Tài liệu Nghiên cứu chiết tách và xác định hoạt tính sinh học của các flavonoid từ cây an xoa (helicteres hirsuta lour) quảng nam

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HỒ THỊ HUYỀN TRÂN NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC FLAVONOID TỪ CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR.) QUẢNG NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KĨ THUẬT Đà Nẵng – Năm 2018 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HỒ THỊ HUYỀN TRÂN NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC FLAVONOID TỪ CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR.) QUẢNG NAM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ KĨ THUẬT Người hướng dẫn khoa học: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM Đà Nẵng – Năm 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Hồ Thị Huyền Trân ii NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC FLAVONOID TỪ CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR.) QUẢNG NAM Học viên: Hồ Thị Huyền Trân Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 60420201 Khóa: K32 Trường Đại Học Bách Khoa – ĐHĐN Tóm tắt Cao chiết rễ cây an xoa được chiết xuất bằng dung môi methanol 40% theo phương pháp siêu âm điện cực ở nhiệt độ 60oC trong thời gian 50 phút với tần số là 25 kHz cho hàm lượng flavonoid cao nhất có giá trị là 10,933 mgCE/g ± 0,101a. Cao chiết và dịch chiết có hoạt tính kháng oxy hóa tốt nhất với giá trị IC50 lần lượt là 271,900 µg/mL và 302,850 µg/mL. Cao chiết rễ có khả năng kháng khuẩn với vòng kháng khuẩn là 20,667 mm ± 1,155a trên E. coli và 16,667 mm ± 1,1528a trên Samonella ở nồng độ 652 µg/ml. An xoa có thể xem là nguồn thực vật tự nhiên đầy tiềm năng của các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa và kháng khuẩn. Từ khóa: An xoa, flavonoid, chiết xuất, kháng oxy hóa, kháng khuẩn. EXTRACTION AND DETERMINATION OF BIOLOGICAL PROPERTIES OF FLAVONOIDS FROM HELICTERES HIRSUTA LOUR. QUANG NAM Abstract The Root of Helicteres hirsuta Lour was extracted with solvent of methanol 40% by electrodeposition ultrasonic at 60oC for 50 minutes with a frequency of 25 kHz show the highest flavonoid content of 10.933 mg/g ± 0.101a. Extracts and extract solution have the best antioxidant activity with an IC50 value that are 271,900 μg/mL and 302,850 μg mL. The roof extracts had antibacterial activity with zones of inhibition of 20,667mm ± 1,155a against E. coli and 16,667mm ± 1,1528a against Samonella at concentration 652 µg/ml. Helicteres hirsuta Lour can be regarded as promising candidates for natural plant soures of antioxidant and antibacterial activities. Key words: Helicteres hirsuta Lour, flavonoid, extracts, antioxidants, antibacterial. iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của đề tài ......................................................................................1 2. Mục tiêu nghiên cứu ...........................................................................................1 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ......................................................................2 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ...............................................2 5. Cấu trúc luận văn ................................................................................................2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................3 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.) ..................................3 1.1.1. Phân loại .......................................................................................................3 1.1.2. Đặc điểm hình thái của cây An xoa ..............................................................3 1.1.3. Công dụng của cây An xoa ...........................................................................4 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY AN XOA ...................................................4 1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới .........................................................................4 1.2.2. Các nghiên cứu trong nước ...........................................................................5 1.3. TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT FLAVONOID .......................................................6 1.3.1. Định nghĩa.....................................................................................................6 1.3.2. Phân loại các hợp chất flavonoid ..................................................................7 1.3.3. Phân bố flavonoid trong thực vật................................................................10 1.3.4. Hoạt tính sinh học của các hợp chất flavonoid ...........................................11 1.4. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH CÁC HỢP CHẤT FLAVONOID .....................13 1.4.1. Khái niệm phương pháp chiết tách .............................................................13 1.4.2. Phương pháp chiết tách các hợp chất flavonoid .........................................14 1.4.3. Các phương pháp chiết tách bằng dung môi...............................................15 1.4.4. Một số phương pháp chiết tách khác ..........................................................16 1.5. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI QUÁ TRÌNH CHIẾT....................................18 1.5.1. Dung môi ....................................................................................................18 1.5.2. Những yếu tố về kỹ thuật ............................................................................18 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................20 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ....................................................................................21 2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................................21 2.1.2. Thiết bị, hóa chất ........................................................................................21 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................................................22 2.2.1. Xác định một số thành phần hóa học trong lá, thân và rễ cây An xoa .......22 2.2.2. Phương pháp tách chiết và xác định hàm lượng flavonoid toàn phần ........24 iv CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................................33 3.1. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÂY AN XOA ......33 3.2. PHƯƠNG TRÌNH ĐƯỜNG CHUẨN CATECHIN ..............................................34 3.3. KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG FLAVONOID TOÀN PHẦN CÓ TRONG CÁC BỘ PHẬN KHÁC NHAU CỦA CÂY AN XOA ................................................................35 3.4. NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP CHIẾT .......................................36 3.5. NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN DUNG MÔI CHIẾT ...............................................37 3.6. NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HÀM LƯỢNG FLAVONOID TOÀN PHẦN TRONG QUÁ TRÌNH CHIẾT .....................................38 3.6.1. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng flavonoid toàn phần trong quá trình chiết .......................................................................................................................38 3.6.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng flavonoid toàn phần trong quá trình chiết ..............................................................................................39 3.6.3. Ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm đến hàm lượng flavonoid toàn phần trong quá trình chiết.......................................................................................................40 3.7. TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH TRÍCH LY FLAVONOID TOÀN PHẦN TỪ RỄ CÂY AN XOA BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁP ỨNG BỀ MẶT RSM ........................41 3.8. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FLAVONOID TOÀN PHẦN TRONG DỊCH CHIẾT VÀ CAO CHIẾT VỚI CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU ......................................................44 3.9. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CÓ TRONG DỊCH CHIẾT VÀ CAO CHIẾT TỪ RỄ CÂY AN XOA ...........................................................................45 3.10. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG PHÂN BÀO TỪ CAO CHIẾT CỦA RỄ CÂY AN XOA ........................................................................48 3.10.1. Đánh giá khả năng kháng khuẩn từ cao chiết của rễ cây An xoa .............48 3.10.2. Đánh giá khả năng gây độc tế bào ............................................................49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................51 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI (BẢN SAO) v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AOAC CE DC DPPH EA HAD80 IC50 MeOH PE OD R/L SRB TCVN V/v : Association of Official Analytical Chemists : Catechin equivalents : Dicloromethane : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl : Ethyl acetate : Sấy nóng bằng không khí ở 800C : Inhibitory concentration 50% : Methanol : Petroleum ether : Optical Density - Mật độ quang : Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi : Sulforhodamine B : Tiêu chuẩn Việt Nam : Thể tích/thể tích vi DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu bảng 1.1. 1.2. 2.1. 2.2. 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. 3.8. 3.9. 3.10. 3.11. Tên bảng Trang Tính chất lý học của các dung môi Độ nhớt và sức căng bề mặt của một số dung môi thường gặp ở nhiệt độ 200C (xếp theo thứ tự tăng dần) Nhân tố và các mức độ bố trí thí nghiệm theo mô hình Box- behnken Mô hình thí nghiệm tác động qua lại giữa các nhân tố Một số thành phần hóa học có trong bột cây An xoa Nhân tố và các mức độ bố trí thí nghiệm theo mô hình Box- behnken Kết quả hàm lượng flavonoid toàn phần từ rễ cây An xoa thu được qua các thí nghiệm Mức ý nghĩa của các hệ số hồi quy Phân tích phương sai (ANOVA) của phương trình hồi quy cho quá trình chiết có hỗ trợ siêu âm điện cực Hàm lượng flavonoid toàn phần có trong dịch chiết và cao chiết Tỷ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của dịch chiết rễ An xoa trong dung môi methanol 40% có hỗ trợ bằng phương pháp siêu âm điện cực Tỷ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao chiết rễ An xoa trong dung môi methanol 40% có hỗ trợ bằng phương pháp siêu âm điện cực Giá trị IC50 của dịch chiết và cao chiết từ rễ cây An xoa trong dung môi methanol 40% bằng phương pháp siêu âm điện cực trong điều kiện tối ưu Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết trên dòng tế bào ung thư Gan Hep - G2 ở nồng độ 100 µg/mL 14 18 27 28 33 41 41 42 43 45 46 47 48 48 50 vii DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Số hiệu hình và đồ thị 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6. 1.7. 1.8. 1.9. 2.1. 2.2. 2.3. 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. 3.8. 3.9. Tên hình và đồ thị Trang Hình ảnh cây An xoa Cấu trúc của flavonoid Phân loại flavonoid Cấu trúc của anthocyanidin Cấu trúc của Catechin và Gallocatechin Cấu trúc của flavan 3,4-diol Một số chất flavanon có trong thực vật Cấu trúc của flavonol Cấu trúc của dihydrochalcon Sơ đồ thực hiện đề tài Mẫu nguyên liệu Sơ đồ tinh sạch cao chiết flavonoid từ cây An xoa Đồ thị phương trình đường chuẩn catechin. A: Dung môi methanol 40%; B: Dung môi ethanol 40%; C: Dung môi chloroform 40%. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các bộ phận khác nhau của cây An xoa đến hàm lượng flavonoid toàn phần Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các phương pháp chiết khác nhau đến hàm lượng flavonoid toàn phần Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các dung môi chiết khác nhau đến hàm lượng flavonoid toàn phần Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các thời gian chiết khác nhau đến hàm lượng flavonoid toàn phần Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các tỷ lệ nguyên liệu/dung môi chiết khác nhau đến hàm lượng flavonoid toàn phần Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các cường độ sóng siêu âm chiết khác nhau đến hàm lượng flavonoid toàn phần Biểu đồ chu tuyến 3D (A) và biểu đồ bề mặt 2D (B) xác định vùng giá trị cho mỗi điều kiện Các điều kiện tối ưu của quá trình chiết flavonoid toàn phần từ rễ cây An xoa bằng phương pháp siêu âm điện cực trong dung môi methanol 40%. 3 7 7 7 8 8 9 9 10 20 21 30 35 36 37 38 38 39 40 44 44 viii Số hiệu hình và đồ thị 3.10. 3.11. 3.12. 3.13. Tên hình và đồ thị Đồ thị biểu diễn % bắt gốc tự do DPPH đối với các hàm lượng flavonoid khác nhau có trong dịch chiết từ rễ cây An xoa Đồ thị biểu diễn % bắt gốc tự do DPPH đối với các hàm lượng flavonoid khác nhau có trong cao chiết từ rễ cây An xoa Ảnh thực hiện phản ứng khử gốc tự do DPPH ở các nồng độ flavonoid toàn phần khác nhau Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Trang 46 47 48 49 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cây An xoa (hay còn gọi là cây thâu kén cái, thâu kén lông, tổ kén cái, dó lông) có tên khoa học Helicteres hirsuta Lour. là một loài thực vật thuộc họ Trôm (Sterculiaceae), là cây bụi, thân gỗ, mọc ở nơi đất ẩm, lá thường to bằng bàn tay, có lông, hoa có màu hồng hay đỏ, quả có hình như con sâu, có lông chạm vào thì ngứa [2]; [24]. Cây phân bố chủ yếu ở Nam Trung Quốc, khu vực Nam Á và các nước Đông Nam Á như Lào, Indonesia, Campuchia, Thái Lan và Việt Nam. Cây rất dễ trồng, sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiều điều kiện sinh thái. Tại một số nước như Ấn Độ, Trung Quốc, cây An xoa được sử dụng như một loại thuốc truyền thống để điều trị các bệnh như sốt rét và bệnh tiểu đường. Trong đó, cây An xoa chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao có tác dụng điều trị nhiều bệnh khác nhau, do đó được sử dụng để làm thuốc chữa bệnh, hầu hết các bộ phận của cây đều được sử dụng để trị bệnh…. Cây An xoa được dùng trong những trường hợp người hay nhức mỏi, đau lưng, mất ngủ, da xanh, kể cả những người tim hay mệt cũng có thể cải thiện sức khỏe một cách hiệu quả [2]; [24]. Lá cây An xoa có thể chữa trị được một số bệnh thường gặp như ung nhọt, sưng lở. Phần rễ dùng làm dịu cơn đau, chữa kiết lỵ, đậu sởi, cảm cúm, đái dắt và làm thuốc tiêu độc [3]. Ở Campuchia và ở tỉnh Bình Phước - Việt Nam, cây cũng được sử dụng như một loại thuốc dân gian để điều trị các bệnh về gan. Hiện nay, tại Việt Nam cây An xoa được tìm thấy nhiều nơi ở các tỉnh giáp biên giới Campuchia như Bình Phước và nhiều tỉnh miền Trung. Trong đó, tỉnh Quảng Nam là một trong những nơi tìm thấy nhiều cây An xoa, cây mọc hoang và chưa được trồng phổ biến. Tại huyện Phú Ninh cây cũng được tìm thấy nhiều nhưng chưa được trồng và sử dụng rộng rãi để làm thuốc. Trên thế giới, cũng có một số công trình nghiên cứu đã xác định được trong cây An xoa chứa các chất có hoạt tính sinh học có tác dụng chữa được một số bệnh. Ở Việt Nam, vấn đề nghiên cứu về cây An xoa vẫn còn hạn chế và chưa thực sự được quan tâm nhiều, chỉ được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền, chưa ứng dụng nhiều vào công nghệ dược phẩm để chữa bệnh. Với những tác dụng to lớn của loài cây này, đồng thời nhằm tìm hiểu để ứng dụng vào dược phẩm và các loại thực phẩm chức năng chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách và xác định hoạt tính sinh học của các flavonoid từ cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.) Quảng Nam”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng quy trình tách chiết để thu được dịch chiết và cao chiết có chứa hàm lượng flavonoid toàn phần cao nhất từ cây An xoa. - Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn, và hoạt tính gây độc tế bào từ cao chiết. 2 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu Các bộ phận của cây An xoa (thân, lá, rễ) được thu hái tại huyện Phú Ninh - tỉnh Quảng Nam, Việt Nam. * Phạm vi nghiên cứu Các nghiên cứu được thực trên quy mô phòng thí nghiệm thuộc khoa Hóa Trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng. 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài * Ý nghĩa khoa học - Cung cấp thông tin khoa học về thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của dịch chiết và cao chiết flavonoid từ cây An xoa tại huyện Phú Ninh, tỉnh Quảng Nam. - Cung cấp thông số công nghệ của quá trình tách chiết bằng các phương pháp phân tích khoa học và hiện đại. * Ý nghĩa thực tiễn - Xây dựng phương trình tối ưu hóa điều kiện chiết ở quy mô phòng thí nghiệm, làm cơ sở cho những nghiên cứu ứng dụng ở quy mô sản xuất công nghiệp. - Cao chiết từ cây An xoa là nguồn sử dụng tạo ra sản phẩm mới có giá trị dược liệu cao, góp phần đa dạng hóa sản phẩm và nâng cao giá trị chữa bệnh từ cây An xoa. 5. Cấu trúc luận văn Ngoài phần mở đầu, kết luận và kiến nghị, danh mục tài liệu tham khảo và phụ lục, trong luận văn gồm có các chương với nội dung như sau: - Chương 1: Tổng quan tài liệu - Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - Chương 3: Kết quả và thảo luận 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.) Cây An xoa có tên khoa học Helicteres hirsuta Lour., được biết đến với nhiều tên gọi khác nhau như: cây dó lông, tổ kén lông, thâu kén lông, thâu kén cái [6]. 1.1.1. Phân loại Cây An xoa được phân loại theo khoa học, cụ thể là: Giới thực vật : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Bộ Cẩm quỳ : Malvales Họ Cẩm quỳ : Malvaceae Chi : Helicteres Loài : Helicteres hirsuta Lour. Hình 1.1. Hình ảnh cây An xoa 1.1.2. Đặc điểm hình thái của cây An xoa Cây An xoa là cây thân bụi, cao từ 1 - 3m, nhánh hình trụ, có lông. Lá hình trái xoan, dài 5 - 17cm, rộng 2,5 - 7,5cm. Gốc cụt hay hình tim, đầu thon dài thành mủi nhọn. Mép có răng không đều. Mặt dưới màu trắng, cả hai mặt phủ đầy lông hình sao, gân gốc 5cm, cuống lá dài 0,8 - 4cm, có lông, dễ rụng. Cụm hoa là những bông ngắn, đơn hay xếp đôi ở nách lá. Hoa màu hồng hay đỏ, cuống hoa có khớp và có lá bắc dễ rụng, đài hình ống phủ lông hình sao, màu đo đỏ, chia 5 răng, cánh hoa 5, cuống bộ nhị có vân đỏ, nhị 10, nhị lép bằng chỉ nhị, bầu có nhiều gợn, chứa 25 - 30 màu trong mỗi lá noãn. Quả nang hình trụ nhọn, hạt nhiều hình lăng trụ. Ra hoa kết quả từ mùa hạ đến mùa đông [2]; [6]. Cây An xoa mọc phổ biến từ Bắc vào Nam, mọc phổ biến trong rừng thưa, ven rừng, trên các bãi hoang, đồi cỏ, ở độ cao từ thấp lên đến 1500m. Ra hoa kết trái gần 4 như quanh năm. Riêng tại Lộc Ninh (Bình Phước) và Tân Uyên (Bình Dương) cây thường mọc vùng đất cát, đất xám. Sống dưới tán cây rừng, cây khộp, rừng bụi, vùng ven suối, trên đất hoang. Mùa khô mọc ít lá, hoa nở nhiều từ tháng 4 - 5. Hiện nay cây An xoa được dùng như một loại thuốc dân gian chữa được nhiều loại bệnh. 1.1.3. Công dụng của cây An xoa Cây An xoa chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao có tác dụng điều trị nhiều bệnh khác nhau, do đó được sử dụng để làm thuốc chữa bệnh, hầu hết các bộ phận của cây đều được sử dụng. Cây An xoa được dùng trong những trường hợp người hay nhức mỏi, đau lưng, mất ngủ, da xanh, kể cả những người tim hay mệt cũng có thể cải thiện sức khỏe một cách hiệu quả [25]. Các bộ phận của cây An xoa dùng để chữa bệnh về gan [2]. Lá có thể chữa trị được một số bệnh thường gặp như ung nhọt, sưng lở. Phần rễ dùng làm dịu cơn đau, chữa kiết lỵ, đậu sởi, cảm cúm, đái dắt và làm thuốc tiêu độc [3]. Hiện nay, cây được sử dụng phổ biến như một loại thuốc dân gian dùng để chữa ung thư gan. 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY AN XOA 1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới Năm 2005, Young - Won Chin và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu hợp chất lignan gây độc tế bào từ bộ phận thân của cây An xoa. Nghiên cứu đã thành công trong việc cô lập và xác định sáu lignan, sau đó đánh giá các hiệu ứng độc tế bào của chúng đối với một bảng nhỏ các đường tế bào ung thư ở người, cụ thể là (±)-pinoresinol, (±)medioresinol, (±)-syringaresinol, (-)-boehmenan, (-)-boehmenan H và (±)-transdihydrodiconiferyl alcohol. Trong số những phân lập này, (±)-pinoresinol có tác dụng gây độc mạnh khi đánh giá trên một bảng nhỏ có các dòng tế bào ung thư [17]. Năm 2014, Jain và cộng sự đã nghiên cứu đánh giá hàm lượng flavonoid cũng như hoạt tính chống oxy hoá của cây Helicteres isora Lour. Trong nghiên cứu này, bốn loại dung môi nước, ethanol, methanol, và axeton được sử dụng trong quá trình tách chiết từ các bộ phận khác nhau của cây Helicters isora Lour. Trong đó methanol đã được chứng minh là dung môi tốt nhất để chiết xuất các hợp chất flavonoid và chất chống oxy hoá. Nghiên cứu này chứng minh được hoạt tính kháng oxy hóa của chiết xuất thô từ lá khô, rễ khô, quả tươi phụ thuộc rất nhiều vào hàm lượng flavonoid từ đó ứng dụng trong việc phát triển sản xuất các loại thuốc thảo dược [20]. Năm 2015, Phạm Hồng Ngọc Thúy và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết xuất lên tính chất hóa lý và hoạt tính chống oxy hóa của lá cây An xoa. Nghiên cứu này cho thấy các đặc tính vật lý, hóa học và chống oxy hóa của lá cây An xoa đã bị ảnh hưởng đáng kể bởi các dung môi. Trong số các dung môi như acetonitril, ethanol, methanol, ethyl acetate thì methanol là dung môi thích hợp nhất để tách chiết flavonoid [24]. Năm 2016, Phạm Hồng Ngọc Thúy và cộng sự đã nghiên cứu cho thấy các loại 5 dung môi khác nhau có tác động đáng kể đến hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học và hoạt tính chống oxy hoá từ thân cây An xoa. Qua quá trình nghiên cứu cho thấy nước là một dung môi an toàn, rẻ tiền và thân thiện với môi trường được lựa chọn để chiết xuất các hợp chất flavonoid. Các hợp chất flavonoid ảnh hưởng đến khả năng chống oxy hoá của chiết xuất từ thân cây Helicteres hirsuta Lour [24]. Năm 2017, nhằm mục đích tối ưu hóa các điều kiện chiết xuất thông thường để đạt được hàm lượng flavonoid và hoạt tính chống oxy hoá cao nhất trong cây nên Phạm Hồng Ngọc Thúy và cộng sự đã tiếp tục tiến hành nghiên cứu về cây An xoa. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của thời gian chiết, nhiệt độ, và tỷ lệ mẫu đến dung môi đối với hoạt tính các hợp chất sinh học và khả năng chống oxy hoá của cây An xoa. Kết quả cho thấy tỷ lệ mẫu với dung môi tác động mạnh nhất lên hoạt tính sinh học và khả năng chống oxy hoá của Helicteres hirsuta Lour. và các điều kiện chiết tối ưu bao gồm nhiệt độ 600C, thời gian 35 phút ở tỷ lệ mẫu/dung môi 1:100g/ml bằng 40% (V/v) methanol làm dung môi. Trong các điều kiện này, hàm lượng flavonoid cao nhất là 17,55mg CE/g, cao hơn đáng kể so với các giá trị thu được khi sử dụng nước làm dung môi [25]. Năm 2018, Phạm Hồng Ngọc Thúy và cộng sự đã tiến hành khảo sát các đặc tính kháng khuẩn và chống ung thư trong ống nghiệm của chất chiết xuất từ lá và thân của cây An xoa thông qua hai phân đoạn của chúng (phân đoạn butanol chứa saponin ở dạng lỏng và phân đoạn cô đặc saponin) đã được chứng minh. Các xét nghiệm MTT và CCK-8 được sử dụng để đánh giá các đặc tính chống ung thư trong ống nghiệm đối với các dòng tế bào ung thư khác nhau. Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá bằng phương pháp khuyếch tán đĩa và xác định các giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). Kết quả cho thấy các phân đoạn giàu saponin từ lá và thân của cây H. hirsuta có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất chống lại vi khuẩn E. coli (giá trị MIC 2,50 và 5,00 mg/ml) và S. lugdunensis (giá trị MIC 0,35 và 0,50 mg/mL, tương ứng). Quan trọng hơn, những phân đoạn giàu saponin này có hoạt tính chống ung thư mạnh trong ống nghiệm đối với một loạt các dòng tế bào ung thư bao gồm MIA PaCa-2 (Tuyến tụy); A2780 (Buồng trứng); H460 (Phổi); A431 (Da); Du145 (Tuyến tiền liệt); HT29 (Đại tràng); MCF-7 (Vú); SJ-G2, U87, SMA (Glioblastoma) và BE2-C (Neuroblastoma) ở liều thấp (giá trị GI50 0,36-11,17 µg/ml). Nhóm nghiên cứu cho biết hoạt tính chống ung thư tuyến tụy trong ống nghiệm chống lại được các tế bào MIA PaCa-2, BxPC-3 và CFPAC-1 với giá trị IC50 là 1,80-6,43 µg/ml. Nghiên cứu này cung cấp bằng chứng khoa học về hoạt tính gây độc tế bào của chất chiết xuất từ lá và thân cây Helicteres hirsuta và đề xuất các nghiên cứu sâu hơn để phân lập các hợp chất có hoạt tính để phát triển các tác nhân chống ung thư mới từ các chất chiết xuất của cây [29]. 1.2.2. Các nghiên cứu trong nước Năm 2016, Nguyễn Hữu Duyên và Lê Thanh Phước đã thu mẫu thân, lá và hoa 6 của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.) tại Hòn Sơn thuộc xã Lại Sơn, huyện Kiên Hải, Tỉnh Kiên Giang để tiến hành thí nghiệm. Bột khô của cây an xoa được ngâm dầm trong ethanol 96% trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó lọc và cô quay thu được cao ethanol. Cao ethanol được chiết lần lượt với các dung môi petroleum ether (PE), dicloromethane (DC), ethyl acetate (EA), methanol (MeOH) và thu được bốn cao phân đoạn tương ứng. Các cao chiết sau đó được gởi tại Phòng Sinh học Thực nghiệm Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam để khảo sát hoạt tính gây độc trên dòng tế bào Hep-G2 (ung thư gan), được thực hiện theo phương pháp của Skehan (1990) và Likhiwitayawuid (1993) hiện đang được áp dụng tại Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI) và trường Đại học Dược, Đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ. Kết quả có hai cao biểu hiện hoạt tính gây độc với dòng tế bào Hep-G2 là cao PE và cao DC. Từ cao DC đã cô lập được 4 hợp chất: stigmasterol, lupeol, apigenin và tiliroside. Cấu trúc hóa học các hợp chất được xác định bằng các phương pháp phổ (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) [3]. Năm 2017, Lê Thị Hải Yến và cộng sự tiếp tục nghiên cứu tác dụng giảm đau và chống viêm trên chuột nhắt trắng từ các chất chiết xuất của cây Helicteres hirsuta Lour. Tác dụng giảm đau khi nghiên cứu trên máy đo ngưỡng đau và trên mô hình mâm nóng ở chuột nhắt trắng dùng ở liều 24 g/kg/ngày (liều tương đương lâm sàng) uống trong 5 ngày liên tục. Ngoài ra, khi sử dụng liều 72 g/kg/ngày (gấp 3 liều lâm sàng) uống trong 5 ngày liên tục có tác dụng chống viêm cấp ở chuột nhắt trắng trên mô hình gây phù chân chuột, thể hiện rõ ở các thời điểm sau gây viêm 2 và 4 giờ [15]. Năm 2018, từ hoạt tính kháng tế bào ung thư gan khá cao của nghiên cứu trước đó cũng như các công dụng chữa bệnh về gan trong các bài thuốc trong dân gian Việt Nam của cây an xoa, Nguyễn Hữu Duyên, Lê Thanh Phước và Nguyễn Văn Ky tiếp tục tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của cây an xoa nhằm góp phần giải thích rõ ràng hơn công dụng chữa bệnh của loài thảo dược này. Từ 200g cao tổng (ethanol) tiến hành tách phân đoạn bằng kỹ thuật phân bố lỏng - lỏng thu được 20,85g cao dichloromethan. Từ 8g cao dichloromethan tiến hành sắc ký cột pha thường và phân lập được 2 hợp chất HD07 và HD10d. Dựa vào số liệu phổ 1D, 2D-NMR, MS và đối chiếu với các tài liệu tham khảo đã nhận danh được 2 hợp chất HD07 và HD10d lần lượt là: α-p-hydroxy truxillic acid và 7,4'-di-O-methyl-8-O-sulphat isoscutellarein [16]. 1.3. TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT FLAVONOID 1.3.1. Định nghĩa Flavonoid là nhóm hợp chất phenol có cấu tạo khung theo kiểu C6-C3-C6 hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon là nhóm hợp chất tự nhiên thường gặp trong thực vật (hình 1.1). Phần lớn các flavonoid có màu vàng nhạt, một số có màu đỏ, xanh, tía và các dạng không màu [19]. 7 Hình 1.2. Cấu trúc của flavonoid 1.3.2. Phân loại các hợp chất flavonoid Phân loại flavonoid: Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hoá của mạch 3C. Flavonoid được phân loại: euflavonoid là các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-2, isoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3, neoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4, (hình 1.2). Ngoài ra, còn phân biệt biflavonoid là những flavonoid dimer, triflavonoid cấu tạo bởi 3 monomer flavonoid, flavolignan là những flavonoid mà phân tử có một phần cấu trúc lignan [19]. Euflavonoid Isoflavonoid Neoflavonoid Hình 1.3. Phân loại flavonoid - Euflavonoid: gồm các nhóm anthocyanidin, flavan, flavan 3-ol, flavan 4-ol, flavan 3,4-diol, flavanon, 3-hydroxy flavon, flavonol, dihydrochalcon, chalcon, auron [19]. - Anthocyanidin: hay 2 phenylbenzopyrilium đây cũng là sắc tố phổ biến trong thực vật. Trong cây các sắc tố này đều ở dạng glycoside (anthocyanin) nằm trong dịch tế bào. Khi đun anthocyanin trong dung dịch HCl 20% thì phần đường trong phân tử (thường nối vào OH ở C-3) bị cắt và cho phần aglycon được gọi là anthocyanidin. Ở trong dung dịch acid (pH 1 - 4) tạo muối có màu đỏ, ở môi trường kiềm (pH>6) là anion cũng tạo được muối với các chất kiềm có màu xanh. Dung dịch anthocyanidin mất màu bởi bisulfit kiềm và dễ bị oxi hóa nên ít được dùng làm phẩm màu [19]; [12]. Hình 1.4. Cấu trúc của anthocyanidin 8 - Flavan 3-ol: tùy theo các nhóm thế đính vào 2 vòng A và B mà có những dẫn chất flavan 3-ol khác nhau. Catechin, gallocatechin và những đồng phân của chúng là những dẫn chất của flavan 3-ol nhiều trong thực vật như lá chè. Các chất catechin và gallocatechin có công thức như sau: Hình 1.5. Cấu trúc của Catechin và Gallocatechin Người ta thường gặp những dẫn chất của flavan 3-ol ở dạng dimer, trimer, tetramer, pentamer và được gọi là tannin, thường có trong loại trà Camellia sinensis CV. viridis [12]. Flavan 3,4-diol: các dẫn chất flavan 3,4-diol đều không màu, có tính quang hoạt, khi đun sôi với acid thì dễ chuyển thành anthocyanidin có màu đỏ. Vì dễ bị oxi hóa và trùng hợp nên việc phân lập chất tinh khiết gặp khó khăn. Phần lớn chúng thường ở dạng dimmer. Các đơn phân được xác định bằng cách chuyển thành các dẫn chất anthocyanidin tương ứng [12]. Hình 1.6. Cấu trúc của flavan 3,4-diol Flavanon: flavanon là những chất không màu nhưng khi làm phản ứng cyaniding thì cho màu rõ hơn flavon, ngoài ra flavanon có điểm chảy thấp hơn flavon tương ứng, dựa vào đây có thể sơ bộ nhận biết. Nhóm này thường có nhiều trong cây cam thảo (liquiritin và isoliquiritin). Hesperidin, naringin là những flavanon gặp nhiều trong một số vỏ cây Citrus. Naringin có vị đắng bằng 1/5 quinin, tuy nhiên aglycon thì không đắng ngoài ra nếu thay đường neohesperidose bằng đường rutinose thì lại mất vị đắng. Nếu mở vòng C của naringin để tạo thành chalcon rồi hydrogen hóa tạo thành dihydro chalcon thì dẫn chất này có vị ngọt bằng saccharin [8]; [12]. 9 Hình 1.7. Một số chất flavanon có trong thực vật 3- Hydroxyflavanon (dihydroflavanol = flavanonol): có 2 carbon bất đối ở C2 và C3. Phần lớn dihyroflavonol ở dạng aglycon, cũng có một số ở dạng glycoside. Dihydroflavonol khó phân lập vì kém bền, dễ bị oxi hóa. Trong đó có dẫn chất của taxifolin hay gặp nhất [12]. Flavon: có cấu trúc 2 vòng benzen A và B, với vòng B gắn vào vòng C (pyran) tại vị trí C2, có nối đôi ở vị trí 2-3. Các dẫn chất flavon rất phổ biến trong thực vật, kết tinh không màu đến vàng nhạt. Chỉ tính đến các flavon có nhóm thế OH hoặc OCH3 đã có tới hơn 300 chất. Chất flavon đơn giản nhất không có nhóm thế đã được phân lập từ cây anh thảo (Primula). Hai flavon hay gặp nhất trong cây là apigenin và lutelin [12]. Flavonol (flavon 3-ol): khác với flavon thì flavonol có thêm nhóm OH ở C3. Flavonol kết tinh màu vàng nhạt đến vàng. Những dẫn chất flavonol rất phổ biến trong thực vật, đặc biệt là hành, hoa hòe, lúa mạch, rau nghễ, diếp cá. Cho đến năm 1992 đã có tới 380 chất flavonol có nhóm thế hydroxyl và hoặc methoxyl đã được biết tới. Các chất thường gặp ở thực vật: kaempferol, quercetin, myricetin [12]. Hình 1.8. Cấu trúc của flavonol Chalcon: có 2 vòng A và B nối với nhau bởi một mạch hở 3C không có dị vòng C như các flavonoid khác. Đây là những chất có màu vàng đến vàng cam. Chalcon có chủ yếu trong một số hoa thuộc họ Cúc (Asteraceae). Để nhận biết chalcon có thể dùng hơi ammoniac hoặc khói kiềm của thuốc lá, màu sẽ chuyển sang đỏ cam hoặc 10 cam đỏ hay đỏ. Chalcon cũng có thể ở trong các bộ phận khác như vỏ, lá, rễ, quả (ví dụ: isoliquiritigenin trong rễ cam thảo) [12]. Dihydrochalcon: các chất này ít gặp trong tự nhiên. Ví dụ như phloridin có trong một loài Malus, chất này có độc tính ngăn sự hấp thu glucose ở ruột non và ngăn sự tái hấp thu glucose ở tiểu quản thận. Một số dihydrochalcon có vị rất ngọt ví dụ như neohesperidosid có vị ngọt gấp 2000 lần đường mía [12]. Hình 1.9. Cấu trúc của dihydrochalcon Auron: là nhóm flavonoid có màu vàng sáng. Khung của auron cũng có 15C như các flavonoids khác nhưng dị vòng C có 5 cạnh. Số lượng cũng như sự phân bố trong cây cũng bị hạn chế. Chất điển hình là auresidin gặp phổ biến trong hoa của một số họ: Asteraceae, Scrophulariaceae, Plumbaginaceae, Oxalidaceae và ở dạng 4- glucosid hay 6-glucosid [12]. Isoflavonoid: Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3, gồm nhiều nhóm khác nhau như isoflavan, isoflava-3-ene, isoflavan 4-ol, isoflavanon; isoflavon, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3-arylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon, các chất này thường gặp trong các cây họ đậu (Fabaceae). + Isoflavan: glabridin là một thành phần flavonoid gặp trong rễ cam thảo. + Isoflavan-3-ene: flabren có trong cam thảo. + Isoflavon: là nhóm lớn nhất của isoflavonoid. Hiện nay, hơn 364 chất đã được xác định, chúng có nhiều tác dụng trong y học thường gặp trong các họ Rosaceae, Amaranthaceae, Iridacea, ví dụ daizein trong sắn dây, forrmonometin trong cam thảo [8]; [12]. Rotenoid: cho đến nay hơn 75 chất thuộc nhóm chất này đã được phân lập và xác định được cấu trúc. Cấu trúc của nhóm rotenoid là C6-C4-C6 vì có thêm 1C do oxy hóa đóng vòng. Điển hình là rotenon có tác dụng diệt sâu bọ. Neoflavonoid: các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4, gồm nhóm chất có khung 4arylchroman và 4-aryl coumarin, các chất này chỉ có giới hạn trong một số loài thực vật [12]. 1.3.3. Phân bố flavonoid trong thực vật Flavonoid ít gặp trong thực vật bậc thấp. Tuy nhiên, một số nghiên cứu về ngành rêu và dương xỉ cho thấy có sự xuất hiện của các nhóm anthocyanin, flavanon, flavon, flavonol, chalcon, dihydrochalcon. Ngành hạt trần có khoảng 700 loài, 20 họ, số lượng flavonoid cũng không nhiều nhưng cũng đủ các nhóm anthocyanidin, leucoanthocyanidin, flavanon, flavon,