Tài liệu Nghiên cứu quá trình đối kháng nấm men saccharomyces cerevisiae của chitosan – nano bạc.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ---------------------- ĐỖ HUYỀN TRANG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH ĐỐI KHÁNG NẤM MEN Saccharomyces cerevisiae CỦA CHITOSAN – NANO BẠC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011 - 2015 Thái Nguyên - 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ---------------------- ĐỖ HUYỀN TRANG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH ĐỐI KHÁNG NẤM MEN Saccharomyces cerevisiae CỦA CHITOSAN – NANO BẠC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011 - 2015 Giáo viên hướng dẫn: Th.S Lương Hùng Tiến Khoa CNSH&CNTP - Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên Thái Nguyên - 2015 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng số liệu và các kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chƣa hề sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thiện luận văn mọi sự giúp đỡ đều đã đƣợc cám ơn và các trích dẫn trong luận văn đều đƣợc ghi rõ nguồn gốc. Thái Nguyên, ngày 29 tháng 05 năm 2015 NGƢỜI VIẾT CAM ĐOAN Đỗ Huyền Trang ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đƣợc khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân, em đã nhận đƣợc sự giúp đỡ rất nhiều từ các cá nhân và tập thể. Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn giáo viên hƣớng dẫn, thầy Lƣơng Hùng Tiến giảng viên Khoa CNSH – CNTP, đã tin tƣởng giao đề tài, tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo làm việc và quản lí tại phòng Thì nghiệm vi sinh đã thƣờng xuyên giúp đỡ em thực hiện và hoàn thành kháo luận tốt nghiệp này. Cuối cùng, em xin cảm ơn toàn thể ngƣời thân trong gia đình cùng bạn bè đã quan tâm, ủng hộ và tạo điều kiện để em hoàn thành tốt khóa luận này. Dù đã cố gắng nhiều, xong bài khóa luận vẫn còn những thiếu xót và hạn chế. Kính mong nhận đƣợc sự chia sẻ và những ý kiến đóng góp quý báu của thầy, cô giáo và các bạn. Em xin chân thành cảm ơn ! iii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Hàm lƣợng Chitin trong vỏ một số động vật giáp xác ..................... 5 Bảng 2.2. Số nguyên tử bạc trong một đơn vị thể tích ................................... 14 Bảng 2.3: Thành phần các chất có trong cấu trúc của nấ m men đƣơ ̣c la ̣nh đông khô .......................................................................................................... 28 Bảng 2.4: Các thành phần hóa học trong nấm men đông khô ........................ 28 Bảng 3.1. Công thức phối trộn Chitosan và nano bạc .................................... 39 Bảng 4.1. Kết quả anh hƣởng của nồng độ nano bạc đến hiệu quả kháng nấm men S.cerevisiae .............................................................................................. 41 Bảng 4.2. Kết quả ảnh hƣởng của nồng độ nano bạc đến hiệu quả kháng nấm men S.cerevisiae .............................................................................................. 42 Bảng 4.3. Hiệu quả kháng nấm men S.cerevisiae của công thức phối trộn Chitosan và nano bạc ...................................................................................... 43 iv DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Công thức cấu tạo của Chitin ............................................................ 6 Hình 2.2. Công thức cấu tạo của Chitosan ........................................................ 6 Hình 2.3 Ion bạc vô hiệu hóa enzyme chuyển hóa oxy của vi sinh vật .......... 17 Hình 2.4. Nấm men Saccharomysces.............................................................. 27 Hình 4.1: Kết quả xác định MIC của chế phẩm nano bạc kháng nấm men S.cerevisiae ...................................................................................................... 