Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Giáo dục - Đào tạo Sinh học Bồi dưỡng học sinh giỏi môn sinh học thpt chuyên đề công nghệ and tái tổ hợp và ...

Tài liệu Bồi dưỡng học sinh giỏi môn sinh học thpt chuyên đề công nghệ and tái tổ hợp và bài tập

.DOC
20
1600
112

Mô tả:

Chuyên đề Công nghệ AND tái tổ hợp CHUYÊN ĐỀ: CÔNG NGHỆ AND TÁI TỔ HỢP VÀ BÀI TẬP PHẦN I: MỞ ĐẦU Dựa trên hai nền tảng là sinh hóa học và di truyền học, cùng sự phát triển nhanh chóng của công nghệ hiện đại, sinh học phân tử ra đời tác động toàn diện tới nhiều ngành khoa học và đời sống con người. Sinh học phân tử không những góp phần giúp ta giải thích các hiện tượng của sự sống thông qua các phân tử cấu tạo cơ thể sống mà còn ảnh hưởng ngày càng sâu rộng tới nhiều lĩnh vực y học, nông nghiệp, pháp lý. Trong nghiên cứu sinh học phân tử, thực nghiệm thao tác với AND mà cơ bản là công nghệ AND tái tổ hợp giữ vai trò cốt lõi. Công nghệ AND tái tổ hợp bao gồm việc thao tác trên vật liệu di truyền là phân tử AND, nhằm nghiên cứu sự sống ở mức độ phân tử một cách định hướng và xác định. CNSH mà đỉnh cao là kỹ thuật tái tổ hợp ADN đang ngày càng có ý nghĩa to lớn đối với đời sống con người, tạo ra được những điều mà trước đây tưởng chừng như không làm được. Trong chương trình sinh học phổ thông, số tiết về công nghệ gen hạn chế, kiến thức giáo khoa sơ sài, chưa đi sâu khai thác bản chất vấn đề, các câu hỏi ở mức đơn giản và bài tập gần như không có tài liệu đề cập nên học sinh thường gặp lung túng trong học và ôn luyện. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi lựa chọn chuyên đề: “Công nghệ AND tái tổ hợp và bài tập” Tuy nhiên do thời gian soạn thảo ngắn, trình độ hạn chế cho nên chuyên đề không tránh khỏi sai sót, chúng tôi rất mong nhân được sự đóng góp nhiệt tình của các thầy cô giáo và các bạn đồng nghiệp để chuyên đề này được hoàn thiện hơn. 1 Chuyên đề Công nghệ AND tái tổ hợp PHẦN II: NỘI DUNG A. LÝ THUYẾT CƠ BẢN 1. Một số khái niệm: - ADN tái tổ hợp: Là một phân tử AND nhỏ được ráp láp từ các đoạn ADN lấy từ các tế bào khác nhau (thể truyền và gen cần chuyển) mà thể truyền là một phân tử ADN nhỏ có khả năng nhân đôi một cách độc lập đối với hệ gen của tế bào cũng như có thể gắn vào hệ gen của tế bào - Công nghệ di truyền: còn gọi là công nghệ gen hay kỹ thuật tái tổ hợp AND, thực hiện việc chuyển gen để tạo ra các tế bào hoặc có thể mang các gen mới nhằm tạo ra những vật chất cần thiết. - Kĩ thuật di truyền: Kĩ thuật di truyền là kĩ thuật thao tác trên vật liệu di truyền dựa vào những hiểu biết về cấu trúc hoá học của các axit nuclêic và di truyền vi sinh vật. KTDT được sử dụng phổ biến hiện nay là kĩ thuật cấy gen, tức là chuyển một đoạn ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận bằng cách dùng thể truyền. Thể truyền có thể có nhiều loại: plasmid, thể thực khuẩn, nấm men,... Kĩ thuật cấy gen bằng plasmid có 3 khâu chủ yếu: + Tách ADN nhiễm sắc thể của tế bào cho và tách plasmit ra khỏi tế bào. + Cắt và nối đoạn ADN của tế bào cho vào ADN plasmit ở những điểm xác định, tạo nên ADN tái tổ hợp. Thao tác cắt tách đoạn ADN được thực hiện nhờ enzim cắt (restrictaza). Các phân tử enzim này nhận ra và cắt đứt ADN ở những nuclêôtit xác định nhờ đó người ta có thể tách các gen mã hoá những prôtêin nhất định. Việc cắt đứt ADN vòng của plasmit cũng được thực hiện do enzim cắt còn việc ghép đoạn ADN của tế bào cho vào ADN plasmit thì do enzim nối (ligaza) đảm nhiệm. + Chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận, tạo điều kiện cho gen đã ghép được biểu hiện. Plasmit mang ADN tái tổ hợp được chuyển vào tế bào nhận bằng nhiều phương pháp khác nhau. Vào tế bào nhận, nó tự nhân đôi, được truyền qua các thế hệ tế bào sau qua cơ chế phân bào và tổng hợp loại prôtêin đã mã hoá trong đoạn ADN được ghép. Tế bào nhận được dùng phổ biến là vi khuẩn đường ruột E.Coli. Tế bào E.Coli sau 30 phút lại tự nhân đôi. Sau 12 giờ, 1 tế bào ban đầu sẽ sinh ra 16 triệu tế bào, qua đó các plasmit trong chúng cũng được nhân lên rất nhanh và sản xuất ra một lượng lớn các chất tương ứng với các gen đã ghép vào plasmit. Trong kĩ thuật cấy gen người ta còn dùng thể thực khuẩn làm thể truyền. Nó gắn đoạn ADN của tế bào cho vào ADN của nó và trong khi xâm nhập vào tế bào nhận nó sẽ đem theo cả đoạn ADN này vào đó. 2. Kỹ thuật ADN tái tổ hợp: AND tái tổ hợp được hình thành bằng cắt 1 đoạn AND rồi đưa vào 1 phân tử AND có khả năng tái bản (như plasmid của vi khuẩn) được gọi là vector tạo dòng, từ đó nó được nhân lên (khuyếch đại), tạo ra 1 plasmid được thực hiện nhờ các enzim giới hạn có khả năng cắt AND tại vị trí đặc hiệu, tạo các đoạn AND xác định với dầu phù hợp cho việc gắn nó vào vector đã được mở vòng bằng chính enzim mở đó. Các phân tử ADN tái tổ hợp mới có thể làm thay đổi mức độ biểu hiện bình thường của một gen (chẳng hạn bằng việc dung hợp giữa một trình tự mã hóa của một loài này với trình tự promoter của một loài khác) hoặc thậm chí mã hóa tổng hợp một loại protein “dung hợp” mới (protein lai) mang các trình tự axit amin từ các protein có nguồn gốc khác nhau. Hiện nay, các kỹ thuật tách dòng phân tử (bao gồm cả PCR) đã trở thành các công cụ thiết yếu trong nghiên cứu về sự điều hòa và 2 Chuyên đề Công nghệ AND tái tổ hợp biểu hiện của các gen và hệ gen ở các loài sinh vật khác nhau. Quá trình tách dòng ADN và tạo nên các phân tử ADN tái tổ hợp điển hình thường liên quan đến việc sử dụng các véctơ là trình tự mang thông tin điều khiển hoạt động nhân lên (khuếch đại) và/hoặc biểu hiện trong tế bào của phân tử ADN tái tổ hợp mang đoạn ADN cài (đoạn trình tự được phân lập) bao gồm trình tự gen được quan tâm nghiên cứu. Các “công cụ” chính để tạo nên các phân tử ADN tái tổ hợp là các enzym giới hạn giúp cắt các phân tử ADN tại các vị trí xác định và các enzym nối cho phép ghép nối các phân đoạn ADN có nguồn gốc khác nhau với nhau. Bằng việc tạo nên các