. Nguyễn Thái Sơn và PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh, những người thầy luôn tận tụy, góp ý cho tôi, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. Luận án được thực hiện tại Bộ môn Vi sinh y học; Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y và Phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học, với sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô, anh chị em đồng nghiệp giành cho, tôi xin phép được gửi tới lòng biết ơn chân thành nhất. Luận án nhận được sự hỗ trợ quý báu bởi đề tài cấp Bộ Quốc Phòng “Nghiên cứu chế tạo kit PCR đa mồi xác định nhanh đồng thời hai tác nhân vi khuẩn than và dịch hạch”, do PGS. TS. Nguyễn Thái Sơn làm chủ nhiệm. Đồng thời, để có thể hoàn thành được chương trình học tập cũng như hoàn thành luận án, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu và nhiệt tình của các cá nhân và cơ quan, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến: GS. TS. Trương Nam Hải, nguyên Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học đã dành cho tôi những đóng góp quý báu về nội dung nghiên cứu chính giai đoạn đầu của nghiên cứu sinh cùng những quan tâm, động viên giúp tôi hoàn thành luận án. Ban Lãnh đạo, Bộ phận Đào tạo Viện Công nghệ sinh học; Đảng ủy, Ban Giám đốc Học viện Quân y; Ban Cán bộ, Phòng Chính trị; Chỉ huy Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự đã tạo điều kiện về thời gian, kinh phí và trang thiết bị. TS. Đoàn Trọng Tuyên, Cục Quân y đã tạo điều kiện thuận lợi về chủng nghiên cứu cùng những chia sẻ về kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu với các mầm bệnh nguy hiểm. Cuối cùng là gia đình thân yêu và bạn bè đã luôn tin tưởng, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận án này. Đinh Thị Thu Hằng i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 NCS. Đinh Thị Thu Hằng ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Chữ viết tắt Giải nghĩa API Analytical profile index BHI Brain heart infusion Môi trường dinh dưỡng BHI BLAST Basic local alignment search tool Bp Base pairs Công cụ xếp cơ bản Cặp base BSL-3 Bio-safety level 3 An toàn sinh học cấp 3 CDC CFU Centers for Disease Control and Prevention Colony forming unit Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Đơn vị hình thành khuẩn lạc CRMs Certified reference materials Vật liệu tham chiếu được chứng nhận dNTPs Deoxynucleotide triphosphates EQA External quality assessment Đánh giá chất lượng từ bên ngoài IC Internal amplification control Chứng nội tại ID Identification Định danh IS International standard Mẫu chuẩn quốc tế ISO International organization Kilo base Kb LAMP LB Loop mediated amplification Luria-Bertani MCS Multiplex cloning site standard isothermal tìm kiếm sắp Tổ chức Tiêu chuẩn Quốc tế Khuếch đại đẳng nhiệt tạo vòm Vùng đa điểm cắt iii mPCR Multiplex PCR PCR đa mồi NAT Nucleic acid amplification testing The National Center for Biotechnology Information Next generation sequencing Xét nghiệm khuếch đại dựa trên axit nucleic Trung tâm Quốc gia về thông tin công nghệ sinh học Giải trình tự thế hệ mới OD The National Institute for Biological Standards and Control The National Institute of Standards and Technology Optical density Viện Quốc gia về kiểm chuẩn sinh học Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và Công nghệ Mật độ quang học ORF Open reading frame Khung đọc mở PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp QA Quality assurance Đảm bảo chất lượng QC Quality control Kiểm soát chất lượng RMs Reference materials Các vật liệu tham chiếu Rpm Resolution per minute Vòng/phút SNPs Đa hình nucleotide đơn SRMs Single nucleotide polymorphisms Standard Reference Materials TBE Tris - Borate - EDTA YHDPQĐ Y học dự phòng Quân đội WHO World Health Organization NCBI NGS NIBSC NIST Các vật liệu tham chiếu chuẩn Tổ chức Y tế Thế giới iv DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Đặc điểm hệ gen của chủng B. anthracis Ames ..................................... 8 Bảng 2.1. Thông tin các chủng vi khuẩn nghiên cứu .............................................. 34 Bảng 2.2. Các mồi sử dụng trong nghiên cứu nhân dòng và giải trình tự ............................... 36 Bảng 2.3. Trình tự cặp mồi tạo dòng chứng nội tại cạnh tranh ............................................... 37 Bảng 2.4. Các máy và thiết bị chính ........................................................................................ 37 Bảng 2.5. Thành phần dự kiến của mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis ............................................................................................................... 41 Bảng 3.1. Thông tin 6 cặp mồi của mPCR xác định B. anthracis và Y. pestis ........................................................................................................................ 52 Bảng 3.2. Tổng hợp kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi trong mPCR ........................................ 60 Bảng 3.3. Tổng hợp kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 trong mPCR ............................................ 60 Bảng 3.4. Tổng hợp kết quả tối ưu nồng độ dNTPs trong mPCR .......................................... 62 Bảng 3.5. Tổng hợp kết quả tối ưu dung dịch đệm trong mPCR............................................. 62 Bảng 3.6 Các thành phần cho mPCR tối ưu với 6 cặp mồi xác định gen vrrA, pagA, capA, ypo2088, pla, caf1 phát hiện đồng thời B. anthracis và Y. pestis ............................................................................................... 63 Bảng 3.7. Bảng pha loãng DNA xác định ngưỡng phát hiện B. anthracis .............................. 70 Bảng 3.8. Bộ mẫu chuẩn độ nhạy mPCR xác định B. anthracis ............................................. 71 Bảng 3.9. Bảng pha loãng DNA xác định ngưỡng phát hiện Y. pestis .................................... 72 74 Bảng 3.10. Bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu kiểm định kit B. anthracis ............................................ Bảng 3.11. Đánh giá độ nhạy của mPCR với B. anthracis trên bộ mẫu chuẩn ........................................................................................................................ 75 Bảng 3.12. Đánh giá độ nhạy của bộ kit mPCR với Y. pestis trên bộ mẫu chuẩn ........................................................................................................................ 76 v 77 Bảng 3.13. Đánh giá độ đặc hiệu của bộ kit mPCR với B. anthracis ........................................ Bảng 3.14. Đánh giá độ đặc hiệu của kit mPCR với Y. pestis trên bộ mẫu chuẩn ........................................................................................................................ 78 Bảng 3.15. Tổng hợp kết quả định danh xác định các chủng B. anthracis bằng kit API50 CH .................................................................................................. 82 Bảng 3.16. Tổng hợp các đột biến được xác định trên các chủng Bacillus anthracis .................................................................................................................. 92 vi DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Bacillus anthracis trên tiêu bản nhuộm Gram từ bệnh phẩm máu ......... 4 Hình 1.2. Khuẩn lạc B. anthracis trên môi trường thạch máu cừu ......................... 5 Hình 1.3. Yersinia pestis trên tiêu bản nhuộm Wright - Giemsa ............................................... 11 Hình 1.4. Khuẩn lạc Y. pestis trên môi trường thạch máu ......................................................... 12 Hình 2.1. Sơ đồ quá trình tạo dòng chứng nội tại tái tổ hợp pJET1.2-capA- IC1 .............................................................................................................................. 43 Hình 3.1. Các đoạn sản phẩm PCR tương ứng với 5 cặp mồi khác nhau gen vrrA ............................................................................................................................ 48 Hình 3.2. Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen vrrA với kích thước khác nhau ............................................................................................................................ 49 Hình 3.3. Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen pagA với kích thước khác nhau ............................................................................................................................ 49 Hình 3.4. Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen capA với kích thước khác nhau ............................................................................................................................ 50 Hình 3.5. Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen ypo2088 với kích thước khác nhau ................................................................................................................... 50 Hình 3.6. Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen pla với kích thước khác nhau ............................................................................................................................ 51 Hình 3.7. Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen caf1 với kích thước khác nhau ............................................................................................................................ 51 Hình 3.8. Sản phẩm khuếch đại 3 gen đích của B. anthracis Ba1 bằng PCR đơn mồi ...................................................................................................................... 53 Hình 3.9. Sản phẩm khuếch đại đồng thời 3 gen đích của B. anthracis bằng mPCR với 3 cặp mồi vrrAF1/R1, pagAF1/R1, capAF1/R1 ...................................... 54 Hình 3.10. Sản phẩm khuếch đại 3 gen đích của Y. pestis Yp1 bằng PCR đơn mồi.............................................................................................................................. 55 vii Hình 3.11. Sản phẩm khuếch đại đồng thời 3 gen đích của Y. pestis Yp1 bằng mPCR với 3 cặp mồi ypo2088F1/R1, plaF1/R1, cafF1/R1 ....................................... 56 Hình 3.12. Sản phẩm PCR với 6 cặp mồi, từng loại DNA khuôn ............................................... 56 Hình 3.13. Sản phẩm mPCR với 6 cặp mồi, 2 loại tác nhân........................................................ 57 Hình 3.14. Tối ưu nồng độ mồi của mPCR ................................................................................. 58 Hình 3.15. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi trong mPCR ........................................................................ 59 Hình 3.16. Tối ưu nồng độ MgCl2 trong mPCR .......................................................................... 61 Hình 3.17. Tối ưu nồng độ dNTPs trong mPCR .......................................................................... 61 Hình 3.18. Phân lập gen lef bằng cặp mồi IC1F-BamHI/R-NdeI và tạo dòng phụ trong vector pJET1.2/blunt ................................................................................. 64 Hình 3.19. Các kết quả tạo dòng chứng nội tại pJET1.2-capA-IC1 ............................................ 65 Hình 3.20. Kiểm tra mPCR tối ưu có bổ sung IC trong quá trình tách chiết DNA ở các nồng độ khác nhau với mẫu B. anthracis ............................................... 66 Hình 3.21. Kiểm tra mPCR tối ưu có bổ sung chứng nội tại trong quá trình tách chiết DNA ở các nồng độ 105 và 5x104 copy ..................................................... 67 Hình 3.22. Master mix mPCR được đóng gói kèm hướng dẫn sử dụng ...................................... 69 Hình 3.23. Xác định ngưỡng phát hiện B. anthracis ................................................................... 70 Hình 3.24. Xác định ngưỡng phát hiện Y. pestis .......................................................................... 73 Hình 3.25. Kiểm tra mPCR trên bộ mẫu chuẩn độ nhạy với B. anthracis .................................. 76 Hình 3.26. Kiểm tra mPCR trên bộ mẫu chuẩn độ nhạy với Y. pestis ......................................... 76 Hình 3.27. Kiểm tra mPCR trên bộ mẫu chuẩn độ nhạy với B. anthracis và Y. pestis ........................................................................................................................... 77 Hình 3.28. Đánh giá độ đặc hiệu với B. anthracis của bộ kit BaYp-mPCR................................ 78 Hình 3.29. Kiểm định độ đặc hiệu với Y. pestis của bộ kit BaYp-mPCR ................................... 78 Hình 3.30. Kiểm tra mPCR ngay sau khi tạo master mix ............................................................ 79 Hình 3.31. Kiểm tra độ ổn định của mPCR sau thời gian bảo quản một tháng ........................... 79 viii Hình 3.32. Kiểm tra độ ổn định của mPCR sau thời gian bảo quản 12 tháng ............................. 80 Hình 3.33. Khuẩn lạc các chủng nghi ngờ B. anthracis trên thạch máu cừu............................... 81 Hình 3.34. Định danh chủng B. anthracis Ba3 bằng kit API 50 CH ........................................... 81 Hình 3.35. Khuẩn lạc Y. pestis trên môi trường thạch máu ......................................................... 82 Hình 3.36. Xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis bằng kỹ thuật mPCR tối ưu chứa chứng nội tại IC ...................................................................................... 83 Hình 3.37. Kiểm tra sản phẩm tổng hợp các gen đích của B. anthracis Ba3 .............................. 85 Hình 3.38. Kiểm tra sản phẩm tổng hợp các gen đích của Y. pestis ........................................... 86 Hình 3.39. Tạo dòng gen pagA trong vector pJET1.2/blunt ........................................................ 87 Hình 3.40. So sánh trình tự nucleotide gen vrrA của 10 chủng B. anthracis với các chủng tham chiếu trên Genbank .................................................................... 89 Hình 3.41. Xác định một số đột biến điểm trên trình tự nucleotide gen pagA của 3 chủng Ba1, Ba3 và Ba4 khi so sánh với 15 chủng B. anthracis tham chiếu .................................................................................................. 90 Hình 3.42. So sánh trình tự gen capA của 3 chủng B. anthracis với 12 chủng B. anthracis tham chiếu trên Genbank (đoạn nucleotide có đột biến điểm)................................................................................................................... 91 Hình 3.43. So sánh trình tự axit amin của protein được mã hóa bởi gen capA 3 chủng B. anthracis Ba1, Ba3 và Ba4 với 12 chủng tham chiếu trên Genbank .............................................................................................................. 91 Hình 3.44. So sánh trình tự nucleotide và axit amin (gen pla) của 2 chủng Y. pestis Yp1, Yp2 với 4 chủng tham chiếu ................................................................... 93 ix MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn .................................................................................................................... i Lời cam đoan ................................................................................................................ ii Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt........................................................................... iii Danh mục bảng ............................................................................................................. vi Danh mục hình ............................................................................................................. viii MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 4 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN B. anthracis VÀ Y. pestis................................... 4 1.1.1. Tổng quan về vi khuẩn B. anthracis ............................................................. 4 1.1.2. Tổng quan về vi khuẩn Y. pestis .................................................................... 11 1.1.3. B. anthracis, Y. pestis và vũ khí sinh học ...................................................... 17 1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH B. anthracis, Y. pestis ................................. 18 1.2.1. Các phương pháp vi sinh truyền thống .......................................................... 18 1.2.2. Các phương pháp xác định sinh hóa .............................................................. 20 1.2.3. Các phương pháp xác định dựa trên ái lực .................................................... 20 1.2.4. Các phương pháp xác định dựa trên axit nucleic .......................................... 22 1.3. KIỂM ĐỊNH KIT mPCR CHẨN ĐOÁN.............................................................. 30 1.3.1. Kiểm định kit PCR chẩn đoán trên thế giới................................................... 30 1.3.2. Kiểm định kit mPCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis ở Việt Nam............................................................................................................... 31 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 34 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................................................... 34 2.1.1. Các chủng vi khuẩn, plasmid ......................................................................... 34 x 2.1.2. Sinh phẩm, hóa chất....................................................................................... 34 2.1.3. Các máy, thiết bị nghiên cứu ......................................................................... 37 2.1.4. Địa điểm nghiên cứu...................................................................................... 37 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................... 38 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ....................................................................................... 38 2.2.2. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu ......................................................... 38 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...................................................................... 48 3.1. NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ KỸ THUẬT mPCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI B. anthracis VÀ Y. pestis ............................................................. 48 3.1.1. Nghiên cứu thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho mPCR .................................. 48 3.1.2. Nghiên cứu thiết kế kỹ thuật mPCR .............................................................. 53 3.1.3. Nghiên cứu tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis .................................................................................................... 57 3.1.4. Nghiên cứu thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp trong kỹ thuật mPCR ............. 63 3.1.5. Chế tạo kit mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis ................... 68 3.2. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN CỦA KỸ THUẬT mPCR TRÊN CÁC BỘ MẪU CHUẨN VÀ CÁC CHỦNG PHÂN LẬP .................... 69 3.2.1. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các bộ mẫu chuẩn ............................................................................................................... 69 3.2.2. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các chủng phân lập ......................................................................................................... 80 3.2.3. Kiểm định bộ kit BaYp-mPCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis ............ 94 Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................ 95 4.1. THIẾT KẾ KỸ THUẬT mPCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI B. anthracis VÀ Y. pestis ........................................................................................ 95 4.1.1. Thiết kế, tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis .................................................................................................. 95 xi 4.1.2. Chứng nội tại trong mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis ........................................................................................................... 100 4.2. KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN CỦA KỸ THUẬT mPCR TRÊN CÁC BỘ MẪU CHUẨN VÀ CÁC CHỦNG PHÂN LẬP ................................................ 103 4.2.1. Khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các bộ mẫu chuẩn ................ 103 4.2.2. Khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các chủng phân lập .............. 107 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 116 NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .................... 118 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH ............................................................ 119 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 125 PHỤ LỤC xii 1 MỞ ĐẦU Bacillus anthracis và Yersinia pestis là hai loài vi khuẩn gây bệnh tối nguy hiểm tương ứng là bệnh than và dịch hạch, từng gây nên nỗi kinh hoàng trong lịch sử loài người, có thể bị lợi dụng làm vũ khí sinh học. Bởi tính chất dễ lây truyền và tỷ lệ tử vong cao qua đường hô hấp, theo Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (Centers for Disease Control and Prevention, USA - CDC), B. anthracis và Y. pestis được phân loại là những tác nhân khủng bố sinh học nhóm A (nhóm các tác nhân sinh học tối nguy hiểm). Ở Việt Nam, B. anthracis còn xuất hiện rải rác ở các tỉnh miền núi phía Bắc, trong khi Y. pestis vẫn tồn tại trên một số loài gặm nhấm ở khu vực Tây Nguyên và có thể bùng phát thành dịch bất kỳ lúc nào. Mặt khác, chúng ta cần có phương án ứng phó nhanh, kịp thời trong phòng chống khủng bố sinh học. Trong một vụ tấn công nghi ngờ có khủng bố sinh học hay mẫu môi trường nghi nhiễm các mầm bệnh này, việc phát hiện nhanh, chính xác tác nhân sinh học là một trong những yếu tố quyết định đến sức khỏe cộng đồng và an ninh quốc gia. Việc sàng lọc nhanh những mẫu nghi ngờ giúp kiểm soát sự lây lan và đảm bảo điều trị chính xác. Phương pháp nuôi cấy truyền thống được xem là “tiêu chẩn vàng” trong xác định B. anthracis và Y. pestis. Tuy nhiên, mặc dù có độ nhạy cao, phương pháp này đòi hỏi thời gian 2 - 3 ngày, một số trường hợp độ đặc hiệu không cao, cần tiến hành các thử nghiệm bổ sung. Ngoài ra, phương pháp nuôi cấy cần tiến hành ở điều kiện phòng an toàn sinh học cấp 3 (Biosafety level 3, BSL-3) với nhân viên được đào tạo và có kinh nghiệm. Các phương pháp miễn dịch được nghiên cứu dưới dạng các que thử nhanh rất thuận tiện nhưng độ nhạy, độ đặc hiệu thấp. Do đó, các phương pháp này khó ứng dụng trong chẩn đoán trên thực địa và phòng chống khủng bố sinh học. Hiện nay, đã có một số kỹ thuật dựa trên PCR dùng để xác định nhanh và chính xác B. anthracis cũng như Y. pestis được phát triển với những ưu điểm nổi bật như độ nhạy, độ đặc hiệu cao và có thể thực hiện với các mẫu đã bất hoạt (nên chỉ 2 cần thực hiện ở điều kiện phòng an toàn sinh học cấp 2). Tuy nhiên, hầu hết các kỹ thuật này chỉ phát hiện một loại plasmid độc lực với từng tác nhân nên không phát hiện được các trường hợp chủng thiếu một trong các plasmid trên. Đối với B. anthracis trong tự nhiên, để chẩn đoán chính xác những chủng gây bệnh, ngoài gen đặc trưng trên nhiễm sắc thể, cần chỉ ra được sự có mặt đầy đủ của hai plasmid độc lực là pXO1 và pXO2. Trong thực tế có những chủng B. anthracis thiếu một trong hai plasmid trên nên khả năng gây bệnh thay đổi. Tương tự, Y. pestis chứa hai plasmid liên quan đến tính độc là pPCP1 và pMT1 với các gen đặc trưng tương ứng. Do đó, các kỹ thuật này có thể không đánh giá được đầy đủ tình trạng độc lực của B. anthracis, Y. pestis và phải phụ thuộc vào thiết bị chuyên dụng đắt tiền nhưng vẫn có thể bỏ sót chẩn đoán, chưa đề cập đến là chúng có thể không phù hợp với một số chủng trong nước. Ở Việt Nam, việc sử dụng các kỹ thuật dựa trên PCR để chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis đã được một số tác giả công bố, tuy nhiên những nghiên cứu này chỉ mới dừng ở việc thiết kế kỹ thuật PCR để chẩn đoán từng loại vi khuẩn trên. Điều này có nghĩa là trong thực tế khi bệnh dịch xảy ra mà chưa biết tác nhân nào được sử dụng, nếu dùng PCR với tác nhân thứ nhất cho kết quả âm tính thì phải dùng PCR lần thứ hai với tác nhân khác, như vậy đòi hỏi thời gian và kinh phí. Do đó, kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR - mPCR) có thể xác định chính xác đồng thời hai loại tác nhân B. anthracis và Y. pestis là một lựa chọn khả thi. Xuất phát từ những vấn đề trên, luận án: “Nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis và Yersinia pestis” được thực hiện với hai mục tiêu: - Phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời B. anthracis và Y. pestis. - Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật multiplex PCR trên các bộ mẫu chuẩn và các chủng phân lập. 3 Đóng góp mới của luận án Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời B. anthracis và Y. pestis. Kỹ thuật multiplex PCR với 6 cặp mồi được thiết kế, tối ưu cho phép khuếch đại đồng thời 7 sản phẩm bao gồm: 3 gen đích là vrrA (thuộc nhiễm sắc thể), pagA (thuộc plasmid pXO1), capA (thuộc plasmid pXO2) của B. anthracis; và 3 gen đích là ypo2088 (thuộc nhiễm sắc thể), pla (thuộc plasmid pPCP1), caf1 (thuộc plasmid pMT1) của Y. pestis, cùng 1 gen chứng nội tại là plasmid tái tổ hợp để xác minh kết quả chẩn đoán. Do đó, khắc phục được hiện tượng dương tính giả đối với trường hợp các chủng vi khuẩn B. anthracis và Y. pestis không đầy đủ độc lực, phân biệt với chủng gây bệnh, giúp giảm giá thành chẩn đoán so với việc phải thực hiện các lần PCR riêng rẽ, rút ngắn thời gian chẩn đoán. 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN B. anthracis VÀ Y. pestis 1.1.1. Tổng quan về vi khuẩn B. anthracis 1.1.1.1. Đặc điểm sinh học B. anthracis là trực khuẩn thuộc chi Bacillus, họ Bacillaceae. Chi Bacillus gồm các vi khuẩn Gram dương sinh bào tử, đa số không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn (Bacillus cereus), một số có lợi cho con người (Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides). Đặc điểm hình thái, tính chất sinh lý, sinh hoá, tính chất nuôi cấy của các loài thuộc chi Bacillus rất giống nhau. Tuy nhiên, B. anthracis có đặc điểm khác biệt với các loài trực khuẩn hiếu khí sinh bào tử khác, đó là có plasmid pXO1 mã hóa cho ngoại độc tố và plasmid pXO2 mã hoá protein vỏ. B. anthracis hình thẳng, hai đầu vuông, kích thước từ 11,51,58 µm, thường xếp thành từng chuỗi dài (Hình 1.1). Ở ngoại cảnh hoặc trong môi trường nuôi cấy, vi khuẩn hình thành bào tử nằm giữa thân và không làm thay đổi hình dạng tế bào. Trên động vật bị bệnh hoặc môi trường nuôi cấy đặc biệt, vi khuẩn có vỏ, không di động (Lê Thu Hồng, 2011; Christine, 2015). Hình 1. 1. B. anthracis trên tiêu bản nhuộm Gram từ bệnh phẩm máu (Nguồn: Christine, 2015) 5 B. anthracis dễ sinh trưởng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37C, pH 6,9 - 7,0. Trên môi trường thạch thường, vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc dạng R (Rough - dạng xù xì), đường kính 4 - 5 mm, màu trắng ngà, bờ không đều, rất dai, bám chặt vào bề mặt môi trường. Trên môi trường thạch máu cừu, vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc không làm tan máu, khuẩn lạc khi được phóng đại vài chục lần có hình thể như búi tóc xoăn hoặc bờm sư tử (Hình 1.2). Vi khuẩn mọc không làm đục trên môi trường lỏng, tạo cặn như bông lắng xuống đáy, lắc không tan. Tính chất lên men đường của B. anthracis bao gồm: Lên men không sinh hơi với các đường glucose, manitol, saccarose, không lên men đường salicin, làm lỏng gelatin, đông huyết tương, không mọc trên môi trường thạch Mac Conkey (Geo, 2013). Hình 1. 2. Khuẩn lạc B. anthracis trên môi trường thạch máu cừu (Nguồn: Christine, 2015) Thể sinh dưỡng của B. anthracis có sức đề kháng không cao, bị diệt ở điều kiện nhiệt độ 60°C trong 30 phút, ở 100°C trong 5 phút và những chất khử trùng thông thường. Thể bào tử có sức đề kháng rất cao, tồn tại trong điều kiện tự nhiên nhiều năm, có thể tới vài chục năm mà vẫn còn khả năng gây bệnh (Geo, 2013). Tuy nhiên, bào tử có thể bị phá hủy bởi hấp ướt ở điều kiện 121°C sau 20 phút (Fasanella, 2003). Độc lực của B. anthracis được tạo thành bởi 2 yếu tố chính đó là ngoại độc tố và protein vỏ. Ngoại độc tố của B. anthracis hợp thành từ 3 yếu tố riêng biệt được mã hóa bởi plasmid pXO1. Yếu tố gây phù làm ức chế chức năng của bạch cầu đa nhân 6 trung tính, yếu tố bảo vệ giúp độc tố xâm nhập vào tế bào chủ và yếu tố gây chết làm tăng hoạt hóa đại thực bào, hoạt hóa quá trình đốt oxy, giải phóng cytokin, bất hoạt protein kinase (Lê Thu Hồng, 2011; Jang, 2011). Protein vỏ có bản chất là chuỗi trùng hợp axit poly-D-glutamic mà sự tổng hợp của nó liên quan đến sự xuất hiện của plasmid pXO2. Plasmid này có thể truyền từ loài có khả năng hình thành vỏ sang loài không có khả năng này (Jang, 2011; Lê Thu Hồng, 2011; Christine, 2015). Những chủng không có khả năng hình thành vỏ cũng mất khả năng gây bệnh và thường được dùng để chế tạo vắc xin (Okinaka, 2014). Bản thân protein vỏ không gây độc nhưng có chức năng bảo vệ vi khuẩn do có khả năng chống lại phức hợp bổ thể và hiện tượng thực bào của bạch cầu. Vỏ của vi khuẩn có thể được hình thành ở động vật mắc bệnh hoặc trên môi trường nuôi cấy ở điều kiện khí trường CO2 5%, được phát hiện bằng các phương pháp như: Nhuộm mực tàu, kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang. Đây cũng là những phương pháp để phân biệt B. anthracis với B. cereus và B. thuringiensis bởi chúng đều không có khả năng tổng hợp vỏ. Với những chủng B. anthracis không có plasmid pXO2, thành tế bào xuất hiện lớp S-layer (Surface layer), gồm 2 loại protein là EA1 (Extractable Antigen 1- Kháng nguyên có thể tách chiết) và Sap (Surface array protein- Protein bề mặt), được mã hóa bởi các gen trên nhiễm sắc thể. Đây là một dạng siêu cấu trúc xuất hiện phổ biến ở một số đơn bào nguyên thủy và các vi khuẩn khác. Lớp S-layer được cho là có vai trò quan trọng trong mối liên hệ giữa vi khuẩn và môi trường bên ngoài, đảm bảo hình dạng vi khuẩn và là nơi gắn kết của các phage. Ngoài ra, S-layer còn có vai trò giúp vi khuẩn chống lại tác động của bổ thể và thay đổi khả năng tiếp cận của đại thực bào vật chủ (Fouet, 1999). 1.1.1.2. Đặc điểm hệ gen Hệ gen của B. anthracis gồm 1 nhiễm sắc thể dạng vòng và 2 plasmid độc lực là pXO1, pXO2. Hệ gen với hàm lượng nucleotide AT cao, GC chỉ chiếm khoảng 35%. Điều này cho thấy DNA của B. anthracis có nhiệt độ nóng chảy thấp hơn các loài khác. Các plasmid tương đối lớn và mã hóa cho nhiều gen khác nhau,