Tài liệu Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ polygonum multiflorum thunb

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG -------- BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỀ TÀI: XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ POLYGONUM MULTIFLORUM THUNB TRƯƠNG CÔNG PHI NGUYỄN XUYẾN THÀNH THẮNG BIÊN HÒA, 12/2012 TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG -------- BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỀ TÀI: XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ POLYGONUM MULTIFLORUM THUNB Sinh viên thực hiện: TRƯƠNG CÔNG PHI NGUYỄN XUYẾN THÀNH THẮNG Giảng viên hướng dẫn: ThS. Trịnh Thị Thanh Huyền BIÊN HÒA, 12/2012 LỜI CẢM ƠN Bài báo cáo nghiên cứu của chúng em có được thành quả như hôm nay là nhờ sự giúp đỡ và quan tâm tận tình của các thầy cô và các anh chị đi trước. Chúng em xin chân thành cảm ơn những ý kiến đóng góp chân thành và những lời động viên của các thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Lạc Hồng. Chúng em xin cảm ơn chị Trịnh Thị Thanh Huyền, người trực tiếp hướng dẫn đề tài nghiên cứu của chúng em đã quan tâm và tận tình hướng dẫn các thao tác kỹ thuật, cũng như các kiến thức về lý thuyết chuyên ngành. Chúng em xin chân thành cảm ơn các anh Ngô Quang Hưởng, chị Phí Thị Thu Hiền… làm việc tại Phòng Nuôi Cấy Mô Thực Vật, thuộc Trung tâm Ứng dụng Công nghệ Sinh học – Sở Khoa học Công nghệ - Tỉnh Đồng Nai đã hướng dẫn và giúp đỡ chúng em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu. Và cuối cùng em xin gửi lời biết ơn đến gia đình, người thân, tập thể các bạn khoa Công nghệ Sinh học – Môi trường khóa 2008, đã giúp đỡ và động viên chúng em trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu của mình. i MỤC LỤC Mục Trang TRANG PHỤ BÌA LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC ...................................................................................................................i TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... iii PHỤ LỤC ................................................................................................................. iii DANH MỤC BIỂU ĐỒ VÀ BẢNG BIỂU .............................................................iv DANH MỤC HÌNH ẢNH ......................................................................................... v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT...................................................................................vi PHẦN 1: PHẦN MỞ ĐẦU ....................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ................................................................................................ 1 2. Mục tiêu, mục đích của đề tài ........................................................................... 1 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu .................................................................... 2 4. Phƣơng pháp nghiên cứu của đề tài ................................................................. 2 5. Những đóng góp và mặt hạn chế ...................................................................... 2 6. Kết cấu của đề tài ............................................................................................... 2 PHẦN II: NỘI DUNG ............................................................................................... 