phân tử ADN tái tổ hợp có thể tự nhận lên trong tế bào chủ, một đoạn ADN cài xác định nào đó có thể được phân lập, tinh sạch và nhân lên thành một số lượng lớn các bản sao. 3. Sử dụng enzym giới hạn trong phân tích ADN Hầu hết các phân tử ADN trong tự nhiên đều lớn hơn nhiều so với kích thước có thể thao tác và phân tích một cách thuận lợi trong phòng thí nghiệm. Trong các tế bào, phần lớn các nhiễm sắc thể thường là một phân tử ADN dài chứa hàng trăm thậm trí hàng nghìn gen khác nhau. Vì vậy, để có thể phân lập và phân tích từng gen, người ta phải cắt các phân tử ADN kích thước lớn thành các phân đoạn nhỏ. Công việc này được thực hiện bởi một nhóm các enzym đặc biệt gọi là enzym giới hạn. Tất cả các enzym giới hạn đều có hai đặc tính: a) nhận biết một trình tự đặc hiệu trên phân tử ADN (gọi là trình tự giới hạn); b) cắt bên trong phân tử ADN tại vị trí đặc hiệu (hoặc ngay tại vị trí giới hạn; hoặc cách vị trí giới hạn một số nucleotit nhất định). Trong các nhóm enzym giới hạn, nhóm thường được dùng trong các nghiên cứu di truyền phân tử và kỹ nghệ gen là nhóm nhờ vị trí và trình tự cắt của chúng được xác định rõ. Vì vậy ở đây chỉ đề cập đến việc ứng dụng của nhóm enzym giới hạn này. Các trình tự giới hạn của enzym nhóm thường gồm 4 - 8 bp, thông thường có tính đối xứng và vị trí cắt thường nằm trong trình tự giới hạn này. Ví dụ như enzym giới hạn coR được tìm thấy ở vi khuẩn E. coli có trình tự giới hạn là 5’GAATTC- 3’ với vị trí cắt ở giữa G và A. Tên enzym gồm 3 ký tự đầu chỉ tên loài vi khuẩn mà từ đó 3 Chuyên đề Công nghệ AND tái tổ hợp enzym được tìm thấy (Eco = Escherichia coli), các ký tự sau chỉ tên của chủng vi khuẩn và số thứ tự của enzym được tìm thấy ở loài vi khuẩn đó (EcoRI là enzym giới hạn đầu tiên được tìm thấy ở E. coli). Một enzym giới hạn có trình tự giới hạn gồm 6 bp giống EcoRI thông thường được trông đợi sẽ có trung bình một vị trí cắt trong một đoạn trình tự có kích thước khoảng 4 kb (bởi theo nguyên tắc xác suất tại một vị trí nhất định xác suất để có một loại nucleotit nhất định là 1/4, vì vậy xác suất để có một trình tự nhất định gồm 6 bp sẽ là 1/46 = 1/4096). Giả sử có một phân tử ADN mạch thẳng có 6 vị trí cắt của enzym EcoRI. Việc cắt phân tử ADN này bằng EcoRI sẽ cho ra 7 phân đoạn ADN khác nhau. Do đó, khi điện di trên gel sản phẩm cắt, 7 phân đoạn ADN sẽ phân tách nhau ra do chúng khác nhau về khối lượng (vì chúng khác nhau về thành phần và trình tự các nucleotit). Như vậy, một phân đoạn ADN sẽ tương ứng với một vùng của phân tử ADN ban đầu. Việc sử dụng một enzym giới hạn khác, chẳng hạn HindIII cũng có trình tự giới hạn gồm 6 bp, nhưng có trình tự giới hạn thay đổi (5’-AAGCTT- 3’) sẽ cho ra các sản phẩm cắt khác với khi sử dụng EcoRI (với cùng phân tử ADN ban đầu). Như vậy, việc sử dụng đồng thời nhiều enzym giới hạn sẽ tạo ra một kiểu hình phổ điện di các phân đoạn cắt giới hạn đặc thù đối với từng gen phân tích. Đối với một số enzym giới hạn khác, chẳng hạn như Sau3A1 (tìm thấy ở vi khuẩn Staphylococcus aureus) có trình tự giới hạn ngắn hơn (5’-GATC-3’), nên tần số cắt của chúng thường cao hơn các enzym có trình tự giới hạn dài. Theo xác suất, Sau3A1 có trung bình 1 vị trí cắt trong một đoạn trình tự khoảng 250 bp (1/44 = 1/256). Ngược lại, enzym NotI có trình tự giới hạn dài (5’-GCGGCCGC-3’) trung bình cứ một đoạn trình tự dài khoảng 65 kb, mới có 1 vị trí cắt (1/48 = 1/65536). Các enzym giới hạn không chỉ khác nhau về trình tự giới hạn và độ dài đoạn trình tự giới hạn đặc trưng của chúng, mà chúng còn khác nhau về cách “cắt” phân tử ADN. Chẳng hạn như enzym HpaI tạo ra các phân tử ADN dạng đầu bằng (đầu tù), còn các enzym ERcoRI, HindIII và PsIt cắt phân tử ADN tạo ra các phân đoạn có đầu dính. Sở dĩ gọi là “đầu dính” bởi phần các trình tự ở hai đầu sau khi được enzym cắt ra bổ trợ với nhau theo nguyên tắc Chargaff và vì vậy chúng có xu hướng “dính” trở lại với nhau, hoặc với các phân tử ADN được cắt bởi cùng một loại enzym giới hạn. Tính chất này được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ ADN tái tổ hợp và các kỹ thuật tách dòng phân tử. VD vềề các vị trí giới hạn trong hệ gen người Vậy bằng cách nào các phân tử ADN được cắt, tái tổ hợp và nhân lên? 4. Tách dòng ADN trong các véctơ plasmid 4 Chuyên đề Công nghệ AND tái tổ hợp Sau khi một phân đoạn ADN được cắt khỏi một phân tử ADN có kích thước lớn hơn bằng enzym giới hạn, phân đoạn ADN đó cần được “cài” vào một véctơ để có thể nhân lên. Hay nói cách khác là một phân đoạn ADN cần được cài vào một phân tử ADN thứ hai (véctơ) để có thể nhân lên được trong tế bào chủ như đã nói ở trên. Cho đến nay, tế bào chủ được sử dụng rộng rãi nhất để nhân lên các đoạn ADN trong công nghệ ADN tái tổ hợp là vi khuẩn E. coli. Các véctơ ADN điển hình thường có 3 đặc tính: a) Chúng phải chứa một trình tự khởi đầu sao chép (tái bản), cho phép chúng tự sao chép độc lập với nhiễm sắc thể của tế bào chủ b) Chúng phải mang một dấu chuẩn chọn lọc cho phép dễ dàng xác định và phân lập được các tế bào mang véctơ tái tổ hợp (mang đoạn ADN cài) với các tế bào không mang véctơ tái tổ hợp. c) Có vị trí cắt của một hoặc nhiều enzym giới hạn khác nhau. Đây chính là vị trí cài của phân đoạn ADN cần tách dòng vào véctơ. Véctơ tách dòng phổ biến nhất là các phân tử ADN sợi kép, mạch vòng kích thước nhỏ (khoảng 3 kb) được gọi là các plasmit. Các véctơ này phần lớn có nguồn gốc từ các loài vi khuẩn và một số từ các sinh vật nhân chuẩn đơn bào (nấm men). Trong nhiều trường hợp, các phân tử ADN này trong tự nhiên đã mang sẵn các gen mã hóa tính kháng chất kháng sinh. Như vậy, các plasmid trong tự nhiên đã có sẵn hai thuộc tính là: khả năng tự sao chép trong tế bào chủ và có trình tự dấu chuẩn chọn lọc. Ngoài ra, các véctơ plasmit còn một ưu điểm nữa là chúng có thể đồng thời tồn tại nhiều bản sao trong tế bào. Điều này có thể giúp khuếch đại và phân lập được một số lượng lớn một phân đoạn ADN nào đó từ một quần thể tế bào nhỏ. Trước đây, một số véctơ plasmit chỉ có một vị trí cắt của enzym giới hạn duy nhất. Cùng với thời gian, cấu trúc của các véctơ plasmit được cải tiến theo hướng cắt bỏ bớt các trình tự không cần thiết và gắn thêm vào đoạn trình tự có thể được cắt bằng nhiều loại enzym giới hạn khác nhau. Vị trí trên véctơ mang đoạn trình tự như vậy được gọi là vị trí đa tách dòng (polycloning site). Có những vị trí đa tách dòng hiện nay có kích thước ngắn nhưng có thể được cắt bởi trên 20 loại enzym giới hạn khác nhau. Nhờ đặc tính này, một véctơ có thể được dùng để tách dòng nhiều phân đoạn ADN có nguồn gốc khác nhau. Trên cơ sở các nguyên tắc tương tự, ngoài véctơ plasmit, hiện nay người ta đã phát triển được nhiều loại véctơ khác nhau có nguồn gốc phagơ, hoặc lai giữa vi khuẩn - phagơ (như phagemid, cosmid P), hoặc có nguồn gốc từ nấm men (ví dụ: YAC). Việc cài một phân đoạn ADN vào một véctơ thường là một công việc tương đối đơn giản. Người ta thường sử dụng cùng một loại enzym giới hạn để cắt véctơ và đoạn ADN cài. Chẳng hạn như việc sử dụng enzym EcoRI sẽ cắt và chuyển véctơ từ dạng “vòng” sang dạng “mạch thẳng” có hai đầu dính. Do được cắt bởi cùng enzym giới hạn, nên đoạn ADN cài cũng có hai đầu dính với trình tự bổ trợ với trình tự đầu dính của véctơ. Các đầu dính này sẽ liên kết véctơ và đoạn ADN cài lại với nhau hình thành nên một phân tử ADN mạch vòng mới (phân tử ADN tái tổ hợp) chỉ còn thiếu hai liên kết phosphodieste duy nhất còn lại ở mỗi mạch. Hai liên kết này sẽ được “hàn” kín nhờ sử dụng enzym ADN ligase trong sự có mặt của ATP. Để hạn chế khả năng gắn kết lại của hai đầu dính của chính véctơ (vì hai đầu dính này có trình tự bổ trợ) sau khi được cắt bởi enzym giới 5 Chuyên đề Công nghệ AND tái tổ hợp hạn, người ta thường cho lượng ADN cài dư thừa so với véctơ để phần lớn các véctơ sau khi gắn lại là các véctơ tái tổ hợp mang các đoạn ADN cài. Một số loại véctơ không những cho phép phân lập và tinh sạch được một phân đoạn gen nào đó, mà còn có thể điều hòa sự biểu hiện của gen nằm trong phân đoạn ADN cài. Những véctơ như vậy được gọi là các véctơ biểu hiện. Các véctơ này thường phải chứa trình tự promoter nằm ngược dòng sát với vị trí cài gen. Nếu vùng mã hóa của gen (không chứa promoter) được gắn vào véctơ theo đúng chiều khung đọc của gen, thì gen cài sẽ được phiên mã thành mARN và dịch mã thành protein trong tế bào chủ. Các véctơ biểu hiện thường được sử dụng để biểu hiện các gen đột biến hoặc các gen lai để tiến hành phân tích chức năng của chúng. Chúng cũng có thể được dùng để sản xuất một lượng lớn một loại protein nào đó vốn không thu được hiệu suất tương tự bằng các con đường tự nhiên. Ngoài ra, các promoter trong các véctơ biểu hiện có thể được lựa chọn sao cho sự biểu hiện của gen cài có thể được điều hòa bằng việc bổ sung một hợp chất đơn giản vào môi trường nuôi cấy (như một loại đường hoặc axit amin chẳng hạn). Việc có thể điều khiển chủ động sự biểu hiện của một gen nào đó có ý nghĩa quan trọng, đặc biệt đối với các gen gây độc. 5. Biến nạp các véctơ ADN vào tế bào chủ Biến nạp là quá trình ở đó một cơ thể chủ có thể tiếp nhận một phân tử ADN ngoại lai từ môi trường bên ngoài. Một số vi khuẩn (trong đó không có E. coli) có khả năng biến nạp tự nhiên được gọi là các vi khuẩn khả biến di truyền. Vi khuẩn E. coli có thể trở nên khả biến khi được xử lý với ion Ca2+. Mặc dù cơ chế khả biến chưa được biết đầy đủ, nhưng dường như ion Ca 2+ bao bọc lại các điện tích âm trên phân tử ADN và tăng cường khả năng của chúng xuyên qua màng tế bào. Các tế bào được xử lý với Ca2+ vì vậy được gọi là các tế bào khả biến. Người ta có thể sử dụng một chất kháng sinh mà véctơ plasmid mang gen dấu chuẩn mã hóa tính kháng chất kháng sinh đó để chọn lọc được các thể mang plasmid tái tổ hợp. Các tế bào mang véctơ tái tổ hợp có thể sinh trưởng trong môi trường chứa chất kháng sinh, trong khi các tế bào khác thì không. Thông thường quá trình biến nạp có hiệu suất không cao. Chỉ có một tỉ lệ nhỏ các tế bào được xử lý biến nạp có thể tiếp nhận được plasmid tái tổ hợp. Nhưng, chính hiệu quả biến nạp thấp giúp hầu hết các tế bào mang véctơ tái tổ hợp thường chỉ tiếp nhận một plasmid duy nhất. Thuộc tính này giúp cho các tế bào biến nạp và dòng tế bào do chúng sinh ra (do phân chia trực phân) chỉ mang một véctơ ADN tái tổ hợp duy nhất và cho phép các nhà nghiên cứu thể phân lập và tinh sạch được các gen hoặc hoặc sản phẩm của các gen riêng rẽ từ hỗn hợp biến nạp mang cả các phân tử ADN khác. 6. Thư viện hệ gen Đối với các hệ gen đơn giản, kỹ thuật tách dòng thường khá đơn giản. Chẳng hạn như với hệ gen một số virut có kích thước khoảng 10 kb, người ta có thể trực tiếp tách chiết ADN, cắt chúng bằng enzym giới hạn rồi tiến hành phân tích điện di. Các phân đoạn ADN tách biệt trên gel điện di được cắt khỏi gel, tinh sạch rồi cài vào các véctơ. Trong khi đó, đối với các hệ gen phức tạp, kích thước lớn (như hệ gen người), việc cắt ADN tổng số bằng enzym giới hạn rồi phân tích điện di thường dẫn đến sự hình thành một dải băng điện di liên tục do có sự phân bố liên tục của các phân đoạn ADN được cắt giới hạn chỉ khác nhau một hoặc một vài nucleotit. Vì vậy, để đơn giản hóa quy trình tách dòng ở những hệ gen này, người ta 6 Chuyên đề Công nghệ AND tái tổ hợp thường tiến hành biến nạp toàn bộ các phân đoạn ADN (thu được sau khi cắt bằng enzym giới hạn) vào véctơ tách dòng rồi biến nạp tất cả chúng vào tế bào chủ, sau đó mới phân lập các dòng tế bào mang véctơ tái tổ hợp có các đoạn cài ADN khác nhau. Tập hợp các dòng tế bào như vậy được gọi là thư viện hệ gen. Như vậy, thư viện hệ gen là tập hợp các dòng tế bào mang các véctơ tái tổ hợp chứa các đoạn ADN cài khác nhau có cùng nguồn gốc (cùng hệ gen). Để thiết lập một thư viện gen, hệ gen của tế bào đích (chẳng hạn ADN hệ gen người) được cắt bằng enzym giới hạn để tạo ra các phân đoạn ADN có kích thước trung bình mong muốn. Kích thước các phân đoạn (đoạn cài) có thể dao động từ 100 bp đến trên 1 Mb (đối với các phân đoạn ADN kích thước rất lớn, phân tử ADN thường được cắt không hoàn toàn bằng một enzym giới hạn). Các phân đoạn ADN cắt giới hạn sau đó được “trộn” với một loại véctơ phù hợp (trước đó được cắt bởi cùng loại enzym giới hạn) và ADN ligase. Kết quả của bước này sẽ tạo ra một tập hợp các véctơ mang các đoạn ADN cài khác nhau. Người ta có thể tạo ra nhiều thư viện gen khác nhau bắt nguồn từ các nguồn vật liệu khác nhau. Thư viện hệ gen đơn giản nhất bắt nguồn từ ADN hệ gen tổng số được cắt bằng một enzym giới hạn duy nhất, gọi là thư viện hệ gen. Loại thư viện này có ý nghĩa ứng dụng rõ rệt nhất nhằm giải mã trình tự các hệ gen. Ngược lại, đối với mục đích tìm và phân lập ra một phân đoạn mang gen mong muốn, thì thư viện hệ gen chỉ tỏ ra hiệu quả đối với hệ gen chỉ chứa một phần tương đối nhỏ các vùng không mã hóa. Đối với các hệ gen phức tạp hơn, thư viện hệ gen không phù hợp cho việc tìm ra phân đoạn mang gen mong muốn bởi vì phần lớn các dòng trong thư viện mang các đoạn cài thuộc các vùng không mã hóa. Để có được thư viện gen mang hầu hết các đoạn cài là các vùng mã hóa, người ta sử dụng thư viện cADN. Các bước thiết lập thư viện cADN được minh họa trên hình 10. Theo đó, trong bước đầu tiên thay vì bắt đầu từ ADN, người ta phiên mã ngược trình tự mARN thành trình tự ADN phiên bản (cADN). Quá trình này được gọi là quá trình phiên mã ngược và được thực hiện nhờ một enzym ADN polymerase đặc biệt là reverse transcriptase. Enzym này có khả năng tổng hợp ADN bắt nguồn từ phân tử ARN mạch đơn làm khuôn ban đầu. Khi có mặt enzym reverse transcriptase, các trình tự mARN được phiên mã ngược thành các phân tử ADN sợi kép, và những phân tử này có thể được gắn vào các véctơ. Để có thể phân lập được các đoạn cài riêng rẽ từ thư viện hệ gen, các tế bào E. coli được tiến hành biến nạp với tất cả các phân đoạn trong thư viện. Mỗi một tế bào biến nạp thường chỉ mang duy nhất một véctơ mang đoạn cài ADN. Vì vậy, khi các tế bào nhân lên sau đó chúng sẽ sẽ tạo ra nhiều dòng tế bào, mỗi dòng chứa nhiều bản sao của một phân đoạn trong thư viện cADN. Khuẩn lạc được tạo ra từ các tế bào mang các trình tự ADN mong muốn có thể được phân lập và từ đó thu lại ADN. Có một số cách để xác định các dòng tế bào đã mang gen biến nạp. Chẳng hạn phương pháp được nêu dưới đây sử dụng các mẫu dò ARN và /hoặc ADN để xác định các quần thể tế bào mang một đoạn ADN nhất định nào đó. 7. Sử dụng lai mẫu dò để xác định các dòng tế bào trong thư viện gen Trong phương pháp sử dụng mẫu dò, người ta sử dụng các đoạn trình tự ADN /ARN có trình tự bổ trợ được đánh dấu và lai với các dòng tế bào mang các đoạn gen cài khác nhau trong thư viện hệ gen. Kỹ thuật này được gọi là phương pháp lai khuẩn lạc. Một thư viện hệ gen điển hình thường 7 Chuyên đề Công nghệ AND tái tổ hợp chứa hàng ngàn đoạn cài khác nhau được mang bởi cùng một loại véctơ tách dòng. Sau khi véctơ được biến nạp vào một chủng vi khuẩn phù hợp, các tế bào vi khuẩn được cấy trên bề mặt đĩa petri chứa môi trường bán rắn chứa agar. Mỗi tế bào sau đó sẽ phát triển lên thành một khuẩn lạc riêng rẽ, và các tế bào trong cùng một khuẩn lạc đều mang cùng loại véctơ và đoạn gen cài giống nhau. Trong kỹ thuật lai khuẩn lạc, người ta cũng có thể sử dụng loại màng lai được dùng trong các phương pháp thẩm tách Southern và Northern để thu hồi được một lượng “vết” ADN đủ cho sự kết cặp với mẫu dò. ở đây, người ta sẽ dùng màng lai ép lên bề mặt đĩa nuôi cấy chứa khuẩn lạc và in hình chúng lên màng lai (cùng với ADN của chúng) sao cho vị trí của các dòng tế bào trên màng lai tương ứng với các vị trí khuẩn lạc của chúng trên đĩa petri (theo nguyên tắc “đóng dấu”). Điều này đảm bảo cho việc khi chúng ta xác định được một vị trí trên màng lai có kết quả “dương tính” và việc bắt cặp với mẫu dò thì chúng ta sẽ xác định được tương ứng khuẩn lạc mang dòng tế bào chứa véctơ tái tổ hợp mang đoạn gen cài mong muốn. Màng lai được đem lai với mẫu dò như sau: người ta tiến hành xử lý màng lai sao cho màng tế bào vỡ ra và các phân tử ADN thoát ra ngoài gắn lên màng lai tại chính vị trí tế bào của chúng. Các màng lai sau đó được ủ với các mẫu dò được đánh dấu từ trước trong các điều kiện giống như khi tiến hành các kỹ thuật thẩm tách Northern hay Southern. Trong công nghệ ADN tái tổ hợp, ngoài các véctơ plasmit có nguồn gốc vi khuẩn, người ta còn có thể sử dụng véctơ có nguồn gốc virut (bacteriophage), hoặc từ các sinh vật bậc cao hơn như nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men (YAC), hay nhiễm sắc thể nhân tạo có nguồn gốc vi khuẩn (BAC), hoặc một số véctơ lai giữa chúng (vd: cosmid, P). Trong các véctơ có nguồn gốc bacteriophage, phage l được sử dụng phổ biến. ADN của virut này được cải biến và sử dụng như véctơ tách dòng. Véctơ này được sử dụng để tách dòng các thư viện hệ gen về nguyên tắc giống hệt như khi sử dụng các véctơ plasmit. Chỉ có một điểm khác là khi tiến hành lai để xác định các dòng gen biến nạp thì vị trí các mẫu dò được xác định trên màng lai tương ứng với vị trí các vết tan thay cho vị trí các khuẩn lạc như khi sử dụng véctơ tách dòng plasmit. 8 Chuyên đề Công nghệ AND tái tổ hợp B. CÂU HỎI LÝ THUYẾT TỰ LUẬN 1. Thế nào là DNA tái tổ hợp invitro ? Tại sao kĩ thuật tái tổ hợp DNA còn gọi là kĩ thuật tạo dòng phân tử ? DNA tái tổ hợp invitro là DNA tạo thành do ghép nối những đoạn DNA khác nhau trong ống nghiệm và biểu hiện hoạt tính khi đưa trở lại tế bào sống. Kĩ thuật tái tổ hợp DNA còn gọi là kĩ thuật tạo dòng phân tử vì cho phép từ một bản sao của một đoạn acid nucleic nhân lên thành dòng gồm các bản sao giống nhau. 2. Ý nghĩa của enzyme restrictase ? + Giúp vi khuẩn nhận biết và hạn chế khả năng sinh sản của phage bằng khả năng cắt DNA một cách đặc hiệu của restrictase enzyme. + Enzyme restrictase được dùng để cắt DNA trong kĩ thuật tái tổ hợp DNA. 3. Nững loại enzyme nào được dùng để cắt, nối và sao chép gene ? Loại enzyme nào đóng vai trò hàng đầu ? Nuclease, DNA polymerase, ligase, reverse transcriptase, terminal transferase, hàng đầu là restrictase. 4. Một gene cấu trúc biết rõ trình tự đã được tổng hợp nhân tạo lần đầu tiên bởi nhóm của Khorona vào 1969 nhưng gene này không có hoạt tính. Giải thích. Thiếu trình tự điều hòa (promoter). 5. Tạo nòi vi khuẩn sản xuất insulin bằng phương pháp hóa tổng hợp gene như sau: dùng ligase nối các đoạn oligonucleotide đã tổng hợp thành polynucleotide. Polynucleotide được gắn vào plasmid. Tế bào chứa plasmid mang gene insulin sẽ sản xuất ra proinsulin, qua xử lí hóa học sẽ thu được insulin. Ở một thí nghiệm người ta thấy tế bào chứa plasmid mang gene insulin không tổng hợp ra proinsulin. Giải thích. Do plasmid không có gắn promoter cần cho sự phiên mã gene lạ. 6. Có 3 phương pháp thu nhận gene để thực hiện kĩ thuật tái tổ hợp DNA: Cách 1: Tách các đoạn DNA từ hệ gene: dùng enzyme restriction cắt toàn bộ DNA thành các đoạn nhỏ rồi gắn vào vector mang gene tạo plasmid tái tổ hợp. Cách 2:Hóa tổng hợp nhân tạo gene (xem câu 5). Cách 3: sinh tổng hợp gene từ mRNA tương ứng: tổng hợp cDNA mạch đơn từ mRNA trưởng thành nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase), sau đó dùng DNA polymerase tổng hợp cDNA mạch kép từ cDNA mạch đơn. Gắn cDNA mạch kép vào plasmid và biến nạp vào tế bào vi khuẩn. Trong thực tiễn kĩ thuật di truyền, người ta thường dùng cách nào ? Giải thích. +Trong thực tiễn kĩ thuật di truyền, người ta thường dùng cách 3. +cách 1:tách các đoạn DNA từ hệ gene có nhiều bất lợi: hệ gene của những sinh vật khác nhau chứa rất nhiều gene; số đoạn DNA tạo ra có thể rất nhiều trong đó có những đoạn DNA tương tự nhau; số đoạn DNA rất nhiều nên cần một số lượng rất lớn các dòng vi khuẩn mang DNA; phần lớn DNA Eukarytotae bậc cao không mã hóa tổng hợp protein nên dễ làm tốn công vô ích khi tạo dòng. 9 Chuyên đề Công nghệ AND tái tổ hợp Tuy nhiên, cách này vẫn dùng có hiệu quả trong lập ngân hàng của DNA hệ gene hay thư viện DNA hệ gene. +cách 2: Phải biết trình tự nucleotide của gene. Tuy nhiên, nhờ sự phát triển của phương pháp nghiên cứu cấu trúc bậc một của protein và các sản phẩm khác của gene cùng phương pháp xác định trình tự nucleotide đã thúc đẩy nhanh cách này. +cách 3:dòng cDNA của hệ gene là những đoạn nucleotide ngẫu nhiên, gần như không phụ thuộc loại tế bào dùng để lấy DNA; dòng cDNA chứa trình tự mã hóa liên tục nên cDNA có thể tổng hợp protein cần thiết với số lượng lớn; protein được tạo ra với số lượng lớn thì mRNA của protein đó có tỉ lệ cao nên dễ xác định đúng dòng cDNA mong muốn. 7. Vector chuyển gene là gì ? Vector chuyển gene là phân tử DNA có khả năng tự sao chép, tồn tại độc lập trong tế bào mà không nhất thiết phải gắn vào hệ gene tế bào chủ và mang được gene mong muốn với số lượng lớn. Vector phải gắn thêm promoter (trình tự điều hòa) tạo thuận lợi cho sự phiên mã gene lạ cũng như các gene đánh dấu để dễ dàng phát hiện ra vector hay gene lạ gắn vào. Vector được cấu tạo tùy theo mục tiêu sử dụng và được cải tiến không ngừng. 8. Vì sao vector phage λ được dùng rộng rãi để lập ngân hàng gene thay vì đưa plasmid vào tế báo vi khuẩn bằng biến nạp ? +Dễ bảo quản, dễ tách ra để phân tích, dễ loại bỏ. +Có hệ thống tự động xâm nhập và sinh sản trong tế bào vi khuẩn. +Một ưu thế của phage là có khả năng mang đoạn DNA lạ dài hơn so với plasmid. +Dễ xác định DNA lạ đã gắn vào phage chưa. 9. Vì sao để đưa DNA tái tổ hợp vào thực vật nhiễm gene (transgenic plant) người ta thường bắn DNA trực tiếp vào tế bào mà không tạo tế bào trần ? +Tạo tế bào trần: phải làm mất vách tế bào để DNA ngấm vào trong; thường tế bào có sức sống kém, khó phân chia để tự tái sinh. +DNA được bắn với tốc độ nhanh, xuyên thủng vách tế bào vào trong. 10. Tại sao PCR có vai trò cách mạng hóa nghiên cứu cấu trúc và chức năng của gene ? +Thời gian thực hiện cực nhanh, đơn giản và ít tốn kém. +Độ tinh sạch của mẫu không cần cao. +Khuyếch đại nhanh nhiều bản sao của các đoạn acid nucleic mà không cần tạo dòng. +Được hoàn thiện không ngừng và có nhiều ứng dụng như xác định trình tự nucleotide, gây đột biến điểm định hướng,...Có thể thực hiện PCR ngay trong tế bào với cả DNA và RNA. 11. Làm sao tạo đột biến điểm định hướng tức là chủ động gây đột biến tại một điểm chuyên biệt mong muốn ? +Làm mất đoạn. +Làm tăng đoạn. +Nối các đoạn gene lại. 10 Chuyên đề Công nghệ AND tái tổ hợp +Thay thế 1 nucleotide này bằng 1 nucleotide khác. 12. Vì sao lai acid nucleic và PCR được coi là phương pháp chẩn đoán mới trong y học ? +Tác nhân gây bệnh nhiễm trùng nếu hiện diện đủ cho phân tích thì không cần nuôi cấy. +Có thể dùng được ngay khi vi sinh vật gây bệnh không nuôi được như các bệnh do nhiễm virus. +Một mẫu có thể xác định đại diện cho tất cả serotype. +Có thể tạo dòng ngay chính gene bệnh để sản xuất mẫu thử tương ứng. 11 Chuyên đề Công nghệ AND tái tổ hợp C. CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM LÝ THUYẾT: Câu 1: Quy trình tạo ra những tế bào hoặc sinh vật có gen bị biến đổi, có thêm gen mới, từ đó tạo ra các cơ thể với những đặc điểm mới được gọi là A. công nghệ tế bào B. công nghệ sinh học. C.* công nghệ gen. D. công nghệ vi sinh vật. Câu 2: Khâu đầu tiên trong quy trình chuyển gen là việc tạo ra A. vectơ chuyển gen. B. biến dị tổ hợp. C. gen đột biến. D. *ADN tái tổ hợp. Câu 3: Enzim nối sử dụng trong kĩ thuật tạo ADN tái tổ hợp có tên là A. restrictaza. B. * ligaza. C. ADN-pôlimeraza. D. ARN-pôlimeraza. Câu 4: Plasmít là ADN vòng, mạch kép có trong A. nhân tế bào các loài sinh vật. B. nhân tế bào tế bào vi khuẩn. C. * tế bào chất của tế bào vi khuẩn. D. ti thể, lục lạp. Câu 5: Kĩ thuật chuyển một đoạn ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận bằng thể truyền được gọi là A. *kĩ thuật chuyển gen. B. kĩ thuật tạo ADN tái tổ hợp. C. kĩ thuật tổ hợp gen. D. kĩ thuật ghép các gen. Câu 6: Trong công nghệ gen, kĩ thuật gắn gen cần chuyển vào thể truyền được gọi là A. thao tác trên gen. B. * kĩ thuật tạo ADN tái tổ hợp. C. kĩ thuật chuyển gen. D. thao tác trên plasmit. Câu 7: Một trong những đặc điểm rất quan trọng của các chủng vi khuẩn sử dụng trong công nghệ gen là A. *có tốc độ sinh sản nhanh. B. dùng làm vectơ thể truyền. C. có khả năng xâm nhập và tế bào. C. phổ biến và không có hại. Câu 8: Vectơ chuyển gen được sử dụng phổ biến là A. E. coli. B. virút. C. *plasmit. D. thực khuẩn thể. Câu 9: Công nghệ gen được ứng dụng nhằm tạo ra A. các phân tử ADN tái tổ hợp. B. các sản phẩm sinh học. C. *các sinh vật chuyển gen. D. các chủng vi khuẩn E. coli có lợi. Câu 10: Trong công nghệ gen, ADN tái tổ hợp là phân tử lai được tạo ra bằng cách nối đoạn ADN của A. *tế bào cho vào ADN của plasmit. B. tế bào cho vào ADN của tế bào nhận. C. plasmít vào ADN của tế bào nhận. D. plasmít vào ADN của vi khuẩn E. coli. Câu 11: Restrictaza và ligaza tham gia vào công đoạn nào sau đây của quy trình chuyển gen? A. Tách ADN của nhiễm sắc thể tế bào cho và tách plasmít ra khỏi tế bào vi khuẩn. B. *Cắt, nối ADN của tế bào cho và plasmit ở những điểm xác định tạo nên ADN tái tổ hợp. C. Chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận. D. Tạo điều kiện cho gen được ghép biểu hiện. Câu 12: Để có thể xác định dòng tế bào đã nhận được ADN tái tổ hợp, các nhà khoa học A. chọn thể truyền có gen đột biến. B. chọn thể truyền có kích thước lớn. C. quan sát tế bào dưới kính hiển vi. D. *chọn thể truyền có các gen đánh dấu. 12 Chuyên đề Công nghệ AND tái tổ hợp Câu 13: Nhận định nào sau đây là đúng? A. *Vectơ chuyển gen được dùng là plasmit cũng có thể là thể thực khuẩn. B. Việc cắt phân tử ADN trong kĩ thuật chuyển gen nhờ enzym ligaza. C. Việc nối các đoạn ADN trong kĩ thuật tạo ADN tái tổ hợp do enzym restrictaza. D. Vectơ chuyển gen là phân tử ADN tồn tại độc lập trong tế bào nhưng không có khả năng tự nhân đôi. Câu 14: Phương pháp biến nạp là phương pháp đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận bằng cách: A. dùng xung điện kích thích làm co màng sinh chất của tế bào B. *dùng muối CaCl2 làm dãn màng sinh chất của tế bào. B. dùng thực khuẩn Lambda làm thể xâm nhập. D. dùng hormon kích thích làm dãn màng sinh chất của tế bào Câu 15: Trong kĩ thuật chuyển gen, phân tử ADN tái tổ hợp được tạo như thế nào? A. *ADN plasmit sau khi được nối thêm vào một đoạn ADN của tế bào cho. B. ADN của tế bào cho sau khi được nối vào một đoạn ADN của tế bào nhận. C. ADN của tế bào nhận sau khi được nối vào một đoạn ADN của tế bào cho. D. ADN plasmit sau khi được nối thêm vào một đoạn ADN của tế bào nhận. Câu 16: Khâu nào sau đây đóng vai trò trung tâm trong công nghệ gen? A. Tách chiết thể truyền và gen cần chuyển ra khỏi tế bào. B. *Tạo ADN tái tổ hợp để chuyển gen. C. Chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận. D. Phân lập dòng tế bào chứa ADN tái tổ hợp. Câu 17: Các bước tiến hành trong kĩ thuật chuyển gen theo trình tự là: A. * tạo ADN tái tổ hợp → đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận → phân lập dòng tế bào chứa ADN tái tổ hợp. B. tách gen và thể truyền → cắt và nối ADN tái tổ hợp → đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận. C. tạo ADN tái tổ hợp → phân lập dòng ADN tái tổ hợp → đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận. D. phân lập dòng tế bào chứa ADN tái tổ hợp→ tạo ADN tái tổ hợp→ chuyển ADN tái tổ hợp vào TB nhận. Câu 18: Điều nào sau đây là không đúng với plasmit? A. Chứa phân tử ADN dạng vòng. B. *Là một loại virút kí sinh trên tế bào vi khuẩn. C. Là phân tử ADN nhỏ nằm trong tế bào chất của vi khuẩn. D. ADN plasmit tự nhân đôi độc lập với ADN nhiễm sắc thể. Câu 19: ADN nhiễm sắc thể và ADN plasmit có chung đặc điểm nào sau đây? A. Nằm trong nhân tế bào. B. Có cấu trúc xoắn vòng. C. *Có khả năng tự nhân đôi. D. Có số lượng nuclêôtit như nhau. Câu 20: Đặc điểm quan trọng nhất của plasmit mà người ta chọn nó làm vật thể truyền gen là: A. chứa gen mang thông tin di truyền quy định một số tính trạng nào đó. B. chỉ tồn tại trong tế bào chất của vi khuẩn. 13 Chuyên đề Công nghệ AND tái tổ hợp C. *ADN plasmit tự nhân đôi độc lập với ADN của nhiễm sắc thể. D. ADN có số lượng cặp nuclêôtit ít: từ 8000-200000 cặp Câu 21: Trong kĩ thuật cấy gen dùng plasmit, tế bào nhận thường dùng phổ biến là (M) nhờ vào đặc điểm (N) của chúng. (M) và (N) lần lượt là: A. (M): E. coli, (N): cấu tạo đơn giản. B. * (M): E. coli, (N): sinh sản rất nhanh. C. (M): virút, (N): cấu tạo đơn giản. D. (M): virút, (N): sinh sản rất nhanh. Câu 22: Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật tác động lên vật chất di truyền ở cấp độ A. *phân tử. B. tế bào. C. quần thể. D. cơ thể. Câu 23: Kỹ thuật cấy gen là kỹ thuật tác động trên đối tượng nào sau đây? A. *ADN. B. ARN. C. Protêin. D. Nhiễm sắc thể. Câu 24: Để đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận có thể dùng chất nào sau đây? A. Muối CaCl2. B. Xung điện. C. * Muối CaCl2 hoặc xung điện. D. Cônxixin. Câu 25: Thành tựu nào sau đây không phải là do công nghệ gen? A. Tạo ra cây bông mang gen kháng được thuốc trừ sâu. B. *Tạo ra cừu Đôly. C. Tạo giống cà chua có gen sản sinh etilen bị bất hoạt, làm quả chậm chín. D. Tạo vi khuẩn E.coli sản xuất insulin chữa bệnh đái tháo đường ở người. Câu 26: Ý nghĩa của công nghệ gen trong tạo giống là gì? A. Giúp tạo giống vi sinh vật sản xuất các sản phẩm sinh học trên quy mô công nghiệp. B. Giúp tạo giống cây trồng sản xuất chất bột đường, protêin trị liệu, kháng thể trong thời gian ngắn. C. Giúp tạo ra các giống vật nuôi có năng suất, chất lượng sản phẩm cao. D. *Giúp tạo giống mới sản xuất các sản phẩm phục vụ cho nhu cầu ngày càng cao của con người. Câu 27: Thành tựu nào dưới đây không được tạo ra từ ứng dụng công nghệ gen? A. Vi khuẩn E. coli sản xuất hormon somatostatin. B. Lúa chuyển gen tổng hợp β caroten. C. *Ngô DT6 có năng suất cao, hàm lượng protêin cao. D. Cừu chuyển gen tổng hợp protêin huyết thanh của người. Câu 28: Đối tượng vi sinh vật được sử dụng phổ biến tạo ra các sản phẩm sinh học trong công nghệ gen là: A. vi rút. B. * vi khuẩn. C. thực khuẩn. D. nấm. Câu 29: Các sản phẩm sinh học do các giống bò và cừu chuyển gen sản xuất được lấy từ A. *Sữa. B. máu. C. thịt. D. tuỷ xương. Câu 30. Một trong những ứng dụng của kỹ thuật di truyền là A. Tạo thể song nhị bội B. Tạo các giống cây ăn quả không hạt C. *Sản xuất lượng lớn protein trong thời gian ngắn D. Tạo ưu thế lai Câu 31. Thành tựu của kỹ thuật di truyền là 14 Chuyên đề Công nghệ AND tái tổ hợp A. Tạo đột biến gen là nguồn nguyên liệu chủ yếu cho chọn giống B. Tạo đột biến là nguồn nguyên liệu cho chọn giống C. Tăng cường biến dị tổ hợp D. *Sản xuất trên quy mô công nghiệp các sản phẩm sinh học nhờ vi khuẩn Câu 32. Enzyme cắt (restrictase) được dùng trong kỹ thuật di truyền vì nó có khả năng A. Phân loại được các gen cần chuyển B. Nối gen cần chuyển vào thể truyền để tạo ADN tái tổ hợp C. *Nhận biết và cắt đứt ADN ở những điểm xác định D. Đánh dấu được thể truyền để dễ nhận biết trong quá trình chuyển gen Câu 33. Enzym giới hạn AvaI có trình tự giới hạn là CYCGRG, trong đó Y là pyrimidine còn R là purine. Việc sử dụng enzym này cắt ngẫu nhiên các phân tử ADN sẽ tạo ra các đoạn có kích thước dài trung bình là bao nhiêu bp? A. 4096 B. 1024 C.682 D.64 Câu 34 Một phân tử ADN sợi kép mạch vòng có kích thước 5,9 Mb (Mb = 10 6 cặp nucleotide) trong ống nghiệm được cắt bởi một enzym giới hạn mà người ta chưa biết trình tự giới hạn, rồi đem điện di thì thu được 90 phân đoạn ADN khác nhau. Kết luận nào dưới đây có nhiều khả năng đúng nhất? A. Enzym này có trình tự giới hạn gồm 8 nucleotide. B. Enzym này có trình tự giới hạn gồm 6 nucleotide C. Enzym này có trình tự giới hạn gồm 4 nucleotide, nhưng chỉ cắt phân tử ADN mạch đơn D. Enzym này cắt ADN tạo thành một số phân đoạn có dạng đầu dính Câu 35 Nếu các nucleotide được xếp ngẫu nhiên trên một phân tử ARN dài 10 6 nucleotide, chứa 20%A, 25%X, 25%U và 30% G. Số lần trình tự 5’-GUUA-3’ được mong đợi xuất hiện trong đoạn phân tử ARN nêu trên là bao nhiêu? A. từ 1 đến 2 lần B. từ 3 đến 4 lần. C. từ 4 đến 5 lần. D. nhiều hơn 5 lần Câu 36 Phương pháp nào dưới đây có thể dùng để bất hoạt chức năng của một gen mà không nhất thiết phải thay đổi trình tự của gen đó? A. Kỹ thuật bất hoạt gen B. Sử dụng ARN can thiệp. C. Tạo đột biến trội âm tính. D. *Phương án 2 và 3 đúng Câu 37 Bằng chứng nào dưới đây chỉ sự có mặt của một gen trong một đoạn ADN mới được giải trình tự? A. Có trình tự tương đồng với ít nhất một phần trình tự cADN B. Có trình tự giống với các gen đã biết ở những loài khác. C. Có ORF phù hợp với các nguyên tắc xác định các trình tự intron và exon. D. * Tất cả các bằng chứng trên đây Câu 38 Để sản xuất ở quy mô lớn một loại protein đặc thù của người bằng nuôi cấy tế bào E. coli, cADN tương ứng với protein đó được biến đổi sao cho protein được biểu hiện có thêm 6 axit amin 15 Chuyên đề Công nghệ AND tái tổ hợp histidine ở phía tận cùng đầu carboxyl. Mục đích của biến đổi này là A. tăng cường hiệu quả biến nạp cADN vào các tế bào E. coli. B. tạo ra trình tự promoter mới cho sự phiên mã cADN trong tế bào E. coli C. *tạo điều kiện để việc tinh sạch protein tái tổ hợp thuận tiện hơn bằng kỹ thuật sắc ký ái lực qua cột chứa các nguyên tử niken. D. ngăn cản sự biến tính của protein tái tổ hợp trong tế bào E. coli Câu 39 Các phân tích tái tổ hợp di truyền có thể lập bản đồ các gen gây bệnh cách nhau khoảng 1 cM. Tính trung bình thì một vùng trình tự ADN như vậy chứa khoảng bao nhiêu gen? A. 1 hoặc 2 B. 10 – 50 C. 100 – 200 D. 1000 – 2000 Câu 40 Ước tính có bao nhiêu gen trong hệ gen người? A. *20.000 - 25,000. B. 30.000 - 35,000 C. 50.000 - 75,000 D. Trên 100,000 Câu 41 Phát biểu nào dưới đây về lai axit nucleic là sai? A. Nó tuân thủ theo nguyên tắc Chargaff B. ADN có thể lai với một mạch ADN hoặc ARN. C. Phân tử lai ADN – ADN hoặc ADN – ARN bị biến tính ở nhiệt độ cao D. *Mẫu dò dùng để lai có thể là ADN, ARN hoặc polysaccharide. Câu 42 mARN sẽ chỉ tạo phân tử lai với mạch ADN đối mã bởi vì A. mạch ADN mã hóa dễ biến tính ở nhiệt độ cao B. nồng độ muối ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp với mạch ADN mã hóa C. *lai ADN – ARN tuân thủ theo nguyên tắc kết cặp bổ sung D. ADN sợi kép không bắt cặp trở lại sau khi đã được gây biến tính. Câu 43 Vectơ nào dưới đây mang được đoạn ADN cài có kích thước lớn nhất? A. *YAC B. Cosmid C. Plasmid D. Vectơ con thoi Câu 44 Các thí nghiệm lai ADN từ hai loài vi khuẩn thường được dùng để so sánh A. tốc độ sao chép ADN giữa chúng B. cơ chế tổng hợp ARN từ ADN giữa chúng C. *trình tự ADN giữa chúng D. thành phần ribosome 16S giữa chúng Câu 45 16 Chuyên đề Công nghệ AND tái tổ hợp Trong nghiên cứu hệ gen học, nhằm tìm hiểu nguyên nhân gây ra một bệnh loạn dưỡng cơ, người ta có thể sử dụng kỹ thuật nào dưới đây? A. Xây dựng ngân hàng hệ gen. B. *Xác định các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự biểu hiện của gen được quan tâm nghiên cứu. C. Giải trình tự gen gây bệnh D. Lập bản đồ di truyền nhiễm sắc thể mang gen gây bệnh D. MỘT SỐ DẠNG TẬP CƠ BẢN: 1. Một phân tử AND, nếu số nucleotide A khác T hoặc G khác X thì AND đó là mạch đơn Từ tỷ lệ các bazo của AND sau, xác định nó là mạch đơn hay kép A G T X ADN1 32 18 31 10 ADN2 17 28 31 24 ADN3 29 25 29 17 Giải: Phân tử 1 có thể là mạch kép vì A=T và G=X Phân tử 2 và 3 là mạch đơn vì A khác T và G khác X 2. Hàm lượng G-X cao thì nhiệt độ gây biến tính AND cao Nhiệt độ mà ở đó phân tử ADN mạch kép bị tách thành 2 sợi đơn gọi là nhiệt độ "nóng chảy". Hãy cho biết các đoạn ADN có cấu trúc như thế nào thì có nhiệt "nóng chảy" cao và ngược lại. Nếu ADN1 biến tính ở 740C và ADN2 biến tính ở 810C, hãy so sánh hàm lượng G-X của chúng? Giải: Những đoạn ADN có nhiệt độ :nóng chảy" cao là những đoạn có chứa nhiều loại G-X vì số lượng liên kết hyđrô nhiều hơn, ngược lại, các đoạn ADN có nhiều cặp A-T , ít G-X thì có nhiệt độ nóng chảy thấp hơn do có ít liên kết hyđrô hơn Phân tử ADN2 có hàm lượng G-X cao hơn vì nó biến tính ở nhiệt độ cao hơn. 3. Phân tử AND mạch vòng có n điểm giới hạn sẽ tạo n đoạn khi xử lý bằng enzim giới hạn. Khi cắt plasmid pBR322 bằng HaeI có 11 đoạn AND được tạo ra, khi cắt bằng BamHI thì chỉ có 1 đoạn được tạo ra. Có bao nhiêu điểm giới hạn cho mỗi enzim? Giải: AND mạch vòng, do đó có 11 điểm giới hạn cho HaeI và 1 cho BamHI 4. AND mạch thẳng có có n điểm giới hạn sẽ tạo ra n+1 đọan Một phân tử AND mạch thẳng được cắt bằng EcoRI và tạo ra các đọan 3kb, 4,2kb, 5kb. Hãy xác định bản đồ giới hạn của nó. 17 Chuyên đề Công nghệ AND tái tổ hợp Giải: Có ba đọan AND tạo thành sau khi cắt với enzyme giới hạn, vậy phải có 2 điểm cắt giới hạn. Các điểm đó có thể phân bố như sau: 3 5 4.2 3 4.2 5 3 5 4.2 5. Khi dùng enzym giới hạn cắt AND, nếu đột biết xảy ra tại vị trí cắt giới hạn, có thể mất một hoặc một số đọan và làm xuất hiện đọan mới dài hơn Khi xử lý một gen (đọan AND) bằng BgIII, nó tạo ra các đọan 1,7kb; 2,1kb và 3,2kb. Khi xử lý đoạn AND tách ra từ 1 thể đột biến ko tổng hợp được enzim của gen này bằng BgIII, người ta chỉ thấy 2 đoạn 3,2 và 3,8kb. Điều gì đã xảy ra? Giải: Đột biến làm thay đổi 1 hoặc một số loại bazo tại điểm nhận biết của BgIII, và như vậy E chỉ cắt ADN một lần. Đoạn mới là tổng của 2 đoạn 1,7kb và 2,1kb cho thấy 2 đoạn này nằm kề nhau trên AND bình thường. 6. Đột biến tạo ra vị trí cắt giới hạn mới sẽ làm mất đi 1 đoạn cũ và xuất hiện 2 đoạn mới ngắn hơn Xét đoạn AND ở bài 5, khi xử lý AND được tách ra từ một thể đột biến khác bằng BgIII thấy xuất hiện các đoạn 1,3kb; 1,7kb; 1,9kb và 2,1kb. Giải thích kết quả thu được? Giải: Các đoạn 1,7kb và 2,1kb có cả ở ADN bình thường lẫn đột biến. Điểm giới hạn sinh ra 2 đoạn này phải còn nguyên vẹn trên AND đột biến. Hai đoạn còn lại có tổng bằng 3,2kb đúng bằng đoạn bị mất. Vậy một vị trí cắt giới hạn mới đã được tạo ra ở AND gốc. 7. Nếu 1 đoạn do enzim giới hạn tạo ra cùng xuất hiện khi xử lý bằng 1 enzim và hỗn hợp 2 enzim thì đoạn đó không có điểm giới hạn cho enzim thứ 2 Một AND mạch thẳng được xử lý bằng các enzim dưới đây và kết quả như sau: EcoRI: 1,7; 2,1; 3,2kb HaeI: 1,0; 1,4; 4,6kb Hỗn hợp: 0,7; 1,0; 1,4; 1,8; 2,1kb Những đoạn giới hạn nào của EcoRI không chứa các điểm giới hạn của HaeI và ngược lại? Giải: Đoạn 2,1kb của EcoRI cũng xuất hiện trong hỗn hợp, vậy nó ko có điểm giới hạn của HaeI. Các đoạn khác của EcoRI mất đi khi xử lý bằng cả 2 E nên chúng phải chứa các điểm giới hạn của HaeI. Tương tự các đoạn 1,0 và 1,4 của HaeI đều ko chứa các điểm giới hạn của HaeI 8. Tế bào thu nhận plasmid phải biểu hiện tính kháng lien quan đến plasmid đó. Trong các thí nghiệm biến nạp điển hình, chưa đến 1% số tế bào thực sự nhận được plasmid. Bằng cách nào bạn có thể tách được số tế bào có plasmid? Giải: thiết kế các plasmid có chứa 1 vài gen kháng chất kháng sinh. Trộn các tế bào với plasmid này và cấy trên môi trường chứa chất kháng sinh. Chỉ những tế bào nhận được plasmid mới sinh trưởng được. 9. Việc xen một đoạn AND ngoại lai vào gen thường làm mất chức năng của gen. 18 Chuyên đề Công nghệ AND tái tổ hợp Một plasmid chứa các gen kháng ampicillin và tetracycline. Plasmid đó chứa 1 điểm giới hạn nằm trong gen tetracycline. Plasmid đó được xử lý với E giới hạn trộn với AND ngoại lai rồi đem ủ với E.coli. Bằng cách nào để có thể tách được tế bào có plasmid lai? Giải: Cấy các tế bào trên trong mt có ampicillin và chọn các tế bào sinh trưởng được. các tế bào có plasmid sẽ có gen ampicillin trọn vẹn. Cấy sao chép các tế bào này vào mt chứa tetracycline. Những tế bào ko sinh trưởng được là những tế bào mang các gen có đoạn xen. Trở lại với các tế bào gốc trên mt chứa ampicillin để lấy ra ngững tế bào ko sinh trưởng được trên mt chứa tetracycline. 10. ARN có đánh dấu phóng xạ, hoặc cADN có thể được dùng như các mẫu dò vì chúng sẽ gắn với đoạn AND từ đó chúng được sinh ra. Các phân tử sẽ bổ trợ với AND và tạo ra đoạn lai có thể phát hiện được. Xử lý AND hệ gen người với E.coli rồi phân tách các đoạn tạo ra bằng điện di. Các băng AND được chuyển sang màng lọc rồi ủ với cADN mã hóa insulin có đánh dấu phóng xạ. Kết quả như sau: (dấu *= các băng có đánh dấu phóng xạ) * * Có thể kết luận gì từ thí nghiệm này? Giải: Hai băng được đánh dấu * có chứa các trình tự bổ trợ với cADN insulin, và đó là những phần của gen insulin. Sự có mặt của hơn 1 băng cho thấy gen này có chứa điểm cắt giới hạn của E.coli 19 Chuyên đề Công nghệ AND tái tổ hợp PHẦN III. KẾT LUẬN Công nghệ DNA tái tổ hợp được ra đời trên cơ sở các thành tựu của sinh học phân tử và hiện nay đang đóng vai trò cách mạng đối với sự phát triển của sinh học cũng như cải tạo sinh giới. Công nghệ sinh học mà đỉnh cao là kỹ thuật tái tổ hợp ADN đang ngày càng có ý nghĩa to lớn đối với đời sống con người, tạo ra được những điều mà trước đây tưởng chừng như không làm được.Thực vậy, nhờ kỹ thuật tái tổ hợp ADN con người đã làm ra được nhiều sản phẩm mới ưu việt hơn, điều chế ra được nhiều loại văcxin phòng được nhiều bệnh nguy hiểm, nâng cao chất lượng cuộc sống. Chuyên đề “Công nghệ AND tái tổ hợp” tập trung vào ba nội dung cơ bản là hệ thống hóa kiến thức lý thuyết - Các dạng câu hỏi lý thuyết trắc nghiệm và tự luận - Một số dạng bài tập cơ bản về kỹ thuật di truyền phân tử. Khi áp dụng chuyên đề vào giảng dạy cho học sinh chuyên, ôn luyện thi học sinh giỏi, ôn thi đại học bước đầu đã thu được những kết quả tốt. Rất mong được sự góp ý của các đồng nghiệp để chuyên đề được hoàn thiện hơn./. 20
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan