Tài liệu Nghiên cứu phòng trừ bệnh đạo ôn (pyricularia grisea) hại lúa bằng vi sinh vật đối kháng streptomyces và bacillus bản địa ở đồng bằng sông cửu long tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ----------------------- NGUYỄN THỊ PHONG LAN NGHIÊN CỨU PHÒNG TRỪ BỆNH ĐẠO ÔN (PYRICULARIA ORYZAE) HẠI LÚA BẰNG VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG STREPTOMYCES VÀ BACILLUS BẢN ĐỊA Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 62.62.01.12 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP CẦN THƠ - 2016 Công trình được hoàn thành tại: VIỆN LÚA ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Người hướng dẫn khoa học: 1.PGS. TS. Trần Thị Cúc Hòa 2. TS. Bùi Thị Thanh Tâm Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long ngày .... tháng..... năm..... Có thể tìm hiểu luận án tại: 1. Thư Viện Quốc gia 2. Thư Viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 3. Thư Viện Viện Lúa ĐBSCL MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Nền nông nghiệp ở các nước đang phát triển luôn phải chịu áp lực của thâm canh, tăng vụ, sản xuất phải đáp ứng tăng năng suất và tăng sản lượng. Trong điều kiện thâm canh cao kết hợp với tác động của biến đổi khí hậu, dịch hại trên cây trồng ngày càng trở nên đa dạng và nghiêm trọng hơn. Bệnh đạo ôn trên lúa do nấm Pyricularia oryzae Cav. gây ra là một trong những dịch bệnh có lịch sử lâu đời với địa bàn phân bố rộng và tác hại nghiêm trọng đối với tất cả các quốc gia trồng lúa trên thế giới, ở ĐBSCL ước tính năng suất lúa giảm khoảng 20-50% khi trồng giống bị nhiễm bệnh. Mặc dù có rất nhiều nghiên cứu về chọn tạo giống kháng bệnh đạo ôn, các kỹ thuật canh tác trong quy trình sản xuất để đối phó với bệnh đạo ôn. Tuy nhiên trong thực tế sản xuất, việc sử dụng thuốc hóa học vẫn là giải pháp tình thế được chấp nhận phổ biến nhất, chưa có nghiên cứu nào thật sự đưa ra biện pháp quản lý bền vững và an toàn cho vấn đề bệnh đạo ôn đang diễn ra liên tiếp ở ĐBSCL. Phòng trừ sinh học (PTSH) là một lĩnh vực còn rất nhiều tiềm năng cần được khai thác và ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp. Vì vậy, cần thiết nghiên cứu những mặt tích cực của nguồn tài nguyên phong phú này trên từng vùng sinh thái chuyên biệt, tái lập lại sự cân bằng vốn có của hệ sinh thái - nền tảng của nền nông nghiệp bền vững. Xuất phát từ những nhu cầu thực tế của sản xuất nông nghiệp, kết hợp với tiềm năng của hệ sinh thái cây lúa nước vùng ĐBSCL, đề tài “Nghiên cứu phòng trừ bệnh đạo ôn (Pyricularia oryzae) hại lúa bằng vi sinh vật đối kháng Streptomyces và Bacillus bản địa ở Đồng bằng sông Cửu Long” được đề xuất thực hiện nhằm xác định mức độ đa dạng sinh học của nguồn vi sinh vật có ích hiện diện trên cùng hệ sinh thái với cây lúa vùng ĐBSCL và hướng khai thác nguồn tài nguyên sẳn có bổ sung vào các giải pháp quản lý bệnh đạo ôn theo hướng an toàn sinh học, thân thiện môi trường. 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Tuyển chọn nguồn vi sinh vật có ích từ đất vùng trồng lúa và sử dụng nguồn vi sinh vật đối kháng có khả năng kiểm soát bệnh đạo ôn ở điều kiện ngoài đồng. - Đề xuất giải pháp phòng trừ sinh học trong quản lý bệnh đạo ôn an toàn và bền vững ở ĐBSCL. 3. Ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn và tính mới của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp cơ sở dữ liệu, phương pháp luận trong nghiên cứu vi sinh vật đối kháng với nấm P. oryzae, trong đó đặc biệt là nghiên cứu, sử dụng xạ khuẩn Streptomyces, vi khuẩn, .... Kết quả này có thể bổ sung cho giáo trình giảng dạy và tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu trong lĩnh vực tương tự. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu với các dòng xạ khuẩn, vi khuẩn có thể ứng dụng trong thực tiển sản xuất lúa ở ĐBSCL nhằm quản lý sinh học, an toàn đối với bệnh đạo ôn, một bệnh hại chính trên lúa, góp phần giảm thiểu thuốc hóa học, đảm bảo môi sinh an toàn. 3.3 Tính mới của đề tài - Xác định nguồn tác nhân phòng trừ sinh học có hiệu quả cao đối với bệnh đạo ôn hại lúa ở điều kiện ngoài đồng. - Xây dựng quy trình phòng trừ sinh học bệnh đạo ôn sử dụng nguồn vi sinh vật bản địa đạt hiệu quả, góp phần bảo vệ môi trường, phục vụ sản xuất lúa gạo an toàn. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4.1. Đối tượng nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu là các tác nhân sinh học hiện diện trong hệ sinh thái cây lúa nước vùng ĐBSCL (xạ khuẩn, vi khuẩn) có khả năng đối kháng với các nguồn nấm Pyricularia oryzae gây 1 bệnh đạo ôn; bổ sung vào các giải pháp khoa học công nghệ hiện có nhằm nâng cao hiệu quả quản lý bệnh đạo ôn an toàn và bền vững. 4.2. Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trên các vùng trồng lúa ở ĐBSCL. 4.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu : Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm, nhà lưới và khu ruộng thí nghiệm của Bộ môn Bảo vệ thực vật, Viện Lúa ĐBSCL, từ tháng 6 năm 2012 đến tháng 6 năm 2015. 4.4. Bố cục luận án: Luận án gồm 161 trang không kể Tài liệu tham khảo; 59 bảng; 61 hình. CHƯƠNG 1 CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cơ sở khoa học của đề tài Trong nền nông nghiệp hiện đại, phòng trừ sinh học (PTSH) sẽ trở nên phổ biến hơn, là chiến lược nhằm để giảm lạm dụng thuốc hóa học quản lý bệnh hại cây trồng, vì vậy việc sử dụng tác nhân sinh học hạn chế sự phát triển của các quần thể sinh vật gây hại là một trong những vấn đề được quan tâm và đánh giá cao. 1.1.1. Sử dụng hiệu quả nguồn tác nhân phòng trừ sinh học bản địa Phòng trừ sinh học (PTSH) là hướng nghiên cứu bảo vệ cây trồng an toàn với môi trường và bền vững đối với các loại dịch hại cây trồng, là xu thế phát triển của nền nông nghiệp sạch mà nhiều quốc gia trên thế giới đang hướng tới. Xạ khuẩn là một trong những nhóm tác nhân PTSH có tiềm năng rất lớn. Chi Streptomyces có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme thủy phân có hoạt tính cao, chất kháng sinh có khả năng chống nấm mạnh, phổ tác dụng rộng, tạo nguồn sản xuất các chế phẩm hữu ích (Lê Gia Hy,1994). Vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng (PGPR) là một nhóm tác nhân PTSH lớn với các chi Pseudomonas, Bacillus, Azospirillum, Rhizobium và Serretia, hoạt động với rất nhiều cơ chế như: sản xuất siderophores, tạo kháng sinh có phổ tác dụng rộng, tạo enzymes chitinases, glucanases thủy phân vách tế bào nấm bệnh, cạnh tranh dinh dưỡng, không gian sống… với các sinh vật gây bệnh. Sử dụng hiệu quả nguồn tác nhân bản địa trong PTSH là một lĩnh vực còn rất nhiều tiềm năng khai thác ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp. 1.1.2. Phòng trừ sinh học hướng đến nông nghiệp sạch, nông sản an toàn Nghiên cứu PTSH bệnh hại lúa bắt đầu từ khoảng 1980, tại Viện Nghiên Cứu Lúa Quốc Tế (IRRI) một số nghiên cứu kiểm soát bệnh hại lúa sử dụng vi khuẩn, Trichoderma spp. (Mew and Rosales, 1986; Rosales and Mew, 1997) hay xạ khuẩn (Bonjar et al., 2006; Tan et al., 2006). PTSH ở nước ta bước đầu đã có những kết quả khả quan, một số nghiên cứu tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng tạo kháng sinh có hiệu quả cao trong kiểm soát một số bệnh hại cây trồng ở các tỉnh phía Bắc (Lê Gia Hy, 1994; Bùi Thị Việt Hà, 2006). Ở ĐBSCL,trong những năm gần đây đã có những nghiên cứu về tác nhân PTSH trong quản lý bệnh đạo ôn hại lúa, tuy nhiên hầu hết kết quả đang ở giai đoạn phòng thí nghiệm và nhà lưới. Nghiên cứu sử dụng tác nhân sinh học sản xuất chế phẩm phòng trừ bệnh đạo ôn là rất cần thiết hiện nay, phát triển PTSH bệnh đạo ôn hại lúa trên diện rộng sẽ góp phần làm giảm thiểu lượng thuốc hóa học đang sử dụng phổ biến, góp phần bảo vệ môi trường và xây dựng nền nông nghiệp sạch, hướng đến nông sản an toàn. 1.2. Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước 1.2.1. Bệnh đạo ôn hại lúa- tác nhân gây bệnh và sự biến động của quần thể nấm gây bệnh đạo ôn Bệnh do nấm Pyricularia oryzae Cav., thuộc họ Moniliacea, bộ Miniliales, lớp nấm bất toàn, giai đoạn hữu tính là Magnaporthe oryzae thuộc lớp nấm nang. Bệnh đạo ôn là một trong những dịch hại quan trọng phân bố ở hầu hết các vùng trồng lúa trên thế giới (Ou, 1985). Theo ước tính của FAO thiệt hại do bệnh này gây ra làm giảm năng suất lúa trung bình từ 0,7-17,5%, những nơi 2 thiệt hại nặng có thể làm giảm đến 80%. Mặc dù có rất nhiều loại thuốc BVTV được sử dụng trong phòng trị bệnh đạo ôn và sự cố gắng của các nhà khoa học trong cải tiến giống lúa kháng bệnh đạo ôn qua phương pháp truyền thống hoặc với sự hỗ trợ của công nghệ sinh học, bệnh đạo ôn vẫn được xem như là dịch hại quan trọng của cây lúa. Trong những năm gần đây, bệnh đạo ôn diễn ra liên tiếp ở ĐBSCL, gây hại trên diện tích lớn tất cả các vụ lúa trong năm, diễn biến bệnh không theo quy luật nhất định đã gây nhiều khó khăn cho chỉ đạo sản xuất. Sự biến động của quần thể nấm P. oryzae đã được nhiều nước trên thế giới quan tâm như Nhật (Kiyosawa, 1976), Philippines (Kiyosawa et al., 1981), Mỹ (Levy et al., 1991), Pháp (Roumen et al., 1997), Thái Lan (Mekwatanakarn et al., 2000), Hàn Quốc (Kang & Lee, 2000). IRRI đã phát triển bộ giống chỉ thị đơn gen để phân tích đặc tính của quần thể nấm gây bệnh và sử dụng trong kỹ thuật lai tạo giống kháng bệnh đạo ôn (Tsunematsu et al., 2000). 1.2.2. Tình hình sử dụng hóa chất trong sản xuất nông nghiệp Việt Nam là nước nông nghiệp với diện tích canh tác lớn, điều kiện khí hậu thuận lợi, chủng loại cây trồng phong phú nên dịch hại phát triển đa dạng và nước ta cũng là một trong những quốc gia sử dụng thuốc bảo vệ thực vật nhiều nhất thế giới. Vì vậy, giảm lượng thuốc BVTV trong sản xuất nông nghiệp là việc làm cấp bách để giảm thiểu những tác hại đến môi trường, tìm kiếm những hướng nghiên cứu, công nghệ sản xuất mới nhằm tạo ra các sản phẩm mới có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu bệnh nhưng an toàn hơn với con người và môi trường. 1.2.3. Phòng trừ sinh học hướng đến nền nông nghiệp sạch nông sản an toàn VSV đối kháng rất có lợi cho việc bảo vệ cây trồng khỏi bị sâu bệnh tấn công. Số lượng VSV có ích trong tự nhiên thường có nhiều hơn so với số lượng VSV gây hại (Cook and Baker, 1983) , tuy nhiên do tác động của quá trình sản xuất, của những diễn biến bất thường của biến đổi khí hậu đã gây không ít tổn thương cho hệ vi sinh vật này. Trong PTSH, VSV có thể được sử dụng dưới hai hình thức: (i) nhân nuôi rồi phun lên cây hoặc bón vào đất để trừ dịch hại; (ii) bảo tồn làm cho quần thể VSV có ích phát triển mạnh trong tự nhiên, biện pháp này gọi là bảo tồn cân bằng sinh thái hoặc là quản lý dịch hại tổng hợp (IPM). + Vi sinh vật vùng rễ và tiềm năng sử dụng trong PTSH Nguồn VSV có ích, đặc biệt là nhóm xạ khuẩn và vi khuẩn vùng rễ trong hệ sinh thái cây lúa vùng ĐBSCL rất đa dạng về chủng loại và tính năng sử dụng, cần được phát triển, khai thác và bảo tồn. Vi khuẩn vùng rễ (VKVR) là nhóm tác nhân PTSH có rất nhiều triển vọng nhờ vào khả năng tiết ra chất kích thích tăng trưởng cây trồng, chất ức chế hoặc làm suy yếu tác nhân gây bệnh hại cây hay những yếu tố khác như tiết siderophores, HCN, cạnh tranh dinh dưỡng, ....(Kloepper and Schroth, 1978), việc phối hợp các VSV có tác động kích thích tính kháng theo nhiều cơ chế khác nhau rất triển vọng trong việc cải thiện hiệu quả quản lý bệnh khi các cơ chế kháng được kích họat cùng lúc (Verhagen et al., 2004). Nghiên cứu gần đay ghi nhận vi khuẩn có khả năng ức chế sự hình thành và phát triển của đĩa áp nấm M.oryzae đồng thời kích thích tính kháng lưu dẫn (ISR) thông qua truyền dẫn tín hiệu JA và ET giúp giảm số lượng vết bệnh hình thành (Spence et al., 2014). Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật có khả năng tạo kháng sinh mạnh, có khả năng sản sinh sidorephore, kích thích tính kháng, khả năng tiết các enzyme thủy phân vách tế bào như cellulases, hemicellulases, chitinases, amylases và glucanases, đặc biệt chi Streptomyces được biết đến với khả năng sản xuất của nhiều enzyme ngoại bào, bao gồm cả chitinases, do đó thường xạ khuẩn có khả năng chống lại những loại nấm bệnh gây hại cho cây trồng (Gupta et al., 1995). 3 PTSH là một lĩnh vực còn rất nhiều tiềm năng khai thác ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp, vì vậy cần phải nghiên cứu những mặt tích cực của nguồn tài nguyên phong phú này, tái lập lại sự cân bằng vốn có của hệ sinh thái- nền tảng của nền nông nghiệp thân thiện với môi trường. CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu - Nguyên vật liệu bao gồm các trang thiết bị trong Phòng thí nghiệm vi sinh như tủ thanh trùng, tủ sấy, tủ lạnh trữ mẫu, tủ cấy vi sinh, kính hiển vi, kính lúp, phòng lây nhiễm bệnh, các dụng cụ thủy tinh. Môi trường nuôi cấy vi sinh các loại (PDA, RSA, NA, Gause, NB, ISP 1-9,...), các giống lúa nhiễm bệnh đạo ôn IR50404, OM7347; giống lúa chống chịu tốt bệnh đạo ôn OM5451,OM8959; phân bón, thuốc BVTV, khay chậu và các vật liệu khác... - Địa điểm: Phòng thí nghiệm, nhà lưới và khu ruộng thí nghiệm thuộc Viện Lúa ĐBSCL, Mô hình triển khai ở các địa phương. - Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6/2012 đến tháng 8/2015. 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Thu thập, phân lập và chọn lọc các chủng vi sinh vật - Thu thập, phân lập và xác định độc tính nguồn nấm bệnh đạo ôn - Thu thập, phân lập và sơ tuyển các chủng vi sinh vật đối kháng với nấm P. oryzae 2.2.2. Đánh giá khả năng kiểm soát bệnh đạo ôn trên lúa của các chủng vi sinh vật trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng - Kiểm tra khả năng gây bệnh và xác định độ an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật đã được chọn trong phòng thí nghiệm. - Xác định một số yếu tố nâng cao hiệu quả sử dụng vi sinh vật: mật số vi sinh vật tối thiểu, thời điểm xử lý. - Đánh giá khả năng kiểm soát bệnh đạo ôn của các chủng vi sinh vật trong điều kiện nhà lưới. - Đánh giá khả năng kiểm soát bệnh đạo ôn của các chủng vi sinh vật ở điều kiện ngoài đồng 2.2.3. Xây dựng qui trình PTSH bệnh đạo ôn hại lúa và triển khai Mô hình ứng dụng qui trình PTSH bệnh đạo ôn hại lúa. - Xác định một số chủng có triển vọng, gửi mẫu định danh . - Nghiên cứu môi trường nhân nhanh sinh khối vi sinh vật có triển vọng đảm bảo mật số, thời gian và hoạt tính. - Xây dựng qui trình PTSH bệnh đạo ôn hại lúa và triển khai mô hình ứng dụng qui trình PTSH bệnh đạo ôn hại lúa. 2.2.4. Kết hợp PTSH vào Mô hình Quản lý tổng hợp bệnh đạo ôn hại lúa ở ĐBSCL - Kết hợp sử dụng nguồn xạ khuẩn S. variabilis S28 vào Mô hình quản lý tổng hợp bệnh đạo ôn triển khai diện rộng 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Thu thập, phân lập và chọn lọc nguồn vi sinh vật: + Thu thập, phân lập và xác định độc tính nguồn nấm P. oryzae gây bệnh đạo ôn: mẫu bệnh đạo ôn trên lúa đã được thu thập ở 10 tỉnh: Long An, Trà Vinh, Cần Thơ, Sóc Trăng, Tiền Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, An Giang, Kiên Giang và Bạc Liêu trong vụ Hè Thu 2012. Phân lập nấm theo phương pháp của IRRI (1996) có cải tiến. - Đánh giá độc tính của nguồn nấm với bộ chuẩn nòi Nhật theo phương pháp Kiyosawa (1984). - Phân nòi các nguồn nấm P. oryzae theo phương pháp của Nagao và Fukuta (2009): mỗi mẫu nấm được lây nhiễm nhân tạo trên bộ giống đơn gen (31 giống) và giống chuẩn nhiễm LTH. 4 Phản ứng của các giống được đánh giá theo qui trình chuẩn của IRRI (SES, 1996) + Thu thập, phân lập và chọn lọc các chủng vi sinh vật đối kháng với nấm P. oryzae: Mẫu đất ruộng, đất vùng rễ ở các ruộng thu mẫu bệnh đạo ôn ở 10 tỉnh được thu thập để phân lập xạ khuẩn và vi khuẩn vùng rễ trong vụ Hè Thu 2012. Phân lập xạ khuẩn và vi khuẩn theo phương pháp pha loãng và trãi trên môi trường thích hợp (Hardoim et al., 2008, Hayakawa et al., 1991). + Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển nấm P. oryzae của các chủng vi sinh vật trong điều kiện in vitro. - Đánh giá khả năng đối kháng với 10 nòi nấm P. oryzae phổ biến Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên đầy đủ (CRD) với 4 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức là một chủng vi sinh vật trắc nghiệm theo phương pháp của Shahidi Bonjar (2003). Các chủng vi sinh vật trong thí nghiệm bao gồm: 20 chủng xạ khuẩn: S15, S27, S28, S29, S30, S44, S52, S53, S82, S132, S136, 2177, S178, S233, S268, S269, S271, S273, S288, S380 và 20 chủng vi khuẩn: B23, B24, B26, B29, B30, B39, B40, B42, B44, B54, B104,B122, B142, B155, B270,B311, B312, B325, B370, B398. Chỉ tiêu theo dõi: bán kính vô khuẩn (BKVK) ở giai đoạn 14 ngày sau thí nghiệm đối với xạ khuẩn và 5 ngày đối với vi khuẩn. - Khảo sát đặc tính sinh học và cơ chế sinh hóa liên quan đến khả năng kểm soát bệnh của một số chủng vi sinh vật triển vọng: đặc điểm hình thái (màu sắc khuẩn ty, sắc tố tan, sự hình thành sắc tố melanin), khả năng đồng hóa các nguồn cacbon (glucose, maltose, fructose, lactose, sucrose), khả năng chịu muối, sinh enzyme ngoại bào, tiết IAA, sinh catalase, thủy phân tinh bột, casein, tiết siderophore, tạo protease, .... 2.3.2. Đánh giá khả năng kiểm soát bệnh đạo ôn trên lúa của các chủng vi sinh vật trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng: Các thí nghiệm trong nhà lưới được thực hiện từ tháng 4/2013 đến tháng 10/2013 tại nhà lưới Bộ môn Bảo vệ thực vật, Viện Lúa ĐBSCL. +Kiểm tra khả năng gây bệnh: các chủng vi sinh vật chọn lọc cho các thí nghiệm nhà lưới được kiểm tra khả năng gây bệnh trên cây lúa (Pathogenicity test). Cây lúa giống IR50404 ở giai đoạn 15 ngày tuổi được phun với các chủng vi sinh vật 2 lần cách nhau 7 ngày. Chỉ tiêu theo dõi : quan sát, ghi nhận các triệu chứng lạ trên cây lúa ở 3, 7, 14 ngày sau lây bệnh (NSLB). + Xác định một số yếu tố nâng cao hiệu quả sử dụng vi sinh vật: - Xác định mật số vi sinh vật tối thiểu: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên đầy đủ (RCD) 3 lần lặp lại với 11 nghiệm thức, mật số vi sinh vật xử lý bao gồm: 108, 109 và 1010 bt/ml đối với xạ khuẩn và 107, 108 và 109 cfu/ml đối với vi khuẩn, nghiệm thức phun P. oryzae riêng rẽ được bố trí làm đối chứng. Cây lúa được lây nhiễm nấm P. oryzae ở 15 ngày sau khi gieo. Mỗi chủng vi sinh vật trắc nghiệm được phun 2 ngày trước và 2 ngày sau khi lây bệnh. Chỉ tiêu theo dõi: ghi nhận tỷ lệ bệnh ở 14NSLB và tính hiệu quả giảm bệnh. - Xác định thời điểm xử lý vi sinh vật : thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên đầy đủ với 7 nghiệm thức và 3 lần lặp lại với chủng vi khuẩn B26 và chủng xạ khuẩn S28. Mỗi chủng vi sinh vật được phun trước hoặc sau khi cây lúa được chủng bệnh, Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh ở 7, 14 và 21NSLB. +Khả năng kích thích cây lúa tăng trưởng: thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên đầy đủ với 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức là một chủng vi sinh vật, 10 chủng xạ khuẩn S27, S28, S29, S30, S44, S132, S136, S233, S288, S380 và mười chủng vi khuẩn B26, B44, B54, B104, B122, B142, B270, B311, B312, B370 được xử lý hạt giống. Hạt giống lúa IR50404 được xử lý thanh trùng ngâm sau 24giờ vớt ra ngâm tiếp vào huyền phù xạ khuẩn 109bt/ml hoặc vi khuẩn mật số 108cfu/ml trong 1 giờ. Sau đó ủ hạt ở điều kiện 30oC có đủ ẩm độ để hạt nảy mầm. Gieo vào khay cát đã thanh trùng, 5 quan sát các chỉ tiêu sinh trưởng sau 7, 14 ngày sau gieo. Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, trọng lượng rễ khô, chiều cao cây mạ ở 7, 14 ngày sau khi gieo (NSG). + Khả năng phòng trị bệnh đạo ôn trên lúa của các chủng vi sinh vật ở điều kiện nhà lưới - Nguồn vi sinh vật: 10 chủng xạ khuẩn S27, S28, S29, S30, S44, S132, S136, S233, S288, S380 và 10 chủng vi khuẩn B26, B44, B54, B104, B122, B142, B270, B311, B312, B370. Nguồn nấm phổ biến Pg2. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên đầy đủ với 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức là 1 chủng vi sinh vật. Nguồn nấm P. oryzae và các nguồn vi sinh vật đã được chọn lọc được nhân nuôi trên môi trường thích hợp để nhân mật số. Cây lúa được lây nhiễm ở 15NSG. Mỗi chủng vi sinh vật trắc nghiệm được phun 2 ngày trước và sau khi cây lúa được chủng bệnh, nghiệm thức đối chứng phun P. oryzae. Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh ở các giai đọan 7, 14, 21NSLB. + Đánh giá khả năng kiểm soát bệnh đạo ôn của các chủng vi sinh vật ở điều kiện ngoài đồng Thí nghiệm được thực hiện tại Viện Lúa ĐBSCL trong vụ Đông Xuân 2013 -2014 và Hè Thu 2014, phân bón: 100-40-30 kg/ha(N-P2O5-K2O) vụ Đông Xuân và 80-40-30 kg/ha (N-P2O5-K2O) vụ Hè Thu. Giống lúa OM7347. Thí nghiệm được bố trí kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên (RCBD), 8 nghiệm thức, 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức là 1 chủng vi sinh vật. Mỗi chủng VSV trắc nghiệm được phun định kỳ 2 đợt (giai đoan đẻ nhánh và trổ), mỗi đợt xử lý gồm 2 lần phun cách nhau 7 ngày. Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh điều tra định kỳ 7 ngày/lần . Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất. 2.3.3. Xây dựng qui trình PTSH bệnh đạo ôn hại lúa và triển khai mô hình PTSH bệnh đạo ôn hại lúa. Các thí nghiệm được thực hiện từ tháng 8/2014 đến tháng 6/2015 tại khu ruộng thí nghiệm của Bộ môn Bảo vệ thực vật, Viện Lúa ĐBSCL. + Định danh một số chủng vi sinh vật triển vọng Mẫu các chủng vi sinh vật triển vọng được gửi định danh xác định loài bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rDNA trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Tra cứu so sánh trình tự gen tương ứng trên cơ sơ dữ liệu GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). + Nghiên cứu các môi trường thích hợp nhân nhanh sinh khối vi sinh vật: chủng xạ khuẩn S28 chọn lọc được nhân trên môi trường tấm gạo (RG) có bổ sung dinh dưỡng giữ ở 28oC±2oC trong 5 ngày, chuyển sang điều kiện tối 10 ngày, làm khô 2-3 ngày ở 30oC. Chủng vi khuẩn B26 được nhân trên môi trường nước trích cám gạo (RB) có bổ sung dinh dưỡng. Kiểm tra mật số vi sinh vật, xác định công thức hiệu quả. 2.1 Sơ đồ tóm tắt qui trình + Xây dựng qui trình PTSH bệnh đạo ôn Hình Hình 2.2 Sơ đồ tóm tắt qui trình sản xuất chế phẩm sinh học sản xuất chế phẩm sinh học hại lúa: qui trình xử lý vi sinh vật phòng chứa xạ khuẩn S. variabilis S28 chứa vi khuẩn B. amyloliquefaciens B26 trừ bệnh đạo ôn được xây dựng trên cơ sở các kết quả thí nghiệm trên. Mô hình sử dụng giống nhiễm bệnh đạo ôn OM7347 với nguồn VSV được xử lý 4 lần (2 lần trừ đạo ôn lá và 2 lần trừ đạo ôn cổ bông). + Triển khai mô hình ứng dụng PTSH bệnh đạo ôn hại lúa: Mô hình được bố trí trong vụ Đông Xuân 2014 -2015 và Hè Thu 2015 trên diện rộng không lặp lại, mỗi chủng vi sinh vật được phun định kỳ 2 đợt (giai đoan đẻ nhánh và giai đoan trổ), mỗi đợt xử lý gồm 2 lần phun cách nhau 7 Phối trộn môi trường Thanh trùng ở 121 oC, 30 phút Nhân nguồn stock trên NB Môi trường RG Giống gốc 10% 28oC, 5 ngày Phối trộn môi trường RB Nhân sinh khối Giống gốc 10% nhiệt độ phòng, 3 ngày 28 oC, 10 ngày điều kiện tối Nhân sinh khối Tạo bào tử sấy 40-45oC, tách bào tử sấy khô, đóng gói, bảo quản chế phẩm 6 sấy 40-45oC nghiền mịn, sấy khô, đóng gói, bảo quẩn ngày. Giống lúa nhiễm bệnh OM7347 được sử dụng. Mô hình 1ha được chia thành 4 nghiệm thức : NT1: sử dụng chủng xạ khuẩn S28, NT2: sử dụng chủng vi khuẩn B26, NT3 (ĐCKP): Đối chứng phun nước lã, NT4(ĐCHH) : đối chứng phun thuốc hóa học (Beam75WP). Chỉ tiêu theo dõi : tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh đạo ôn điều tra định kỳ 7 ngày/lần. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất. 2.3.4. Kết hợp PTSH vào Mô hình Quản lý tổng hợp (QLTH) bệnh đạo ôn hại lúa ở ĐBSCL - Địa điểm: - xã Thạnh Hưng, huyện Mộc Hóa, tỉnh Long An - xã Huyền Hội, huyện Càng Long, tỉnh Trà Vinh - xã Tân Thạnh, huyện Thới Lai, TP Cần Thơ. - Thời gian thực hiện: trong 2 vụ Đông Xuân 2014-2015 và Hè Thu 2015 - Quy mô : 18 ha (3ha/MH x 2 vụ x 3 điểm ) - Mô hình: áp dụng quy trình quản lý tổng hợp bệnh đạo ôn, cụ thể: sử dụng giống chống chịu bệnh tốt OM5451; mật độ sạ 100 kg/ha, công thức phân bón 100-40-30 NPK(kg/ha), sử dụng chế phẩm sinh học chứa chủng xạ khuẩn Streptomyces variabilis S28 để phòng trị bệnh đạo ôn. - Đối chứng: sử dụng giống nhiễm IR50404 (điểm Cần Thơ và Trà Vinh), Nàng hoa 9 (điểm Long An) , mật sộ sạ: 150 kg/ha; công thức phân bón 120-40-30 NPK(kg/ha), sử dụng thuốc hóa học phòng trừ bệnh đạo ôn. 2.4. Thu thập và phân tích số liệu Số liệu được phân tích bằng phần mềm NTSYSpc version 2.10 của Applied Biostatistic Inc., USA (Rohf, 2000) để phân nhóm nòi qua phương pháp phân tích nhóm UPGMA. Tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh, hiệu quả giảm bệnh, giá trị AUDPC được ghi nhận, xử lý bằng phần mềm Excel và phân tích thống kê bằng chương trình SAS 9.2 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.Thu thập, phân lập và chọn lọc các chủng vi sinh vật 3.1.1. Thu thập, phân lập và xác định độc tính nguồn nấm P. oryzae gây bệnh đạo ôn ở vùng ĐBSCL Thu thập và phân lập 1800 mẫu bệnh đạo ôn ở 10 L1 tỉnh vùng ĐBSCL, xác định mã số nòi nấm P. oryzae cho thấy có sự đa dạng về phân bố nòi giữa các địa phương. + Độc tính các nguồn nấm theo phân nòi Kiyosawa Nhật L4 Dựa trên bộ chuẩn nòi Nhật có 41 nòi hiện diện, Cần Thơ là địa phương có số nòi cao nhất (18 nòi), kế đến là Đồng Tháp (17 nòi), Tiền Giang (15 nòi), Trà Vinh (14 nòi), Long An, An Giang (13 nòi), Vĩnh Long, Sóc Trăng (10 nòi) và thấp nhất là Bạc Liêu (8 nòi). Quần thể nấm P. oryzae gây bệnh đạo ôn tại ĐBSCL đang có những biến động về độc tính rất rõ rệt, mã nòi phổ biến ở vùng ĐBSCL bao gồm: 107.4, 102.4, 106.4, 102.7, 100.4; các nòi 007.4, 006.4, 006.0, 003.4, 002.4, 000.4, 000.0, 102.0, 105.4, 004.4 xuất hiện với tỷ lệ thấp. Nòi phổ biến có độc tính cao nhất là 107.4 có thể tấn Hình 3.2. Giản đồ biểu thị mối liên hệ di truyền giữa các nhóm nòi nấm P. oryzae công được 5 giống chuẩn kháng như Shin2(Pik-s, Pihs), gây bệnh đạo ôn phổ biến ở ĐBSCL Aichi Asahi (Pi-a), Ishikari shiroke (Pi-l), Yashiromochi (Pi-ta), và K59 (Pi-t); trong khi đó nòi 000.0 hiện diện ở hầu hết các tỉnh. 7 + Kết quả phân nòi nguồn nấm theo phương pháp Nagao và Fukuta (2009) cho thấy có 47 nòi nấm P. oryzae ở ĐBSCL, trong đó 5 nòi chính bao gồm: nòi U73-i7-k000-z00-ta733 phổ biến ở 7 tỉnh (LA, TG, CT,VL, TV, ĐT và AG) ; U30-i2-k131-z00-ta633 phổ biến ở 5 tỉnh (TG, KG, ST. LA và HG); U73-i7-k000-z10-ta733 phổ biến ở 3 tỉnh (TV, VL, CT); U73-i3-k000-z10-ta733 phổ biến ở 3 tỉnh (KG, HG, ST); U11-i4-k130-z00-ta612 phổ biến ở 3 tỉnh (AG, DT, CT); U11-i2-k000-z00ta100 phổ biến ở 3 tỉnh (HG, ST, KG). Phân tích đa dạng di truyền của các isolate nấm P. oryzae ở ĐBSCL ghi nhận ở mức độ tương đồng 50% có 15 nhóm nòi (linage) gây bệnh đạo ôn bao gồm L1 đến L15, trong đó nhóm nòi L4 phổ biến nhất chiếm tỷ lệ 22,78%, bốn nhóm nòi L3, L6, L8, L9 chiếm tỷ lệ trung bình, biến động từ 11,1- 14,44%; các nhóm nòi còn lại phân bố với tỷ lệ thấp, biến động từ 0,56 -3,33% (Hình 3.2). Bảng 3.2. Các gen kháng bệnh đạo ôn còn hiệu lực ở các tỉnh vùng ĐBSCL. (Viện Lúa ĐBSCL, 2012-2013) Địa điểm IRBL i-F5 IRBL ks-S IRBL kp-K60 IRBL kh-K3 IRBL z-Fu IRBL z5-CA Pii Pik-s Pik-p Pik-h Piz + + + LA + TV + CT ST + ĐT + AG + VL + TG + KG + BL Tỷ lệ 80 70 hiện diện (%) LA: Long An, TV: Trà Vinh, Giang, BL: Bạc Liêu + + + + + + + + + + + + + + + 80 + + + + + + + 70 + + + + + 80 IRBL sh-S IRBL 9W Piz-5 IRB L taK1 Pita Pish Pi9(t) + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 80 70 + + + 80 + + + + + + 60 CT: Cần Thơ, ST: Sóc Trăng, ĐT: Đồng Tháp, AG: An Giang, VL: Vĩnh Long, TG: Tiền Giang, KG: Kiên Một số gen kháng còn hiệu lực cao ở ĐBSCL là Pik-s (IRBLks-S), Pik-p, Pik-h, Pi9(t)(IRBL9-W), Pish (IRBLsh-S), Pii, Piz, Piz-5, Pita (IRBLta-K1) có thể sử dụng trong các chương trình lai tạo giống kháng bệnh đạo ôn cho vùng ĐBSCL(Bảng 3.2). Mười nòi nấm phổ biến và có độc tính cao được chọn cho thí nghiệm sơ tuyển VSV đối kháng, ký hiệu từ Pg1 đến Pg10. 3.1.2. Thu thập, phân lập và sơ tuyển các chủng VSV có khả năng ức chế nấm P. oryzae Từ 765 mẫu đất vùng rễ lúa thu thập ở 10 tỉnh vùng ĐBSCL, có 1150 chủng vi sinh vật (vi khuẩn và xạ khuẩn) được phân lập, tỷ lệ vi sinh vật có khả năng ức chế nấm chiếm 78,38%, trong đó 452 chủng xạ khuẩn (chiếm 40,65%) và 398 chủng vi khuẩn (chiếm 37,73%). Qua sơ tuyển khả năng ức chế nấm P. oryzae, ghi nhận có 10 chủng xạ khuẩn (S27, S28, S29, S30, S44, S132, S136, S233, S271, A B C S288, S380) và 10 chủng vi Hình 3.11. Khả năng tiết enzyme ngoại bào của một số chủng xạ khuẩn khuẩn (B26, B44, B54, B104, A. amylase, B. protease, C. endoglucanase B122, B142, B270, B311, B312, B370) có khả năng đối kháng với 10 nòi nấm P. oryzae có độc tính cao và phổ biến. Các chủng vi sinh vật Hình 3.12. Khả năng tạo protease của các chủng vi khuẩn đối kháng đã được đánh giá 8 một số đặc tính sinh học liên quan đến khả năng kiểm soát bệnh cụ thể là các chủng xạ khuẩn nghiên cứu đều có khả năng đồng hóa tốt các nguồn cacbon : D - glucose; saccarose; D- xylose; rhamnose; raffinose; thuộc nhóm chịu muối trung bình; chủng S28 và S36 có khả năng sinh cả 3 loại enzyme ngoại bào nhưng mạnh nhất là protease. Chủng S30 sinh amylase và cellulase với hoạt tính cao, chủng S30, S27 và S28 có khả năng sinh endoglucanase. Các chủng xạ khuẩn S27, S28, S30, S132, S136, S233 có khả năng tiết IAA. Các chủng vi khuẩn có triển vọng đều có khả năng tạo siderophore ở các dạng khác nhau, các chủng B26, B44, B54, B122, B270, B312 và B370 có khả năng tạo siderophore dạng catechol, các chủng B104, B142, B31 có khả năng tạo siderophore dạng hydroxamate, điều này liên quan đến việc vi khuẩn Bacillus sẽ có khả năng ức chế các vi sinh vật gây bệnh khác nhau. 3.2. Đánh giá khả năng kiểm soát bệnh đạo ôn trên lúa của các chủng vi sinh vật trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng 3.2.1. Kiểm tra khả năng gây bệnh của các chủng vi sinh vật chọn lọc Kết quả kiểm tra khả năng gây bệnh đã xác định 10 chủng xạ khuẩn S27, S28, S29, S30, S44, S132, S136, S233, S288, S380 và 10 chủng vi khuẩn B26, B44, B54, B104, B122, B142, B270, B311, B312, B370 không phải là tác nhân gây hại trên cây lúa có thể sử dụng trong nghiên cứu phòng trừ sinh học. 3.2.2. Xác định mật số vi sinh vật tối thiểu và thời điểm xử lý đạt hiệu quả phòng trừ bệnh đạo ôn Nghiên cứu đã xác định mật số tối thiểu cần thiết để xử lý trong các nghiên cứu phòng trừ bệnh đạo ôn đối với các chủng xạ khuẩn là 109bt/ml; đối với các chủng vi khuẩn là 108cfu/ml. Thời điểm xử lý vi sinh vật đối kháng đạt hiệu quả phòng trừ bệnh đạo ôn là xử lý 2 lần liên tiếp, cách nhau 2 - 5 ngày tùy điều kiện cụ thể. 3.2.3. Khảo sát khả năng kích thích cây lúa tăng trưởng của các chủng vi sinh vật chọn lọc. Kết quả ghi nhận trong điều kiện nhà lưới, có 9 chủng xạ khuẩn (S28, S136, S44, S30, S132 và S27) và 5 chủng vi khuẩn (B26, B122, B270, B312 và B370) có khả năng kích thích sự nảy mầm của hạt lúa, kích thích sự phát triển bộ rễ lúa và sinh trưởng của cây lúa trong giai đoạn đầu. Trong đó chủng xạ khuẩn S28 và vi khuẩn B26 thể hiện tốt nhất. 3.2.4. Khả năng kiểm soát bệnh đạo ôn hại lúa của các chủng vi sinh vật trong điều kiện nhà lưới. + Khả năng kiểm soát bệnh đạo ôn của các chủng xạ khuẩn Kết quả ghi nhận trong điều kiện nhà lưới có chủng bệnh nhân tạo áp lực cao cho thấy chủng S28 cho hiệu quả cao nhất và duy trì hiệu quả ổn định; các chủng S27, S30, S132, S136 và S233 có khả năng khống chế tỷ lệ bệnh đạo