Tài liệu Nghiên cứu biến nạp gen vào đậu tương (glycine max (l.) merrill) thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ---------  -------- NGUYỄN TIẾN DŨNG Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN VÀO ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens” LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên-2010 http://www.lrc -tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ---------  -------- NGUYỄN TIẾN DŨNG Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60.42.30 Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN VÀO ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens” LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: T.S. Nguyễn Văn Đồng PGS.TS. Ngô Xuân Bình Thái Nguyên-2010 http://www.lrc -tnu.edu.vn http://www.lrc -tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Các quốc gia sản xuất đậu tương nhiều nhất thế giới năm 2008 ............. 5 Bảng 1.2. Số liệu thống kê sản xuất đậu tương qua các vùng khác nhau ............... 6 Bảng 1.3. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam ..................................... 7 Bảng 1.4. Các chỉ thị chọn lọc dùng cho biến nạp gen ........................................... 17 Bảng 1.5 Các gen thông báo chỉ thị sinh hóa ......................................................... 20 Bảng 2.1. Thành phần môi trường nuôi cấy ........................................................... 38 Bảng 3.1. Khả năng phát sinh chồi của một số giống đậu tương sau 10 ngày ....... 45 Bảng 3.2. Khả năng kéo dài chồi và ra rễ tạo cây hoàn chỉnh ..................................47 Bảng 3.3. Kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho biến nạp gen .............. 48 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn biến nạp đến hiệu quả biến nạp gen .... 53 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của phương thức tăng cường khả năng lây nhiễm ............... 54 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp gen ....... 56 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến khả năng biến nạp gen ........................ 57 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của L-cystein đến hiệu quả biến nạp gen ............................ 58 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của hygromycin đến khả năng chọn lọc sau chuyển gen ......... 59 Bảng 3.10. Hiệu quả chuyển gen vào một số giống đậu tương .............................. 62 Bảng 3.11. Số cây sau chọn lọc của một số giống đậu tương ................................. 63 Bảng 3.12. Kết quả phân tích PCR các dòng đậu tương chuyển gen với cặp mồi .. 65 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopin ................................................. 10 Hình 1.2. Sự tương tác giữa Agrobacterium với tế bào thực vật ........................... 12 Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc vector nhị thể ................................................................. 15 Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp ............................................................... 16 Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc vector pX2-H ................................................................. 31 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình tái sinh cây đậu tương ................................................... 35 Hình 2.3. Sơ đồ quy trình biến nạp gen vào đậu tương .......................................... 37 Hình 3.1. Phát sinh tạo đa chồi ở một số giống đậu tương nghiên cứu ................... 46 Hình 3.2. Phát sinh rễ của một số giống đậu tương ................................................ 48 Hình 3.3. Biểu hiện gus ở đậu tương khi được lây nhiễm với các chủng vi khuẩn .......... 49 Hình 3.4. Mẫu biến nạp plasmid pX2-H::gfp trong Agrobacterium chủng AGL1 .. 51 Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi gfp ..................... 52 Hình 3.6. Chọn lọc chồi chuyển gen trên môi trường SIM .................................... 60 Hình 3.7. Biểu hiện của gen gfp được chuyển vào các giống đậu tương ................ 63 Hình 3.8. Kết quả điện di DNA tổng số của các dòng đậu tương ........................... 64 Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR . ............................................................ 65 http://www.lrc -tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AS : Acetosyringone BAP : 6 - Benzylaminopurine bp : base pair (cặp bazơ) GFP : Green Fluorescent Protein DNA EDTA : : Deoxyribo Nucleic Acid Ethylene Diamine Tetraacetace Axit Et-Br gus : : Ethidium Bromide hpt MSC NAA MS : : : : Gen mã hóa hygromycin phosphotransferase Multi - Cloning Site α -Napthalene acetic acid Murashige and Skoog, 1962 LB NOS : : Luria Bertani Nopalin Sythetase OD PCR : : Optical Density (mật độ quang học) Polymerase Chain Reaction SDS TAE : : Sodium Dodecyl Sulfate Tris-Acetate-EDTA TE : Tris-EDTA T- DNA Ti-Plasmid : : Transfer DNA (ADN chuyển) Tumor inducing plasmid (plasmit gây khối u thực vật) VIR X-gluc : : Virulence region (vùng gây độc có khả năng tạo khối u) 2,4-D : Dichlorophenoxy acetic acid & cs : và cộng sự -Glucuronidase gene (gen mã hóa -glucuronidase) 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronodase acid http://www.lrc -tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................................... 2 3. Yêu cầu nghiên cứu ........................................................................................... 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................... 3 1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu tƣơng ......................................................... 3 1.2. Đặc tính chống chịu của cây đậu tương ......................................................... 3 1.3. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và tại Việt Nam ....................... 6 1.3.1.Trên thế giới .................................................................................................. 6 1.3.2. Ở Việt Nam ................................................................................................... 7 1.4. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và quá trình chuyển gen ................... 9 1.4.1. Agrobacterium tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen thực vật trong tự nhiên ................................................................................................................... 9 1.4.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid ........................................................ 9 1.4.3. Cấu trúc và chức năng của các đoạn T-DNA .............................................. 11 1.4.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen ........................................................... 11 1.4.5. Tương tác giữa T-DNA và genome tế bào thực vật...................................... 13 1.5. Hệ thống vector sử dụng để biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ................................................................................... 14 1.5.1. Vector nhị thể ............................................................................................... 14 1.5.2. Hệ vector liên hợp ........................................................................................ 16 1.6. Gen chỉ thị ..................................................................................................... 17 1.6.1. Chỉ thị chọn lọc ........................................................................................... 17 1.6.2 Chỉ thị sàng lọc ............................................................................................. 18 1.7. Hệ thống tái sinh và biến nạp gen ở giống đậu tƣơng .................................. 20 1.7.1. Hệ thống tái sinh ở đậu tương ..................................................................... 20 1.7.2. Phương pháp biến nạp gen ở đậu tương...................................................... 21 Chƣơng 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 30 2.1. VẬT LIỆU ....................................................................................................... 30 2.1.1. Các thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ............................................................. 30 2.1.2. Hóa chất ....................................................................................................... 30 2.1.3. Plasmid, primers và vi khuẩn ..................................................................... 30 2.1.4. Vật liệu thực vật................................................................................ ............. 31 2.1.5. Địa điểm nghiên cứu....................................................................................... 32 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU................................................................................ 32 2.3. Ph-¬ng ph¸p nghiªn cøu..................................................................... ... 32 2.3.1. Biến nạp plasmid vào tế bào E.coli bằng phƣơng pháp sốc nhiệt ............. 32 2.3.2. Biến nạp plasmid vào tế bào Agrobacterium tumefaciens bằng phƣơng pháp xung điện ...................................................................................................... 33 2.3.3. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn ................................... 33 2.3.4. Phƣơng pháp PCR ...................................................................................... 34 2.3.5. Ph-¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gel agarose 2.3.6. Phƣơng pháp nuôi cấy tái sinh cây hoàn chỉnh ......................................... 35 2.3.7. Phƣơng pháp biến nạp gen vào các giống đậu tƣơng ................................ 39 2.3.8 Sàng lọc, phân tích cây chuyển gen ............................................................. 39 2.3.8.1. Sàng lọc thông qua gen chỉ thị GFP ......................................................... 39 2.3.8.2. Phân tích PCR........................................................................................... 39 2.3.9. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm, theo dõi, đánh giá và sử lý kết quả ........ 41 2.3.9.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm………………………………………….... 41 2.3.9.2. Phương pháp theo dõi, đánh giá ............................................................... .42 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 44 3.1. Kết quả đánh giá khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của một số giống đậu tƣơng ..................................................................................................................... 44 3.1.1. Khả năng phát sinh chồi của một số giống đậu tương ................................ 44 3.1.2. Khả năng kéo dài chồi, ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của các giống đậu tương nghiên cứu ............................................................................................................. 46 http://www.lrc -tnu.edu.vn 3.2. Kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen ở đậu tƣơng . 48 3.3. Kết quả biến nạp plasmid vector pX2-H::gfp vào chủng vi khuẩn thích hợp để biến nạp vào đậu tƣơng ............................................................................ 51 3.4. Tối ƣu hóa các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả biến nạp gen ..................... 52 3.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn lây nhiễm............................................... 52 3.4.2. Ảnh hưởng của phương thức tăng cường khả năng lây nhiễm .................. 54 3.4.3. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp gen .......... 55 3.4.4. Ảnh hưởng của nồng độ Acetosyringon (AS) ............................................. 56 3.4.5. Ảnh hưởng của L-cystein đến khả năng biến nạp ....................................... 57 3.4.6. Ảnh hưởng của hygromycin đến khả năng chọn lọc sau chuyển gen ......... 59 3.5. Đánh giá hiệu quả chuyển gen của một số giống đậu tƣơng ....................... 61 3.5.1. Hiệu quả chuyển gen thông qua gen chỉ thị sàng lọc gfp ........................... 61 3.5.2. Kết quả tách chiết DNA tổng số và phân tích PCR các dòng đậu tƣơng chuyển gen. ............................................................................................................ 63 LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................... 67 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ .......................................... 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 69 http://www.lrc -tnu.edu.vn MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Đậu tương [Glycine max (L.) Merrill.] là một trong những cây trồng có vị trí quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Ngoài giá trị dinh dưỡng trong hạt, đậu tương còn là cây trồng lý tưởng trong hệ thống luân canh do có khả năng cải tạo đất. Diện tích cây đậu tương ở nước ta 5 năm gần đây chỉ trên 170.000 ha, năng suất bình quân xấp xỉ 1,5 tấn/ha, sản lượng hạt trên 210 nghìn tấn, thấp hơn nhiều so với năng suất bình quân của thế giới [14]. Nguyên nhân chính là do năng suất của giống không cao, tổn thất do sâu bệnh hại trên đồng ruộng và sau thu hoạch lớn (hàng năm, ước tính thiệt hại về số lượng sau thu hoạch đối với đậu tương khoảng 6,2 - 14%). Diện tích đất canh tác nông nghiệp ngày càng bị thu hẹp do sự phát triển của các ngành công nghiệp và dịch vụ. Bên cạnh đó, nhu cầu về sản lượng hạt đậu tương để phục vụ cho phát triển chăn nuôi, công nghiệp chế biến ngày một tăng. Sản lượng đậu tương không đáp ứng đủ nhu cầu trong nước, do đó phải nhập khẩu từ các nước bên ngoài (năm 2009, Việt Nam nhập khẩu 2,3 triệu tấn đậu tương từ nước ngoài). Thêm nữa, những năm gần đây khí hậu toàn cầu đang có dấu hiệu thay đổi phức tạp. Hiện tượng trái đất nóng lên đã làm cho tình hình hạn hán, lũ lụt ngày càng trở nên nghiêm trọng. Việt Nam là một trong những nước sẽ chịu nhiều ảnh hưởng. Dự kiến, nếu mực nước biển dâng cao 1 mét, Việt Nam sẽ mất hơn 12% diện tích đất đai, nơi cư trú của 23% số dân. Nguồn nước và sản xuất nông nghiệp bị ảnh hưởng nghiêm trọng. Cùng với đó là sự gia tăng của dịch hại đã tác động không nhỏ đến cây trồng nói chung và đậu tương nói riêng. Để tăng sản lượng đậu tương, ngoài mở rộng thêm diện tích trong cơ cấu luân canh thì việc tăng năng suất là giải pháp chính. Sử dụng giống đậu tương biến đổi gen là một tiến bộ quan trọng trong ngành sản xuất đậu tương của thế giới hiện nay. Ở nước ta, đậu tương, ngô và bông là 3 cây trồng đang được nghiên cứu để tạo cây chuyển gen. Một số phòng thí nghiệm của các Viện nghiên cứu đã có những báo cáo kết quả nghiên cứu cây chuyển gen của Việt Nam như đậu tương [7], [8], ngô [4]. Tuy nhiên đó mới chỉ là các kết quả nghiên cứu ban đầu. http://www.lrc -tnu.edu.vn 1