40 Hình 4.2. Kết quả kháng nấm men S.cerevisiae của công thức phối trộn Chitosan và nano bạc ...................................................................................... 43 Hình 4..3. Kết quả xác định MIC của chế phẩm Chitosan kháng nấm men S.cerevisiae ...................................................................................................... 42 v DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ ADN Deoxyribonucleic acid CFU Colony forming unit DDA Dgree of Deacetylation DI De-ion E.coli Escherichia coli h Giờ mARN Messenger Ribonucleic acid MIC Minimum Inhibitory Concentration ppm Part per million S.cerevisiae Saccharomyces cerevisiae vi MỤC LỤC PHẦN 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1 1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài .................................................................. 2 1.2.1. Mục đích.................................................................................................. 2 1.2.2.Yêu cầu ................................................................................................. …2 1.3. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 2 1.3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 2 1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn ........................................................................... 2 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 2.1. Tổng quan về chế phẩm chitosan ............................................................... 3 2.1.1. Nguồn gốc của chitin và Chitosan .......................................................... 3 2.1.2. Cấu trúc hóa học của Chitosan ................................................................ 5 2.1.3. Tính chất cơ bản của Chitosan ................................................................ 6 2.1.4. Tính chất sinh học của Chitosan ............................................................. 7 2.1.5. Đặc tính kháng khuẩn và các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động kháng khuẩn của Chitosan ........................................................................................... 8 2.1.6. Ứng dụng của Chitosan ......................................................................... 11 2.2. Tổng quan về chế phẩm nano bạc ............................................................ 12 2.2.1. Giới thiệu về nano bạc .......................................................................... 12 2.2.2. Tính chất lý học của hạt nano bạc......................................................... 14 2.2.3. Tính chất hóa học của hạt nano bạc ...................................................... 16 2.2.4. Cơ chế kháng khuẩ n của nano bạc ........................................................ 16 2.2.5.Các yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng kháng khuẩn của nano bạc ............ 19 2.1.6. Ảnh hƣởng của hạt nano bạc đến sức khỏe con ngƣời ......................... 20 2.2.7. Các phƣơng pháp chế tạo hạt nano bạc. ................................................ 21 2.2.8. Ứng dụng của nano bạc trong cuô ̣c số ng. ............................................. 22 2.3. Tổng quan về nấm men ............................................................................ 24 2.3.1. Khái quát chung về nấ m men ................................................................ 24 2.3.2. Nấm men S.cerevisiae ........................................................................... 27 2.4. Tổng quan các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ...................................... 31 2.4.1. Tổng quan về nghiên cứu thế giới......................................................... 31 vii 2.4.2. Tổng quan về nghiên cứu Việt Nam ..................................................... 31 PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.... 34 3.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 34 3.1.1. Vật liệu .................................................................................................. 34 3.1.2. Chủng nấ m men .................................................................................... 34 3.1.3. Hóa chất, môi trƣờng ............................................................................ 34 3.1.4. Dụng cụ, thiết bị .................................................................................... 34 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 35 3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 35 3.4. Phƣơng pháp nghiên cƣ́u .......................................................................... 35 3.4.1. Phƣơng pháp bảo quản giố ng vi sinh vâ ̣t .............................................. 35 3.4.2. Phƣơng pháp hoa ̣t hóa vi sinh vâ ̣t ......................................................... 36 3.4.3. Phƣơng pháp quan sát hiǹ h thái và xác đinh ̣ mâ ̣t đô ̣ tế bào.................. 36 3.4.4. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn ...................................... 37 3.4.5. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm.............................................................. 37 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 40 4.1. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với nấm men S.cerevisiae ...................................................................................................... 40 4.2. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của chitosan đối với nấm men S.cerevisiae ...................................................................................................... 41 4.3. Lựa chọn công thức phối trộn Chitosan với nano bạc kháng lại nấm men S.cerevisiae .................................................................................................... .43 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................... 45 5.1. Kết luận .................................................................................................... 45 5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 45 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Chitosan là dẫn xuất của Chitin – một polysaccharid có nhiều trong vỏ của các loài giáp xác. Chitosan có khả năng tạo thành màng mỏng, kết hợp chất béo, ion kim loại, có tính kháng khuẩn… vì vậy Chitosan là một polyme sinh học đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp nhƣ thực phẩm, nông nghiệp, môi trƣờng, y học và mỹ phẩm . Hiện nay, Chitosan đƣợc sản xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau (tôm, cua, mực, vi nấm và vi khuẩn), trong đó nhiều nhất là nguồn phế liệu tôm. Những năm gần đây, công nghệ nano ra đời không những tạo nên bƣớc nhảy đột phá trong ngành điện tử, tin học, y sinh học mà còn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong đời sống, gạc chữa bỏng đƣợc phủ nano bạc, nƣớc rửa rau sống, chất diệt khuẩn khử mùi trong máy lạnh Bạc và các hợp chất của bạc thể hiện tính độc đối với vi khuẩn, virus, tảo và nấm. Tuy nhiên, khác với các kim loại nặng khác (chì, thủy ngân…) bạc không thể hiện tính độc với con ngƣời. Từ những năm gần đây, do hiện tƣợng các chủng vi sinh ngày càng trở nên kháng thuốc, ngƣời ta lại quan tâm trở lại đối với việc ứng dụng khả năng diệt khuẩn và các ứng dụng khác của bạc, đặc biệt là dƣới dạng hạt có kích thƣớc nano. Nano mét là một đơn vị đo lƣờng chiều dài cực nhỏ, ký hiệu là nm, bằng một phần triệu mm. Qua nghiên cứu thấy rằng, do sự tăng lên của nguyên tử bề mặt nên so với bạc khối tác dụng sát khuẩn của các hạt bạc siêu nhỏ có kích thƣớc nano đƣợc nhân lên gấp bội, một gam nano bạc có thể sát khuẩn cho hàng trăm mét vuông chất nền. Việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc có các hoạt tính kháng khuẩn tốt, ổn định, thân thiện với môi trƣờng để sử dụng trong nhiều lĩnh vực nhằm hạn chế những ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời,... 2 Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu quá trình đối kháng nấm men Saccharomyces cerevisiae của Chitosan – nano bạc" 1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài 1.2.1. Mục đích Xác định quá trình đối kháng của nấm men Saccharomyces cerevisiae của Chitosan – nano bạc. 1.2.2. Yêu cầu - Lựa chọn phƣơng pháp thích hợp để xác định khả năng kháng nấm men Saccharomyces cerevisiae của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc. - Đánh giá nồng độ ức chế của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc đối với nấm men Saccharomyces cerevisiae. 1.3. Ý nghĩa của đề tài 1.3.1. Ý nghĩa khoa học - Giúp sinh viên có cơ hội tiếp cận với các quy trình, các thao tác kỹ thuật trong thực tế. Qua đó kết hợp với các kiến thức lý thuyết đã đƣợc học để có những hiểu biết chuyên sâu và cái nhìn tổng quát hơn. 1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn - Nghiên cứu đƣợc khả năng kháng nấm men Saccharomyces cerevisiae của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc. Từ đó ứng dụng vào chế biến, bảo quản thực phẩm...hạn chế những ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời. - Đáp ứng phục vụ đào tạo thực tập tay nghề cho sinh viên. 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về chế phẩm Chitosan 2.1.1. Nguồn gốc của Chitin và Chitosan Về mặt lịch sử, Chitin đƣợc Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1821, trong cặn dịch chiết từ một loại nấm. Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nó. Năm 1823 Odier phân lập đƣợc một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin, tiếng Hy Lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhƣng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận Chitin có dạng công thức giống cenllulose (Trần Thị Luyến và cộng sự, 2007) [15]. Trong động vật, Chitin là một thành phần có cấu trúc quan trọng trong vỏ của một số động vật không xƣơng sống nhƣ : côn trùng, giáp xác, giun tròn. Trong động vật bậc cao monome của Chitin là một thành thành phần chủ yếu trong mô da nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thƣơng ở da. Trong thực vật Chitin có ở thành tế bào nấm họ zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo… Trong nấm men S.cerevisiae Chitin chiếm 5% trọng lƣợng khô của thành tế bào. Hầu hết Chitin nằm giữa các sẹo chồi, chỉ một phần nhỏ phân bố ở phần khác trên thành tế bào (Trần Thị Luyến và cộng sự, 2007) [15]. Chitosan là sản phẩm biến tính của Chitin, một chất rắn, xốp nhẹ, hình vẩy, có thể xay nhỏ thành các kích cỡ khác nhau. Chitosan đƣợc xem là polymer tự nhiên quan trọng nhất. Với đặc tính có thể hòa tan tốt trong môi trƣờng acid, chitosan đƣợc ứng dụng nhiều trong lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm, dƣợc phẩm,… 4 Chitosan là vật liệu sinh học quý có nhiều trong phế liệu thủy sản nhƣ vỏ tôm, vỏ ghẹ. Chitosan có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp, nông nghiệp, y dƣợc và bảo vệ môi trƣờng (Nguyễn Ngọc Tú,2003) [12]. - Trong y dƣợc: Chitosan từ vỏ tôm, cua có thể sản xuất Glucosamin – một dƣợc chất quý đang phải nhập khẩu để sản xuất dạng dƣợc phẩm tƣơng tự có tên Glusivac (dùng trong điều trị bệnh khớp và giảm béo). Ngoài ra còn sản xuất các loại dƣợc liệu khác nhau nhƣ chỉ phẫu thuật tự hoại, chotooligosaccharite, da nhân tạo, … cũng đƣợc nghiên cứu sản xuất từ Chitin – Chitosan. - Trong công nghiệp: Chitosan có thể chế tạo nhiều sản phẩm công nghiệp có giá trị cao nhƣ vải Chitosan có khả năng diệt khuẩn, mực in ấn có độ bám dính cao, sản xuất sơn chống thấm và chống mốc. - Trong nông nghiệp: Chitosan đƣợc sử dụng để bảo quản quả, hạt mang lại hiệu quả cao. - Trong công nghệ môi trƣờng hiện nay Chitosan đƣợc sử dụng trong xử lý nƣớc thải công nghiệp rất hiệu quả nhƣ xử lý nƣớc thải nhuộm vải, xử lý nƣớc đầm hồ trong công nghiệp nuôi tôm, cá. Ngoài ra Chitosan còn đƣợc dùng trong công nghệ sinh học nhƣ dùng làm chất mang cố định enzyme và cố định tế bào. Giống nhƣ cellulose, Chitosan là chất xơ, không giống chất xơ thực vật, Chitosan có khả năng tạo màng, có các tính chất của cấu trúc quang học… Chitosan tích điện dƣơng do đó nó có khả năng kết hợp với những chất tích điện âm nhƣ chất béo, lipid và acid mật. Chitosan là polymer không độc, có khả năng phân hủy sinh học và tính tƣơng thích về mặt sinh học. Trong nhiều năm qua, các polymer có nguồn gốc từ Chitin đặc biệt là Chitosan đã đƣợc chú ý nhƣ là một loại vật liệu mới có 5 ứng dụng đặc biệt trong công nghiệp dƣợc, y học, xử lý nƣớc thải và trong công nghệ thực phẩm,… Bảng 2.1: Hàm lƣợng Chitin trong vỏ một số động vật giáp xác Hàm lƣợng chitin theo STT Phân loại 1 Đầu tôm 11 2 Vỏ tôm 27 3 Vỏ tôm phế thải hỗn hợp 12-18 4 Vỏ tôm hùm 37 5 Càng cua tuyết 24 6 Chân cua tuyết 32 7 Mai mực ống 30-35 8 Đỉa biển 34-49 trọng lƣợng (%) 2.1.2. Cấu trúc hóa học của Chitosan Chitosan là một polysacarit mạch thẳng, là dẫn xuất deaxetyl của Chitin, trong đó nhóm (-NH2) thay thế cho nhóm (-COCH3) ở vị trí C(2). Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên ngƣời ta quy ƣớc nếu độ deacetyl hóa DD> 50% thì gọi là Chitosan, nếu DD< 50% gọi là Chitin ( Đặng Văn Luyến, 1995) [2]. Chitosan đƣợc cấu tạo từ các mắt xích D-glucosamine liên kết với nhau bởi các liên kết β-(1-4)-glycozit, do vậy Chitosan có thể gọi là poly β-(1-4)-2amino-D-glucozo hoặc là poly β-(1-4)-D-glucosamine. 6 Hình 2.1: Công thức cấu tạo của chitin Công thức phân tử của Chitosan : (C6H12O4N)n Phân tử trọng lƣợng: Mchitosan= (161,07)n Hình 2.2. Công thức cấu tạo của chitosan 2.1.3. Tính chất cơ bản của chitosan - Tính chất vật lý: Chitosan là chất rắn, xốp nhẹ,có màu trắng ngà, không mùi,không vị, có thể xay nhỏ ở các kích thƣớc khác nhau. Quá trình deacetyl hóa bao gồm quá trình loại nhóm acetyl khỏi chuỗi phân tử Chitin và hình thành phân tử Chitosan với nhóm amino hoạt động hóa học cao. Mức dộ deacetyl hóa là một đặc tính quan trọng của quá trình sản xuất Chitosan bởi nó ảnh hƣởng đến tính chất lý hóa, khả năng ứng dụng của Chitosan (Lƣu Văn Chính và cộng sự, 2000) [5]. Chitosan không tan trong nƣớc, dung dịch kiềm và acid đậm đặc nhƣng tan trong dung dịch đệm hoặc acid yếu có pH <6. Tạo dung dịch keo trong, có khả năng tạo màng tốt, nhiệt độ nóng chảy 309 - 311oC. 7 Độ nhớt của Chitosan trong dung dịch axit loãng liên quan đến kích thƣớc và khối lƣợng phân tử trung bình của Chitosan. Chitosan có khả năng tạo màng sử dụng trong bảo quản thực phẩm. Khi sử dụng màng Chitosan dễ dàng điều chỉnh nhiệt độ, độ thoáng khí cho thực phẩm, màng Chitosan khá dai, khó xé rách, có độ bền tƣơng đƣơng với một số chất dẻo vẫn đƣợc dùng để bao gói. Màng Chitosan làm chậm lại quá trình bị thâm của rau quả (Morimoto M. và cộng sự, 1997) [26]. - Tính chất hóa học: Chitosan là polysacharide có đạm không độc hại, có khối lƣợng phân tử lớn. Trong phân tử Chitosan có chứa nhóm chứ (- OH), (-CHCOCH3) trong các mắt xích N-acetyl-D-glucosamine và nhóm (–OH), nhóm (–NH2) trong các mắt xích D-glucosamine có nghĩa chúng vừa là alcol vừa là amin và amit. Phản ứng hóa học xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N- hoặc dẫn xuất thế O-, N- ( Gerasimenko D.V., 2004) [23]. Mặt khác Chitosan là những polime mà các monome đƣợc nối với nhau bởi các liên kết β-(1-4)-glicozit, các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hoá học nhƣ: axit, bazơ, tác nhân oxy - hóa và các enzim thuỷ phân. Khả năng hấp phụ tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp của Chitosan và một vài dẫn xuất: Trong phân tử Chitosan và một số dẫn xuất của chitin có chứa các nhóm chức mà trong đó các nguyên tử Oxi và Nitơ của nhóm chức còn cặp electron chƣa sử dụng, do đó chúng có khả năng tạo phức, phối trí với hầu hết các kim loại nặng và các kim loại chuyển tiếp nhƣ: Hg2+, Cd2+, Zn2+,Cu2+,Ni2+,Co2+,.... Tuỳ nhóm chức trên mạch polime mà thành phần và cấu trúc của phức khác nhau 2.1.4. Tính chất sinh học của Chitosan - Màng Chitosan dễ phân huỷ sinh học hơn Chitin. - Chitosan là hợp chất tự nhiên không độc, dùng an toàn cho ngƣời. 8 - Chúng có tính hòa hợp cao với cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học. - Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng: Chitosan và các dẫn xuất của chúng đều có tính kháng khuẩn, nhƣ ức chế hoạt động của một số loại vi khuẩn nhƣ E.Coli, diệt đƣợc một số loại nấm hại dâu tây, cà rốt, đậu và có tác dụng tốt trong bảo quản các loại rau quả có vỏ cứng bên ngoài. Khi dùng màng Chitosan dễ dàng điều chỉnh độ ẩm, độ thoáng không khí cho thực phẩm. Màng Chitosan cũng khá dai, khó xé rách, có độ bền tƣơng đƣơng với một số chất dẻo vẫn đƣợc dùng làm bao gói. - Chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid máu,hạ huyết áp, điều trị thận mãn tính, chống rối loạn nội tiết ( Lƣu Văn Chính và cộng sự, 2000) [5]. - Chitosan là chất thân lipid có khả năng hấp thụ dầu mỡ cao. - Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptide-insulin, Chitosan kích thích việc tiết ra insulin ở tuyến tụy giúp điều trị bệnh tiểu đƣờng. 2.1.5. Đặc tính kháng khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động kháng khuẩn của Chitosan 2.1.5.1. Đặc tính kháng khuẩn của Chitosan Chitosan có khả năng ức chế vi khuẩn Gram dƣơng, Gram âm, nấm men, nấm mốc. Khả năng kháng khuẩn của Chitosan phụ thuộc vào các yếu tố nhƣ: Mức độ deacetyl hóa, khối lƣợng phân tử của Chitosan, pH môi trƣờng, nhiệt độ, sự có mặt của các thành phần trong thực phẩm. Khả năng kháng khuẩn của Chitosan đã đƣợc nghiên cứu bởi một số tác giả, trong đó cơ chế kháng khuẩn cũng đã đƣợc giải thích trong một số trƣờng hợp.Tuy nhiên trong các cách giải thích đều chỉ ra rằng việc ức chế vi khuẩn của Chitosan là do liên kết giữa chuỗi polyme của Chitosan với các ion kim loại trên bề mặt vi khuẩn làm thay đổi tính thấm của màng tế bào. Một số cơ chế đã đƣợc giải thích ( Lê Thanh Hà và cộng sự, 2011) [4]: 9 - Chitosan là polyme tích điện dƣơng trong khi màng tế bào vi sinh vật đa số tích điện âm, do đó xảy ra tƣơng tác tĩnh điện làm cho màng tế bào vi sinh vật bị thay đổi, ngăn cản quá trình trao đổi chất qua màng đồng thời xuất hiện các lỗ hổng trên thành tế bào tạo điều kiện cho protein và các thành phần khác cấu tạo nên thành tế bào bị thoát ra ngoài từ đó dẫn đến tiêu diệt vi sinh vật. - Các phân tử Chitosan khi phân tán xung quanh tế bào vi sinh vật sẽ tạo ra các tƣơng tác làm thay đổi DNA ảnh hƣởng đến quá trình tổng hợp mARN, tổng hợp protein, ngăn cản sự hình thành bào tử, ngăn cản sự trao đổi chất và hấp thu các chất dinh dƣỡng của vi sinh vật. - Trong quá trình bảo quản nông sản, Chitosan tiếp xúc với mô thực vật và kích thích tiết ra các enzyme bảo vệ nhƣ: Chitinase, Chitonase, 1,3glucanase, từ đó tiêu diệt vi sinh vật. Tuy nhiên cơ chế này không còn đúng trong trƣờng hợp sử dụng màng bao Chitosan cho các sản phẩm bao quản nguyên quả, vì khi đó Chitosan bao bọc bên ngoài lớp vỏ thực vật, không có điều kiện tiếp xúc với các mô thực vật nên không thể kích thích tiết enzyme tiêu diệt vi sinh vật (Đặng Văn Luyến, 1995) [2]. 2.1.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của chitosan Mức độ kháng vi sinh vật của Chitosan bị ảnh hƣởng bởi các yếu tố bên trong và bên ngoài nhƣ khối lƣợng phân tử, độ deacetyl, pH, nhiệt độ, độ hòa tan, nguồn gốc và vi sinh vật đích. So với Chitin, Chitosan có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tốt hơn vì Chitosan tích điện dƣơng ở vị trí carbon thứ 2 ở pH nhỏ hơn 6. Chitosan có độ deacetyl cao trên 85% thì có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tốt. Chitosan có phân tử lƣợng dƣới 2.000 dalton thì khả năng ức chế vi sinh vật kém. Chitosan có phân tử lƣợng trên 9.000 dalton thì có khả năng ức chế vi sinh vật cao. Để các ứng dụng của hợp chất chitosan có hiệu quả cần phải làm rõ các yếu tố này (Nguyễn Thị Đoàn, 2009) [10]. 10 - Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng Hoạt tính kháng khuẩn của Chitosan bị ảnh hƣởng mạnh mẽ bởi pH. pH có ảnh hƣởng đến sự ion hóa của nhóm –NH2 trên mạch phân tử Chitosan. pH càng cao mức độ ion hóa của nhóm –NH2 càng thấp làm giảm khả năng kháng khuẩn của Chitosan. Nghiên cứu của Byung và cộng sự trên Chitosan cho thấy Cadida albicans càng ít bị ức chế khi môi trƣờng pH trở nên kiềm tính, hiệu quả ức khuẩn cao nhất trong khoảng pH= (5 – 5,57) ( Đặng Văn Luyến, 1995) [2]. - Ảnh hƣởng bởi trọng lƣợng phân tử Ảnh hƣởng của trọng lƣợng phân tử Chitosan đến hoạt động kháng khuẩn đã đƣợc nghiên cứu. Tùy tuộc vào loại vi khuẩn thử nghiệm, điều kiện thử nghiệm và trọng lƣợng phân tử mà so sánh đƣợc một vài nghiên cứu về hoạt động diệt khuẩn của Chitosan, nhƣng kết quả thu đƣợc không hoàn toàn tƣơng thích. Tăng trọng lƣợng phân tử đến giảm hoạt tính E.coli của Chitosan trong một số nghiên cứu (Gerasimenko D.V, Avdienko I.D, et al, 2004) [23]. Rất khó tìm đƣợc mối tƣơng quan rõ ràng giữa hoạt tính kháng khuẩn và trọng lƣợng phân tử của Chitosan. Tuy nhiên hoạt tính này giảm so với một trọng lƣợng phân tử cao nhất định. Sự khác biệt giữa kết quả của các nghiên cứu có thể là so độ deacetyl và trọng lƣợng phân tử khác nhau của Chitosan. Việc đánh giá tùy thuộc vào việc khảo sát phạm vi trọng lƣợng phân tử Chitosan rộng với độ deacetyl là nhƣ nhau, điều này khó gặp vì Chitosan là một polymer tự nhiên. Vì vậy, khó có thể xác định trọng lƣợng phân tử tối ƣu nhất cho hoạt động tính kháng khuẩn tốt nhất. Việc lựa chọn trọng lƣợng phân tử của Chitosan phụ thuộc vào ứng dụng của nó. - Ảnh hƣởng bởi độ deacetyl(DDA) của Chitosan 11 DDA của Chitosan thể hiện hàm lƣợng –NH2 trong phân tử Chitosan. Các thí nghiệm đếu chứng tỏ Chitosan với độ deacetyl cao thể diện tính kháng khuẩn và khả năng làm sạch nƣớc càng hiệu quả. Điều này có thể giải thích là do sự tăng lên về khả năng ion hóa tạo phức của Chitosan. - Ảnh hƣởng bởi nồng độ của Chitosan Nồng độ Chitosan càng cao khả năng ức khuẩn sẽ tăng. Tuy nhiên nồng độ chitosan hợp lý sẽ nâng cao hiệu quả sử dụng nó. - Ảnh hƣởng bởi các yếu tố khác Dung môi hòa tan Chitosan và các hợp chất bổ sung có thể tăng cƣờng hiệu quả ức khuẩn của Chitosan. Một số nghiên cứu cho thấy làm tăng kháng khuẩn của dung dịch của Chitosan nếu dùng các dung môi là acide citric, lactic và acetic. Nghiên cứu của Matsuhashi và Kume cho thấy Chitosan chiếu xạ có khả năng ức chế cao nhất đối với sự phát triển của E. coli. Một số nghiên cứu khác đã chứng tỏ khả năng kháng vi sinh vật tăng lên khi sử dụng thêm phụ liệu tạo dẻo cho màng Chitosan là Sorbitol trong bao gói thịt bò. Tỷ lệ vi sinh vật tổng số giảm so với mẫu đối chứng là 73,86%, so với mẫu ban đầu là 77% trong khi đó khả năng làm giảm vi sinh vật tổng số lại giảm đi cùng phụ liệu tạo dẻo là glycerin. Ngoài ra hiệu quả kháng khuẩn của Chitosan còn phụ thuộc vào số lƣợng vi sinh vật trong thực phẩm và thời kì sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật. 2.1.6. Ứng dụng của Chitosan - Chitosan và các dẫn xuất của chúng có nhiều đặc tính quý báu nhƣ: có hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, có khả năng tự phân huỷ sinh học cao, không gây dị ứng, không gây độc hại cho ngƣời và gia súc, có khả năng tạo phức với một số kim loại chuyển tiếp nhƣ: Cu(II), Ni(II), Co(II)... Do vậy Chitosan và một số dẫn xuất của đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: