Tài liệu Nghiên cứu tạo axít phenyllactic và ứng dụng trong bảo quản một số rau quả chế biến tối thiểu

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí, tập san khoa học với sự đồng ý của các đồng tác giả, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ thực hiện luận án đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 3 tháng 10 năm 2016 Tác giả luận án Bùi Kim Thúy 1 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận án, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, tạo điều kiện của Lãnh đạo Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, các nhà khoa học trong và ngoài nước. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành về sự giúp đỡ này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Duy Lâm và PGS.TS. Nguyễn Thị Hoài Trâm, những thầy cô giáo trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Vụ Khoa học và công nghệ, Bộ Công Thương đã hỗ trợ một phần kinh phí để thực hiện đề tài nghiên cứu này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ Phòng Vi sinh học phân tử, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện thí nghiệm phục vụ luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp của tôi đang công tác tại Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạchvà gia đình đã động viên, khích lệ, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận án này. Hà Nội, ngày 3 tháng 10 năm 2016 Tác giả luận án Bùi Kim Thúy 2 MỤC LỤC 3 KÍ HIỆU VIẾT TẮT AA : Axít ascorbic BZN : Benzoat natri CBTT : Chế biến tối thiểu CFU/ml : Colony Forming Unit Số đơn vị khuẩn lạc/ml mẫu CL : Canxi lactat FAO : Food and Agriculture Organization Tổ chức lương thực và nông nghiệp FDA : Food and Drug Administration Cục Quản lý thuốc và dược phẩm Hoa Kỳ GRAS : Generally Recognized as Safe Chứng nhận tuyệt đối an toàn HPLC : High Pressure Liquid Chromatography Sắc kí lỏng cao áp MAP : Modified Atmosphere Packaging Bao gói khí điều biến MIC : Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MRS : Man Rogosa Sharpe PDA : Potatoes Dextrose Agar PLA : Axít phenyllactic PPA : Axít phenylpyruvic PVC : Polyvinylchloride Màng nhựa dẻo TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam TSS : Tổng số chất rắn hòa tan VKHKTS : Vi khuẩn hiếu khí tổng số NMNMT S : Nấm men, nấm mốc tổng số DANH MỤC BẢNG 4 5 DANH MỤC HÌNH 6 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Từ lâu, vi khuẩn lactic là nhóm vi sinh vật được coi là an toàn (GRAS) và việc ứng dụng thành công nhóm vi khuẩn này hay những hợp chất kháng vi sinh vật mà chúng sản sinh ra trong bảo quản thực phẩm đã được đề cập nhiều. Một số loại chế phẩm sinh học đã được thử nghiệm và ứng dụng trong thực tiễn đem đến hiệu quả cao như bacterioxin và một số loại axít hữu cơ như axít lactic, axetic, xitric. Bacterioxin là các hợp chất có bản chất protein có khả năng ức chế vi sinh vật khá tốt được ứng dụng nhiều trong thực phẩm tuy phổ kháng vi sinh vật không rộng [35]. Trong khi đó, axít lactic, axít axetic và axít xitric lại có khả năng phòng trừ vi sinh vật tương đối yếu. Do vậy, những loại axít này thường được sử dụng kết hợp với những hợp chất khác để làm tăng hiệu quả. Gần đây, một hợp chất sinh học mới có tiềm năng ứng dụng như là chất bảo quản thực phẩm được sinh tổng hợp bởi nhóm vi khuẩn lactic được các nhà khoa học thế giới phát hiện có tên là axít phenyllactic. So với nhiều loại bacterioxin sản sinh bởi vi khuẩn lactic như nisin thì axít phenyllactic có khối lượng phân tử thấp, phổ kháng vi sinh vật rộng và tính bền cũng như độ hòa tan cao [109]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng axít phenyllactic là một hợp chất an toàn, có khả năng ức chế cả vi khuẩn gram âm lẫn gram dương và nấm men, nấm mốc, đặc biệt là nhiều loài nấm sinh độc tố [54][100] [110]. Trước những lợi ích cũng như tiềm năng đã được kiểm chứng thì axít phenyllactic là sản phẩm rất phù hợp sử dụng cho những đối tượng nông sản, thực phẩm dễ bị lây nhiễm bởi vi sinh vật gây hại và đòi hỏi có tính an toàn cao khi sử dụng. Rau quả chế biến tối thiểu (CBTT) là một trong những đối tượng nông sản đang được người tiêu dùng hướng tới hiện nay với tiêu chí đảm bảo độ tươi, ngon, tiện dụng và an toàn ít sử dụng hóa chất bảo quản nhất. Hơn nữa, rau quả chế biến thối thiểu là một dạng sơ chế, là những sản phẩm rau quả tươi đã thay đổi hình dạng ban đầu bằng một số tác động nhưng không bị xử lý nhiệt hay hóa chất đến mức chúng bị thay đổi trạng thái tươi sống. Rau quả tươi được chế biến tối thiểu thường phải qua các công đoạncơ bản mà không phải qua khâu nấu chín như xử lý cơ học (làm sạch, tách vỏ, cắt gọt, tạo hình,…), ổn định sản phẩm (xử lý hóa học) và bao gói[80]. Nhược điểm lớn nhất của chế biến tối thiểu là thời hạn sử dụng sản phẩm bị giảm do khả năng bảo quản bị kém đi so với bảo quản các sản phẩm nguyên vẹn. Do rau quả CBTT bị loại bỏ lớp vỏ bảo vệ bên ngoài, làm kích hoạt các enzyme hoạt động tạo môi trường thuận lợi cho sự xâm nhập và phát triển của các loài vi 7 sinh vật khác nhau nên đã làm thay đổi màu sắc, cấu trúc, mất trọng lượng dẫn tới tổn thất về cả số lượng và chất lượng trong quá trình bảo quản [78]. Vi sinh vật gây hại rau quả CBTT rất đa dạng về chủng loại và số lượng. Trong các sản phẩm rau quả chế biến tối thiểu người ta tìm thấy một số vi sinh vật phát triển mạnh như vi khuẩn ưa ẩm, vi khuẩn lactic, coliform, nấm men, nấm mốc, trong đó có nhiều loài có khả năng sinh độc tố mycotoxin [21]. Ngoài ra, những sản phẩm rau quảsẵn sàng để sử dụng vẫn còn bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh sau quá trình CBTT là một vấn đề tồn tại trong đảm bảo an toàn thực phẩm. Trong số đó, đáng kể đến là Listeria monocytogenes, Salmonella typhivà Escherichia coli, đặc biệt là E. coli O157: H7 [104]. Hạn chế tới mức thấp nhất vi sinh vật gây hại và ngăn chặn quá trình làm biến màu sản phẩm là những vấn đề cần được quan tâm và giải quyết trong CBTT. Những hợp chất hóa học thông thường được sử dụng cho mục đích này gồm clo, axít ascorbic, axít axetic, axít lactic và muối canxi (canxi lactat, canxi clorua) [45] [60]. Do khả năng ức chế vi sinh vật của những hợp chất này đối với rau quả cắt không cao nênmột số hợp chất hóa học khác được sử dụng kết hợp như 4hexylresorcino, cysteine, benzoat natri, sorbat kali,… để đem lại hiệu quả tốt hơn trong việc ngăn chặn biến màu, giảm thối hỏng do vi sinh vật gây ra và đảm bảo được độ cứng của sản phẩm [38]. Việc sử dụng những chất hóa học này đang ngày càng bị hạn chế bởi mong muốn của người tiêu dùng đang ngày càng ưa chuộng sử dụng những sản phẩm thực phẩm tươi và tự nhiên có tính an toàn cao không sử dụng chất bảo quản hoá học. Nhiều nỗ lực đã được thực hiện nhằm tìm ra những hợp chất tự nhiên hay những chế phẩm sinh học để thay thế những chất hóa học có khả năng phòng trừ vi sinh vật gây hại trên rau quả chế biến tối thiểu [38]. Xu hướng sử dụng thực phẩm tươi và thực phẩm ít chế biếncủa người tiêu dùng hiện nay ngày càng tăng, hình thành nên một dạng thực phẩm mới là các sản phẩm rau quả chế biến tối thiểu. Rau quả CBTT hiệnlà một trong những mặt hàng hóa sôi động nhất trong các cửa hàng rau quả thực phẩm ở Mỹ. Thị trường rau quả cắt ở các nước Châu Á đã phát triển từ cuối những năm 80 và đầu những năm 90,đặc biệt là Nhật Bản và Hàn Quốc. Ở nhiều nước phát triển, việc sản xuất các sản phẩm rau quả tươi dạng CBTT đã trở thành một ngành công nghiệp có thị phần không nhỏ [47]. Tuy nhiên, ở Việt Nam, CBTT gần đây mới bắt đầu được quan tâm nghiên cứu và thương mại. Dạng thực phẩm này tuy mới xuất hiện với số lượng hạn chế về chủng loại nhưng có tiềm năng phát triển mạnh mẽ vì phù hợp với xu thế phát triển kinh tế xã hội và lối sống hiện đại. Một số kết quả nghiên cứu bước đầu 8 về công nghệ CBTTcủa Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạchđạt đượcmột số kết quả nhất định như đảm bảo được độ cứng, màu sắc của mít, dứa cắt mặc dù thời gian bảo quản còn ngắn (8-10 ngày) [2-4].Công nghệ CBTT ở Việt Nam hiện nay rất cần có hướng nghiên cứu sâu hơn, đa dạng hơn về chủng loại. Cho tới nay, những công trình nghiên cứu và ứng dụng axít phenyllactic trên thế giới mới dừng ở phạm vi tuyển chọn những chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh axít phenyllactic cao ứng dụng trực tiếp trong thực phẩm như bổ sung vào bột làm bánh hay bổ sung vào thức ăn chăn nuôi [99][105], chỉ có một vài nghiên cứu thử nghiệm sản xuất axít phenyllactic thông qua quá trình lên men ở quy mô nhỏ phòng thí nghiệm (3-10 lít) [69]. Do đó, việc “Nghiên cứu tạo axít phenyllactic và ứng dụng trong bảo quản một số rau quả chế biến tối thiểu”là thực sự cần thiết. 2. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu tạoaxít phenyllactic từ vi khuẩn lactic và đánh giá được hiệu quả của axítphenyllactic trong việc duy trì chất lượng và đảm bảo an toàn thực phẩm đối với một số sản phẩm rau quả chế biến tối thiểu. 3. Nội dung nghiên cứu - Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh axít phenyllactic cao; - Tạo axít phenyllactic từ vi khuẩn tuyển chọn được bằng phương pháp lên men; - Đánh giá chất lượng của axít phenyllactic thu được; - Đánh giá hiệu quả của axít phenyllactic trong sơ chế, bảo quản một số rau (cà rốt, khoai tây) quả (dứa, mít, vải)chế biến tối thiểu. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4.1. Ý nghĩa khoa học 9  Đã phân lập và tuyển chọn được bộ chủng giống vi khuẩn Lactobacillus plantarum có khả năng sinh axít phenyllactic cao.Kết quả này đã góp phần khai thác đa dạng vi sinh vật của Việt Nam cho ứng dụng trong công nghệ sinh học;  Là công trình nghiên cứu đầu tiên có hệ thống tổng thể về quá trình tạo axít phenyllactic, giải quyết trọn vẹn vấn đề từ khâu chủng giống đến khâu tạochế phẩm và cuối cùng là ứng dụng sản phẩm trên một số đối tượng rau quả CBTT. Đây là nguồn tài liệu đáng tin cậy để các nhà khoa học quan tâm đến các vấn đề tương tự tham khảo. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn  Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm axít phenyllactic để có thể chủ động sản xuất chế phẩm đáp ứng nhu cầu sử dụng trong nước, đa dạng hóa sản phẩm bảo quản sinh học an toàn;  Đối tượng lựa chọn để ứng dụng chế phẩm tạo ra là rau quả chế biến tối thiểu. Đây là những sản phẩm rau quả ‘sẵn sàng để ăn’ và ‘sẵn sàng để nấu’ với yêu cầu phải đảm bảo chất lượng tươi, ngon và chứa những thành phần tự nhiên. Bởi vậy, việc ứng dụng chế phẩm PLA là chế phẩm bảo quản sinh học an toàn để bảo quản các sản phẩm CBTT có ý nghĩa thực tiễn cao;  Tạo ra cơ sở dữ liệu làm tài liệu tham khảo khi nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học từ vi sinh vật ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. 5. Điểm mới của luận án  Đã tuyển chọn được 02 chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarumC2 và C15 có khả năng sinh axít phenyllactic cao (hàm lượng đạt 1,2 g/l) với trình tự gen rADN 16S tương đồng 99% với trình tự gen của chủng Lactobacillus plantarum NRIC 1767. Hai chủng vi khuẩn này là hai chủng hoàn toàn mới so với các công trình đã công bố trước đây trong và ngoài nước.  Đã xây dựng được quy trình tạo axít phenyllactic bởi chủng L.plantarum C2 bằng phương pháp lên men gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng quy mô 800 lít/mẻ hoàn chỉnh, là tiền đề tiến tới sản xuất chế phẩm quy mô công nghiệp;  Đã tạo ra được chất bảo quản thực phẩm có nguồn gốc sinh học và ứng dụng trong bảo quản rau quả chế biến tối thiểu, đây là điểm mới so với các công trình nghiên cứu và ứng dụng axít phenyllactic khác trên thế giới; 6. Cấu trúc của luận án Luận án được trình bày trong 155 trang gồm 3 phần với 35 bảng, 53 hình và đồ thị.Phần 1. Tổng quan; Phần 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu; Phần 3. Kết quả và thảo luận; Phần 4. Kết luận và kiến nghị; Tài liệu tham khảo với 112 tài liệu tham khảo và Phần phụ lục.  10 CHƯƠNGI.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về axít phenyllactic 1.1.1. Đặc tính và tác dụng của axít phenyllactic Axít phenyllactic (PLA) là một loại axít thơm, có công thức phân tử là C9H10O3, trong phân tử có chứa vòng thơm (thể hiện ở hình 1.1). PLA dễ dàng hòa tan trong nước tạo thành dung dịch, nhiệt độ nóng chảy là 121-125ºC, khối lượng phân tử 166,2 [53]. Hình 1. 1. Cấu trúc phân tử của axít phenyllactic PLA đã được chứng minh là có khả năng ức chế sinh trưởng và sự phát triển của một số loài vi khuẩn gram âm, gram dương, cùng nhiều loài nấm men, nấm mốc gây hư hỏngthực phẩm [54][63][93]. PLA có thể gây ra những biến đổi về hoạt động và cấu trúc của vi khuẩn Listeria monocytogenes. Cơ chế tiêu diệt vi khuẩn là dưới sự hiện diện của PLA, vi khuẩn tập hợp thành khối, các polysaccarit được tách ra, thành tế bào mất đi tính chất mềm dẻo, linh hoạt, bán thấm, làm cho tế bào trương nước, căng ra và kết quả là các tế bào vi khuẩn bị vỡ và tan rã [95]. Bên cạnh việc sử dụng PLA là chất kháng vi sinh vật trong nông sản và thực phẩm, gần đây PLA còn được sử dụng trong một số dược phẩm và mỹ phẩm [29][74]. Hơn nữa, PLA còn được chứng minh là có ảnh hưởng tốt đến hệ thống miễn dịch, khả năng đẻ trứng của gà. Tỷ lệ đẻ trứng của gà tăng lên, độ cứng của vỏ trứng cũng tăng khi bổ sung PLA vào khẩu phần ăn hàng ngày [105]. Một số nghiên cứu cho thấy PLA hoàn toàn không gây độc với con người và động vật. PLA có mặt trong một số loại mật ong tự nhiên với hàm lượng cao và được đánh giá là rất an toàn với môi trường sống [109]. 11 Như vậy, axít phenyllactic được đánh giá là hợp chất an toàn có khả năng ức chế, kiểm soát tốt nhiều loài vi sinh vật gây hại thực phẩm nên rất có tiềm năng ứng dụng trong bảo quản nông sản và thực phẩm. Từ đó, việc nghiên cứu tạo ra chế phẩm axít phenyllactic tự nhiên an toàn để ứng dụng trong bảo quản là hướng đi mới và cần thiết hiện nay. 1.1.2. Cơ chế tổng hợp PLA PLA có thể được tạo ra bằng phương pháp hóa học và sinh học. PLA được tổng hợp bằng con đường hoá học thông qua quá trình khử của kẽm và axit hydrochloric và azlactone, hoặc quá trình hydro hoá dưới sự xúc tác của Raney-N hoặc hợp kim của Pd-C.Bằng phương pháp này có thể sinh ra cả 2 dạng đồng phân là dạng D và dạng L. Tuy nhiên, việc sản xuất PLA theo phương pháp này còn nhiều hạn chế như điều kiện tiến hành phản ứng phải tuân thủ một cách nghiêm ngặt và gây ảnh hưởng tới môi trường sống [101]. Ngược lại, quá trình tổng hợp PLA bằng con đường sinh học có nhiều ưu điểm hơn. Sản xuất PLA theo phương pháp này chủ yếu sinh ra đồng phân dạng D là dạng có mặt trong cơ thể sống. Do vậy, PLA sản xuất theo phương pháp tổng hợp sinh học dễ dàng được người tiêu dùng chấp nhận [109]. Hình 1.2. Cơ chế sinh tổng hợp axít phenyllactic[68] Ở quá trình này, PLA được sản sinh ra bởi một số loài vi sinh vật thông qua quá trình lên men. PLA là sản phẩm cuối cùng của quá trình biến đổi phenylalanine, một trong số 20 axít amin thiết yếu sinh protein được mã hóa bởi AND (hình 1.2). 12 Trong quá trình biến đổi đó, ở điều kiện nhất định, phenylalanine chuyển hóa thànhaxít phenylpyruvic.Tiếp đến, sự hoạt hóa của enzym D-phenyllactic acid dehydrogenase, axít phenylpyruvic tiếp tục chuyển hóa thành axít phenyllactic [68]. Do đó, sản lượng PLA được tạo ra phụ thuộc rất nhiều chủng vi sinh vật sinh PLA và thành phần, điều kiện môi trường nuôi cấy vi sinh vật [69]. 1.1.3. Vi sinh vật sinh tổng hợp PLA và các yếu tố ảnh hưởng 1.1.3.1. Vi sinh vật sinh tổng hợp PLA Một số kết quả nghiên cứu trên thế giới đã tìm ra được một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh PLA thông qua quá trình lên men trên môi trường đặc hiệu (bảng 1.1). Chủng nấm men Geotrichum candidumđược phát hiện lần đầu tiên là có khả năng sản sinh PLA trên môi trường lên men từ dịch chiết đậu tương và dịch chiết nấm men [36]. Nhiều nghiên cứu sau đó đã tìm ra được nhiều chủng vi khuẩn chủ yếu thuộc nhóm vi khuẩn lactic, đặc biệt là chi Lactobacilluscó khả năng sinh PLA [97][100]. Trong số những chủng vi khuẩn có khả năng sinh PLA thuộc chi này thì loài Lactobacillus plantarum được phát hiện nhiều hơn cả [97][101][109]. Nhóm vi khuẩn lactic bao gồm nhiều giống có đặc tính chung là lên men gluxit thành axít lactic. Tất cả những vi khuẩn lactic này đều có đặc điểm chung là: gram dương, bất động, không sinh bào tử, catalaza âm tính, nitratoreducaza âm tính, là vi khuẩn kị khí chịu khí, là loại cơ thể độc nhất có khả năng lên men hiếu khí cũng như kị khí. Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng gồm nhiều giống rất khác nhau. Tế bào của chúng có thể là hình cầu như Streptoococcus hay Lactococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus, hoặc hình que như Lactobacillus. Người ta phân biệt chúng bằng khả năng lên men đồng hình hay dị hình[100]. Giống (chi) Lactobacillus là những vi khuẩn không sinh bào tử thuộc lớp vi khuẩn gram dương. Những trực khuẩn này đứng riêng lẻ hay thành chuỗi, thủy phân đường saccharoza mạnh, hình thành axít dạng D, L hay DL, không khử nitrat, chúng phân giải gelatin, casein, indole và H 2S. Chúng không có catalaza và cytochrome oxydaza. Chúng là những vi khuẩn khuyết dưỡng nhiều loại vitamin, axít amin. Nhiều vi khuẩn thuộc nhóm lactic đã được phát hiện có khả năng sinh PLA như Lactobacillus plantarum, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus brevis,...(bảng 1.1). 13 Bảng 1.1. Một số loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp axít phenyllactic [93] Chủng vi sinh vật Chất tạo thành Brevibacterium lactofermentum Axít phenyllactic Geotrichum candidum Axít phenyllactic Lactobacillus plantarum 20B, Lactobacillus plantarum 21B Axít phenyllactic, 4-hydroxy- phenyllactic acid Lactobacillus plantarum MiLAB 393 3- Axít phenyllactic , cyclo (Phe-pro), cyclo (Phe-OH-Pro) Lactobacilluscoryniformis Si3,Lactobacillus sakei Peptide, Axít phenyllactic, cyclo (Phe-pro), cyclo (Phe-OH-Pro), reuterin Lactobacillus plantarum MiLAB 14 Hydroxy fatty acids, Axít phenyllactic cyclo (Phe-pro), cyclo (Phe-OH-Pro) Lactobacillus plantarum, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus brevis, Leuconostoc citreum Axít phenyllactic Lactobacillus plantarum FST1.7 Axít phenyllactic Lactobacillus plantarum ITM21B Axít phenyllactic Lactobacillus sp SK007 Axít phenyllactic Lactobacillus plantarum CRL778, Lactobacillus reuteri CRL1100, Lactobacillus brevis CRL772và CRL796 Axít phenyllactic, axít axetic Lactobacillus có khả năng sinh bacterioxin, PLA, axít 4-hydroxy phenyllactic và có khả năng sinh protein kháng khuẩn có trọng lượng phân tử 10 30 KDa [62]. 1.1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của Lactobacillus plantarum 14 , Để tổng hợp và thu nhận PLA đạt hiệu suất cao nhất từ Lactobacillus plantarum, phương pháp nuôi cấy chìm gián đoạn với thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp thường được sử dụng. Thành phần môi trường là nhân tố quyết định tới quá trình sinh trưởng và phát triển của Lactobacillus plantarum cũng như hiệu suất sinh PLA. Thành phần dinh dưỡng bao gồm các yếu tố như nguồn cacbon, nguồn nitơ, nguồn khoáng… và các yếu tố môi trường như ảnh hưởng của pH, thời gian lên men, hàm lượng oxy. a. Ảnh hưởng của môi trườngnuôi cấy Vi khuẩn lactic có nhu cầu về dinh dưỡng khá phức tạp bởi khả năng tổng hợp hạn chế những yếu tố sinh trưởng của chúng như vitamin B và các axít amin. Chúng đòi hỏi một số nhân tố cho sinh trưởng như nguồn cacbon và nitơ ở dạng cacbohydrate, axít amin, vitamin và khoáng chất [53]. Một số yếu tố kích thích sinh trưởng cũng có ảnh hưởng đến tỷ lệ sản xuất axít phenyllactic. Hỗn hợp các axít amin, peptit luôn kích thích sự phát triển của vi khuẩn lactic và làm cho tỷ lệ phát triển cao hơn những chủng chỉ có axít amin tự do [100]. Axít béo cũng có ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lactic và các muối phosphate là những muối quan trọng nhất trong quá trình lên men lactic. Ion ammonium không phải là nguồn nitơ duy nhất mà chúng còn có một số ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa một số axít amin nhất định. Nhìn chung, những đặc tính tốt của vi khuẩn lactic sử dụng trong công nghiệp là khả năng chuyển hóa nhanh và hoàn toàn những nguyên liệu rẻ tiền thành axít với nhu cầu dinh dưỡng thấp nhất và cung cấp chất đồng phân lập thể thích hợp hơn với sản lượng cao mà không có sản phẩm phụ nào [93]. Nhu cầu về cacbon Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại nguồn cacbon khác nhau để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cacbon của chúng. Tuy nhiên, nguồn cacbon quan trọng nhất đối với vi khuẩn vẫn là monosaccharide và disaccharide [8][108].Những nguyên liệu tinh bột thường được sử dụng để sản xuất axít lactic bao gồm cao lương, lúa mì, ngô, sắn, khoai tây, gạo, lúa mạch đen và đại mạch. Những nguyên liệu này phải được thủy phân thành đường trước khi lên men bởi chúng chứa chủ yếu là α(1,4)-glucose và α(1,6)-glucose [71]. Những chủng vi khuẩn L.amylophilus và L.amylovorus có khả năng sản sinh amylase thường được sử dụng để lên men trực tiếp nguyên liệu tinh bột để tạo ra axít lactic [106]. Nguyên liệu xenlulose được sử dụng để sản xuất axít lactic theo cách tương tự như tinh bột,chúng chứa chủ yếu là β(1,4)-glucan gồm xylan, arabinan, galactan và lignin [107]. Rỉ đường là phụ phẩm của quá trình sản xuất 15 đường và nó thường chứa một lượng lớn đường saccharose [53]. L. delbrueckii và E. faecalis là hai chủng được sử dụng để sản xuất axít lactic từ rỉ đường [49]. Nhu cầu về nguồn nitơ Phần lớn vi khuẩn lactic đều là các vi khuẩn dị dưỡng nitơ, vì vậy để đảm bảo cho quá trình phát triển và sinh tổng hợp axít hữu cơ được dễ dàng chúng cần có nguồn nitơ sẵn có trong môi trường. Nguồn cung cấp dinh dưỡng nitơ là các axít amin, trong quá trình nuôi cấy con người sẽ bổ sung các nguồn chứa nitơ như: cao nấm men, cao thịt, pepton, cao ngô, casein.Dinh dưỡng phổ biến nhất cho quá trình lên men sản xuất axít lactic, axít phenyllactic là dịch chiết nấm men, nhưng chính điều này lại làm tăng giá thành sản xuất. Dịch chiết ngô, một phụ phẩm của quy trình ngâm chiết ngô, đã được sử dụng thay thế dịch chiết nấm men trong sản xuất thành công axít lactic [27]. Hàm lượng nitơ của dịch chiết ngô phụ thuộc vào quy trình ngâm chiết được sử dụng. 85% hàm lượng nitơ tổng số gồm protein, peptit và axít amin. Mu và cộng sự (2008) đã nghiên cứu chọn lọc ra được thành phần môi trường tối ưu có chứa dịch chiết ngô (4,7%) và bột nấm men ((3%) để sản xuất axít phenyllactic với sản lượng 2,3 g/l [68].Yun và cộng sự đã chỉ cho thấy cám gạo và cám lúa mì là thành phần dinh dưỡng quan trọng để sản xuất axít lactic bởi vì chúng chứa một số nhân tố dinh dưỡng cũng như cacbohydrat có khả năng lên men [108]. Nhu cầu về các chất khoáng Để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển đầy đủ của mình, vi khuẩn Lactobacillus plantarum cần phức hợp các hợp chất vô cơ như: photpho, lưu huỳnh, kali, magie, mangan, đồng, sắt, natri…đặc biệt là mangan. Lactobacillus plantarum cần một nhu cầu rất lớn về các hợp chất hữu cơ cho sự phát triển của chúng. Axít axetic, axít xitric, axít oleic hoặc axít linolenic có tác động thuận lợi đến tốc độ phát triển của vi khuẩn Lactobacillus plantarum. Đó cũng là lý do mà môi trường nuôi cấy và bảo quản Lactobacillus plantarum thường có mặt của các muối axetat, xitrat và Tween-80 [44]. b. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy Nhiệt độ và pH cũng là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lactic và sản xuất axít [69]. Ảnh hưởng của pH Hoạt động của vi khuẩn lactic chịu tác động rất mạnh của pH môi trường lên men. Độ pH của môi trường tác động đến quá trình trao đổi chất của tế bào, đặc biệt 16 là tác động đến hệ enzim của chúng, mỗi enzim đều có một dải pH tối ưu mà tại đó hoạt lực của enzim là cao nhất [53]. Nếu pH không thích hợp, vi khuẩn có thể bị ức chế, phát triển kém hay bị tiêu diệt. Cho nên việc xác định pH ban đầu thích hợp và duy trì pH cần thiết trong thời gian sinh trưởng của tế bào là rất quan trọng. Các vi khuẩn lactic có pH tối ưu cho sự phát triển là 5,5 – 6,2 (Lactobacillus), 5,5 – 6,5 (Pecliococcus), 6,3 – 6,5 (Leuconostoc). Giá trị pH cuối cùng mà mỗi giống vi khuẩn lactic có thể chịu được là khác nhau: Lactobacillus có thể chịu được pH = 3,2 – 3,5, Pecliococcus có thể chịu được pH = 3,5 – 4,4, Leuconostoc là pH = 5. Khoảng pH thích hợp cho Lactobacillus plantarum sinh PLA cao nhất là 5,5 - 6,5 [57]. Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống của vi khuẩn, do tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nhiệt độ. Tốc độ phản ứng hóa sinh, hoạt lực enzim, tốc độ của quá trình chuyển hóa phụ thuộc vào nhiệt độ. Mỗi loài vi khuẩn phát triển ở dải nhiệt độ khác nhau. Đã có nhiều nhà khoa học nghiên cứu cho rằng vi khuẩn Lactobacillus plantarum có thể phát triển trong dải nhiệt độ từ 30°C- 45°C [95]. Nhưng nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng phát triển là 30 0C. Nếu nhiệt độ thấp vi khuẩn sinh trưởng kém, mất nhiều thời gian, nếu nhiệt độ quá cao trên 45°C thì vi khuẩn sẽ bị tiêu diệt. Ảnh hưởng của thời gian lên men PLA là một axít, khi nó được sinh ra trong điều kiện lên men sẽ làm giảm pH của môi trường. Do đó, thời gian lên men là một yếu tố rất quan trọng để PLA thu được với hiệu suất cao nhất. Nếu thời gian ngắn có thể sinh khối Lactobacillus plantarum tạo ra ít, PLA chưa được tạo ra, còn nếu thời gian quá dài thì lượng dinh dưỡng của môi trường giảm, không đủ thức ăn cho vi khuẩn, vi khuẩn sẽ chết, đồng thời pH giảm mạnh sẽ ức chế vi khuẩn hoạt động, gây tốn kém. Bởi vậy, việc tối ưu hoá thời gian lên men là rất cần thiết. Theo những nghiên cứu mới đây, PLA tạo ra đạt năng suất cao khi thời gian lên men kéo dài từ 24 giờ – 72 giờ ở điều kiện lên men chìm sục khí, gián đoạn có điều chỉnh pH 6 và bổ sung cơ chất [69]. 1.1.4. Công nghệ sản xuất axít phenyllactic 1.1.4.1. Công nghệ lên men sinh axít phenyllactic Axít phenyllactic được phát hiện lần đầu tiên là do chủng nấm men Geotrichun candidum sảnsinh ra khi chủng này được nuôi cấy trên môi trường dịch 17 chiết đậu tương và dịch chiết nấm men với sản lượng từ 0,6 - 1 g/l [112]. Sau đó, nhiều loài vi khuẩn thuộc nhóm lactic có khả năng sinh PLA cũng được tìm thấy như Lactobacillus plantarum, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus hilgardii, Leuconostoc citreum, Lactobacillus brevis [100]. Trong số 12 chủng vi khuẩn lactic được sử dụng phổ biến trong sản xuất thực phẩm lên men đã phát hiện được 9 chủng có khả năng sinh PLAvới sản lượng từ 0,028 – 0,091 g/l.Một số chủng vi khuẩn được phân lập từ bột mỳ lên men có khả năng sinh PLA nhưLactobacillus plantarumITM21A và L.sanfranciscensis IDMC57 với hàm lượng PLA là 0,058 g/l,L.citreum ITM22A với hàm lượng PLA 0,071 g/l. Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ITMY30phân lập từ quả oliu có khả năng sinh 0,094 g/l PLA [97].Ngoài ra, một số vi khuẩn probiotic thương mại được phát hiện là có khả năng sinh PLA như L.johnsonii La1 và L.acidophillus IBB801 có thể sinh 0,042 g/l và 0,025 g/l PLA [64]. Lactobacillus plantarumFST1.7 được xác định là có khả năng sinh 33,47mg PLA trong 1kg bột mỳ lên men [20]. L.plantarum TMW1.468 cũng được phát hiện là có khả năng sinh 0,083 g/l PLA [101]. Trong số 112 chủng vi khuẩn phân lập từ rau củ lên men truyền thống của Trung Quốc thì 70 chủng có khả năng sinh PLA với sản lượng cao hơn, trong đó chủng Lactobacillus plantarum SK007 có thể sinh 0,094 g/l PLA tương đương với chủng Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ITMY30[56]. Mặc dù PLA có thể được sản sinh ra bởi nhiều loài vi khuẩn Lactobacillus, nhưng hoạt tính sinh PLA vẫn còn thấp. PLA được sản sinh bởi vi khuẩn lactic nuôi cấy trên môi trường MRS cao nhất cũng chỉ đạt đến 0,94 g/l [56][99]. Những nghiên cứu sản xuất PLA từ vi khuẩn lactic đều ứng dụng axít amin làm cơ chất. Sản lượng PLA sinh ra từ L.plantarum ITM21B tăng lên khi tăng lượng axít amin phenylalanin [99]. Tuy nhiên, quá trình trao đổi axít amin bởi vi khuẩn lactic bị giới hạn bởi khả năng huy động của chất nhận amin trong phản ứng chuyển hóa amin. Vermeulen và cộng sự đã chỉ ra rằng việc chuyển hóa phenylalanin là một nhân tố hạn chế trong quy trình sản xuất PLA bởi L.sanfranciscensis DSM20451 và L.plantarum TMW1.468. Họ cũng nhận thấy rằng sản lượng PLA tăng từ 530% khi bổ sung α-ketoglutarate vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn [101]. Li và cộng sự (2007) đã chỉ ra rằng quá trình sinh tổng hợp PLA bởi Lactobacillus plantarum SK007 bị hạn chế bởi phenylalanin và điều này có thể vượt qua được nhờ giải pháp thay thế cơ chất phenylalanin bằng axít phenylpyruvic. Kết quả là sản lượng PLA đã tăng từ 0,094 g/l lên 1,31 g/l (tăng 14 lần)[56]. Trong một nghiên cứu khác, khi bổ sung 3 g/l axít phenylpyruvic vào môi trường nuôi cấy vi 18 khuẩn Lactobacillus plantarum IMAU 10124 thu được sản lượng axít phenyllactic lên tới 2,9 g/l, gấp trên 12 lần so với không bổ sung tiền chất [110]. Axít phenyllactic có nhiều đặc tính giống với axít lactic và cùng được sản sinh ra từ vi khuẩn lactic. Tuy nhiên, khác với axít phenyllactic mới được phát hiện và nghiên cứu thì axít lactic đã được nghiên cứu từ lâu và cho đến nay được sản xuất thương mại ứng dụng nhiều trong thực phẩm. Để sản xuất axít lactic bằng công nghệ sinh học tiện lợi thì những nguyên liệu thô rẻ tiền thường được sử dụng bởi những nhà sản xuất polymer và sản xuất công nghiệp khác luôn luôn cần số lượng lớn axít lactic với giá thành tương đối thấp. Những nguyên liệu thô sử dụng để sản xuấtaxít lactic phải có những đặc tính là rẻ, mức nhiễm tạp thấp, tỷ lệ sản xuất nhanh, sản lượng cao, ít hoặc không có sản phẩm phụ, khả năng lên men không cần tiền xử lý hoặc xử lý ít và luôn sẵn có quanh năm. Khi những nguyên liệu tinh chế được sử dụng cho sản xuất, giá thành cho tinh sạch sản phẩm cần phải thấp. Tuy nhiên, điều này không có lợi về mặt kinh tế vì cacbohydrate tinh chế quá đắt làm tăng giá thành sản xuất [44]. Bởi vậy, nhiều nghiên cứu đã sàng lọc những nguyên liệu thô rẻ tiền cho sản xuất axít lactic đạt hiệu quả kinh tế. Những nguyên liệu rẻ tiền như tinh bột, xenlulose, whey và rỉ đường thường được sử dụng để sản xuất axít lactic. Trong số đó, tinh bột và xenlulose được quan tâm sử dụng nhiều hơn bởi giá thành rẻ, số lượng nhiều và có thể thay mới được [8]. Bên cạnh đó, một số phế phụ phẩm công nghiệp như whey và rỉ đường được sử dụng làm cơ chất cho sản xuất axít lactic. Whey là phụ phẩm chính của ngành công nghiệp sữa và nó chứa lactose, protein, chất béo và muối khoáng. Để tận dụng hoàn toàn lactose của whey, người ta thường bổ sung thêm nguồn nitơ vào whey nhằm mục đích giảm lượng dinh dưỡng không sử dụng hết của quá trình lên men và tăng hiệu quả kinh tế. Schepers và cộng sựđã bổ sung thêm dịch chiết nấm men vào whey làm cho quá trình sản xuất axít lactic bởi chủng L. helveticus tăng nhanh [92]. Ngoài ra, để tăng nhanh quá trình sản xuất axít lactic cần phải bổ sung thêm dinh dưỡng vào môi trường lên men. Dinh dưỡng phổ biến nhất để sản xuất axít lactic là dịch chiết nấm men, nhưng chính điều này lại làm tăng giá thành sản xuất. Dịch chiết ngô, một phụ phẩm của quy trình ngâm chiết ngô, đã được sử dụng thay thế dịch chiết nấm men trong sản xuất thành công axít lactic [27]. Với mục tiêu sản xuất axít lactic, axít phenyllactic đạt hiệu suất cao, ngoài việc tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi sinh vật và lựa chọn chủng vi sinh vật thích hợp, thì việc lựa chọn công nghệ lên men tối ưu để thu được axít với hàm lượng cao, giảm thời gian lên men cũng như giá thành sản xuất đóng vai trò hết sức quan trọng. Axít lactic, axít phenyllactic thường được sản xuất theo phương pháp lên men 19 gián đoạn, gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng và liên tục. Lên men gián đoạn và gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng thường thu được nồng độ axít cao hơn lên men liên tục, trong khi đó hiệu suất cao hơn có thể đạt được khi sử dụng lên men liên tục [92]. Một ưu điểm nữa của lên men liên tục so với gián đoạn là khả năng liên tục quy trình trong một thời gian dài hơn. Những quy trình lên men liên tục và gián đoạn lặp lại cùng với hệ thống tuần hoàn tế bào có thể thu được mật độ tế bào và sản lượng sản phẩm lớn. Oh và cộng sự đã sản xuất axít lactic ở tỷ lệ 6,4 g/l.h bằng phương pháp lên men gián đoạn lặp lại tuần hoàn tế bào. Kết quả cũng chỉ cho thấy chỉ 26% lượng dịch chiết nấm men so với lên men gián đoạn thông thường cần để sản xuất ra cùng một lượng axít lactic, bởi vậy đã giảm được giá thành sản xuất đáng kể. Mật độ tế bào cao nhất thu được lớn hơn 28 g/l, làm tăng hiệu suất và giảm lượng dinh dưỡng bổ sung thêm [72]. Phương pháp lên men gián đoạn chủng Lactobacillus plantarum SK007 có bổ sung dinh dưỡng 2 giờ/một lần (100g/l PPA, 500g/l glucose) và điều chỉnh pH 6,0 có thể đạt được sản lượng PLA cao nhất là 17,38 g/l [69]. Gần đây, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm loại bớt axít lactic đồng thời ngay khi nó được hình thành. Quá trình lên men thẩm tách bằng điện với màng trao đổi ion cũng thường được sử dụng để loại bớt axít lactic. Hệ thống lên men thẩm tách điện có đồng hồ đo mức độ là hệ thống hiệu quả nhất và thu được sản lượng cao hơn nếu nồng độ glucose trong dịch lên men được kiểm soát luôn duy trì ở một mức thấp hơn. Màng lọc nano và nhựa trao đổi ion được ghép với lò phản ứng sinh học trong việc lấy bớt axít lactic [71]. 1.1.4.2. Thu hồi axít phenyllactic Trong quy trình sản xuất axít hữu cơ, tiếp ngay sau quá trình lên men là quá trình thu hồi sản phẩm axít từ dịch lên men. Một số phương pháp được sử dụng để thu hồi axít lactic bao gồm trích li,thu hồi bằng hóa học, chưng cất, thẩm tách điện và trao đổi ion … Nhiều quá trình dùng dung môi trích li đã được dùng để tinh chế axít lactic sau khi tế bào vi sinh vật đã được tách khỏi dịch đường. Một hệ thống trích li liên tục dựa trên ete isopropyl được công ty Anh Croda Bowmans Chemicals Ltd. đưa vào ứng dụng ở mức độ sản xuất công nghiệp [72]. Tuy nhiên, phương pháp trích li lỏng-lỏng có nhược điểm là khó chọn các dung môi thích hợp, các dung môi trích li tốt lại thường có độc tính cao đối với tế bào và ngược lại. Thu hồi axít lactic bằng phương pháp chưng cất cũng được sử dụng dựa trên nguyên tắc este hóa axít lactic bằng rượu methanol rồi sau đó thủy phân metyl lactate thành axít lactic bằng cách chưng cất. Đối với phản ứng este hóa, người ta dùng chất xúc tác để đảm bảo chỉ có quá trình este hóa xảy ra. Hỗn hợp sản phẩm 20