Tài liệu Nghiên cứu một số đặc điểm của bệnh care ở chó nuôi tại hà nội và chế kháng thể phòng trị bệnh tt

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA BỆNH CARE Ở CHÓ NUÔI TẠI HÀ NỘI VÀ CHẾ KHÁNG THỂ PHÒNG TRỊ BỆNH Ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số : 9 64 01 02 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2021 Công trình hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Hữu Nam PGS.TS. Phạm Ngọc Thạch Phản biện 1: GS.TS. Nguyễn Thị Kim Lan Trường Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên Phản biện 2: PGS.TS. Cù Hữu Phú Hội Thú y Phản biện 3: PGS.TS. Lại Thị Lan Hương Học viện Nông nghiệp Việt Nam Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thư viện Lương Định Của, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 24 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Bệnh Sài sốt chó (Canine Distemper) hay Care là một trong những bệnh nguy hiểm và phổ biến nhất trên chó. Bệnh phân bố ở nhiều quốc gia trên thế giới và gây bệnh trên hầu hết các loại thú ăn thịt như chồn, cáo, hổ, báo, sư tử,... Do đó, bệnh được tổ chức thú y thế giới (OIE) quan tâm và cập nhật tình hình trong những năm qua. Ở Việt Nam, bệnh Care được phát hiện từ năm 1920. Chó mắc bệnh thường chết với tỷ lệ rất cao, có thể lên đến 100% nếu không được điều trị kịp thời. Trong những năm gần đây, phong trào nuôi chó cảnh ở nước ta tăng nhanh khiến số lượng chó giống ngoại nhập tăng lên đáng kể. Các giống chó ngoại phổ biến ở nước ta thường là giống có kích thước lớn như Bergie, Alaska,… và một số giống chó nhỏ như Phốc, Poodle, Corgi hay Pomeranian. Theo đó, nguy cơ về bệnh truyền nhiễm nguy hiểm lây lan như Care bùng phát cũng tăng lên. Tuy vậy, nghiên cứu về đặc điểm của bệnh Care vẫn còn hạn chế. Thông tin về tỷ lệ chó mắc bệnh Care, đặc điểm lưu hành và phân bố bệnh vẫn chưa được thống kê đầy đủ tại khu vực Hà Nội. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm xác định sự lưu hành của bệnh Care ở khu vực nội thành Hà Nội làm cơ sở khoa học cho việc phòng và trị bệnh, tìm ra các yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh. Đồng thời nghiên cứu chế tạo chế phẩm kháng thể kháng virus Care để điều trị bệnh Care cho chó mắc bệnh đạt hiệu quả cao. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Hoàn thiện nghiên cứu về các đặc điểm của bệnh Care trên địa bàn Hà Nội. Với mục đích mô tả bệnh và sự phân bố của bệnh dưới ảnh hưởng của thời tiết mùa vụ, lứa tuổi chó. Đồng thời xác định được tỷ lệ nhiễm bệnh giữa các giống chó nội và chó ngoại nhập. Đồng thời nghiên cứu chế tạo kháng thể Care từ chủng virus thực địa, xác định liều điều trị cho chó mắc bệnh. Xây dựng phác đồ điều trị thử nghiệm bệnh Care cho từng giai đoạn của bệnh. Phục vụ cho công tác phòng và trị bệnh có hiệu quả cao. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1. Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu: - Chó mắc bệnh trong tự nhiên được mang đến khám và điều trị tại hệ thống Bệnh viện thú cảnh của Công ty Hanvet tại Hà Nội, Bệnh viện Thú y Petheath, Bệnh viện Thú y Hải Đăng, Phòng khám Thú y Hà Nội; Bao gồm tất cả các giống chó nội và chó ngoại ở các lứa tuổi trong 6 năm liên tục (từ tháng 1/2013 tới tháng 12/2018). Thông tin về thời gian khám, giống, lứa tuổi, lịch tiêm phòng được ghi chép đầy đủ và chi tiết. - Chó từ 2 tháng tuổi được nuôi thí nghiệm tại trung tâm nghiên cứu công ty Hanvet; và được nuôi tại trại thực nghiệm Khoa Thú y - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam. 1 - Thỏ từ 2 tháng tuổi được nuôi thí nghiệm tại Trung tâm Nghiên cứu Công ty Hanvet. * Địa điểm nghiên cứu: + Phòng Thí nghiệm Trung tâm của Học viện Nông Nghiệp Việt Nam + Phòng Thí nghiệm Bộ môn Bệnh lý - Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam. + Trung tâm Nghiên cứu Sinh phẩm, Công ty cổ phần Dược Hanvet + Bệnh viện Thú cảnh Hanvet - Công ty Dược Hanvet * Thời gian nghiên cứu: - Thời gian tiến hành đề tài luận án từ tháng 6/2014 - tháng 12/ 2018. - Số liệu của đề tài được thu thập từ tháng 01/2013 đến tháng 12/2018. 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm của bệnh Care trên đàn chó được nuôi tại Hà Nội giai đoạn tháng 1 năm 2013 đến tháng 12 năm 2018; - Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng virus Care từ chủng virus nhược độc được lưu giữ tại Trung tâm Nghiên cứu Sinh phẩm - Công ty Hanvet; - Nghiên cứu gây bệnh thực nghiệm và điều trị thử nghiệm bằng kháng thể kháng virus Care tại trại thực nghiêm khoa thú y - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Ứng dụng điều trị thử nghiệm bằng kháng thể kháng virus Care tại Bệnh Viện Thú Cảnh Hanvet. 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đây là công trình nghiên cứu hoàn chỉnh và có hệ thống về bệnh Care trên chó ở khu vực Hà Nội. Kết quả khảo sát thực trạng của bệnh Care, đánh giá mô tả được các đặc điểm của bệnh ở trên tất cả các giống chó, lứa tuổi chó, mùa vụ mắc bệnh. Bên cạnh đó xây dựng được quy trình chế tạo kháng thể kháng virus Care bằng chủng phân lập ở Việt Nam chữa bệnh cho chó đạt hiệu quả cao. 1.5.Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc hiểu biết rõ hơn về đặc điểm của bệnh Care (CDV) tại Việt Nam. Đây cũng là tư liệu khoa học có giá trị cho các nghiên cứu tiếp theo về bệnh Care và trong nghiên cứu vaccine phòng bệnh. Luận án là tài liệu tham khảo tốt phục vụ nghiên cứu khoa học và là tư liệu tham khảo dùng trong giảng dạy chuyên ngành thú y. Là tài liệu cần thiết cho những người làm công tác thú y thực hành tại các Bệnh viện Thú y và các Phòng khám thú y. 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn Đề tài là cơ sở khoa học để đưa ra những biện pháp phòng chống bệnh Care ở chó. Từ đó khuyến cáo người nuôi chó sử dụng vaccine Care phù hợp theo từng lứa tuổi. Kết quả nghiên cứu đã đưa ra được một sản phẩm kháng thể kháng virus Care để phòng và trị bệnh, đồng thời xây dựng được phác đồ điều trị hiệu quả trên đàn chó mắc bệnh Care. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH CARE 2.1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh Care trên thế giới Care là một bệnh truyền nhiễm cấp tính trên chó do Canine distemper virus (CDV) gây ra. Bệnh lây lan rất nhanh, xảy ra ở mọi lứa tuổi nhưng chủ yếu ở chó non với các các triệu chứng sốt, viêm phổi, viêm ruột và cuối cùng thường có hội chứng thần kinh (Greene & cs., 2006; Appel & cs., 1978). Đặc biệt bệnh gây chết với tỷ lệ rất cao. Bệnh Care được báo cáo lần đầu tiên ở châu Âu vào năm 1760 (Appel Max Jg & cs., 1972). Bệnh cũng xuất hiện ở một số nước châu Á và Nam Mỹ từ giữa thế kỷ 18 (Timothy, 2008; Woma & cs., 2009). Các triệu chứng lâm sàng và tiến triển của bệnh đã được mô tả từ năm 1809 bởi Edward Jenner (Shell, 1990). Năm 1905, bác sĩ thú y người Pháp Henri Carré đã phân lập được virus Care từ nước mũi của chó bị bệnh. Sau đó năm 1923, Putoni lần đầu tiên chế vắc xin nhược độc, tuy nhiên virus vắc xin này độc tính vẫn còn cao. Từ năm 1948 về sau, với sự phát triển mạnh mẽ của virus học, nhiều vắc xin phòng bệnh Care có hiệu quả đã ra đời. Hiện nay bệnh có ở khắp nơi trên thế giới, không những xảy ra ở chó nuôi mà còn ở nhiều quần thể động vật hoang dã. Bệnh Care cũng thường thấy ở châu Á. Dịch bệnh diễn ra ở các vùng khác nhau của Nhật Bản Lan NT & cs. (2006), Thái Lan Keawcharoen & cs. (2005), Hàn Quốc An & cs. (2008) và Ấn Độ Latha & cs. (2007). 2.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh Care ở Việt Nam Bệnh Care được phát hiện tại Việt Nam từ năm 1920. Nghiên cứu của Hồ Đình Chúc (1993) đã chỉ ra thời kỳ ủ bệnh Care thường là 3 - 6 ngày (dài nhất là 17 - 21 ngày) và có thể kéo dài trong khoảng thời gian trên dưới 1 tháng. Chó phát bệnh thường chết với tỷ lệ 50 - 80%, thậm chí lên đến 100% nếu không điều trị kịp thời. Cho đến nay, bệnh xảy ra ở hầu hết các tỉnh và gây thiệt hại lớn do tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao (Lê Thị Tài, 2006). Tất cả các loài chó đều cảm thụ bệnh, nhưng mẫn cảm ở là loài chó lai, chó cảnh, chó nội ít mẫn cảm hơn (Tô Du & Xuân Giao, 2006). Trong nghiên cứu của Lan & cs. (2009), hai chủng virus Care là Vn86 và Vn99 đã được phân lập từ chó 4 tháng tuổi có đặc điểm là viêm não không mưng mủ, viêm phổi, suy giảm tế bào lympho và viêm dạ dày ruột. Kết quả phân tích sinh học phân tử đã chỉ ra 2 chủng phân lập được này đều thuộc nhóm cổ điển (Classic type), khác xa với nhóm Asia 1 và Asia 2. Theo Trần Văn Nên & cs. (2017), vắc xin vô hoạt Care được chế từ chủng CDVVNUA-768 đã được đánh giá có khả năng bảo hộ trên chó bằng công cường độc với chủng CDV-HUA-04H. Thí nghiệm tiêm vắc xin vô hoạt Care chế từ chủng CDV-VNUA-768 cho những chó becgie cái 6 tuần tuổi, sau đó 3 tuần công cường độc bằng chủng virus CDV-HUA-04H. Đáp ứng miễn dịch kháng thể của chó thí nghiệm sau khi tiêm vắc xin vô hoạt Care gây ra được khảo sát bằng phản ứng ELISA phát hiện kháng thể. 3 2.2. BỆNH CARE TRÊN CHÓ 2.2.1. Dịch tễ học Trong tự nhiên các giống chó đều cảm thụ, nhưng mẫn cảm nhất là chó nhập ngoại, chó nhập nội ít mắc hơn Trần Thanh Phong (1996). Ngoài ra cáo, cầy và các loài động vật ăn thịt khác cũng mắc, đặc biệt là loài chồn vô cùng mẫn cảm, thú ăn thịt ở biển có vầy cũng mắc. Trong phòng thí nghiệm tốt nhất là dùng chồn đen. Ngoài ra có thể dùng chuột lang, thỏ, chuột nhắt trắng, khỉ. Trong tự nhiên hầu hết chó từ 2 đến 12 tháng tuổi đều mắc bệnh, tỷ lệ mắc bệnh nhiều nhất là chó từ 3 đến 6 tháng tuổi. Những chó đang bú mẹ ít mắc do được miễn dịch thụ động qua sữa đầu. Việc gây bệnh thực nghiệm trên chó 6 tháng tuổi dễ hơn chó 3 tuần tuổi do chó 3 tuần tuổi có miễn dịch thụ động thu nhận từ mẹ. Tô Du & Xuân Giao (2006), khi nghiên cứu về dịch tễ bệnh Care cho rằng tất cả các loài chó đều cảm thụ bệnh, nhưng mẫn cảm hơn là chó lai và chó ngoại nhập, chó nội ít mẫn cảm hơn. Bệnh xuất hiện nhiều khi có sự thay đổi thời tiết đặc biệt vào những ngày mưa. 2.2.2. Cơ chế sinh bệnh Thời kỳ ủ bệnh của Care thường là từ 3-6 ngày (dài nhất là 17-21 ngày) và có thể kéo dài khoảng trên dưới 1 tháng. Bệnh có tỷ lệ chết từ 50-80%, thậm chí 100% nếu không được phát hiện và điều trị sớm Hồ Đình Chúc (1993). Lúc bệnh phát ra ở dạng kế phát (thường kết hợp cùng bệnh pavovirus, viêm gan truyền nhiễm) thì tỷ lệ chết của bệnh càng cao Tô Du & Xuân Giao (2006). Theo Trần Thanh Phong (1996), sau khi virus xâm nhập vào cơ thể qua đường mũi, miệng và ngay lập tức nhân lên trong đại thực bào và những tế bào lympho của đường hô hấp, trong vòng 24 giờ virus dã tới các hạch lympho của phổi. Vào ngày thứ 6 virus đã di cư tới lách, dạ dày, ruột non và gan. Vào thời điểm này thì chó bắt đầu sốt. 2.2.3. Đặc Điểm Bệnh Lý 2.2.3.1. Triệu chứng Theo Trần Văn Nên & cs. (2017), biểu hiện bệnh thường rất đa dạng phụ thuộc vào tuổi chó mắc bệnh, giống chó, tình trạng sức khỏe, chế độ chăm sóc nuôi dưỡng và độc lực của mầm bệnh. Đầu tiên chó xuất hiện những triệu chứng chung: mệt mỏi, ủ rũ, ăn ít, lười vận động, chảy nước mắt, nước mũi, nôn mửa, sau đó sốt, thân nhiệt lên đến 40-41,5°C kéo dài từ 24-26 giờ rồi thân nhiệt giảm xuống 38,5-39,5ºC lúc này chó ăn ít, mệt mỏi. 3-4 ngày sau xuất hiện cơn sốt thứ hai, đó là do có sự bội nhiễm của các vi khuẩn kế phát, cơn sốt kéo dài 3-4 ngày, lúc này bệnh trầm trọng hơn, không chỉ do độc lực của virus mà còn do số lượng và độc lực của các vi khuẩn bội nhiễm cùng xuất hiện với cơn sốt thứ hai, chó bắt đầu biểu hiện các triệu chứng ở đường hô hấp, tiêu hóa, da và thần kinh. 4 2.2.3.2. Bệnh tích Theo Appel Max Jg & Summers (1995), bệnh tích đại thể có thể gặp sừng hoá ở mõm và gan bàn chân. Tuỳ theo mức độ kế phát các vi khuẩn có thể thấy viêm phế quản phổi, viêm ruột, mụn mủ ở da. v.v. Bệnh tích đường tiêu hóa: Viêm cata ruột, loét ruột, hạch ruột sưng, gan thoái hóa mỡ. Đường hô hấp: Viêm mũi, thanh quản, khí quản, viêm phổi, có mụn mủ trong phổi, có khi vỡ ra gây viêm phế mạc. Thần kinh: Viêm não, não tụ máu, các tế bào thần kinh bị hoại tử. Tế bào thượng bì đường hô hấp, tiết niệu, lưỡi, mắt, hạch và tuyến nước bọt có thể tìm thấy tiểu thể lenst trong nguyên sinh chất. PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.1.1. Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh Care ở chó tại Hà Nội - Đánh giá tình hình nhiễm bệnh Care trên chó nuôi tại khu vực Hà Nội - Xác định tỷ lệ mắc bệnh care ở các giống chó nội và chó ngoại nhập. - Xác định lứa tuổi mắc bệnh, mùa vụ mắc bệnh - Các yếu tố nguy cơ mắc bệnh - Mô tả một số đặc điểm bệnh tích đại thể và vi thể của chó mắc bệnh Care 3.1.2. Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng virus Care - Nghiên cứu quy trình chế tạo kháng thể Care + Nghiên cứu lựa chọn động vật sử dụng cho chế tạo kháng thể + Nghiên cứu xác định độ tuổi động vật sử dụng chế tạo kháng thể + Nghiên cứu xác định quy trình tiêm động vật phù hợp sử dụng cho chế tạo kháng thể. + Xây dựng quy trình sơ bộ chế tạo kháng thể - Chế tạo thử nghiệm kháng thể Care quy mô Pilot 3.1.3. Nghiên cứu gây bệnh thực nghiệm và điều trị thử nghiệm bệnh Care bằng kháng thể kháng virus Care - Nghiên cứu gây bệnh thực nghiệm - Nghiên cứu điều trị thử nghiệm kháng thể Care trong phòng và trị bệnh 3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.2.1 Trang thiết bị và dụng cụ - Dụng cụ, vật phẩm lấy mẫu xét nghiệm: tăm bông vô trùng, túi vô trùng đựng bệnh phẩm, nhãn ghi tên… - Trang bị bảo hộ cho người khám, thu mẫu bệnh phẩm: găng tay, khẩu trang, áo blouse. - Máy móc, thiết bị cần thiết: Tủ ấm CO2, tủ ấm thường, tủ ấp trứng, các loại tủ 5 lạnh, máy đo pH, máy khuấy từ, máy Elisa, máy PCR, kính hiển vi các loại, pipetman các loại. - Ngoài ra còn có các dụng cụ thông thường phục vụ cho sản xuất vacxin như ống Valcol 15ml và 50ml. Ống eppendorf 1,5 ml.ống nghiệm, bình tam giác (250,500,1000ml). Đĩa pettri, dầu Tip các loại, dĩa 96 giếng, Pank, kéo... 3.2.2 Vật liệu và hóa chất * Vật liệu và hóa chất: - Chó mắc bệnh Care ở các lứa tuổi mang tới khám tại các Bệnh viện thú y, phòng khám thú y ở Hà Nội. - Chó 2 tháng tuổi khỏe mạnh chưa tiêm phòng vắcxin - Thỏ 2-4 tháng tuổi khỏe mạnh không mắc bệnh truyền nhiễm. - Test chẩn đoán nhanh bệnh Care CDV Ag (Asan Pharmaceutical Co., LTD; Hàn Quốc). - Các chủng virus CDV-Hanvet cường độc phân lập từ mẫu bệnh phẩm chó mắc bệnh Care trong tự nhiên, được lưu giữ tại trung tâm nghiên cứu sinh phẩm công Ty Hanvet - Do công ty Hanvet cung cấp. - Chủng virus Care nhược độc lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu sinh phẩm - công ty Hanvet. - Chủng virus CDV-HV cường độc được phân lập tại Học viện Nông Nghiệp Việt Nam. - Các loại môi trường kiểm tra vô trùng: thạch máu, TSB và nước thịt gan yếm khí nhập khẩu từ các hãng uy tín. - Môi trường nuôi tế bào, gây nhiễm virus, dung dịch đếm số: MEM, M199, DMEM, LH3E, EMEM, FBS, BS, CMF Hank, TE 0.025%...... - Sinh phẩm, hóa chất cần thiết từ nhiều công ty uy tín như Meck, Sigma, Oxoid, Idexx. Dùng cho các quá trình gây nhiễm virus. * Số liệu và phần mềm - Số liệu thu thập về: là chó mắc bệnh Care và chó bị chết do bệnh Care tại bệnh viện thú cảnh của công ty Hanvet và một số phòng khám thú y, Bệnh viện thú y trên địa bàn nghiên cứu. - Phần mềm sử dụng trong xử lý số liệu Excel 2007 và Minitab 16.0. 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm của bệnh Care 3.3.1.1. Phương pháp điều tra phát hiện bệnh Điều tra phát hiện bệnh dựa vào thống kê hồ sơ bệnh án, mô tả bệnh, thống kê sinh học, phương pháp hồi cứu và phương pháp cắt ngang (điều tra theo dõi và phỏng vấn chủ vật nuôi, kết hợp theo dõi và quan sát trực tiếp). Cụ thể như sau: * Phương pháp xác định chó mắc bệnh Care Xác định chó bệnh được dựa vào lịch tiêm phòng vacxin, những triệu chứng lâm 6 sàng đặc trưng của bệnh, bệnh tích điển hình như các tác giả (Appel Max Jg & cs., 1994; Frölich & cs., 2000; Martella & cs., 2002); (Trần Văn Nên & cs., 2017) đã mô tả. Mặt khác, trong phòng thí nghiệm, test chẩn đoán nhanh được dùng để xác định bệnh những con chó có các triệu chứng bệnh Care điển hình. Những trường hợp chó có triệu chứng bệnh Care điển hình khi chẩn đoán bằng test chẩn đoán nhanh cho kết quả âm tính thì chúng tôi tiến hành chẩn đoán bằng phản ứng RT- PCR để loại trừ. Tất cả những chó bị bệnh ở các lứa tuổi và các mùa trong năm, đưa đến khám tại Bệnh Viện Thú cảnh của công ty Hanvet, Bệnh viện thú y Petheath, Bệnh viện thú y Hải Đăng, Bệnh viện thú 2 vet tại Hà Nội được tiến hành kiểm tra thăm hỏi bệnh từ chủ vật nuôi và khám lâm sàng. Trong nghiên cứu chúng tôi đã thực hiện nội dung theo các bước: Lập bệnh án theo dõi và điều trị; Lấy mẫu làm test chẩn đoán nhanh; Thống kê tổng số chó mang đến và số chó mắc bệnh Care. * Phương pháp chẩn đoán bệnh Care bằng test CDV Ag Dựa trên kết quả khám lâm sàng sau đó dùng Test thử CDV Ag để xác định bệnh: Lấy mẫu chẩn đoán nhanh bệnh Care bằng test CDV Ag (ASAN PHARMACEUTICAL CO., LTD; Hàn Quốc) theo hướng dẫn của nhà cung cấp. 3.3.1.2. Phương pháp kiểm tra bệnh tích đại thể và vi thể ở chó bị bệnh Care Mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể của chó được gây nhiễm theo tiêu chuẩn trong TCVN 8402: 2010 (Bộ khoa học & Công nghệ, 2010). Mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể đối với chó chết nghi mắc bệnh Care qua chẩn đoán lâm sàng và test thử CDV Ag có kết quả dương tính với virus Care. Sau đó lấy mẫu ở các cơ quan: Não, hạch ruột, ruột non, ruột già, phổi, hạch phổi… ngâm trong formol 10% để làm tiêu bản kiểm tra biến đổi bệnh lý vi thể. 3.3.2. Phương pháp nghiên cứu chế tạo kháng thể Care 3.3.2.1. Thiết kế thí nghiệm a. Nghiên cứu lựa chọn động vật sử dụng cho chế tạo kháng thể Trong nghiên cứu này, hai đối tượng vật nuôi được sử dụng để gây tối miễn dịch là chó và thỏ. Nhóm 1 gồm chó 02 tháng tuổi, giống Becgie lai, khỏe mạnh. Số lượng 05 con. Nhóm 2 gồm thỏ 02 tháng tuổi, giống Newzealand, khỏe mạnh. Số lượng 05 con. Chó âm tính với kháng thể Care, Thỏ âm tính với virus gây xuất huyết thỏ. Sử dụng kháng nguyên virus Care nhược độc của công ty Hanvet, có hiệu giá 104.0TCID 50/ml để gây miễn dịch bằng cách tiêm dưới da. b. Nghiên cứu chọn độ tuổi động vật sử dụng để tối miễn dịch thu kháng thể kháng virus Care Động vật sử dụng là chó hoặc thỏ. Sử dụng 15 động vật khỏe mạnh chia làm 3 nhóm: + Nhóm 1: 05 con 02 tháng tuổi; + Nhóm 2: 05 con 03 tháng tuổi; + Nhóm 3: 05 con 04 tháng tuổi. 7 ‐ Sử dụng kháng nguyên virus Care nhược độc của công ty Hanvet, có hiệu giá 10 TCID 50/ml để tiêm động vật nhằm mục đích tạo kháng thể. c. Nghiên cứu quy trình tiêm động vật phù hợp sử dụng cho chế tạo kháng thể kháng virus Care ‐ Sau khi lựa chọn được đối tượng và độ tuổi động vật phù hợp, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các quy trình tối miễn dịch khác nhau để nhằm tìm ra quy trình miễn dịch cho hiệu giá kháng thể tốt nhất. Sử dụng 15 động khỏe mạnh chia làm 3 nhóm, miễn dịch với 03 quy trình khác nhau. 3.3.2.2. Phương pháp kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phản ứng Elisa Các bước thực hiện phản ứng Elisa theo bộ kít ELISA INGEZIM MOQUILLO IgG Prod Ref: 15.CDG.K1 3.3.2.3. Phương pháp định lượng kháng thể kháng virus Care bằng phản ứng trung hòa ‐ Huyết thanh pha loãng trong môi trường nuôi cấy tế bào theo cơ số 10 hoặc cơ số 2: huyết thanh dương và huyết thanh âm, thao tác pha trên đĩa 96 giếng; ‐ Virus pha trong môi trường nuôi cấy tế bào 100 TCID50/50 µl liều trung hòa: nhỏ vào mỗi giếng thí nghiệm 50 µl; ‐ Điều kiện trung hòa 370C /1 giờ/ 5%C02 (20 phút láng một lần); ‐ Nuôi đĩa phản ứng 370C /1 giờ / 5%C02; ‐ Đọc kết quả hàng ngày: ngày thứ nhất CPE bắt đầu xuất hiện: tế bào vỡ vụn thành mảnh nhỏ li ti, ngày thứ 2 CPE rõ tế bào bị phá hủy cả giếng, ngày thứ 3 đọc và kết luận. 3.3.2.4. Phương pháp kiểm nghiệm kháng thể Care * Kiểm nghiệm chỉ tiêu vô trùng và thuần khiết Phương pháp kiểm nghiệm chỉ tiêu vô trùng và thuần khiết được thực hiện căn cứ theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8684:2011 * Kiểm nghiệm chỉ tiêu an toàn Kháng thể được tiêm với liều gấp 05 lần và 10 lần trên thỏ và chó. Sau 10 ngày liên tục theo dõi biểu hiện lâm sàng. Nếu chó và thỏ không có biểu hiện gì, mức độ ăn, uống và thể trạng bình thường thì kháng thể được coi là đã đạt yêu cầu về chỉ tiêu an toàn. * Kiểm nghiệm chỉ tiêu hiệu lực Chỉ tiêu hiệu lực được đánh giá gián tiếp qua kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phương pháp ELISA hoặc phản ứng trung hòa. 3.3.3. Phương pháp gây bệnh thực nghiệm và điều trị thực nghiệm 3.3.3.1. Thiết kế thí nghiệm Động vật thí nghiệm gồm 20 con, chó 2 tháng tuổi có trọng lượng từ 2- 3 kg/con. Chó thí nghiệm được chọn là chó không mắc virus Care và các virus khác (bệnh Parvovirus, bệnh viêm gan chó....) và không có kháng thể kháng virus Care. 4.0 8 Hai mươi chó thí nghiệm được chia thành 4 lô: Lô đối chứng âm không gây nhiễm Lô đối chứng dương gây nhiễm mà không điều trị để nghiên cứu các đặc điểm bệnh lý để so sánh. 3.3.3.2. Gây bệnh thực nghiệm Trước khi gây nhiễm chó được nuôi 7 ngày để theo dõi tình hình sức khỏe, đo nhiệt độ, và đồng thời để chó thích nghi với điều kiện mới (trong phòng thí nghiệm). Lấy máu kiểm tra các chỉ tiêu huyết học, chắt huyết thanh kiểm tra kháng thể Care bằng phương pháp ELISA, kiểm tra sự có mặt của virus Care và một số mầm bệnh khác (virus dại, Leptospira, virus viêm gan,...) bằng phương pháp RT - PCR để khẳng định chó thí nghiệm chưa từng tiếp xúc với virus Care. 3.3.3.3. Phương pháp khám triệu chứng lâm sàng Triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh Care được xác định thông qua theo dõi, quan sát và nghi chép đầy đủ từ bước bắt đầu nuôi chó, sau khi gây nhiễm cho đến khi chó có triệu chứng bệnh điển hình hoặc chết. Những chỉ số lâm sàng cơ bản được chúng tôi kiểm tra là thân nhiệt, nhịp tim, tần số hô hấp và biểu hiện hoạt động của chó. Đồng thời chúng tôi theo dõi chó lô đối chứng để so sánh với chó lô thí nghiệm. 3.3.3.4. Phương pháp RT-PCR xác định sự có mặt của virus Care trong mẫu bệnh phẩm a. Thu thập và xử lý mẫu + Đối với mẫu swab và mẫu phân: Dùng tăm bông vô trùng lấy dịch mắt và mũi của chó nghi bệnh Care, cho tăm bông đã lấy mẫu vào ống eppendorf vô trùng có chứa sẵn 300 μl dung dịch đệm PBS (Phosphat buffer saline). Mẫu được bảo quản lạnh có đá khô và chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ sau khi lấy mẫu. b. Thực hiện phản ứng RT-PCR Để xác định sự có mặt của virus Care trong máu, dịch swab (nhử mắt, mũi) và phân của chó bằng các cặp mồi đặc hiệu với chủng virus Care. 3.3.3.5. Phương pháp kiểm tra một số chỉ tiêu huyết học của chó Phương pháp lấy máu: lấy máu chó vào buổi sáng trước khi cho ăn. Mỗi con lấy 3ml dùng máy phân tích 21 chỉ tiêu để chạy kết quả. 3.3.3.6. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch Sử dụng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) đối với các mẫu bệnh phẩm (phổi, hạch, ruột, lách...) theo phương pháp của Carpenter (1998), Lan (2009). Khi có mặt virus trong tổ chức đem làm hóa mô miễn dịch kết quả dương tính sẽ là sự hiện màu nâu vàng trên lát cắt tổ chức (màu của DAB). Virus tập trung càng nhiều, màu càng rõ, mức dương tính càng cao. 3.3.4. Phương pháp điều trị thử nghiệm bằng kháng thể Care * Cách tính liều điều trị. Chúng tôi dùng kháng thể đã được định lượng ở hiệu giá cao nhất 9 log2, sau đó chia liều điều trị như sau: 9 + Với chó bệnh được phát hiện sớm tiêm liều 0,5ml / 2-5kg Thể trọng; + Với chó bệnh phát hiện muộn tiêm liều 1ml -1,5 ml/2- 5kg Thể trọng; Tất cả liều trên sử dụng liệu trình tấn công 5-7 ngày liên tiếp tùy theo mức độ bệnh. Sử dụng ngày 2 lần (sáng - chiều), hoặc tiêm ngày 1 lần. 3.3.5. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phần mềm SAS 9.0 (2002). Phân tích Khi bình phương (Chi-square) được sử dụng để phân tích cho trường hợp dung lượng mẫu lớn (với các giá trị mong đợi theo lý thuyết lớn hơn 5) và phép thử chính xác của Fisher (Fisher's exact test) được sử dụng để phân tích với trường hợp dung lượng mẫu bé (có ít nhất một giá trị mong đợi theo lý thuyết nhỏ hơn hoặc bằng 5). PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC CỦA BỆNH CARE 4.1.1. Kết quả xác định tỷ lệ mắc bệnh Care của chó đến khám tại phòng mạch trên địa bàn Hà Nội Để đánh giá tình hình mắc bệnh Care trên chó nuôi tại khu vực Hà Nội, trên từng giống và lứa tuổi của chó. Chúng tôi nghiên cứu tổng hợp theo dõi bệnh án điều trị từ năm 2013- 2018 tập hợp và phân loại 18.244 ca bệnh là chó đến khám tại các phòng khám của Bệnh Viện Thú cảnh Công ty Hanvet., Bệnh viện thú y Petheal, Bệnh viện thú y Hải Đăng. Phòng khám thú y Hà Nội... Kết quả được trình bày tại bảng 4.1. Bảng 4.1. Kết quả xác định tỷ lệ mắc bệnh Care ở chó đến khám tại các phòng khám trên địa bàn Hà Nội Nhóm chó Điều trị Tổng số Số Tỷ lệ Năm Không ca bệnh mắc (%) Ngoại Nội Khỏi Chết điều trị 2013 3073 118 3,84 65 53 17 72 29 2014 3115 116 3,72 69 47 17 66 33 2015 3391 88 2,60 52 36 19 44 25 2016 2923 89 3,04 62 27 30 43 16 2017 2814 86 3,06 54 32 42 22 22 2018 2928 78 2,66 52 26 32 14 32 Tổng 18244 575 3,15 354 221 157 261 157 Kết quả cho thấy trong tổng số 18.244 ca bệnh là chó tới khám có 575 chó mắc bệnh Care với triệu chứng điển hình như: Sốt cao, bỏ ăn, viêm kết mạc mắt, viêm phổi, tiêu chảy phân màu đen và màu cà phê, mụn mủ dưới da bụng, gan bàn chân sừng hóa và triệu chứng thần kinh. Sau đó chúng tôi phân loại và làm test chẩn đoán nhanh để khẳng định bệnh. 10 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo dõi ở khu vực Hà Nội có xu hướng giảm dần trong 6 năm qua. Điều này có thể do hiểu biết và điều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng của người nuôi chó ở thủ đô đã được nâng cao. Chó nuôi được quan tâm, chú trọng trong việc tiêm vắc-xin phòng bệnh, chăm sóc nuôi dưỡng và khám chữa bệnh định kỳ đầy đủ. Tỷ lệ chó mắc Care nghiên cứu ở khu vực Hà Nội là 3,15%. Trong đó, số điều trị khỏi là 157 con, số chết là 261 con, còn 157 con không điều trị do bệnh đã rất nghiêm trọng trả lại chủ nuôi hoặc chủ nuôi không muốn điều trị. 4.1.2. Kết quả kiểm tra chó mắc bệnh Care bằng test chẩn đoán nhanh CDV-Ag 4.1.2.1. Kết quả kiểm tra bằng test chẩn đoán nhanh Kết quả thực hiện theo quy trình của bộ kít thương mại CDV-Ag (Asan Pharm, Hàn Quốc). 4.1.2.2. Tỷ lệ chó bị bệnh do virus Care bằng kit CDV-Ag Kết quả thử nghiệm test CDV-Ag được trình bày ở bảng 4.2. Tổng số mẫu được thử bằng phương pháp kít chẩn đoán nhanh là 354 mẫu (từ năm 2013 - 2018), mẫu đại diện trên cả hai đối tượng là chó nội và chó ngoại nhiễm virus Care. Bảng 4.2. Kết quả kiểm tra chó mắc bệnh Care bằng test chẩn đoán nhanh CDV Ag Nhóm chó ngoại Nhóm chó nội Số Năm Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số test dương Số mắc Số test mắc (%) dương tính (%) tính 2013 76 51 45 88,24 53 22 20 90,91 2014 79 48 43 89,58 47 20 18 90 2015 57 42 40 95,24 36 11 9 81,82 2016 64 57 54 94,74 27 17 14 82,35 2017 62 45 41 91,11 32 19 17 89,47 2018 53 44 40 90,91 26 15 13 86,67 Tổng 391 287 263 91,64a 221 104 91 87,50b Ghi chú: a, b: thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với P < 0,05 Qua bảng 4.2 có thể thấy, trong số chó được xác định nhiễm Care bằng triệu chứng lâm sàng, tỷ lệ dương tính với test CDV Ag khá cao. Ở các giống chó ngoại tỷ lệ dương tính với test CDV Ag từ 88,24% đến 95,24% (trung bình 91,64%). Ở các giống chó nội từ 81,82% đến 90,91% (trung bình 87,50%). 4.1.3. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo địa bàn điều tra Trong quá trình điều tra, phỏng vấn chủ nuôi chó, chúng tôi đã ghi chép lại địa điểm xuất hiện ca bệnh theo khu vực Quận, Huyện của Hà Nội. Số liệu thu thập được tính toán theo tỷ lệ phần trăm và thể hiện tại Bảng 4.3. 11 Bảng 4.3. Tỷ lệ mắc bệnh Care ở chó theo địa bàn điều tra tại Hà Nội STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Địa bàn Quận Tây Hồ Quận Đống Đa Quận Hai Bà Trưng Quận Cầu Giấy Quận Hà Đông Quận Thanh Xuân Quận Hoàn Kiếm Quận Ba Đình Quận Hoàng Mai Tổng hợp Số theo dõi 2217 2696 2102 1986 1857 1714 1953 2014 1705 18244 Số mắc 73 186 85 63 27 54 49 28 10 575 Tỷ lệ mắc (%) 3.29bc 6.9a 4.04b 3.17bc 1.45d 3.15bc 2.51c 1.39d 0.59e 3.15 P-value <0,0001 Trong cùng một cột các giá trị tỷ lệ mang chữ cái khác nhau, sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,0001) Kết quả Bảng 4.3 cho thấy chó bị mắc Care xuất hiện chủ yếu tại quận Đống Đa với tỷ lệ 6,9%. Những quận khác có tỷ lệ mắc thấp hơn bao gồm quận Tây Hồ (3,29%), Hai Bà Trưng (4,04%), Cầu Giấy (3,17%). Riêng chó ở quận Hà Đông, Ba Đình có tỷ lệ mắc Care là thấp nhất (0,59-1,45), ngoại trừ một số ca bệnh lẻ ở khu vực khác như Sơn Tây, Gia Lâm chúng tôi không thống kê trong nghiên cứu bởi số liệu rất ít. 4.1.4. Tỷ lệ mắc bệnh Care theo giống chó Từ những bệnh án được lưu trữ trong 6 năm 2013- 2018, với số liệu thống kê, được chúng tôi xử lý phân tích tỷ lệ mắc bệnh theo các giống chó thường tới thăm khám tại các phòng mạch trên địa bàn Hà Nội, kết quả được trình bày ở Bảng 4.4. Bảng 4.4. Kết quả xác định tỷ lệ mắc bệnh Care theo giống chó Giống chó Nhóm chó nội Nhóm chó ngoại Phú Quốc Bắc Hà Mông cộc Chó Vàng Lai Bergie Phốc Pomeranian Poodle Dachshund Alaska Corgi Chowchow Bergie Rottweiler Giống chó khác Tổng hợp Khi bình phương (χ2) P-value Tổng số ca bệnh 1102 1089 664 1574 1880 1877 1273 2461 831 596 869 404 1328 889 1407 18244 Số mắc Tỷ lệ mắc (con) (%) 42 3.81a 41 3.76a 37 5.72a 32 2.03b 69 3.67a 56 2.98b 29 2.28bc 58 2.36bc 29 3.49b 22 3.69ab 30 3.45b 13 3.22b 72 5.42a 16 1.8c 29 2.06bc 575 3.15 3,90 0,048 P-value 0,0007 <0,0001 Trong cùng một cột và cùng một nhóm chó các giá trị tỷ lệ mang chữ cái khác nhau, sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,0001) 12 Kết quả nghiên cứu cho thấy: Tất cả 14 giống chó mang tới khám tại các phòng khám đều mắc Care với tỷ lệ khác nhau. Kết quả này phù hợp với công bố của nhiều tác giả cho rằng trong tự nhiên tất cả các giống chó đều mắc bệnh Green & Appel (1987); Hines (2006). 4.1.5. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo lứa tuổi Để xác định tỷ lệ mắc bệnh Care ở các lứa tuổi chúng tôi thống kê tỷ lệ mắc bệnh Care theo 4 nhóm tuổi của chó được trình trình bày ở Bảng 4.5. Bảng 4.5. Kết quả xác định tỷ lệ mắc Care theo lứa tuổi Số theo Lứa tuổi Số mắc Tỷ lệ mắc (%) P-value dõi Chó dưới 2 tháng tuổi 3774 56 1.48b Chó từ 2 - 6 tháng tuổi 4587 327 7.13a <0,0001 Chó từ 7- 12 tháng tuổi 4985 102 2,05b Chó trên 12 tháng tuổi 4898 90 1.84b Tổng hợp 18244 575 3.15 Trong cùng một cột các giá trị tỷ lệ mang chữ cái khác nhau, sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,0001) Kết quả điều tra cho thấy: tỷ lệ mắc bệnh Care cao nhất ở chó từ 2-6 tháng tuổi (7.13%), tiếp đến là chó từ 7-12 tháng tuổi có tỷ lệ mắc Care là (2,05%), chó trên 12 tháng tuổi tỷ lệ mắc là (1,84%) và thấp nhất ở chó dưới 2 tháng tuổi (1,48%). Kết quả của chúng tôi phù hợp với nhận xét của (Hines, 2006; Greene & cs., 2001). 4.1.6. Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo mùa Để đánh giá tỷ lệ mắc bệnh Care theo mùa chúng tôi tiến hành khảo sát, phân loại kết quả được trình bày ở Bảng 4.6. Bảng 4.6. Kết quả xác định tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo mùa vụ Mùa Số theo dõi Số mắc Tỷ lệ mắc (%) P-value a Mùa Xuân 4702 207 4.40 Mùa Hè 4574 76 1.66b <0,0001 Mùa Thu 4691 68 1.45b Mùa Đông 4277 224 5.24a Tổng hợp 18244 575 3.15 Trong cùng một cột các giá trị tỷ lệ mang chữ cái khác nhau, sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,0001) Từ kết quả trên chúng tôi thấy: có sự chênh lệch rõ rệt giữa tỷ lệ mắc bệnh Care của chó ở mùa Đông và mùa Xuân với mùa Hè và mùa Thu. Vào mùa đông tỷ lệ chó mắc bệnh Care là cao nhất (5,24%). Sau đó đến mùa xuân (4,40%), thấp nhất là mùa thu (1,45%) và mùa hè (1,66%). Tỷ lệ chó mắc bệnh Care ở từng mùa vụ qua các năm không có sự khác biệt rõ. Tuy nhiên, mùa vụ có ảnh hưởng rất rõ đến tỷ lệ mắc bệnh Care. Mùa Đông - Xuân, chó mắc bệnh Care cao nhất và thấp nhất ở mùa Hè-Thu. 13 4.1.7. Một số hình ảnh triệu chứng điển hình của chó mắc bệnh Care Tất cả những con chó bệnh đã làm test thử CDV dương tính đều có các triệu chứng điển hình như sau: 1 2 3 4 1. Chó nôn nhiều. 2.xuất hiện mụn mủ ở da bụng. 3.Đi ngoài phân có máu màu cafe. 4. Sừng hóa gan bàn chân Hình 4.1. Một số triệu chứng điển hình của chó mắc bệnh Care 4.1.8. Kết quả bệnh tích đại thể và vi thể của chó mắc bệnh Care a. Bệnh tích đại thể của chó mắc bệnh Care Chó dương tính với test CDV Ag được mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể. Kết quả mổ khám cho thấy bệnh tích tập trung chủ yếu ở các cơ quan như: Hạch lympho, phổi, ruột, gan, lách, thận, tim, não. Trong đó, mức độ biến đổi ở các cơ quan khác nhau ở các chó mắc bệnh là khác nhau phụ thuộc vào số lượng, độc lực của chủng virus, tuổi và trạng thái miễn dịch của từng chó. Hạch lympho màng treo ruột bị sưng và xuất huyết Phổi bị viêm và xuất huyết, hoại tử Ruột bị xuất huyết Gan, túi mật viêm sưng to, Phổi và gan xuất huyết Lách sưng to gan xuất huyết Hình 4.2. Bệnh tích đại thể của chó mắc bệnh Care b. Biến đổi vi thể của chó mắc bệnh Care Biến đổi bệnh tích vi thể qua các tiêu bản từ các mẫu bệnh phẩm là não, hạch ruột, ruột non, ruột già, phổi, hạch phổi ở chó mắc bệnh Care cho thấy các tổ chức cơ quan có tổn thương sung huyết và thâm nhiễm tế bào viêm ở các cơ quan nội tạng chiếm tỷ lệ cao hơn so với các tổn thương khác. Đặc biệt các cơ quan như ruột non, ruột già, phổi 14 và hạch lympho là những cơ quan có tổn thương vi thể chiếm tỷ lệ cao hơn so với các cơ quan khác. Kết quả hình 4.3. a 0 b c d Ghi chú: a) Phổi chó mắc Care, dịch rỉ viêm trong lòng phế nang. HE 10x. b) Phổi chó mắc Care, vách phế nang đứt nát, lòng phế namg chứa tế bào viêm. HE 20x. c) Phổi chó bị xuất huyết, bệnh Care, hồng cầu trong lòng các phế nang. HE 20x. Hình 4.3. Một số hình ảnh bệnh tích vi thể ở chó bị nhiễm virus Care Như vậy qua kết quả về bệnh tích đại thể và vi thể trên các cơ quan phủ tạng ở chó mắc bệnh Care cho thấy: Virus Care có đích tấn công chủ yếu là hạch lympho, phổi và ruột. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả Kubo & cs. (2007); Nguyễn Thị Lan & Khao Keonam (2012). 4.2. NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KHÁNG THỂ KHÁNG VIRUS CARE 4.2.1. Nghiên cứu quy trình chế tạo kháng thể kháng virus Care 4.2.1.1. Nghiên cứu lựa chọn động vật sử dụng cho chế tạo kháng thể Kết quả cho thấy: Khi miễn gây miễn dịch virus Care nhược độc cho chó và thỏ, cả hai loại đều đáp ứng tốt với kháng nguyên. Chó và thỏ phát triển khỏe mạnh bình thường, không có phản ứng phụ. Trong đó, đáp ứng miễn dịch của chó tốt hơn so với thỏ. Cụ thể hiệu giá kháng thể trung hòa virus Care trong huyết thanh chó đạt 9,12 log2, cao hơn so với thỏ đạt hiệu giá kháng thể là 7,24 log2. Tuy nhiên để sản xuất kháng thể với quy mô lớn thì sản xuất ở trên thỏ sẽ thuận lợi hơn rất nhiều so với ở chó. 4.2.1.2. Nghiên cứu xác định độ tuổi động vật sử dụng cho chế tạo kháng thể Sau khi xác định sử dụng thỏ làm đối tượng động vật để chế tạo kháng thể, chúng tôi nghiên cứu xác định độ tuổi của thỏ phù hợp cho sản xuất. Thỏ non quá thì hệ miễn dịch chưa hoàn thiện nên có thể ảnh hưởng đến khả năng sản xuất kháng thể. Thỏ ở lứa tuổi cao quá thì ảnh hưởng đến tiến độ sản xuất. Chúng tôi lựa chọn 03 nhóm thỏ ở giai đoạn 02 tháng, 03 tháng và 04 tháng để thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu cho thấy thỏ 2 tháng tuổi đáp ứng miễn dịch thấp nhất chỉ đạt (6,4 log2), thỏ 3 và 4 tháng tuôi cho hiệu giá kháng thể là (7,4 log2). Vì vậy chúng tôi chọn thỏ 3 và 4 tháng tuổi để sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo. 15 4.2.1.3. Nghiên cứu xác định quy trình tiêm động vật phù hợp sử dụng cho chế tạo kháng thể Chúng tôi đã xây dựng 03 quy trình tiêm virus nhược độc Care nhược độc cho thỏ với mục đích tìm ra quy trình giúp thỏ tạo ra hàm lượng kháng thể nhiều nhất để sản xuất. Quy trình 01: Tiêm 5 lần vào ngày 0, 14, 28, 42, 56. Quy trình 02: Tiêm 6 lần vào ngày 0, 14, 28, 42, 56, 70. Quy trình 03: Tiêm 7 lần vào ngày 0, 14, 28, 42, 56, 70, 84. Kiểm tra kháng thể vào ngày 98, 112, 126 ở cả 03 quy trình. Kết quả trình bày ở hình ảnh cho thấy quy trình 01 cho lượng kháng thể thấp hơn so với quy trình 02 và 03. Để thuận tiện cho quá trình sản xuất, chúng tôi lựa chọn quy trình 02 với số lần tiêm ít hơn (6 lần tiêm) so với quy trình 03 là (7 lần tiêm) nhưng kết quả vẫn đạt hàm lượng kháng thể cao tương đương. 4.2.1.4. Sơ đồ quy trình chế tạo kháng thể kháng virus Care + Kỹ thuật gây miễn dịch trên thỏ - Thỏ khoẻ mạnh, khối lượng từ 2,5 kg – 3,5 kg. Thỏ không dùng trong bất cứ thử nghiệm nào trước đây. Để thỏ thích nghi với điều kiện môi trường nuôi ít nhất 7 ngày trước khi thực hiện thử nghiệm và theo dõi thỏ trong suốt giai đoạn này (thức ăn, nước uống và trọng lượng). + Kết quả lấy mẫu và tách huyết thanh thỏ Mẫu máu thỏ được ly tâm ở 3000 vòng/phút/15 phút, tách huyết thanh cho vào ống falcol và bảo quản ở -20oC. Kết quả tách huyết thanh cho thấy, tổng số huyết thanh/mẫu thu được của các thỏ lô 1, lô 2, lô 3 tương ứng là: 1350 ml/3765 ml, 1320/3990 ml, 1400 ml/3930 ml. Các thỏ khác nhau cho tổng lượng huyết thanh/mẫu khác nhau là do trạng thái của từng thỏ tại thời điểm lấy mẫu và do kỹ thuật thu huyết thanh của từng đợt. Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể Sau khi tách chiết, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng kháng thể trong huyết thanh qua đó phản ánh mức độ đáp ứng miễn dịch, bảo vệ cơ thể con vật. Chúng tôi xây dựng sơ đồ tóm tắt quy trình chế tạo kháng thể Care sau khi đã xác định đối tượng động vật, lứa tuổi và quy trình gây miễn dịch. 4.2.2. Chế tạo thử nghiệm kháng thể kháng virus Care quy mô Pilot 4.2.2.1. Tinh chế kháng thể kháng virus Care trong huyết thanh Huyết thanh sau thu hoạch được cất lạnh âm 20oC. Sau khi rã đông sẽ có chứa nhiều protein kết tủa tạo thành 1 lớp cặn. Vì vậy cần phải tinh chế huyết thanh trước khi phối trộn sản phẩm. Huyết thanh sau khi xử lý vô trùng bằng phương pháp lọc, sẽ được cô đặc bằng hệ thống lọc tiếp tuyến (TFF). Từ bảng kết quả trên cho thấy: Hiệu giá kháng thể tăng tương ứng với số lần cô đặc, nước thải của quá trình lọc cô đặc kiểm tra không phát hiện có kháng thể Care. Như vậy hiệu suất lọc ở các mức cô đặc khác nhau đều đạt hiệu suất 100%. 16 4.2.2.2. Sản xuất thử nghiệm kháng thể kháng virus Care quy mô Pilot Sau khi nghiên cứu được các thông số tối ưu cho quy trình tối miễn dịch trên thỏ thu kháng thể Care, chúng tôi đã tiến hành sản xuất thử nghiệm 03 lô kháng thể Care ở quy mô pilot. Số lượng 30 thỏ/lô sản xuất. Kết quả được trình bày ở bảng 4.7. Bảng 4.7. Kết quả thử nghiệm chế tạo kháng thể kháng virus Care quy mô Pilot Số thỏ Số con Số con thu Lượng huyết HGKT Lô sản xuất miễn dịch thỏ sống huyết thanh thanh thu (ml) (log2) (con) (con) (con) Lô 0116 30 30 30 1350 10 Lô 0216 30 29 29* 1320 10 Lô 0316 30 30 30 1400 11 Ghi chú: (*) có 01 thỏ bị chết sau mũi tiêm số 6, mổ khám không có bệnh tích. Kết quả cho thấy: Cả 03 lô sản xuất thử nghiệm: thỏ đều phát triển tốt, cho đáp ứng miễn dịch đồng đều. Hiệu giá kháng thể trong huyết thanh thu được đạt (10 – 11log2). Bán thành phẩm sau khi tinh chế, được bổ sung thêm chất bảo quản Thiomersano, tính toán hiệu giá kháng thể để phối trộn và ra chai. 4.2.2.3. Kiểm nghiệm sản phẩm kháng thể Care Sản phẩm kháng thể phải đạt các tiêu chuẩn về vô trùng, độ thuần khiết, tính an toàn và hiệu giá kháng thể đáp ứng miễn dịch. Kết quả ở bảng 4.8. Bảng 4.8. Kết quả ra chai và kiểm nghiệm 03 lô sản phẩm kháng thể Care Kết quả kiểm nghiệm thành phẩm Quy Lô sản xuất cách Số lọ Vô Thuần Hiệu An toàn * (ml/lọ) trùng khiết giá KT.Care 01 3 680 Đạt Đạt Đạt 9log2 KT.Care 02 3 630 Đạt Đạt Đạt 9log2 KT.Care 03 3 750 Đạt Đạt Đạt 9log2 Ghi chú: *: Không tạp nhiễm virus xuất huyết truyền nhiễm thỏ Kết quả sản phẩm đạt yêu cầu về độ vô trùng (không tạp nhiễm vi khuẩn, nấm), thuần khiết (không tạp nhiễm virus gây xuất huyết truyền nhiễm thỏ), độ an toàn cao (tiêm thí nghiệm trên chó thấy động vật không có phản ứng phụ, khỏe mạnh bình thường) và hiệu giá kháng thể đạt được là 9log2. 4.3. KẾT QUẢ GÂY BỆNH THỰC NGHIỆM VÀ ĐIỀU TRỊ THỬ NGHIỆM BẰNG KHÁNG THỂ KHÁNG VIRUS CARE 4.3.1. Kết quả gây bệnh thực nghiệm Động vật thí nghiệm gồm 20 con, chó 2 tháng tuổi có trọng lượng từ 2- 3 kg/con. Chó thí nghiệm được chọn là chó không mắc virus Care và các virus khác (bệnh Parvovirus, bệnh viêm gan chó, bệnh leptospira...) và không có kháng thể kháng virus Care. Bố trí thí nghiệm: 20 con chó được chia thành 4 lô: Các lô thí nghiệm và lô đối chứng được nuôi ở các chuồng khác nhau ở khu nuôi 17 động vật thí nghiệm đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học cấp 2 của khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Kết quả sau gây nhiễm, các chó ở lô thí nghiệm có triệu chứng bệnh đặc trưng và sốt cao vào ngày thứ 3 (sốt 39oC), sốt đến ngày thứ 5 (sốt 40oC), sốt đợt 2 được tính vào ngày thứ 11, chó sốt cao đến 41oC kéo dài đến ngày thứ 15 (40,5oC). Lô đối chứng không có biểu hiện gì khác thường, chó hoàn toàn khỏe mạnh. 4.3.1.1. Thời gian virus xuất hiện trong máu, dịch mắt, mũi và trong phân Sau khi gây bệnh thực nghiệm chủng virus Care (CDV-HV), mẫu máu, dịch swab (nhử mắt, nhử mũi) và phân được thu vào ngày thứ 1, 3, 5, 7 ở cả lô chó thí nghiệm và chó lô đối chứng. 4.3.1.2. Kết quả kiểm tra phát hiện virus Care trên chó gây bệnh thí nghiệm bang phương pháp RT-PCR Mẫu máu, dịch swab (nhử mắt, mũi) và phân của chó thí nghiệm được sử dụng để kiểm tra xác định sự có mặt của virus Care bằng phương pháp RT- PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu với chủng virus Care. Kết quả được thế hiện ở hình 4.4. M 1 2 3 4 5 6 500bp 400bp 300bp 200bp M 7 8 9 10 11 429 bp 100bp Ghi chú: M: (Marker) thang chuẩn 100 bp; Thứ tự giếng 1,2 3 là mẫu máu; giếng 4, 5, 6 là mẫu dịch swab; giếng 7, 8,9 là mẫu phân của 3 chó gây nhiễm chủng virus Care (CDV-HV), giếng 10 là đối chứng âm; giếng 11 là đối chứng dương. Hình 4.4. Kết quả điện di thực hiện phản ứng RT-PCR sau 5 ngày gây nhiễm CDV-HV Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR với đoạn gene P được trình bày ở hình 4.1 với một băng sáng duy nhất tương ứng với kích thước là 429 bp. Điều này cho thấy các bước tách chiết ARN tổng số, thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng RTPCR đã được tối ưu. 4.3.1.3. Kết quả nghiên cứu các chỉ tiêu lâm sàng của chó thí nghiệm a. Kết quả xác định thân nhiệt Sau 3 ngày gây bệnh thực nghiệm, chó bắt đầu có biểu hiện đầu tiên là sốt, có con sốt cao nhất là 40,30C. Hiện tượng sốt biểu hiện ở cả 5 chó thí nghiệm. 18