Tài liệu Nghiên cứu ở mức độ phân tử khả năng kháng carbapenem của một số vi khuẩn gram âm phân lập từ bệnh nhân tại bệnh viện việt đức và bệnh viện trung ương quân đội 108

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN DIỆU LINH NGHIÊN CỨU Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ KHẢ NĂNG KHÁNG CARBAPENEM CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN GRAM ÂM PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN TẠI BỆNH VIỆN VIỆT ĐỨC VÀ BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG QUÂN ĐỘI 108 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN DIỆU LINH NGHIÊN CỨU Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ KHẢ NĂNG KHÁNG CARBAPENEM CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN GRAM ÂM PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN TẠI BỆNH VIỆN VIỆT ĐỨC VÀ BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG QUÂN ĐỘI 108 Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62420107 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS. TS. Đặng Đức Anh 2. GS. TS. Phạm Văn Ty Hà Nội - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi, tất cả các kết quả và số liệu trong luận án do chính tôi thực hiện. Tất cả các số liệu trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học trong nước và nước ngoài. Phần còn lại trong luận án chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tác giả của luận án Trần Diệu Linh LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS. TS. Đặng Đức Anh, Viện trưởng Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, là người hướng dẫn khoa học, đã luôn giúp đỡ tôi, tận tình truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi có thể hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS. TS. Phạm Văn Ty, nguyên giảng viên Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, là giáo viên đồng hướng dẫn, đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. BS. Trần Huy Hoàng, Phó Trưởng khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, là cố vấn khoa học trong suốt quá trình nghiên cứu, đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi thực hiện các nghiên cứu, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS. TS. Timothy Walsh, Trường Đại học Cardiff, Anh và TS. Masato Suzuki, Viện Nghiên cứu Quốc gia các Bệnh truyền nhiễm Nhật Bản đã hợp tác giải trình tự toàn bộ hệ gen vi khuẩn; TS. Rogier Van Doorm, Đơn vị nghiên cứu lâm sàng Trường Đại học Oxford Hà Nội (OUCRU) đã hỗ trợ phân tích kết quả, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới các bạn đồng nghiệp của Phòng thí nghiệm Kháng sinh Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và OUCRU đã quan tâm, giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời trân trọng cảm ơn tới:  Ban giám đốc, Trung tâm Đảm bảo chất lượng xét nghiệm và Kiểm chuẩn, Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương;  Ban giám đốc cùng toàn thể cán bộ Khoa Vi sinh vật và Khoa Sinh học phân tử, Bệnh viện Trung ương Quân đội 108;  Ban giám đốc cùng toàn thể cán bộ Khoa Vi sinh vật, Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức. Cuối cùng tôi xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ của cha mẹ tôi, cha mẹ chồng và sự ủng hộ, động viên, thương yêu, chăm sóc, khích lệ của chồng, con và các em, những người luôn ở bên tôi, là chỗ dựa vững chắc để tôi yên tâm học tập và hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2018. Trần Diệu Linh Nghiên cứu được thực hiện sử dụng kinh phí của các đề tài/dự án: - Đề tài cấp nhà nước "Đánh giá thực trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn tại Việt Nam, xác định đặc điểm cấu trúc gen và yếu tố liên quan của các vi khuẩn kháng thuốc thường gặp ở Việt Nam" (Mã số: MOST: NHQT/SPĐP/02.16) do TS. Trần Huy Hoàng chủ nhiệm. - Đề tài nhánh “Dịch tễ học phân tử của các chủng Enterobacteriaceae và Acinetobacter kháng carbapenem" thuộc Dự án "Phát triển và áp dụng các kỹ thuật chẩn đoán chuyên sâu một số bệnh truyền nhiễm tại Việt Nam" giữa Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương và Viện Nghiên cứu Quốc gia các Bệnh truyền nhiễm Nhật Bản giai đoạn 2016-2019 do TS. Trần Huy Hoàng chủ nhiệm. MỤC LỤC MỤC LỤC ..................................................................................................................1 CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................................4 DANH MỤC CÁC HÌNH .........................................................................................7 DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................9 MỞ ĐẦU ..................................................................................................................10 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................14 1.1. Vi khuẩn Gram âm và tính kháng kháng sinh ................................................14 1.1.1. Vi khuẩn Gram âm ..................................................................................14 1.1.2. Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm ......................................15 1.1.3. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm...................................17 1.1.4. Cơ sở di truyền học của cơ chế kháng kháng sinh ..................................21 1.2. Kháng sinh nhóm carbapenem và cơ chế kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram âm ..........................................................................................25 1.2.1. Kháng sinh nhóm carbapenem ................................................................25 1.2.2. Cơ chế đề kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram âm ...........................................................................................................................28 1.3. Một số phương pháp hiện đại ứng dụng trong nghiên cứu cơ chế đề kháng carbapenem ở mức độ phân tử và khả năng lan truyền của các chủng vi khuẩn mang gen kháng ..............................................................................................................41 1.3.1. Các phương pháp nghiên cứu đặc tính và cơ chế kháng carbapenem ở mức độ phân tử của các chủng vi khuẩn kháng thuốc ..............................................41 1.3.2. Các phương pháp nghiên cứu khả năng lan truyền của các chủng vi khuẩn mang gen kháng ................................................................................................44 1.4. Tình hình kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram âm trên thế giới và tại Việt Nam ..............................................................................................46 1.4.1. Tình hình kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram âm trên thế giới .......................................................................................................46 1.4.2. Tình hình kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram âm tại Việt Nam ...........................................................................................................51 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................54 2.1. Địa điểm nghiên cứu ......................................................................................54 2.2. Thiết kế nghiên cứu ........................................................................................54 2.3. Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu ..................................................54 2.3.1. Thời gian thực hiện .................................................................................54 2.3.2. Địa điểm thực hiện ..................................................................................54 2.4. Đối tượng nghiên cứu.....................................................................................55 1 2.5. Cỡ mẫu nghiên cứu ........................................................................................55 2.5.1. Cỡ mẫu cho mục tiêu 1 ...........................................................................55 2.5.2. Cỡ mẫu cho mục tiêu 2 ...........................................................................56 2.6. Sơ đồ tóm tắt các bước nghiên cứu ................................................................58 2.6.1. Sơ đồ tóm tắt các bước nghiên cứu đáp ứng mục tiêu 1 .........................58 2.6.2. Sơ đồ tóm tắt các bước nghiên cứu đáp ứng mục tiêu 2 .........................59 2.7. Phương pháp nghiên cứu................................................................................59 2.7.1. Trang thiết bị chính .................................................................................59 2.7.2. Nuôi cấy và định danh lại vi khuẩn.........................................................59 2.7.3. Tách chiết ADN ......................................................................................60 2.7.4. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) .........................................................60 2.7.5. Giải trình tự gen ......................................................................................60 2.7.6. Thử nghiệm khả năng sinh enzyme carbapenemase của các chủng mang gen kháng bằng phương pháp Carba NP cải tiến (Carba NP - direct) ..............61 2.7.7. Thử nghiệm xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sự phát triển của vi khuẩn (MIC) ...........................................................................................62 2.7.8. Kỹ thuật điện di xung trường (PFGE).....................................................63 2.7.9. Kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn (WGS) ....................65 2.7.10. Kỹ thuật S1-PFGE và Southern blot ....................................................65 2.7.11. Kỹ thuật tiếp hợp vi khuẩn để truyền plasmid .....................................66 2.8. Xử lý và phân tích số liệu ..............................................................................67 2.9. Kiểm soát tính chính xác và độ tin cậy của các kỹ thuật trong quá trình nghiên cứu .........................................................................................................................70 2.10. Đạo đức trong nghiên cứu ............................................................................70 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ....................................71 3.1. Một số đặc điểm chung của các chủng vi khuẩn phân lập tại 2 bệnh viện ....71 3.2. Phát hiện sự có mặt của các gen mã hoá carbapenemase ở các chủng vi khuẩn kháng carbapenem phân lập tại 2 bệnh viện .........................................................74 3.3. Xác định khả năng sinh enzyme carbapenemase và mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn mang gen mã hoá carbapenemase...........................80 3.3.1. Xác định khả năng sinh enzyme carbapenemase của các chủng vi khuẩn mang gen mã hoá carbapenemase .....................................................................80 3.3.2. Xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn mang gen mã hoá carbapenemase theo tiêu chuẩn lâm sàng .............................................82 3.4. Xác định mối liên hệ về kiểu gen của các chủng vi khuẩn mang gen mã hoá carbapenemase phân lập tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương quân đội 108 ...................................................................................................................92 2 3.4.1. Xác định mối liên hệ về kiểu gen của các chủng vi khuẩn sinh enzyme carbapenemase trong nghiên cứu bằng kỹ thuật PFGE ....................................92 3.4.2. Xác định mối liên hệ về kiểu gen và sequence type của các chủng vi khuẩn sinh enzyme carbapenemase tại Việt Nam và trên thế giới bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn .................................................................97 3.5. Xác định cơ chế lan truyền qua trung gian plasmid của các chủng vi khuẩn mang gen mã hoá carbapenemase .......................................................................110 3.5.1. Xác định đặc điểm của các plasmid mang gen mã hoá carbapenemase .........................................................................................................................110 3.5.2. Xác định khả năng lan truyền gen kháng qua trung gian plasmid giữa các chủng vi khuẩn ................................................................................................117 3.6. Xác định cấu trúc của các yếu tố di truyền di động mang gen mã hoá carbapenemase ....................................................................................................119 3.6.1. Cấu trúc của các yếu tố di truyền di động mang gen blaKPC-2 ...............120 3.6.2. Cấu trúc của các yếu tố di truyền di động mang gen blaNDM-1..............123 3.6.3. Cấu trúc của các yếu tố di truyền di động mang gen blaOXA-48 .............126 3.6.4. Cấu trúc của yếu tố di truyền di động mang gen blaIMP-1 .....................127 3.6.5. Cấu trúc của yếu tố di truyền di động mang gen blaOXA-23 ...................129 KẾT LUẬN ............................................................................................................131 KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................133 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ ĐÃ XUẤT BẢN CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN..............................................................................134 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................135 PHỤ LỤC TÀI LIỆU .................................................................................................. PHỤ LỤC 1: DANH SÁCH MẪU NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ THEO MỘT SỐ NỘI DUNG CỦA MỤC TIÊU 1 .................................................................................. PHỤ LỤC 2: DANH SÁCH MẪU NGHIÊN CỨU ĐƯỢC GIẢI TRÌNH TỰ TOÀN BỘ HỆ GEN CỦA MỤC TIÊU 2 ................................................................................. PHỤ LỤC 3: BẢNG PHIÊN GIẢI KẾT QUẢ MIC THEO TIÊU CHUẨN CLSI 2017 ....................................................................................................................................... 3 CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết đầy đủ tiếng Anh Giải nghĩa tiếng Việt A. baumannii Acinetobacter baumannii ADN ATCC Deoxyribonucleic acid American Type Culture Collection blaCTX Gene coding for CTX - Gen mã hoá sinh tổng hợp lactamase enzyme -lactamase CTX Gene coding for IMP - Gen mã hoá sinh tổng hợp lactamase enzyme -lactamase IMP Gene coding for KPC - Gen mã hoá sinh tổng hợp lactamase enzyme -lactamase KPC Gene coding for NDM - Gen mã hoá sinh tổng hợp lactamase enzyme -lactamase NDM Gene coding for OXA-23 - Gen mã hoá sinh tổng hợp lactamase enzyme -lactamase OXA-23 Gene coding for OXA-24 - Gen mã hoá sinh tổng hợp lactamase enzyme -lactamase OXA-24 Gene coding for OXA-48 - Gen mã hoá sinh tổng hợp lactamase enzyme -lactamase OXA-48 Gene coding for OXA-51 - Gen mã hoá sinh tổng hợp lactamase enzyme -lactamase OXA-51 Gene coding for OXA-58 - Gen mã hoá sinh tổng hợp lactamase enzyme -lactamase OXA-58 Gene coding for SHV - Gen mã hoá sinh tổng hợp lactamase enzyme -lactamase SHV blaTEM Gene coding for TEM - Gen mã hoá sinh tổng hợp enzyme -lactamase TEM bp CAZ CIP lactamase Base pairs Ceftazidime Ciprofloxacin blaIMP blaKPC blaNDM blaOXA-23 blaOXA-24 blaOXA-48 blaOXA-51 blaOXA-58 blaSHV Vi khuẩn Acinetobacter baumannii Axit nucleic Bộ sưu tập chủng chuẩn Mỹ Cặp bazơ Kháng sinh Ceftazidime Kháng sinh Ciprofloxacin 4 CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CS Colistin CTX Cefotaxime DDD/100 Define daily dose/100 bed days E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid ESBL Extended-spectrum βlactamase GES Guiana extended spectrum IMI Imipenem-hydrolyzing βlactamase Kháng sinh IMP Imipenem IMP Imipenemase IS KPC K. pneumoniae Insert sequence Klebsiella pneumoniae carbapenemase Klebsiella pneumoniae LB Luria-Bertani MEM MIC Meropenem Minimal Inhibitory Concentration MLST Multi Locus Sequence Typing National Center for Biotechnology Information NCBI 5 Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và Phòng xét nghiệm Kháng sinh Colistin Kháng sinh Cefotaxime Liều xác định trong ngày/100 ngày nằm viện Vi khuẩn Escherichia coli Axit Ethylene diamine tetra acetic Enzyme ly giải vòng β-lactam phổ rộng Enzyme Guiana phổ rộng Enzyme beta-lactamase ly giải kháng sinh imipenem Kháng sinh Imipenem Enzyme ly giải kháng sinh imipenem Trình tự chèn Enzyme carbapenemase phát hiện ở K. pneumoniae Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae Môi trường Luria-Bertani nuôi cấy vi khuẩn Kháng sinh Meropenem Nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sự phát triển của vi khuẩn Phân loại trình tự đa locus Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia, Hoa Kỳ NDM New Delhi Metallolactamase OXA Oxacillinase PCR PFGE P. aeruginosa SHV Polymerase Chain Reaction Pulsed-field Gel Electrophoresis Pseudomonas aeruginosa Sulphydryl variable enzyme SIM Seoul imipenemase SME Serratia marcescens enzyme SPM Sao Paulo metallo-betalactamase ST TEM Sequence type β-lactamase named after a Greek patient Temoneira THT Triton Hodge Test TƯQĐ VIM WGS Verona integron-encoded Metallo-lactamase Whole genome sequence 6 Enzyme New Delhi Metallolactamase được đặt theo tên của thủ đô New Delhi Enzyme oxacillinase ly giải carbapenem Phản ứng chuỗi Điện di xung trường Trực khuẩn mủ xanh Enzyme sulphydryl ly giải kháng sinh phổ rộng Enzyme ly giải imipenem đặt theo tên thủ đô Seoul Enzyme Serratia marcescens ly giải carbapenem Enzyme metallo-betalactamase-1 được đặt theo tên của thủ đô Sao Paulo Loại trình tự gen Enzyme beta-lactamase được đặt theo tên của bệnh nhân người Hy Lạp Thử nghiệm Hodge Test cải tiến bổ sung Triton Trung ương Quân đội Enzyme Verona integronencoded Metallo-lactamase Giải trình tự toàn bộ hệ gen vi khuẩn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Đích tác động của các nhóm kháng sinh phổ biến ở tế bào vi khuẩn. .....17 Hình 1.2: Các cơ chế kháng kháng sinh phổ biến của các vi khuẩn Gram âm. .......17 Hình 1.3: Các cơ chế truyền gen ngang: tiếp hợp (A), biến nạp (B), tải nạp (C) và thông qua các yếu tố truyền gen (D). ........................................................................23 Hình 1.4: Cấu trúc cơ bản của IS và transposon. .....................................................24 Hình 1.5: Cấu trúc cơ bản của integron. ...................................................................25 Hình 1.6: Cấu trúc phân tử của carbapenem so với penicillin và cephalosporin . ...26 Hình 1.7: Các cơ chế đề kháng carbapenem chủ yếu của vi khuẩn Gram âm. ........29 Hình 1.8: Quá trình thuỷ phân carbapenem của họ enzyme carbapenemase sử dụng serine ở vị trí hoạt động (nhóm A và nhóm D) xúc tác cho quá trình thuỷ phân. ....30 Hình 1.9: Cấu trúc transposon Tn4410 chứa gen blaKPC. .........................................33 Hình 1.10: Cấu trúc di truyền của transposon chứa gen blaNDM-1. ...........................36 Hình 1.11: Cấu trúc của các dạng transposon Tn1999 mang gen blaOXA-48 . ...........40 Hình 1.12: Phân bố các chủng sinh enzyme KPC trên thế giới. ..............................47 Hình 1.13: Phân bố các chủng sinh enzyme NDM trên thế giới. .............................48 Hình 1.14: Sự phân bố của các chủng sinh enzyme họ OXA-48-like trên thế giới. 50 Hình 2.1: Các bước phân tích dữ liệu WGS để xác định các đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn mang gen mã hoá carbapenemase. .................................................69 Hình 3.1: Tỉ lệ phân bố các chủng vi khuẩn kháng carbapenem thu thập từ 2 bệnh viện. ...........................................................................................................................72 Hình 3.2: Tỉ lệ phân bố các chủng vi khuẩn theo loại mẫu thu thập từ 2 bệnh viện. ...................................................................................................................................73 Hình 3.3: Hình ảnh đại diện cho phản ứng PCR phát hiện các gen mã hoá carbapenemase sử dụng các cặp mồi đặc hiệu. .........................................................74 Hình 3.4: Hình ảnh đại diện cho kết quả xác định các biến thể của gen mã hoá carbapenemase và một số chủng mang đồng thời nhiều gen mã hoá carbapenemase. ...................................................................................................................................79 Hình 3.5: Hình ảnh đại diện cho thử nghiệm khả năng sinh enzyme carbapenemase của các chủng vi khuẩn mang gen kháng bằng phương pháp CarbaNP cải tiến. .....81 Hình 3.6: Mối liên hệ về kiểu gen giữa các chủng E. coli mang gen mã hoá carbapenemase phân lập từ 2 bệnh viện. ...................................................................92 Hình 3.7: Mối liên hệ về kiểu gen giữa các chủng K. pneumoniae mang gen kháng mã hóa carbapenemase phân lập từ 2 bệnh viện. ......................................................94 Hình 3.8: Mối liên hệ về kiểu gen giữa các chủng A. baumannii mang gen kháng mã hóa carbapenemase phân lập từ 2 bệnh viện. ............................................................96 7 Hình 3.9: Cây phân loại kiểu gen của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mã hoá carbapenemase phân lập tại 2 bệnh viện nghiên cứu ................................................98 Hình 3.10: Cây phân loại kiểu gen của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mã hoá carbapenemase phân lập tại 4 bệnh viện lớn của Hà Nội. ......................................100 Hình 3.11: Biểu đồ mối liên hệ và phân bố sequence type của vi khuẩn E. coli mang gen mã hoá carbapenemase theo các châu lục. .......................................................102 Hình 3.12: Cây phân loại kiểu gen của các chủng vi khuẩn K. pneumoniae mang gen mã hoá carbapenemase phân lập tại 2 bệnh viện nghiên cứu .................................104 Hình 3.13: Cây phân loại kiểu gen của các chủng vi khuẩn K. pneumoniae mang gen mã hoá carbapenemase phân lập tại 4 bệnh viện lớn của Hà Nội. ..........................106 Hình 3.14: Biểu đồ mối liên hệ và phân bố sequence type của vi khuẩn K. pneumoniae mang gen mã hoá carbapenemase theo các châu lục..........................109 Hình 3.15: Kết quả phát hiện plasmid mang gen blaKPC của một số chủng vi khuẩn phân lập tại Bệnh viện TƯQĐ 108 và Việt Đức bằng kỹ thuật S1-PFGE và Southern blot. ..........................................................................................................................112 Hình 3.16: Kết quả phát hiện plasmid mang gen blaNDM của một số chủng vi khuẩn phân lập tại Bệnh viện TƯQĐ 108 và Việt Đức bằng kỹ thuật S1-PFGE và Southern blot. ..........................................................................................................................114 Hình 3.17: Kết quả phát hiện plasmid mang gen blaOXA-48-like của một số chủng vi khuẩn phân lập tại Bệnh viện TƯQĐ 108 và Việt Đức bằng kỹ thuật S1-PFGE và Southern blot. ..........................................................................................................117 Hình 3.18: Các dạng cấu trúc của yếu tố di truyền di động mang gen blaKPC-2. ....121 Hình 3.19: Các dạng cấu trúc của yếu tố di truyền di động mang gen blaNDM-1. ...124 Hình 3.20: Cấu trúc của yếu tố di truyền di động mang gen blaOXA-48. .................127 Hình 3.21: Cấu trúc của yếu tố di truyền di động mang gen blaIMP-1. ...................127 Hình 3.22: Cấu trúc của yếu tố di truyền di động mang gen blaOXA-23. .................129 8 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Đặc điểm của các loại kháng sinh thuộc nhóm carbapenem được sử dụng trong lâm sàng. ..........................................................................................................27 Bảng 1.2: Đặc điểm của một số họ enzyme carbapenemase chính thuộc nhóm A, B và D . .........................................................................................................................32 Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi đặc hiệu phát hiện gen mã hoá carbapenemase .....61 Bảng 2.2: Cách diễn giải kết quả thử nghiệm Carba NP cải tiến .............................62 Bảng 3.1: Số lượng chủng vi khuẩn thu thập tại 2 bệnh viện trong giai đoạn nghiên cứu. ............................................................................................................................71 Bảng 3.2: Phân bố các chủng vi khuẩn mang gen mã hoá carbapenemase ở 2 bệnh viện. ...........................................................................................................................75 Bảng 3.3: Số lượng chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang các gen mã hoá carbapenemase ..........................................................................................................76 Bảng 3.4: Kết quả thử nghiệm khả năng sinh carbapenemase của các chủng kháng bằng phương pháp CarbaNP cải tiến.........................................................................82 Bảng 3.5: Kết quả thử nghiệm nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sự phát triển của vi khuẩn E. coli (n=39)..............................................................................................84 Bảng 3.6: Kết quả thử nghiệm nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sự phát triển của vi khuẩn K. pneumoniae (n=88). ...............................................................................85 Bảng 3.7: Kết quả thử nghiệm nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sự phát triển của vi khuẩn A. baumannii (n=90). .................................................................................86 Bảng 3.8: Kết quả thử nghiệm nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sự phát triển của vi khuẩn A. baumannii (n=90) (tiếp). ........................................................................87 Bảng 3.9: Số lượng và loại plasmid chiếm ưu thế mang các gen mã hoá carbapenemase ........................................................................................................111 Bảng 3.10: Kết quả thử nghiệm tiếp hợp truyền plasmid giữa các chủng vi khuẩn mang gen mã hoá carbapenemase và chủng vi khuẩn nhận E. coli J53..................118 9 MỞ ĐẦU Vi khuẩn kháng kháng sinh là một vấn đề quan trọng và ảnh hưởng trực tiếp đến công tác chăm sóc, bảo vệ sức khoẻ cho con người. Tổ chức Y tế thế giới cũng như các quốc gia phát triển như Anh, Mỹ đều đã gióng những hồi chuông cảnh báo về tốc độ gia tăng tình trạng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh thường gặp trên lâm sàng hiện nay. Điều này nghiêm trọng tới mức một số nhà lãnh đạo nổi tiếng như nguyên thủ tướng Anh David Cameron, tổng giám đốc Tổ chức Y tế thế giới Margaret Chan hay nguyên tổng thống Mỹ Barack Obama đã phải lên tiếng cảnh báo về tác động to lớn của nó đến đời sống, sức khoẻ con người, kinh tế và xã hội [218]. Tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh càng nguy hiểm khi có sự xuất hiện và lây lan nhanh chóng của các chủng vi khuẩn kháng carbapenem, vì nhóm kháng sinh này vốn được coi là kháng sinh thuộc “nhóm lựa chọn cuối cùng” sử dụng trong bệnh viện để điều trị các trường hợp nhiễm trùng do vi khuẩn đa kháng thuốc hoặc kháng colistin, là kháng sinh được khuyến cáo sử dụng trở lại như là liệu pháp điều trị cho các trường hợp nhiễm khuẩn do vi khuẩn kháng carbapenem gây ra [104, 114]. Với tốc độ lan rộng nhanh chóng và mức độ kháng của các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh hiện nay sẽ dẫn tới hậu quả là không còn kháng sinh điều trị hiệu quả trong 5-10 năm tới. Do vậy tình trạnh vi khuẩn kháng kháng sinh đang giành được sự quan tâm đặc biệt của nhiều nhà khoa học trên thế giới với số lượng các nghiên cứu về vi khuẩn kháng kháng sinh ngày một tăng. Vi khuẩn kháng lại kháng sinh là một hiện tượng tự nhiên, tuy nhiên việc lạm dụng kháng sinh trong các lĩnh vực chăm sóc sức khoẻ, nông nghiệp và môi trường là nguyên nhân hàng đầu tạo áp lực cho vi khuẩn kháng lại kháng sinh. Sự lây lan nhanh chóng của vi khuẩn gây bệnh kháng kháng sinh có liên quan mật thiết đến năng lực chẩn đoán, kiểm soát nhiễm khuẩn trong các bệnh viện, điều kiện vệ sinh, khả năng tiếp cận nguồn nước sạch của người dân (đặc biệt là tại các quốc gia đang phát triển) và sự gia tăng đi lại, thông thương trong thời đại toàn cầu hoá. Trong số các nguyên nhân hàng đầu dẫn đến sự lan rộng nhanh chóng của vi khuẩn kháng kháng sinh, sự lan truyền trong các cơ sở y tế đứng hàng thứ 3 [90]. 10 Việt Nam nằm trong khu vực châu Á được xem là "điểm nóng" của vi khuẩn kháng kháng sinh. Nhận thức sâu sắc được tầm quan trọng của vấn đề này, trong những năm vừa qua, Bộ Y tế cùng các ban ngành liên quan đang phối hợp với các tổ chức, quốc gia trên thế giới triển khai các hoạt động các hoạt động phòng chống vi khuẩn kháng kháng sinh với các tổ chức, quốc gia trên thế giới. Hiện nay các báo cáo cho thấy tại Việt Nam vi khuẩn Gram âm đã kháng lại carbapenem trong các bệnh viện ở mức độ cao. Hai căn nguyên gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường gặp là P. aeruginosa và A. baumannii được đánh giá ở 6 bệnh viện năm 2008 cho thấy: 20% các chủng P. aeruginosa và 50% các chủng A. baumannii kháng kháng sinh nhóm carbapenem [80]. Một số nghiên cứu đã chỉ ra vai trò của các gen blaNDM-1, blaKPC, blaOXA-23 và blaOXA-58 trong cơ chế kháng carbapenem của vi khuẩn Gram âm được phân lập tại một số bệnh viện ở Việt Nam và bước đầu xác định được một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của các vi khuẩn kháng carbapenem được phân lập [16, 200, 201]. Các kết quả nghiên cứu này đã từng bước giúp chúng ta có được những thông tin hữu ích về các khía cạnh: dịch tễ học, lâm sàng, các yếu tố nguy cơ, đặc điểm về vi sinh và sinh học phân tử của vi khuẩn kháng carbapenem tại Việt Nam. Tuy nhiên các nghiên cứu trên cho thấy còn một số vấn đề cần được làm sáng tỏ bao gồm: (i) Số lượng chủng kháng carbapenem được xác định mang gen blaNDM1, blaKPC, blaOXA-23 và blaOXA-58 thấp hơn nhiều so với tổng số chủng kháng carbapenem phát hiện được [7, 8, 193]; (ii) Những điểm tương đồng hoặc khác biệt giữa các chủng mang gen kháng phân lập tại các bệnh viện Việt Nam với các chủng kháng trên thế giới cũng chưa được làm rõ nhất là trong bối cảnh giao thông và du lịch phát triển mạnh, tạo cơ hội cho sự lây lan của các chủng kháng trên phạm vi toàn cầu; (iii) đặc biệt chưa đi sâu tìm hiểu đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn kháng carbapenem phân lập tại Việt Nam. Ngoài ra trong 5 năm trở lại đây, với sự ra đời của các kỹ thuật tiên tiến như giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) và các phần mềm tin sinh học phân tích hệ gen đã trở thành những công cụ đắc lực cho các nhà nghiên cứu, cung cấp những bằng chứng khoa học có độ tin cậy rất cao. 11 Do đó, việc xác định sự tồn tại của các gen mã hoá sinh tổng hợp enzyme carbapenemase (gọi tắt là gen mã hoá carbapenemase) khác, làm rõ mối liên hệ về kiểu gen, sequence type (ST) giữa các chủng mang gen kháng ở Việt Nam và trên thế giới cũng như tìm hiểu rõ hơn về đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn Gram âm kháng carbapenem phân lập trong những bệnh viện lớn đã trở thành nhu cầu cấp thiết và là cơ sở để chúng tôi thực hiện đề tài: "Nghiên cứu ở mức độ phân tử khả năng kháng carbapenem của một số vi khuẩn Gram âm phân lập từ bệnh nhân tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108". Kết quả nghiên cứu này sẽ giúp bổ sung các thông tin quan trọng về cơ chế kháng phổ biến nhất là sinh enzyme carbapenemase ở mức độ phân tử, sự lây lan của các chủng vi khuẩn Gram âm kháng carbapenem theo cơ chế này tại Việt Nam và mối liên hệ với các chủng vi khuẩn kháng carbapenem trên thế giới, làm cơ sở khoa học để đưa ra các biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn hiệu quả trong bệnh viện, đồng thời góp phần giảm gánh nặng và nguy cơ lan truyền vi khuẩn kháng thuốc ra ngoài cộng đồng. Mục tiêu của đề tài: 1. Phát hiện sự có mặt của các gen mã hoá carbapenemase ở các chủng vi khuẩn E. coli, K. pneumoniae, A. baumannii kháng carbapenem phân lập tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108. 2. Xác định được một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn mang gen mã hoá carbapenemase phân lập tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108. Nội dung của đề tài: 1. Phát hiện sự có mặt của gen mã hoá carbapenemase ở các chủng vi khuẩn E. coli, K. pneumoniae, A. baumannii kháng carbapenem phân lập tại 2 bệnh viện; 2. Xác định khả năng sinh enzyme carbapenemase và mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng mang gen mã hoá carbapenemase; 12 3. Xác định mối liên hệ về kiểu gen và sequence type giữa các chủng vi khuẩn mang gen mã hoá carbapenemase của Việt Nam và thế giới; 4. Xác định cơ chế lan truyền qua trung gian plasmid của các chủng vi khuẩn mang gen mã hoá carbapenemase; 5. Xác định cấu trúc của các yếu tố di truyền di động mang gen mã hoá carbapenemase. Những đóng góp mới của đề tài: 1. Là nghiên cứu có hệ thống đầu tiên ở Việt Nam áp dụng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn để xác định cơ chế kháng carbapenem ở mức độ phân tử bằng con đường sinh tổng hợp enzyme carbapenemase của một số chủng vi khuẩn Gram âm gây nhiễm trùng phổ biến phân lập từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng. 2. Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy mối liên hệ về kiểu gen, sequence type giữa các chủng vi khuẩn kháng carbapenem trong nghiên cứu này với các chủng vi khuẩn kháng carbapenem trên thế giới, qua đó cung cấp các thông tin hữu ích về nguồn gốc và sự lây lan của các chủng vi khuẩn Gram âm kháng carbapenem tại các địa điểm nghiên cứu, làm cơ sở đề xuất các biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn để giảm nguy cơ lây truyền vi khuẩn kháng thuốc ra cộng đồng. 3. Nghiên cứu đầu tiên về đặc điểm phân tử của các plasmid và yếu tố di truyền di động mang gen mã hoá carbapenemase. 13 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. VI KHUẨN GRAM ÂM VÀ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH 1.1.1. Vi khuẩn Gram âm Vi khuẩn Gram âm là một nhóm vi khuẩn có lớp màng kép: trong cùng là màng sinh chất, tiếp theo là một lớp peptidoglycan mỏng nằm trong khoang chu chất và sau đó tới màng ngoài. Lớp màng ngoài là phức hợp lipidpolysaccharide nội độc tố gồm lipoprotein và lipopolysaccharide. Màng ngoài có cấu trúc gần giống màng tế bào chất nhưng phospholipid hầu như chỉ gặp ở lớp trong, còn ở lớp ngoài là lipopolysaccharide dày khoảng 8-10 nm gồm 3 thành phần: Lipid A, Polysaccharide lõi và kháng nguyên O [2]. Màng ngoài còn có thêm các protein: Protein cơ chất: porin ở vi khuẩn còn gọi là protein lỗ xuyên màng với chức năng cho phép một số loại phân tử đi qua chúng như dipeptide, disaccharide, các ion vô cơ…; - Protein màng ngoài: chức năng vận chuyển một số phân tử riêng biệt và đưa qua màng ngoài như: nucleotide, vitamin B12…; - Lipoprotein: đóng vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên trong với lớp màng ngoài. Ở mặt ngoài của một số vi khuẩn Gram âm có những sợi nhỏ và ngắn gọi là pili, được chia thành 2 loại là pili chung và pili giới tính. Pili chung giúp vi khuẩn bám lên các bề mặt qua đó quyết định tính chất ngưng kết hồng cầu của vi khuẩn. Pili giới tính lại đóng vai trò quan trọng là cầu nối truyền ADN từ tế bào vi khuẩn cho sang tế bào vi khuẩn nhận trong quá trình tiếp hợp [2]. Cũng như nhiều loại sinh vật, trong hệ gen của vi khuẩn có nhiều gen chịu trách nhiệm tổng hợp nhiều loại sản phẩm khác nhau cho quá trình sống, sinh trưởng và phát triển của chúng. Điều đặc biệt là có nhiều gen cực kỳ quan trọng của vi khuẩn lại không nằm trong hệ gen của chúng mà định vị trên những ADN vòng tách biệt, nằm rải rác trong nguyên sinh chất của vi khuẩn gọi là các plasmid. Plasmid là một phân tử ADN, có cấu trúc khép lại thành vòng tròn độc lập, có khả năng tồn tại và nhân lên một cách độc lập với hệ gen của tế bào chủ và tương tác, 14