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3 1.1. Giới thiệu chung về hà thủ ô đỏ..................................................................... 3 1.1.1. Nguồn gốc và hình thái ........................................................................3 1.1.2. Tác dụng dƣợc lý ..................................................................................3 1.2. Nuôi cấy in vitro từ mẫu chồi ......................................................................... 5 1.2.1. Khái niệm nuôi cấy in vitro tế bào thực vật .......................................5 1.2.2. Quy trình tạo mẫu chồi in vitro ........................................................... 5 ii 1.2.3. Sự tái sinh chồi từ mẫu chồi ................................................................ 6 1.2.4. Tăng sinh cụm chồi in vitro .................................................................6 1.2.5. Tạo rễ và cây con hoàn chỉnh và chuyển ra vƣờn ƣơm ....................6 1.3. Những vấn đề trong nuôi cấy mô .................................................................. 6 1.3.1. Sự tạp nhiễm ......................................................................................... 6 1.3.2. Tính bất định về mặt di truyền ........................................................... 7 1.3.3. Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy ........................................7 1.3.4. Hiện tƣợng thủy tinh thể .....................................................................8 1.4. Các công trình nghiên cứu liên quan ............................................................ 9 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..................................................10 2.1. Thời gian và địa điểm ................................................................................... 10 2.2. Trang thiết bị và dụng cụ ............................................................................. 10 2.3. Nội dung nghiên cứu..................................................................................... 11 2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ chất khử trùng và thời gian xử lý lên mẫu cây hà thủ ô đỏ ..................................................... 11 2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tái sinh chồi cây hà thủ ô đỏ ....................................................................................................12 2.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tăng sinh cụm chồi cây hà thủ ô đỏ ............................................................................................. 14 2.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tạo rễ và cây con hoàn chỉnh ....................................................................................................15 2.3.5. Thí nghiệm 5: Nuôi trồng trong nhà kính ........................................15 2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................................ 16 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 17 iii 3.1. Kết quả khảo sát nồng độ javel và thời gian xử lý thích hợp để khử trùng mẫu cây hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb ....................................... 17 3.2. Kết quả khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tái sinh chồi cây hà thủ ô đỏ ...... 20 3.3. Kết quả khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tăng sinh cụm chồi cây hà thủ ô đỏ ........................................................................................................................... 25 3.4. Kết quả khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tạo rễ và cây con hoàn chỉnh cây hà thủ ô đỏ ............................................................................................................ 29 3.5. Nuôi trồng trong nhà kính ........................................................................... 32 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................... 35 4.1. Kết luận.......................................................................................................... 35 4.2. Kiến nghị........................................................................................................ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC BIỂU ĐỒ VÀ BẢNG BIỂU DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Tình trạng mẫu sau xử lý ..................................................................... 18 Biểu đồ 3.2: Biểu diễn sự tương tác giữa các nồng độ javel sử dụng và thời gian xử lý ................................................................................................................................ 19 Biểu đồ 3.3 : Biểu diễn môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự tăng sinh cụm chồi cây hà thủ ô đỏ ..................................................................................................................................... 26 Biểu đồ 3.4: Biểu diễn môi trường ảnh hưởng đến chiều cao chồi .......................... 27 Biểu đồ 3.5: Biểu diễn số rễ phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy ............................ 30 Biểu đồ 3.6: Biểu diễn chiều dài rễ phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy ................. 31 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tỷ lệ emodin và physcion .......................................................................... 4 Bảng 2.1: Khảo sát nồng độ javel và thời gian khử trùng mẫu ................................ 11 Bảng 2.2: Khảo sát môi trường tối ưu để tái sinh chồi cây hà thủ ô đỏ .................. 12 Bảng 2.3: Khảo sát môi trường tăng sinh cụm chồi cây hà thủ ô đỏ........................ 14 Bảng 2.4: Khảo sát môi trường tạo rễ và cây con hoàn chỉnh.................................. 15 Bảng 3.1: Tình trạng mẫu hà thủ ô đỏ sau khi khử trùng 3 tuần .............................. 18 Bảng 3.2: Kết quả tái sinh chồi sau 4 tuần nuôi cấy ................................................ 21 Bảng 3.3: Kết quả tăng sinh cụm chồi sau 4 tuần nuôi cấy...................................... 25 Bảng 3.4: Kết quả chồi tạo rễ sau 4 tuần nuôi cấy ................................................... 29 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cây hà thủ ô đỏ .......................................................................................... 3 Hình 3.1: Mẫu hà thủ ô đỏ phát triển từ đốt thân mang chồi ngủ sau 3 tuần nuôi cấy .................................................................................................................19 Hình 3.2: Các chồi tái sinh phát triển trên các môi trường nuôi cấy sau 4 tuần nuôi cấy ............................................................................................................................. 24 Hình 3.3: Cụm chồi phát triển trên các môi trường sau 4 tuần nuôi cấy ................. 28 Hình 3.4: Rễ tái sinh trên các môi trường sau 4 tuần nuôi cấy ................................ 31 Hình 3.5: Rễ tái sinh trên các môi trường sau 4 tuần nuôi cấy ................................ 32 Hình 3.6: Cây con hà thủ ô trồng trên giá thể xơ dừa .............................................. 33 Hình 3.7: Sơ đồ quy trình nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb .................................................................................................... 34 vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DNA: Deoxyribonucleic acid ĐHSTTV: Điều hòa sinh trưởng thực vật NAA: Naphthaleneacetic acid KIN: Kinetin BA: N6-benzyladenin MS: Murashige & Skoog, 1962 1 PHẦN 1: PHẦN MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Thảo dược là một nguồn nguyên liệu thực vật quý giá, cung cấp dược liệu để sản xuất và chế biến các loại thuốc hữu ích phục vụ cho việc chữa bệnh và phục hồi sức khỏe cho con người. Trong đó, hà thủ ô đỏ được tìm thấy ở Trung Quốc vào năm 713 và được sử dụng như một loại thảo dược trường sinh của con người. Trên thế giới, hà thủ ô đỏ có nhiều ở Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản và Ấn Độ. Ở Việt Nam, cây hà thủ ô phân bố chủ yếu ở miền núi phía Bắc như Hà Giang, Lào Cai, Thanh Hóa, Nghệ An… hà thủ ô đỏ chủ yếu được biết đến như là một vị thuốc bổ, trị suy nhược thần kinh, ích huyết, khỏe gân cốt, đen râu tóc. Trong y học cổ truyền, hà thủ ô đỏ có tác dụng thông tiểu, giải độc, chữa đau mỏi tay chân, chữa tóc hay rụng, sớm bạc, làm đen tóc và kéo dài tuổi thọ [3]. Trong cây hà thủ ô đỏ có một số hợp chất quan trọng như: emodin, physcion, rhein, lecithin, catechin… Trong tự nhiên, hà thủ ô đỏ được trồng bằng hạt hoặc dâm cành [3]. Tuy nhiên, Lin (2003), đã xác định các cây hà thủ ô đỏ có nguồn gốc in vitro sẽ cho tỉ lệ các chất emodin và physcion cao hơn so với cây ngoài tự nhiên [1]. Trước đây, nguồn hà thủ ô đỏ tự nhiên ở nước ta khá dồi dào nhưng gần đây do bị khai thác quá mức và do nạn phá rừng nên lượng hà thủ ô đỏ bị giảm sút, không cung cấp đủ nguồn dược liệu cho việc sản xuất và chế biến các loại thuốc để chữa bệnh cho con người. Do đó, việc nhân nhanh số lượng cây hà thủ ô đỏ bằng phương pháp nuôi cấy in vitro để đáp ứng nhu cầu cung cấp nguồn dược liệu là hết sức cần thiết. Để góp phần vào việc đáp ứng nhu cầu thực tiễn, chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb”. 2. Mục tiêu, mục đích của đề tài - Mục tiêu: xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ. - Mục đích: Tạo cây giống hà thủ ô đỏ có chất lượng cao bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. 2 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Đề tài “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb”, được thực hiện trên giống hà thủ ô đỏ do Trung tâm Ứng dụng Công nghệ Sinh học – Sở Khoa học Công nghệ - Tỉnh Đồng Nai cung cấp. Phạm vi nghiên cứu của đề tài là nuôi cấy từ đoạn thân có chứa chồi ngủ cho đến tái sinh được hoàn chỉnh trong điều kiện in vitro và chuyển cây ra vườn ươm. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu của đề tài - Tổng quan tài liệu - Thực nghiệm + Bố trí thí nghiệm + Nuôi cấy mô thực vật - Phân tích và xử lý số liệu thống kê 5. Những đóng góp và mặt hạn chế Đề tài “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb”, đã được thực hiện và thu được những kết quả thiết thực trong việc tìm ra các môi trường thích hợp cho việc tái sinh chồi, nhân nhanh cụm chồi, tạo rễ và tìm ra được quy trình khử trùng mẫu. Từ đó nhân giống được số lượng cây nhiều có chất lượng cao đáp ứng nhu cầu về giống cây hà thủ ô đỏ của thị trường. Tuy nhiên đề tài còn một số hạn chế chưa khắc phục được như: chưa khảo sát được một số yếu tố có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây hà thủ ô trong điều kiện in vitro như: độ pH, ánh sáng và nhiệt độ nuôi cấy. 6. Kết cấu của đề tài Đề tài “ Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb ” được chia làm 3 chương: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 3 PHẦN II: NỘI DUNG CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về hà thủ ô đỏ 1.1.1. Nguồn gốc và hình thái Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora, đồng nghĩa: Polygonum multiflorum Thunb) - Ngành (Division) : Magnoliophyta - Lớp (Class) : Eudicots - Bộ (Ordo) - Họ (Familia) : Polygonaceae - Chi (Genus) : Fallopia - Loài (Species): Fallopia multiflora : Caryophyllales Tên gọi khác: Giao đằng, dạ hợp. Hình 1.1: Cây Hà thủ ô đỏ Hà thủ ô đỏ là loài dây leo, sống nhiều năm. Thân rễ phồng thành củ, thân quấn, mọc xoắn vào nhau, mặt ngoài thân có màu xanh tía, nhẵn, có vân. Lá mọc so le, có cuống dài. Phiến lá hình tim, dài 4 – 8 cm, rộng 2,5 – 5 cm, đầu nhọn, mép nguyên hoặc hơi lượn sóng, cả hạị mặt đều nhẵn. Bẹ chìa mỏng, màu nâu nhạt, ôm lấy thân. Hoa tự chùm nhiều nhánh. Hoa nhỏ, đường kính 2 mm, mọc cách xa nhau ở kẽ những lá bắc ngắn, mỏng. Bao hoa màu trắng, 8 nhụy (trong số đó có 3 nhụy hơi dài hơn). Bầu hoa có 3 cạnh, 3 vòi ngắn rời nhau. Đầu nhụy hình mào gà rủ xuống. Quả 3 góc, nhẵn bóng, đựng trong bao hoa còn lại, 3 bộ phận ngoài của bao hoa phát triển thành cánh rộng, mỏng, nguyên [8]. Trên thế giới, hà thủ ô đỏ phân bố nhiều ở Trung Quốc, Ấn Độ, Đài Loan, bắc Lào. Ở Việt Nam, chúng phân bố chủ yếu ở vùng có điều kiện khí hậu ẩm mát như: Hà Giang, Lai Châu, Lào Cai, Sơn La, Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An…[3]. 1.1.2. Tác dụng dƣợc lý Hà thủ ô đỏ có tác dụng hạ Cholesterol huyết thanh, được chứng minh rõ trên mô hình gây cholesterol cao ở thỏ nhà, thuốc còn có tác dụng làm giảm hấp thu cholesterol của ruột thỏ, theo tác giả, thuốc có thành phần hữu hiệu kết hợp với cholesterol. Thuốc 4 có tác dụng phòng chống và giảm nhẹ xơ cứng động mạch. Có thể tác dụng giảm xơ cứng động mạch và do thuốc có thành phần Lecithin [3]. Thuốc làm chậm nhịp tim. Làm tăng nhẹ lưu lượng máu động mạch vành và bảo vệ được cơ tim thiếu máu. Thuốc giữ được tuyến ức của chuột nhắt già không bị teo mà giữ được mức như lúc chuột còn non, tác dụng này có ý nghĩa chống lão hóa nhưng cơ chế còn cần nghiên cứu thêm. Thuốc có tác dụng nhuận tràng do dẫn chất oxymethylanthraquinone làm tăng nhu động ruột. Hà thủ ô sống có tác dụng nhuận tràng mạnh hơn hà thủ ô chín. Tác dụng kháng khuẩn và virus: thuốc có tác dụng ức chế đối với trực khuẩn lao ở người và trực khuẩn lỵ Flexner. Thuốc có tác dụng ức chế virus cúm. Ngoài ra, sử dụng hà thủ ô đỏ lâu năm còn có tác dụng làm đen râu tóc đối với người bạc tóc sớm, làm tóc đỡ khô và đỡ rụng [3]. Thành phần hoá học: Thân rễ hà thủ ô chứa antranoid, trong đó có emodin, chrysophanol, rhein, physcion; protid, tinh bột, lipid, lecitin, rhaponticin (rhapontin, ponticin). 2,3,5,4 tetrahydroxytibene -2-O-b-D-glucoside. Tanin… Trong tự nhiên, hà thủ ô đỏ được trồng bằng cách giâm cành hoặc trồng bằng hạt. Vấn đề gặp phải với phương pháp nhân giống truyền thống đối với cây hà thủ ô đỏ là khả năng nảy mầm hạt lâu, tỷ lệ sống thấp còn phương pháp giâm cành tạo ra cây con có tuổi thọ ngắn. Và Lin (2003) đã xác định các cây hà thủ ô đỏ có nguồn gốc in vitro sẽ cho tỉ lệ các chất emodin và physcion cao hơn so với cây ngoài tự nhiên. Bảng 1.1: Tỷ lệ emodin và physcion [1] Hàm lượng Emodin Hàm lượng Physcion (mg/g sấy khô) (mg/g sấy khô) Phần thân ngoài tự nhiên 0. 075±0. 000 0. 078±0. 00 Phần rễ ngoài tự nhiên 0. 077±0. 002 0. 084±0. 001 Phần chồi nhân giống in vitro 0. 381±0. 060 0. 277±0. 044 Cây trong nhà kính sau in vitro 0. 392±0. 060 0. 413±0. 064 Sản phẩm Hà thủ ô đỏ 5 Vì vậy, nhân giống in vitro là phương pháp rất hiệu quả và phù hợp với cây hà thủ ô đỏ. 1.2. Nuôi cấy in vitro từ mẫu chồi 1.2.1. Khái niệm nuôi cấy in vitro tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy in vitro tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh hình thái tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo vô trùng) một cách có định hướng dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật [2]. Các bước cơ bản: Tạo mẫu in vitro vô trùng. Tăng sinh mẫu in vitro và tạo cây hoàn chỉnh. Nuôi trồng thực nghiệm trong nhà kính với các điều kiện có kiểm soát và ngoài tự nhiên. 1.2.2. Quy trình tạo mẫu chồi in vitro Quy trình tạo chồi in vitro quá trình khử trùng mẫu chồi bằng các thuốc khử trùng có sẵn: kháng sinh, thuốc diệt nấm, javel hoặc calcihypochloride, cồn. Quá trình này được xây dựng từ quá trình khử trùng mẫu chuẩn với các thí nghiệm thay đổi thời gian quá trình khử trùng đối với từng chất khử trùng dựa vào tỷ lệ nhiễm. Chọn mẫu từ tự nhiên: Mẫu chồi được chọn cần phải khỏe mạnh, không có biểu hiện bệnh sẽ được cắt đem vào phòng thí nghiệm và rửa sơ bộ với xà phòng và nước sạch. Quy trình khử trùng: Toàn bộ chất khử trùng đều được pha với nước cất vô trùng, khi thay đổi dung dịch khử trùng thì phải thao tác trong tủ cấy. Đánh giá kết quả và xây dựng nghiệm thức khử trùng mẫu: Dựa vào kết quả tỷ lệ nhiễm và tỷ lệ sống sau 15 ngày của quá trình khử trùng lần đầu chúng ta sẽ xây dựng nghiệm thức khử trùng mẫu. Nếu mẫu bị nhiễm nấm nhiều thì chúng ta sẽ tăng thời gian lắc thuốc kháng nấm thêm 15 phút, 30 phút và tương tự với nhiễm khuẩn. Ngoài ra, chúng ta có thể tăng thời gian lắc javel vì đây là một chất khử trùng có thể tiêu diệt cả hai tác nhân nhiễm trên [6]. 6 1.2.3. Sự tái sinh chồi từ mẫu chồi Là quá trình tạo chồi bất định phát triển trực tiếp từ mẫu chồi ngoài tự nhiên đã được vô trùng. Môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy tế mô tế bào thực vật: Các môi trường khoáng cơ bản được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy tế bào thực vật là MS hoặc B5 [5]. 1.2.4. Tăng sinh cụm chồi in vitro Chồi sau khi được tái sinh sẽ được cấy chuyền sang môi trường nhân nhanh được bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng phù hợp, mục đích tạo ra thêm nhiều chồi con để phục vụ cho quá trình ra rễ tạo cây hoàn chỉnh. 1.2.5. Tạo rễ và cây con hoàn chỉnh và chuyển ra vƣờn ƣơm Từ cụm chồi tiến hành tách thành các chồi đơn và được cấy vào các môi trường tạo rễ (chứa Auxin riêng lẽ hoặc Auxin kết hợp Cytokinin). Sau khi hình hành rễ, môi trường sẽ được khảo sát với nồng độ Auxin và Cytokinin phù hợp nhất cho ra các cây hoàn chỉnh với hình thái khỏe nhất, lá to thân khỏe và khoảng cách 2 đốt ngắn. Chỉ có những cây này mới có tỷ lệ sống cao khi nuôi trồng ở trong nhà kính. 1.3. Những vấn đề trong nuôi cấy mô 1.3.1. Sự tạp nhiễm Nhiễm là vấn đề rất được quan tâm và dễ xảy ra trong nuôi cấy mô thực vật, gây ảnh huởng nghiêm trọng đến hiệu suất nuôi cấy. Một số nguồn gây tạp nhiễm như từ mẫu cấy, thao tác trong quá trình cấy, từ môi trường, dụng cụ và các máy móc thiết bị như màng lọc của tủ cấy, hệ thống thông khí trong phòng cấy [6]. Trong giai đoạn vô mẫu, mẫu cấy là nguồn gây nhiễm chính và đây cũng được xem là giai đoạn khó nhất trong vi nhân giống. Mẫu cấy có thể là đốt thân, đỉnh sinh trưởng, mẫu lá hay rễ non. Tuy nhiên, để mẫu sống và phát triển trong điều kiện vô trùng thì không phải dễ. Môi trường bên ngoài luôn có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, các rãnh nhỏ, nách lá, lớp vẩy…. của cây mẹ, đây là nơi cư ngụ khá vững chắc mà chất khử trùng không dễ tiếp xúc được chúng. Đặc biệt, vi khuẩn thường 7 nhiễm vào hệ thống mô mạch và gây nhiễm môi trường sau 1 tuần nuôi cấy. Nhiễm khuẩn trong trường hợp này thường gây những vệt trắng sữa xuất phát từ mô cấy và quan sát rõ nhất khi xem từ dưới đáy chai nuôi cấy. Vài loài vi khuẩn thường gây nhiễm: Acinebacter, Aerococcus, Agrobacterium, Bacillus, Clostridium, Curtobacterium, Erwinia, Pseudomonas…. [6]. Điều kiện trồng cây mẹ và vị trí lấy mẫu từ cây mẹ là yếu tố quan trọng thiết lập quá trình nuôi cấy sạch. Cây trồng trong nhà kính ít nhiễm vi sinh vật hơn ngoài đồng ruộng. Các bộ phận như rễ, củ, thân bò thì thường khó làm sạch hơn các bộ phận khác. Môi trường không khí, phòng sáng, phòng cấy gây nhiễm nghiêm trọng nếu không được xử lý kịp thời, nấm thường là nguyên nhân gây nhiễm chính trong trường hợp này. Nấm thường tồn tại dạng bào tử lơ lửng trong không khí, khi phòng nuôi có nhiều người ra vào tạo điều kiện tích lũy vi sinh vật càng nhiều. Nếu màng lọc tủ cấy không tốt sẽ gây nhiễm mẫu hàng loạt ngay trong quá trình cấy. Ngoài ra, bào tử nấm còn tấn công gây nhiễm những chai môi trường chưa sử dụng hoặc những bình đã được nuôi 2 - 3 tháng. Các loài nấm thường gặp: Aspergillus, Candida, Cladosporium, Microsprium và Phialophra [2]. 1.3.2. Tính bất định về mặt di truyền Kỹ thuật nhân giống vô tính áp dụng với mục đích tạo quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo ra những biến dị tế bào qua nuôi cấy mô sẹo. Những biến dị này cũng là cơ sở nghiên cứu ứng dụng vào cải thiện giống cây trồng nhưng thực tế có rất ít biến dị có lợi được báo cáo. Nuôi cấy mô sẹo cho biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh [2]. Đến nay việc gây ra biến dị chưa được làm sáng tỏ nhưng được đồng ý nhất là do thay đổi vị trí DNA. Nhân tố thường gây ra biến dị tế bào là số lần cấy chuyền. Số lần cấy chuyền càng nhiều càng cho độ biến dị cao. Biến dị nhiễm sắc thể nhiều hơn khi nuôi cấy kéo dài [7]. Số lần cấy chuyền ít và thời gian giữa hai lần cấy chuyền ngắn làm giảm sự biến dị. 1.3.3. Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy Thường chúng ta hay thấy hiện tượng hóa nâu hay hoá đen mẫu làm sinh trưởng của mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu. Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có 8 chứa các hợp chất Tannin và Hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn trong mô non. Các phân tử Phenol làm nâu mẫu Cattleya là Eucomic acid và Tyramine. Có vài phương pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu: - Than hoạt tính đưa vào môi trường giúp ngăn cản quá trình hóa nâu hay đen, đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalaenopsis, Cattleya và Aeridesvới nồng độ thường dùng 0,1 – 0,3 %. Tuy nhiên than hoạt tính cũng làm chậm quá trình phát triển của mô do hấp thu các chất kích thích tăng trưởng và các chất khác [2]. - Polyvinylpyrolidone (PVP), một chất thuộc loại polyamide hấp thu phenol qua vòng hydrogen ngăn chặn sự hóa nâu ở nhiều loại cây trồng khác nhau. - Giảm sự hóa nâu bằng cách cho các chất khử quá trình oxy hóa vào môi trường ngăn chặn quá trình oxy hóa phenol, chất khử thường được dùng như ascorbic acid, citric acid, L-cystein hydrochloride, ditheithreitol, glutathione và mecaptoethanol. Để hạn chế ảnh hưởng phenol các nhà khoa học đưa ra vài kỹ thuật khi thao tác trên mẫu: - Sử dụng mẫu nuôi cấy nhỏ từ mô non. - Gây vết thương trên mẫu nhỏ nhất khi khử trùng. - Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic acid, citric acid vài giờ trước khi cấy. - Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, oxy thấp, không có đèn 1-2 tuần. 1.3.4. Hiện tƣợng thủy tinh thể Trong nuôi cấy mô cũng thường gặp hiện tượng thủy tinh thể mẫu nuôi cấy. Khi chuyển ra khỏi bình nuôi cấy, cây con dễ bị mất nước và tỷ lệ sống sót thấp. Dạng này thường thấy khi nuôi cấy trên môi trường lỏng hay môi trường bán rắn, đặc biệt khi sự trao đổi khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây [7]. Để hạn chế quá trình thủy tinh thể một phương pháp hiệu quả nhất được nhiều người ủng hộ là làm giảm ảnh hưởng của hàm lượng nước trong môi trường nuôi cấy bằng cách tăng nồng độ đường và tạo điều kiện môi trường nuôi (nhiệt độ, ánh sáng, trao đổi khí) thích hợp. 9 1.4. Các công trình nghiên cứu liên quan Ở trong nước, năm 2004, Trần Thị Liên đã nghiên cứu quy trình nhân giống vô tính cây hà thủ ô đỏ bằng kỹ thuật in vitro. Sự phát sinh phôi soma từ mô sẹo lá cây hà thủ ô đỏ của Huỳnh Thị Đan San và Võ Thị Bạch Mai vào năm 2009. Hoàng Thị Kim Hồng, năm 2011 đã nghiên cứu và tìm ra môi trường thích hợp cho việc tái sinh chồi và cụm chồi trong môi trường nuôi cấy in vitro cây hà thủ ô đỏ. Lương Văn Thủy, năm 2007, đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân chồi và tạo callus của cây hà thủ ô đỏ. Trần Thị Kim Thu, Trương Thị Bích Phượng, năm 2008, nghiên cứu nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ. Trên thế giới, năm 2003, Li Chang Lin và cộng tác viên đã xây dựng một quy trình nhân giống hà thủ ô đỏ và đánh giá hàm lượng emodin và physcion trong cây được nhân giống với cây trồng tự nhiên. Đây là nghiên cứu có giá trị quan trọng đối với các công ty dược muốn chiết xuất hai chất này cho mục đích thương mại. Tất cả các nghiên cứu trên, đều có đóng góp quan trọng cho việc nhân nhanh cây hà thủ ô đỏ cho mục đích thương mại, bảo tồn cây hà thủ ô đỏ. 10 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Thời gian và địa điểm Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 05/ 2012 đến tháng 10/ 2012 tại Trung tâm ứng dụng công nghệ sinh học Sở Khoa học - công nghệ tỉnh Đồng Nai. 2.2. Trang thiết bị và dụng cụ Đèn cồn Nồi hấp khử trùng Tủ Lạnh Hóa chất Hệ thống phòng cấy Máy cất nước Chai và ống nghiệm Hệ thống phòng nuôi Máy đo pH Hệ thống nhà kính Cân tiểu ly Tủ cấy Ben, kẹp Phòng rữa chai lọ cách biệt Pipet, ống đong, ống hút Hệ thống phòng cấy: là phòng nuôi cấy có kiểm soát không khí không để sự tạp nhiễm xãy ra. Phòng này thuờng kín và trang bị máy lạnh để tránh nhiệt độ nóng ảnh huỡng đến năng suất làm việc. Hệ thống phòng nuôi: là hệ thống phòng có kểm soát nhiệt độ và độ chiếu sáng ổn định, và có nhiều kệ để tăng diện tích. Ánh sáng được kiểm soát theo quang kì của cây và tắt theo hệ thống điện tự động. Hệ thống phòng rửa chai lọ cách biệt là hệ thống phòng dùng để rửa chai lọ và pha môi trường và làm các việc lặt vặt. Do công việc pha môi trường thường làm vương vãi dung dịch dinh duỡng nên nồng độ vi sinh vật trong không khí rất cao, cần được lau chùi, khử trùng thường xuyên. Hệ thống nhà kính: sẽ giảm cường độ ánh sáng bằng lưới lan và cách ly côn trùng, sâu hại. Với tất cả thiết bị, dụng cụ trên bạn đã có một phòng nuôi cấy mô hoàn chỉnh. 11 2.3. Nội dung nghiên cứu 2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ chất khử trùng và thời gian xử lý lên mẫu cây hà thủ ô đỏ - Vật liệu: + Đốt thân (1-1,5 cm) mang chồi ngủ của cây hà thủ ô đỏ trưởng thành ngoài tự nhiên. + Chất khử trùng: javel - Cách tiến hành: + Các thao tác ngoài phòng thí nghiệm: Rửa mẫu bằng xà phòng Rửa mẫu dưới vòi nước sạch trong khoảng 15 – 20 phút Lắc với thuốc kháng sinh 1 giờ + Các thao tác tiếp theo được thực hiện trong tủ cấy: Rửa mẫu bằng cồn 70o Lắc mẫu với javel trong 5, 10 và 15 phút Rửa mẫu bằng nước cất vô trùng 5 lần Bảng 2.1: Khảo sát nồng độ javel và thời gian khử trùng mẫu NT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nồng độ javel (%) 20 20 20 25 25 25 30 30 30 Thời gian xử lý (phút) 5 10 15 5 10 15 5 10 15