Tài liệu Nghiên cứu phân lập, phân loại, bảo quản một số chủng nấm sợi có hoạt tính gelatinaza và xenlulaza gặp trong môi trường đất khu vực vườn bách thảo - hà nội

1 VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN VĂN BẮC Nghiªn cøu Ph©n lËp, ph©n lo¹i, b¶o qu¶n mét sè chñng nÊm sîi cã ho¹t tÝnh gelatinaza vμ xenlulaza gÆp trong m«i tr−êng ®Êt khu vùc v−ên b¸ch th¶o - Hμ Néi LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 Người hướng dẫn : TS. Lại Văn Hòa Hà Nội - 2012 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Lại Văn Hòa. Các số liệu và kết quả được trình bày trong luận văn này là trung thực có nguồn gốc rõ ràng. Tác giả luận văn Nguyễn Văn Bắc 3 MôC LôC Æt vÊn ®Ò................................................................................................................. Ch−¬ng 1: Tæng quan tµi liÖu ...................................................................... 1.1. VÞ trÝ cña nÊm trong sinh giíi........................................................ 1.2. TÝnh ®a d¹ng cña vi nÊm................................................................ 1.3. Vi nÊm trong ®Êt............................................................................ 1.4. Vai trß cña vi nÊm trong c«ng nghiÖp ........................................... 1.5. §Æc tÝnh ®Æc tr−ng cña vi nÊm....................................................... 1.6. HÖ thèng ph©n lo¹i vi nÊm............................................................. 1.6.1. HÖ thèng ph©n lo¹i cña Robert Shaffer (1969)........................... 1.6.2. HÖ thèng cña Ainsworth & Bisby (1995)................................... 1.7. Nh÷ng vÊn ®Ò chung vÒ c¬ chÕ sinh ho¸ vµ sù ph¸ huû sinh häc do vi nÊm g©y nªn......................................................................... 1.7.1. §Æc ®iÓm ph¸ huû sinh häc do vi nÊm ....................................... 1.7.2. C¸c chÊt trao ®æi chuyÓn ho¸ x©m thùc cña sîi nÊm - c¸c lo¹i enzym vµ c¸c axÝt h÷u c¬ ............................................................. 1.8. C¸c ph−¬ng ph¸p b¶o qu¶n vi nÊm................................................ 1.8.1. Nhãm ph−¬ng ph¸p tiÕp tôc duy tr× sù ph¸t triÓn ...................... 1.8.2. Nhãm ph−¬ng ph¸p lµm kh« ...................................................... 1.8.3. Nhãm ph−¬ng ph¸p lµm ®×nh chØ trao ®æi chÊt .......................... 1.9. Lùa chän c¸c ph−¬ng ph¸p b¶o qu¶n ............................................ 1.10. Nh÷ng nghiªn cøu vÒ ph©n lo¹i vµ b¶o qu¶n vi nÊm ë ViÖt Nam.... Ch−¬ng 2: §èi t−îng, vËt liÖu vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu ......... 2.1. §èi t−îng nghiªn cøu .................................................................... 2.2. VËt liÖu nghiªn cøu........................................................................ 2.2.1. Dông cô, thiết bị ......................................................................... 2.2.2. M«i tr−êng nu«i cÊy ................................................................... 2.2.3. Ho¸ chÊt vµ c¸c c¬ chÊt sinh häc................................................ 2.3. Ph−¬ng ph¸p vµ kü thuËt nghiªn cøu............................................. 2.3.1. Ph−¬ng ph¸p lÊy mÉu ................................................................. 2.3.2. Ph−¬ng ph¸p ph©n lËp................................................................. 2.3.3. Ph−¬ng ph¸p ph©n lo¹i vi nÊm ................................................... 1 3 3 4 5 7 8 9 9 10 12 12 13 16 19 20 22 25 26 28 28 28 28 29 29 30 30 30 30 4 2.3.4. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu mét sè ®Æc ®iÓm sinh häc cña vi nÊm 2.3.5. Ph−¬ng ph¸p b¶o qu¶n c¸c chñng nÊm sîi................................. 2.3.6. Ph−¬ng ph¸p phôc håi ................................................................ Ch−¬ng 3: KÕt qu¶ nghiªn cøu..................................................................... 3.1. KÕt qu¶ ph©n lËp vµ ph©n lo¹i c¸c chñng vi nÊm tõ m«i tr−êng ®Êt khu vùc v−ên B¸ch Th¶o ........................................................ 3.1.1. Thành phần chủng loại vi nÊm trong ®Êt v−ên B¸ch Th¶o ......... 3.1.2. §Æc ®iÓm ph©n lo¹i h×nh th¸i cña c¸c chi vi nÊm ph©n lËp ®−îc 3.2. Lùa chän c¸c chñng nÊm sîi cã ho¹t tÝnh enzym ph©n hñy c¬ chÊt gelatin vµ xenluloza ph©n lËp tõ m«i tr−êng khu vùc v−ên B¸ch Th¶o ®−a vµo b¶o qu¶n........................................................ 3.3. KÕt qu¶ phôc håi cña c¸c chñng nÊm sîi cã ho¹t tÝnh enzym ph©n lËp tõ m«i tr−êng ®Êt khu vùc v−ên B¸ch Th¶o – Hµ Néi sau khi b¶o qu¶n trong glyxerin 10%, -200C vµ trªn silicagel ................. 3.4. Kh¶ sinh enzym ph©n huû c¬ chÊt sinh häc cña c¸c chñng nÊm sîi ph©n lËp ®−îc tõ m«i tr−êng ®Êt v−ên B¸ch Th¶o sau b¶o qu¶n 18 th¸ng.............................................................................................. Ch−¬ng 4: Bµn LuËn ........................................................................................... 4.1. Ph©n lËp, ph©n lo¹i c¸c chñng vi nÊm tõ m«i tr−êng ®Êt khu vùc v−ên B¸ch Th¶o ............................................................................ 4.2. Lùa chän c¸c chñng vi nÊm cã ho¹t tÝnh enzym ph©n huû 2 c¬ chÊt sinh häc (xenluloza, gelatin) ®Ó ®−a vµo b¶o qu¶n............... 4.3. B¶o qu¶n c¸c chñng vi nÊm cã ho¹t tÝnh enzym ®· ®−îc chän b»ng hai ph−¬ng ph¸p: l¹nh s©u (glyxerin 10% ë -200C) vµ trªn silicagel. 4.4. Kh¶ n¨ng sinh enzym ph©n huû c¸c c¬ ch¾t sinh häc cña c¸c chñng nÊm sîi phôc håi sau b¶o qu¶n.......................................... Ch−¬ng 5: KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ................................................................ TµI LIÖU THAM KH¶O ........................................................................................... 33 34 35 36 36 36 40 57 59 66 73 73 75 76 77 79 81 5 C¸c ch÷ viÕt t¾t ATCC American Type Culture Colletion CCRC Culture Collection Research Center IMI International Mycological Institute LS Lạnh sâu SLC Silicagel TBQ Trước bảo quản SBQG Sau bảo quản glyxerin SBQS Sau bảo quản Silicagel DMSO Dimethyl sulfoxide 1 §Æt vÊn ®Ò Nấm (Fungi) lµ một giới sinh vật phổ biến trong tự nhiên. Chóng cã thÓ sinh tr−ëng vµ ph¸t triÓn ë kh¾p mäi n¬i, trªn mäi lo¹i c¬ chÊt víi tèc ®é ph¸t triÓn nhanh, m¹nh. §a phần các nấm đều không thể nhìn thấy được bằng mắt thường, chúng sống phần lớn ở trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc kí sinh trên cơ thể động thực vật và nấm khác. Một số loài nấm có thể nhận thấy được khi ở dạng thể quả, như nấm lớn và nấm mốc. Người ta ước tính giới nấm có khoảng 1,5 triệu loài, khoảng 70.000 loài nấm đã được các nhà phân loại học phát hiện và miêu tả, tuy nhiên tính đa dạng của giới Nấm vẫn còn là điều bí ẩn [29]. Các loài nấm hoại sinh đóng vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất và năng lượng trong tự nhiên. Nấm có thể phân giải các chất hữu cơ phức tạp thành các chất đơn giản, đặc biệt là các chất khó phân giải như xenluloza, ligin thành chất vô cơ. Do đó, nó là yếu tố quan trọng làm tăng độ phì nhiêu của đất. Nấm có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống của con người, chúng có vai trò thực tiễn trong kinh tế, khoa học và các chu trình vật chất, năng lượng trong tự nhiên [30]. Nhiều loài nấm được sử dụng trong công nghệ thực phẩm, sử dụng làm thức ăn hoặc các sản phẩm của quá trình lên men... Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích to lớn đó, nhiều loại nấm lại gây bệnh cho người, động thực vật [32]. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về khu hệ vi nấm trong môi trường không khí tự nhiên, trên các sản phẩm công-nông nghiệp khác nhau, trong dược phẩm, trong đất,... nhưng với số lượng chưa nhiều. Ở nước ta, khí hậu nhiệt đới ẩm rất thích hợp cho sự phát triển của nhiều loại vi nấm, chúng phong phú cả về số lượng và thành phần chủng loại. Để góp phần khảo sát sự đa dạng về thành phần chủng loại, đặc tính sinh học và tìm kiếm các chủng vi nấm mới chưa được phát hiện ở Việt Nam nói chung và ở môi trường đất nói riêng, trong luận văn này chóng t«i tiến hành‘‘ Nghiªn cøu ph©n lËp, ph©n lo¹i, b¶o qu¶n mét sè chñng nÊm sîi cã ho¹t tÝnh gelatinaza vµ xenlulaza gÆp trong m«i tr−êng ®Êt khu vùc V−ên Bách thảo-Hà Nội’’. 2 Mục tiêu của chúng tôi đưa ra là: 1. Phân lập, phân loại một số chủng nấm sợi có hoạt tính gelainaza và xenlulaza gặp trong môi trường đất khu vực Vườn Bách thảo-Hà Nội 2. B¶o qu¶n c¸c chñng vi nÊm ®· ph©n lËp ®ưîc b»ng mét sè phư¬ng ph¸p b¶o qu¶n hiÖn nay 3. Gãp phÇn x©y dùng bé sưu tËp c¸c chñng nÊm sîi cã ho¹t tÝnh enzym phôc vô cho c¸c nghiªn cøu vµ vµo bé sưu tËp gièng cña B¶o tµng gièng chuÈn ViÖt Nam. Néi dung nghiªn cøu 1. Ph©n lËp c¸c chñng nÊm sîi tõ m«i tr−êng ®Êt khu vùc v−ên B¸ch Th¶o 2. Ph©n lo¹i x¸c ®Þnh ®Õn chi, loµi c¸c chñng nÊm sîi ®· ph©n lËp ®−îc. 3. X¸c ®Þnh ho¹t tÝnh enzym ph©n huû mét sè c¬ chÊt sinh häc nh− gelatin, xenluloza cña c¸c chñng nÊm sîi ®· ph©n lËp vµ ph©n lo¹i. 4. B¶o qu¶n c¸c loµi nÊm sîi cã ho¹t tÝnh enzym cao b»ng ph−¬ng ph¸p silicagel vµ b¶o qu¶n trong glyxerin 10% ë nhiÖt ®é -200C. 5. Phôc håi c¸c chñng vi nÊm ®· b¶o qu¶n sau 18 th¸ng, kiÓm tra ®é thuÇn khiÕt, ®é sèng sãt, ®é æn ®Þnh vÒ h×nh th¸i vµ kh¶ n¨ng sinh enzym ph©n huû c¬ chÊt sinh häc cña chóng. 6. X©y dùng bé s−u tËp c¸c chñng nÊm sîi cã ho¹t tÝnh enzym phôc vô cho c¸c nghiªn cøu vµ gãp phÇn vµo bé s−u tËp gièng cña B¶o tµng gièng chuÈn ViÖt Nam. 3 Ch−¬ng 1 Tæng quan tμi liÖu 1.1. VÞ trÝ cña nÊm trong sinh giíi Tr−íc ®©y, nÊm ®−îc xÕp vµo mét ngµnh (Mycota) cña d−íi giíi thùc vËt bËc thÊp. HiÖn nay nÊm kh«ng cßn ®−îc xem lµ mét ngµnh cña d−íi giíi thùc vËt bËc thÊp, mµ nÊm lµ mét giíi riªng biÖt trong thÕ giíi sinh vËt. Theo Takhtajan (1973): “Kh«ng cã c¬ së nµo ®¸ng kÓ ®Ó xÕp nÊm vµo thùc vËt”. Vi nÊm cã hµng lo¹t c¸c ®Æc ®iÓm riªng biÖt sau đây: - Dinh d−ìng: NÊm kh«ng dinh d−ìng theo kiÓu quang hîp nh− thùc vËt hoÆc b»ng kiÓu nuèt thøc ¨n nh− ®éng vËt. NÊm dÞ d−ìng b»ng c¸ch hÊp thô hay thÈm thÊu. NÊm hÊp phô c¸c chÊt dinh d−ìng b»ng c¸ch tiÕt ra ngoµi m«i tr−êng các enzym ®Ó ph©n gi¶i c¸c chÊt cã cÊu tróc phøc t¹p thµnh những chÊt cã cÊu tróc ®¬n gi¶n sau ®ã hÊp phô qua mµng. - CÊu tróc tÕ bµo: C¸c nÊm thËt (Eumycota) cã thµnh phÇn ho¸ häc cña v¸ch tÕ bµo lµ kitin (thùc vËt cã v¸ch tÕ bµo lµ xenluloza). - Sinh ho¸: ChÊt dù tr÷ cña nÊm lµ glycogen gièng nh− ë ®éng vËt còn ở thùc vËt cã chÊt dù tr÷ lµ tinh bét. Ngoµi ra, nÊm cßn h×nh thµnh c¸c s¶n phÈm gièng víi ®éng vËt nh− c¸c axít amin. - Ph−¬ng thøc sèng: NÊm dÞ d−ìng b»ng c¸ch hÊp thô, ®éng vËt dÞ d−ìng b»ng c¸ch nuèt thøc ¨n, thùc vËt dÞ d−ìng b»ng c¸ch quang hîp. - C¸ thÓ ph¸t sinh: Trong qu¸ tr×nh ph¸t triÓn c¸ thÓ c¸c nÊm tiÕn ho¸ cao th× cã giai ®o¹n song h¹ch (ở nấm túi vµ nấm đảm), giai ®o¹n song h¹ch kh«ng cã ë c¸c sinh vËt kh¸c. - C¬ thÓ dinh d−ìng: Sîi ph©n nh¸nh t¹o thµnh hÖ sîi nÊm, nhưng ở thùc vËt cã c¬ thÓ dinh d−ìng d¹ng c©y cã rÔ, th©n, l¸. - Sinh s¶n: NÊm sinh s¶n vµ ph¸t t¸n b»ng bµo tö. 4 Nhê nh÷ng thµnh tùu nghiªn cøu về cÊu tróc nh©n, mµng tÕ bµo, ty thÓ, cÊu tróc ph©n tö ARN riboxom; thµnh phÇn sinh ho¸; ph−¬ng thøc dinh d−ìng… th× gianh giíi gi÷a ®éng vËt vµ thùc vËt bÞ mê ®i, mµ râ nÐt lµ gianh giíi gi÷a sinh vËt kh«ng nh©n vµ sinh vËt cã nh©n. HiÖn nay, cã nhiÒu quan ®iÓm kh¸c nhau vÒ viÖc xÕp c¸c ngµnh nÊm vµo c¸c giíi sinh vËt. Theo hÖ thèng 5 giíi cña Whittaker (1978) th× c¸c ngµnh nÊm ®−îc xÕp vµo 2 giíi kh¸c nhau: C¸c ngµnh nÊm nhÇy tÕ bµo (Acrasiomycota), nÊm nhÇy thËt (Myxomycota), nÊm trøng (Oomycota) vµ nÊm cæ (Chytridiomycota) ®−îc xÕp vµo giíi Protoctista; c¸c ngµnh nÊm tiÕp hîp (Zygomycota), nÊm tói (Ascomycota), nÊm ®¶m (Basidiomycota), nÊm bÊt toµn (Deuteromycota) vµ ®Þa y (Lichenomycota) ®−îc xÕp vµo giíi nÊm. Theo Whittaker giíi nÊm chØ gåm 2 ngµnh nÊm tiÕp hîp (Zygomycota) vµ ngµnh nÊm thËt (Eumycota), trong dã ngµnh nÊm thËt bao gåm 4 ph©n ngµnh: nÊm tói (Ascomycotina), nÊm ®¶m (Basidiomycotina), nÊm bÊt toµn (Deuteromycotina) vµ ®Þa y ( Lichenes). Ngoµi ra cßn cã mét sè hÖ thèng kh¸c nh− hÖ thèng 6 giíi cña Lucile Mc Cook (n¨m 2004), hÖ thèng 7 giíi cña Bryce Kendrick (2001). 1.2. TÝnh ®a d¹ng cña vi nÊm Vi nÊm cã kh¶ n¨ng ph¸t triÓn ë hÇu hÕt c¸c d¹ng sinh th¸i, cã thÓ sö dông hÇu hÕt c¸c s¶n phÈm tù nhiªn vµ c¸c s¶n phÈm do con ng−êi lµm ra. Chóng lµ sinh vËt ®Çu tiªn vµ lý t−ëng sinh tr−ëng ë vïng hoang d·, v× chóng cã kh¶ n¨ng thay ®æi ®Ó thÝch nghi víi ®iÒu kiÖn sèng. VÝ dô, c¸c loµi cña chi Aureobasidium cã thÓ sinh tr−ëng ë n¬i nhiÖt ®é thÊp (vïng Antarctica) trªn c¸c hßn ®¸ ë nhiÖt ®é tõ -100 ®Õn -200, cã thÓ chèng chÞu ë nhiÖt ®é thÊp tõ 700C ®Õn -800C. Nh−ng chi nµy còng cã nh÷ng loµi cã thÓ sinh tr−ëng ë vïng nhiÖt ®íi. PhÇn lín c¸c vi nÊm lµ hiÕu khÝ vµ sinh tr−ëng ë môi trường có ho¹t ®é n−íc cao. Nh−ng ng−êi ta ®· ph¸t hiÖn ®−îc vi nÊm kþ khÝ ë d¹ cá cña cõu (Yarlett vµ CS, 1986) vµ còng ®· ph¸t hiÖn ®−îc nhiÒu loµi sinh tr−ëng ®−îc ë 5 c¸c c¬ chÊt cã ho¹t ®é n−íc thÊp (aw <1). Một nhóm loài nấm mốc đặc trưng, đáng chú ý là nhóm loài nấm mốc ưa khô, gồm các loài có khả năng tăng trưởng trên sản phẩm có hoạt độ nước thấp, chúng phát triển được trong các điều kiện môi trường khô lạnh, trên các sản phẩm sấy khô, cô đặc hoặc ướp muối, ướp đường. Nhóm loài nấm mốc đặc trưng này gồm một số loài thuộc các chi Nấm bất toàn ( Deuteromycotina, Fungi imperfecti) như Aspergillus, Chrysosporium, Cladosporium,... và Nấm túi như Eurotium, Eremascus,... Các loài A. Restrictus, E. Rubrum, E. Amstelodami, Wallemia sebi,...gặp được ở các phòng bảo quản có nhiệt độ 16 ± 10C và độ ẩm tương đối của không khí 70 ± 2% [1]. N¨m 1991, ViÖn nÊm quèc tÕ (IMI) ®· ®−a ra danh s¸ch c¸c vËt chñ vµ c¬ chÊt cã thÓ ph©n lËp nÊm. Chóng ta cã thÓ ph©n lËp nÊm sèng ký sinh, céng sinh hoÆc g©y bÖnh cho t¶o, rªu, thùc vËt vµ c¸c loµi nÊm kh¸c (bao gåm c¶ ®Þa y), ®éng vËt ch©n ®èt, c¸c ®éng vËt kh«ng x−¬ng sèng vµ cã x−¬ng sèng. Kh«ng khÝ, ®Êt, n−íc, ph©n, thøc ¨n, c¸c s¶n phÈm thùc vËt, dÇu khÝ vµ một số d−îc phÈm còng lµ nguån ph©n lËp được vi nÊm. 1.3. Vi nÊm trong ®Êt Vi nÊm lµ thµnh phÇn nhiÒu nhÊt trong sinh khèi cña hÖ vi sinh vËt trong ®Êt, mÆc dï sè l−îng cña chóng trong c¸c ®Üa m«i tr−êng pha lo·ng khi ph©n lËp thÊp h¬n vi khuÈn. Nấm có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống của con người, chúng có vai trò thực tiễn trong nền kinh tế, khoa học và các chu trình vật chất, năng lượng trong tự nhiên. Vi nÊm lµ vi sinh vËt g©y môc n¸t chÝnh trong ®Êt, ®Æc biÖt lµ ®Êt rõng, chúng phân giải các chất hữu cơ, các cành lá khô của thực vật thành chất mùn, chất khoáng. Nã tham gia ph©n huû xenluloza, kitin vµ licnin trong líp ®Êt bÒ mÆt, do đó là yếu tố quan trọng làm tăng độ phì nhiêu của đất. NÊm ®Êt bao gåm c¸c loµi thuéc líp: Zygomycetes, Ascomycetes, Deutermycetes, Basidiomycetes vµ mét vµi loµi thuéc hä Pythiaceae cña líp Oomycetes. HÇu hÕt chóng sèng ho¹i sinh, mét sè sèng ký 6 sinh hoÆc b¸n kÝ sinh trªn rÔ c©y. NhiÒu loµi Basidiomycetes d¹ng sîi sèng ë trong ®Êt rÊt khã ph©n lËp b»ng c¸c kü thuËt c¬ b¶n. Chóng sèng céng sinh ®Æc hiÖu víi c©y rõng (nÊm rÔ - ectomycorrhizal), hoÆc sèng ho¹i sinh ph©n huû gç, r¸c. Mét sè vi nÊm cã bµo tö ®éng th−êng sèng trong n−íc cã thÓ cã mÆt trong ®Êt, chóng ®−îc nghiªn cøu b»ng c¸c kü thuËt ®Æc biÖt. NÊm tån t¹i trong ®Êt ë d¹ng sîi, bµo tö (v« tÝnh hoÆc h÷u tÝnh), bµo tö ¸o hoÆc c¸c thÓ h¹ch nÊm. ChØ cã giai ®o¹n sîi míi cã c¸c ho¹t ®éng trao ®æi chÊt ®¸ng kÓ, c¸c giai ®o¹n sau lµ giai ®o¹n ngñ để phôc håi cÊu tróc, khi đó ho¹t ®éng trao ®æi chÊt Ýt vµ cã tÇm quan träng h¹n chÕ trong viÖc chuyÓn ho¸ ®Êt. NÊm sèng trong ®Êt hÇu hÕt ë tr¹ng th¸i ngñ. §Ó ph©n tÝch nÊm ®Êt cÇn cã c¸c hiÓu biÕt vÒ sinh th¸i häc ®Ó ph©n biÖt gi÷a d¹ng sîi vµ tr¹ng th¸i nghØ cña chóng. Kü thuËt ph©n lËp nấm trong ®Êt bao gåm: Kü thuËt kh«ng ®Æc hiÖu vµ kü thuËt ®Æc hiÖu. C¸c kü thuËt nµy ®−îc Kjoler vµ Struwe (1982), Jensen et al (1986) vµ Gams (1998) tæng hîp vµ giíi thiÖu nh− sau [16]: Kü thuËt cÊy ®Üa pha lo·ng (Koch’s ches PlattenguBverfahren): Kü thuËt nµy ®−îc sö dông nhiÒu nhÊt ®Ó x¸c ®Þnh sè l−îng c¸c vi nÊm ph¸t sinh bµo tö. §èi víi vi nÊm Ýt bµo tö dïng ph−¬ng ph¸p nµy kh«ng chÝnh x¸c. Kü thuËt ®Üa ®Êt cña Warcup (1950) Trong kỹ thuật pha lo·ng, mét l−îng ®Êt lín h¬n cã xu h−íng l¾ng nhanh trong hçn dÞch vµ mÊt ®i trong qu¸ tr×nh hoµ tan, do ®ã c¸c chñng nÊm trong c¸c phøc hîp ®Êt h¹t to Ýt khi ph©n lËp ®−îc. Kü thuËt Warcup kh¾c phôc ®−îc nh−îc ®iÓm nµy. Kü thuËt röa ®Êt (Parkinsons & Williams 1961, Gams vµ Domsch 1967) Hai kü thuËt ®Çu ®−îc sö dông ®Ó ph©n lËp c¸c vi nÊm tån t¹i ë c¸c d¹ng bµo tö. §Ó ph©n lËp c¸c vi nÊm tõ c¸c m¶nh d¹ng sîi ph¶i dïng ph−¬ng ph¸p röa ®Êt. Trong ph−¬ng ph¸p nµy hÇu hÕt c¸c bµo tö ®−îc lo¹i bá. C¸c mÉu ®Êt ®−îc röa kÕt hîp víi r©y, nhê ®ã c¸c m¶nh nhá víi c¸c kÝch th−íc