ôn hiệu quả trong điều kiện nhà lưới. Hiệu quả giảm tỷ lệ bệnh so với Đối chứng ở các chủng S233, S132, S30, S136, S28 và S27 lần lượt là 16,1; 14,7; 17,2; 17,6; 29,9 và 31,8%. Ghi nhận chỉ số bệnh cũng cho thấy xử lý các chủng xạ khuẩn có hiệu quả giảm chỉ số bệnh ổn định. Hiệu quả giảm chỉ số bệnh so với Đối chứng ở các nghiệm thức có xử lý xạ khuẩn S27, S28, S30, S123, S136, S233 biến động từ 31,8 đến 14,7%. + Khả năng kiểm soát bệnh đạo ôn của các chủng vi khuẩn Các chủng vi khuẩn chọn lọc đều có khả năng khống chế hiệu quả bệnh đạo ôn ở điều kiện nhà lưới, ở 7, 14 và 21NSLB tỷ lệ bệnh thấp nhất ghi nhận được ở chủng B26 và khác biệt có ý nghĩa so với ĐC. Các chủng B26, B44, B122, B270, B312 và B370 có hiệu quả giảm tỷ lệ bệnh biến động từ 13,2 đến 35,8%. Các chủng vi khuẩn B26, B44, B122, B270, B312 và B370 có hiệu quả giảm chỉ số bệnh biến động từ 34,7 đến 23,5%. Kết quả ở điều kiện nhà lưới đã chọn được 6 chủng xạ khuẩn S28, S27, S30, S132, S136, S233 và 6 chủng vi khuẩn B26, B44, B122, B270, B312, B370 trong đó chủng S28 và B26 có hiệu quả cao nhất sử dụng cho thí nghiệm ở điều kiện ngoài đồng. 3.2.5. Khả năng kiểm soát bệnh đạo ôn của các chủng vi sinh vật ở điều kiện ngoài đồng 9 3.2.5.1. Hiệu quả phòng trị bệnh đạo ôn của các chủng xạ khuẩn ở điều kiện ngoài đồng +Vụ Đông Xuân 2013-2014 Đánh giá khả năng sử dụng các chủng xạ khuẩn đối kháng phòng trừ bệnh đạo ôn ở điều kiện ngoài đồng ghi nhận trong vụ Đông Xuân 2013-2014 có 5 B chủng (S28, S132, S136, S27 và A Hình 3.20 và 3.21 . Biểu đồ hiệu quả xử lý xạ khuẩn đối kháng đến tỉ lệ S233) cho hiệu quả giảm tỉ lệ bệnh(A) và chỉ số bệnh(B) đạo ôn trên lúa ở điều kiện ngoài đồng, vụ bệnh đạo ôn từ 16% đến 34,1% Đông Xuân 2013-2014 và hiệu quả giảm chỉ số bệnh từ 23,8% đến 51,5%, chủng S28 có hiệu quả giảm bệnh cao nhất và cho năng suất cao (6,8T/ha) với hiệu quả tăng năng suất là C D 65,88% so với ĐC-KP . Hình 3.22 và 3.23 . Biểu đồ hiệu quả xử lý xạ khuẩn đối kháng đến tỉ lệ bệnh(A) và chỉ số bệnh(B) đạo ôn trên lúa ở điều kiện ngoài đồng, vụ Hè + vụ Hè Thu 2014 Trong vụ Hè Thu 2014, Thu 2014 có 4 chủng xạ khuẩn cho hiệu quả giảm tỉ lệ bệnh đạo ôn từ 20,5% đến 41,8% và hiệu quả giảm chỉ số bệnh từ 20,9% đến 50,3%, chủng S28 có hiệu quả giảm bệnh cao nhất; các chủng S132, S30, S27 và S233 có hiệu quả giảm bệnh cao. Hiệu quả giảm tỉ lệ bệnh đạo ôn cổ bông 37,7% ghi nhận ở chủng S28. Nghiệm thức xử lý chủng S28 đạt năng suất cao (7,2T/ha) và hiệu quả tăng năng suất là 77,05%. Chủng S28 có khả năng phòng trừ bệnh đạo ôn ở điều kiện ngoài đồng trong cả 2 vụ Đông Xuân và Hè Thu, xử lý S28 trên giống lúa nhiễm bệnh giúp giảm 34,1%- 41,8% tỷ lệ bệnh; giảm 50,3%- 51,5% chỉ số bệnh; 34%- 37,7% bệnh đạo ôn cổ bông và vì vậy giúp tăng năng suất 65,8-77,0% so với Đối chứng không phun thuốc. 3.2.5.2. Hiệu quả phòng trị bệnh đạo ôn của các chủng vi khuẩn ở điều kiện ngoài đồng + vụ Đông Xuân 2013-2014. Đánh giá khả năng sử dụng các chủng vi khuẩn đối kháng phòng trừ bệnh đạo ôn ở điều kiện ngoài đồng trong vụ Đông Xuân 2013-2014 ghi nhận hiệu quả giảm tỉ lệ bệnh từ 12,5% đến 23,3%; hiệu quả giảm chỉ số bệnh 10,6% đến 22,7% và bệnh đạo ôn cổ bông giảm 10,6% đến 31,8%, ở các chủng B270, B312, B311 và B26. Năng suất cao nhất ghi nhận ở nghiệm thức xử lý chủng B26 (7,2T/ha) tương đương ĐC-HH (7,4T/ha), với hiệu quả tăng năng suất 63,6%. + Vụ Hè Thu 2014 Xử lý các chủng vi khuẩn đối kháng phòng trừ bệnh đạo ôn ở điều kiện ngoài đồng trong vụ Hè Thu 2014 cho hiệu quả giảm tỉ lệ bệnh từ 15,8% đến 37,9% ; hiệu quả giảm chỉ số bệnh 19,1% đến 33,1% và bệnh đạo ôn cổ bộng giảm 6,9% đến 22,2% . Hiệu quả giảm bệnh cao nhất ghi nhận trên chủng B26 (Biểu đồ 3.4). Năng suất ở nghiệm thức xử lý chủng B26 (7,0T/ha) tương đương ĐC-HH (7,2T/ha), với hiệu quả tăng năng suất 75,5%. Chủng B26 có khả năng phòng trừ bệnh đạo ôn ở điều kiện ngoài đồng trong cả 2 vụ Đông Xuân và Hè Thu, xử lý B26 trên giống lúa nhiễm bệnh giúp giảm 23,3% -37,9% tỷ lệ bệnh; 22,7%-33,1% chỉ số bệnh; 22,2% - 31,8% bệnh đạo ôn cổ bông và vì vậy giúp tăng năng suất 63,6-75,5% so với Đối chứng không phun thuốc. Kết quả nghiên cứu của Tian (2004) cho thấy có khoảng 50% các chủng vi sinh vật phân lập trên đất lúa đều có khả năng ức chế sự phát triển của một số tác nhân gây bệnh quan trọng trên lúa 10 như Magnaporthe oryzae, Rhizoctonia solani, Xanthomonas oyzae và Fusarium moniliforme. Nghiên cứu ở ĐBSCL, trong số 18 dòng vi khuẩn phân lập từ đất vùng rễ lúa với khả năng cố định đạm sinh học và tổng hợp IAA, 6 dòng vi khuẩn CT14, AM3, NT4, PT10, TN4 và TV2B3 có khả năng đối kháng với nấm P. oryzae, tỉ lệ ức chế nấm dao động từ 45,2% đến 64,4% . Hai dòng CT14 và AM3 là 2 dòng có tính đối kháng mạnh nhất. Qua đó, có thể nhận định rằng các dòng vi khuẩn sống trong đất vùng rễ lúa không những có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật tốt mà còn có khả năng đối kháng nấm gây bệnh đạo ôn rất tiềm năng (Nguyễn Thị Pha và ctv., 2014). 3.3. Xây dựng qui trình PTSH bệnh đạo ôn hại lúa và triển khai mô hình ứng dụng qui trình tại Cần Thơ 3.3.1. Kết quả định danh các chủng vi sinh vật triển vọng Bảng 3.42. So sánh trình tự gene 16S rDNA của các chủng vi sinh vật triển vọng Mẫu S27 S257 S28 S233 S136 S30 B26 Mô tả loài Max Total Max Accession score score Ident. number Streptomyces cavourensis A15 Streptomyces xiamenensis MCCC 1A01550 Streptomyces variabilis SW75 880 865 880 865 99% 99% KF304797.1 NR044035.1 880 880 100% LM644094.1 Streptomyces iakyrus NRRL ISP-5482 Streptomyces scopuliridis NRRL B-24574 Streptomyces fulvissimus DSM 40593 Bacillus amyloliquefaciens UCMB5033 854 854 99% 856 856 99% 835 5014 99% NZ_JNXI0100006 2.1 NZ_JOEI0100005 6.1 CP005080.1 946 9427 100% HG328253.1 1. Max score: sự giống nhau giữa trình tự các nuleotide đang kiểm tra với các trình tự khác trong cơ sở dữ liệu. 2. Total score: tổng số điểm của tất cả các cặp điểm số cao HSP (hight scoring pairs) trong cùng trình tự của cơ sở dữ liệu 3. Max identity: % đồng hình cao nhất của tất cả các cặp điểm số cao HSP được xác định khi so sánh các cặp được cho điểm cao trong cùng 1 cơ sở dữ liệu trình tự 4. Accession number: Số gia nhập vào cơ sở dữ liệu Đối chiếu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng vi sinh vật với khóa phân loại ISP (1974), Bergey's (1989) và kết quả từ Bảng 3.42 cho thấy trình tự của từng chủng vi sinh vật được so sánh với cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen với phần mềm BLAST. Các chủng S27, S257, S233, S136 và S30 có mức độ đồng hình là 99% lần lượt với các chủng Streptomyces cavourensis A15, Streptomyces xiamenensis MCCC 1A01550, Streptomyces iakyrus NRRL ISP5482, Streptomyces scopuliridis NRRL B-24574, Streptomyces fulvissimus DSM 40593. Chủng S28 và B26 có mức độ đồng hình là 100% lần lượt với dòng Streptomyces variabilis SW75 và Bacillus amyloliquefaciens UCMB5033 (Bảng 3.42 và 3.43.). Chủng xạ khuẩn Streptomyces variabilis và vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens thuộc nhóm vi sinh vật an toàn mức độ 1 (BSL1) (BMBL, 2009), có thể sử dụng trong các nghiên cứu phục vụ khoa học đời sống; bên cạnh đó, 2 chủng này cũng đã được công bố là nguồn vi sinh vật có lợi trong sản xuất nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm cũng như y học. Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn 2 chủng Streptomyces variabilis S28 và Bacillus amyloliquefaciens B26 cho nghiên cứu mô hình PTSH bệnh đạo ôn hại lúa diện rộng. 3.3.2. Nghiên cứu qui trình nhân sinh khối vi sinh vật Trên các môi trường đã chọn , mật số xạ khuẩn kiểm tra biến động từ 0,18 x109 đến 1,52x109 bào tử/ gram sản phẩm và mật số vi khuẩn biến động từ 1,16x108 đến 1,45x109 cfu/ ml sản phẩm. 11 Vì vậy môi trường thích hợp cho nhân sinh khối xạ khuẩn được chọn là RG2 và nhân sinh khối vi khuẩn RB4. 3.3.3. Quy trình phòng trừ sinh học bệnh đạo ôn Qui trình xử lý vi sinh vật phòng trừ bệnh đạo ôn được xây dựng trên cơ sở các kết quả nghiên cứu trên và điều chỉnh nhằm dễ ứng dụng trong thực tiễn sản xuất lúa ở vùng ĐBSC, sử dụng chế phẩm sinh học chứa xạ khuẩn Streptomyces variabilis S28 hoặc vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens B26 phòng trừ bệnh đạo ôn. Nguồn chế phẩm PTSH được sản xuất ở 2 dạng: dạng tươi túi chứa 300gr hoặc dạng khô túi chứa 50gr. Qui trình gồm các bước: Bước 1. Chuẩn bị chế phẩm trước khi xử lý Đối với dạng túi 300g chế phẩm tươi: cho thêm 500ml nước vào túi chứa nguồn xạ khuẩn Streptomyces viriabilis S28 hoặc vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens B26, bóp nhẹ để hòa tan hết bào tử; để đạt mật số sử dụng cho thêm nước để pha loãng đạt mức 109btxk/ml hoặc 108tbvk/ml(300g chế phẩm pha với 32 lit nước, sử dụng phun cho 1000m2). - Đối với dạng túi 50g chế phẩm khô: cho 50 gr chế phẩm chứa nguồn xạ khuẩn Streptomyces variabilis S28 hoặc vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens B26 vào 32 lít nước để pha loãng đạt mức 109btxk/ml hoặc 108tbvk/ml (sử dụng phun cho 1000m2) Bước 2. Xử lý hạt giống Hạt giống sau khi ngâm 24 giờ, vớt ra rửa sạch ngâm tiếp với huyền phù chứa xạ khuẩn Streptomyces variabilis S28 hoặc vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens B26 trong 1-2 giờ, tỷ lệ sử dụng 1:1 (1kg giống: 1lit dung dịch), sau đó vớt ra để ráo nước và tiếp tục ủ bình thường. Bước 3. Xử lý phòng trừ đạo ôn lá Phun dung dịch chứa nguồn xạ khuẩn Streptomyces variabilis S28 hoặc vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens B26 đã pha ở Bước 1 khi thấy ruộng có xuất hiện bệnh khoảng 5% và phun lặp lại sau đó 7 ngày, khi phun có thể pha thêm chất bám dính. Đối với giống lúa nhiễm bệnh nên theo có thể phun sớm ở giai đoạn 15-18NSS; khi trồng giống chống chịu tốt tùy theo tình hình thời tiết và dịch hại cụ thể của từng vụ có thể phun khi thấy có bệnh xuất hiện trên ruộng. Bước 4. Xử lý phòng trừ đạo ôn cổ bông Dung dịch chứa nguồn xạ khuẩn S. variabilis S28 hoặc vi khuẩn B. amyloliquefaciens B26 đã pha ở Bước 1 được phun trên ruộng lúa ở giai đoạn khoảng 7 ngày trước trổ và 7 ngày sau trổ. 3.3.4. Mô hình phòng trừ sinh học bệnh đạo ôn vụ Đông Xuân 2014-2015 Trong vụ Đông Xuân 2014-2015, kết quả thực hiện Mô hình PTSH bệnh đạo ôn cho thấy ở Mô hình sử dụng chủng xạ khuẩn S. variabilis S28 hiệu quả giảm tỉ lệ bệnh A B đạo ôn là 56,7%, chỉ số bệnh A. Hình 3.35.Biểu đồ hiệu quả giảm bệnh trên Mô hình PTSH vụ Đông Xuân 2014-2015 tại Cần Thơ 59,3%, tỉ lệ đạo ôn cổ bông B. Hình 3.36. Biểu đồ năng suất trên Mô hình PTSH vụ Đông Xuân 201477,8% và tăng năng suất 2015 tại Cần Thơ 31,58% (Hình 3.35A, 3.36B). Mô hình sử dụng chủng vi khuẩn B. amyloliquefaciens B26 có hiệu quả giảm tỉ lệ bệnh 42,4%, chỉ số bệnh 32,9% và tỉ lệ đạo ôn cổ bông 69,1% và năng suất tăng 27,82% (Hình 3.35, Hình 3.36). 3.3.5. Mô hình phòng trừ sinh học bệnh đạo ôn vụ Hè Thu 2015 12 Trong vụ Hè Thu 2015, kết quả thực hiện Mô hình PTSH bệnh đạo ôn cho thấy Mô hình mô hình sử dụng S. variabilis S28 có hiệu quả giảm tỉ lệ bệnh 42,3%, chỉ số bệnh 50,5% và tỉ lệ A B đạo ôn cổ bông 74,3% và tăng A. Hình 3.41. Biểu đồ hiệu quả giảm bệnh trên Mô hình PTSH vụ Hè năng suất 40,43% so ĐC-KP. Mô Thu 2015 tại Cần Thơ hình sử dụng B. B. Hình 3.42. Biểu đồ năng suất trên Mô hình PTSH vụ Hè Thu 2015 tại Cần Thơ amyloliquefaciens B26 có hiệu quả giảm tỉ lệ bệnh 58,5%, chỉ số bệnh 40%, tỉ lệ đạo ôn cổ bông 82,1% và tăng năng suất 43,62% so ĐC-KP (Hình 3.41, Hình 3.42). Trong cả 2 vụ Đông Xuân 2014-2015 và Hè Thu 2015, Mô hình PTSH sử dụng xạ khuẩn S. variabilis S28 và vi khuẩn B. amyloliquefaciens B26 có hiệu quả giảm tỉ lệ bệnh, chỉ số bệnh đạo ôn lá, tỉ lệ bệnh thối cổ bông tương đương với sử dụng thuốc hóa học, kết quả đã cho thấy vai trò của vsv trong tự nhiên khi phát huy sẽ khống chế tốt vi sinh vật gây hại. 3.4. Kết hợp PTSH vào Mô hình quản lý tổng hợp (QLTH) bệnh đạo ôn hại lúa ở ĐBSCL + Mô hình QLTH bệnh đạo ôn hại lúa vụ Đông Xuân 2014-2015 CẦN THƠ-TLB-ĐX a e CẦN THƠ-CSB-ĐX b i j LONG AN-ĐOCB-ĐX CẦN THƠ- ĐOCB_ĐX g CẦN THƠ-NS-ĐX TRÀ VINH- CSB- ĐX LONG AN-CSB-ĐX f c TRÀ VINH- TLB-ĐX LONG AN- TLB-ĐX TRÀ VINH- ĐÔCB-ĐX k LONG AN-NS_ĐX TRÀ VINH- NS- ĐX d h l Hình 3.44, 3.49, 3.53. Biểu đồ diễn biến bệnh đạo ôn trên ruộng Mô hình QLTH, vụ Đông Xuân 2014-2015 tại Cần Thơ (a,b), Long An (e,f), Trà Vinh (i,j) Hình 3.45,3.50, 3.54. Biểu đồ tỷ lệ bệnh đạo ôn cổ bông và năng suất thực tế trên Mô hình QLTH, vụ Đông Xuân 2014-2015 tại Cần Thơ (b,c), Long An (g, h) và Trà Vinh(k,l) Triển khai diện rộng Mô hình QLTH bệnh đạo ôn hại lúa tại 3 điểm Cần Thơ, Long An và Trà Vinh kết hợp các biện pháp sử dụng giống OM5451 chống chịu bệnh, mật độ sạ thưa hợp lý (100kg/ha), bón phân cân đối và xử lý chủng xạ khuẩn S. variabilis S28 phòng trừ bệnh đạo ôn nên đã giúp giảm tỷ lệ bệnh 75,59 - 89,96%; chỉ số bệnh đạo ôn lá giảm: 74,16 - 84,67% và tỷ lệ bệnh đạo ôn cổ bông giảm 79,32 - 89,02%. Hiệu quả đầu tư so Đối chứng tăng: 25,94-39,14%.Tiết kiệm chi phí đầu tư 1.797.400đ/ha-3.708.000đ/ha; lợi nhuận đạt 10.216.000đ/ha-14.027.00đ/ha; giảm được 3 đợt phun thuốc hóa học/ vụ (Hình 3.44, 3.49, 3.53, 3.45, 3.50, 3.54). 13 + Mô hình QLTH bệnh đạo ôn hại lúa vụ Hè Thu 2015 CẦN THƠ- TLB-HT a LONG AN- TLB-HT i e f CẦN THƠ- ĐOCB-HT c j TRÀ VINH- ĐOCB-HT LONG AN-ĐOCB-HT g CẦN THƠ- NS-HT TRÀ VINH- CSB-HT LONG AN-CSB-HT CẦN THƠ-CSB-HT b TRÀ VINH-TLB-HT k LONG AN- NS- HT TRÀ VINH- NS-HT d h l Hình 3.46, 3.51, 3.55. Biểu đồ diễn biến bệnh đạo ôn trên ruộng Mô hình QLTH, vụ Hè Thu 2015 tại Cần Thơ (a,b), Long An (e,f), Trà Vinh (i,j) Hình 3.47, 3.52, 3.56. Biểu đồ tỷ lệ bệnh đạo ôn cổ bông và năng suất thực tế trên Mô hình QLTH, vụ Hè Thu 2015 tại Cần Thơ (b,c), Long An (g, h) và Trà Vinh(k,l) Kết quả ghi nhận cho thấy trên ruộng Mô hình tỷ lệ bệnh đạo ôn lá giảm 72,39 -78,23%, chỉ số bệnh đạo ôn lá giảm 75,21 - 79,97% và tỷ lệ bệnh đạo ôn cổ bông giảm 80,03 - 83,75%. Tiết kiệm chi phí đầu tư 3.280.000đ/ha-4.520.000đ/ha, lợi nhuận 12.660.000đ/ha-15.750.000đ/ha; hiệu quả đầu tư so với Đối chứng tăng: 49,64 - 56,14% và giảm 4 - 5 đợt phun thuốc hóa học/ vụ (Hình 3.46, 3.51, 3.55, 3.47, 3.52, 3.56). KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.Phân tích độc tính của 1800 mẫu bệnh đạo ôn thu thập ở 10 tỉnh vùng ĐBSCL cho thấy nguồn nấm Pyricularia oryzae ở ĐBSCL rất đa dạng, một số mã nòi phổ biến trong vùng là 107.4, 102.4, 106.4, 102.7, 100.4, những nòi này có khả năng tấn công hầu hết các gen kháng bệnh đạo ôn, lý giải tại sao bệnh đạo ôn luôn là dịch hại khó quản lý trong thực tế sản xuất. 2. Một số gen kháng còn hiệu lực có thể sử dụng trong các chương trình lai tạo giống kháng bệnh như: Pik-s (IRBLks-S), Pik-p, Pik-h, Pi9(t)(IRBL9-W), Pish (IRBLsh-S), Pii, Piz, Piz-5, Pita (IRBLta-K1) 3. Nguồn vi sinh vật trên ruộng lúa vùng ĐBSCL rất phong phú, vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm P. oryzae chiếm 73,38%; trong đó xạ khuẩn 40,65% và vi khuẩn 37,73%. Các chủng xạ khuẩn và các chủng vi khuẩn đươc chọn có khả năng đồng hóa tốt các nguồn cacbon, thuộc nhóm chịu muối trung bình; có khả năng sinh enzyme ngoại bào (protease, amylase, cellulase và endoglucanase), có khả năng tiết IAA. Các chủng vi khuẩn có khả năng tạo siderophore,... có khả năng ức chế tốt các vi sinh vật gây bệnh. Một số chủng có hiệu quả phòng trị bệnh đạo trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng đã được định danh bao gồm: Streptomyces cavourensis S27, S. variabilis S28, S. iakyrus S233, S. scopuliridis S136, S. fulvissimus S30, vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens B26 và một số chủng chưa định danh là nguồn vi sinh vật bản địa cần được khai thác và bảo tồn. Trong đó có 2 chủng Streptomyces variabilis S28 và Bacillus amyloliquefaciens 14 B26 có hiệu quả cao trong phòng trừ bệnh ở điều kiện ngoài đồng được sử dụng cho Mô hình PTSH diện rộng. 4. Mô hình PTSH bệnh đạo ôn sử dụng chủng xạ khuẩn S. variabilis S28 và chủng vi khuẩn B. amyloliquefaciens B26 cho hiệu quả giảm tỷ lệ bệnh lần lượt là 49,53% và 50,46%; hiệu quả giảm chỉ số bệnh là 54,93% và 36,46%; hiệu quả giảm tỷ lệ đạo ôn cổ bông là 76,36% và 75,42%; giúp tăng năng suất 35,73% và 35,23% đã cho thấy tiềm năng sử dụng vi sinh vật bản địa trong phòng trừ bệnh hại lúa ở ĐBSCL là rất lớn, cần nghiên cứu để phát triển các chế phẩm sinh học thân thiện với môi trường . 5. Kết hợp giải pháp PTSH sử dụng nguồn vi sinh vật bản địa vào Mô hình Quản lý tổng hợp bệnh đạo ôn (sử dụng giống chống chịu, kỹ thuật canh tác hợp lý) đã giúp giảm tỷ lệ bệnh đạo ôn lá 75,1 - 82,1%, tỉ lệ bệnh đạo ôn cổ bông 81,8% - 82,6%, bảo vệ năng suất lúa. Mô hình còn giúp tiết kiệm chi phí trung bình 2.700.000 - 3.710.000đ/ha; lợi nhuận 12.600.000 - 14.400.000đ/ha; hiệu quả đầu tư so với Đối chứng đạt 33,1- 52,5%; quan trọng hơn là mô hình còn giúp giảm trung bình 3-4 đợt phun thuốc hóa học/vụ, góp phần hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực vật và giảm ô nhiễm môi trường trong sản xuất lúa. Đề nghị - Tiếp tục nghiên cứu qui trình sản xuất và thương mại hóa chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh đạo ôn hại lúa trên cơ sở các chủng vi sinh vật đối kháng đã được xác định trong đề tài. - Tiếp tục triển khai các Mô hình diện rộng trong sản xuất ở các địa phương trên các cơ cấu sản xuất khác nhau nhằm khai thác ứng dụng nguồn tác nhân phòng trừ sinh học góp phần bảo vệ môi trường sinh thái, hướng đến nền nông nghiệp sạch, nông sản an toàn./. 15 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Nguyễn Thị Phong Lan, Trần Thị Cúc Hòa (2015), "Nghiên cứu phòng trừ sinh học bệnh đạo ôn hại lúa vùng đồng bằng sông Cửu Long", Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, số 20, trang 24-33. 2. Nguyễn Thị Phong Lan, Võ Thị Thu Ngân, Trần Hà Anh, Trần Thị Cúc Hòa (2015), "Sử dụng nguồn xạ khuẩn bản địa chi Streptomyces để phòng trừ sinh học bệnh đạo ôn (Pyricularia oryzae) hại lúa", Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, số 22, trang 3-10. 3. Nguyễn Thị Phong Lan, Võ Thị Thu Ngân, Lương Hữu Tâm, Trần Thị Nam Lý (2014), "Biến động độc tính quần thể nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn trên lúa vùng Đồng bằng sông Cửu Long", Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp, số 4, trang 52-57. 4. Nguyễn Thị Phong Lan, Võ Thị Thu Ngân, Trần Phước Lộc, Trần Hà Anh (2015), "Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn (Streptomyces spp.) đối kháng nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn hại lúa", Tạp chí Khoa học & Phát triển, số 8 , trang 1442-1451. 5. Nguyễn Thị Phong Lan, Võ Thị Thu Ngân, Trần Hà Anh, Võ Thị Dạ Thảo, Trần Thị Kiều, Nguyễn Thị Xuân Mai (2015), "Hiệu quả của các chủng vi sinh vật vùng rễ trong phòng trừ bệnh đạo ôn ở điều kiện nhà lưới", Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp, số 5,trang 127-136. 16