Tài liệu Xây dựng quy trình định danh lactobacillus acidophilus và bacillus subtills có trong chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản bằng kỹ thuật giải trình tự rdna 16s

1 ðẠI HOC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA HOÀNG TƯỜNG VI XÂY DỰNG QUY TRÌNH ðỊNH DANH LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS VÀ BACILLUS SUBTILIS CÓ TRONG CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG THỦY SẢN BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ RDNA 16S Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học LUẬN VĂN THẠC SĨ Tp. Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2008 Hoïc vieân Hoaøng Töôøng Vi 2 LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận văn thạc sĩ này tôi xin : Trân trọng tri ân TS.BS Phạm Hùng Vân- một cánh chim ñầu ñàn trong lĩnh vực công nghệ sinh hoc y học. Thầy ñã luôn tận tình hướng dẫn và chỉ bảo em trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp từ bậc ñại học ñến bậc cao học. Trân trọng cảm ơn các thầy cô trường ðại học Bách Khoa- ngành Công nghệ Sinh học ñã tiếp thêm cho tôi nhiều kiên thức chuyên ngành trong suốt hai năm học tại trường. Tôi xin gửi những lời cảm ơn chân thành ñến Ban Giám ðốc, các anh chị nhân viên Công Ty TNHH-TM-DV Nam Khoa ñã tạo ñiều kiện cho tôi hoàn thành luân văn này. ðặc biệt xin cảm ơn các anh chị phòng RD, anh Thái Bình, chị Ngọc Thảo, chị Hiếu Ngọc ñã không ngại khó khăn giúp ñỡ tôi. Xin thật lòng cảm ơn Anh- Xuân Phán vì những giúp ñỡ vô cùng quan trọng, những lời ñộng viên, chia sẻ trong suốt thời gian thực hiện luận văn này. Gia ñình tôi – Bố, mẹ và em luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi, là nơi tôi cảm thấy bình yên nhất mỗi khi trở về. Thành công ngày hôm nay là quà tặng tôi muốn gởi ñến Gia ðình và Anh. Một lần nữa xin trân trọng cảm ơn! Hoïc vieân Hoaøng Töôøng Vi 3 TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA VIỆT NAM PHÒNG ðÀO TẠO SðH PHÚC CỘNG HÒA Xà HỘI CHỦ NGHĨA ðỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH Tp. HCM, ngày …. tháng …năm 2008 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: HOÀNG TƯỜNG VI Phái: Nữ Ngày tháng năm sinh: 03/08/1983. Nơi sinh: Tp HCM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học. MSHV: I- TÊN ðỀ TÀI: “XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM SINH HỌC CÓ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS VÀ BACILUS SUBTILIS DÙNG TRONG THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI SINH VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ”. II – NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: SỬ DỤNG KĨ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ rDNA 16 VÀ KĨ THUẬT ðỊNH LƯỢNG ðẾM KHUẨN LẠC ðỂ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG THỦY SẢN. ÁP DỤNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG ðỂ KIỂM TRA MỘT SỐ SẢN PHẨM CHẾ PHẨM SINH HỌC TRÊN THỊ TRƯỜNG III – NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: IV – NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: V – CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS.BS PHẠM HÙNG VÂN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CN BỘ MÔN QL CHUYÊN NGÀNH Nội dung và ñề cương luận văn thạc sĩ ñã ñược Hội ñồng chuyên ngành thông qua. Ngày … tháng … năm 2008 TRƯỞNG PHÒNG ðT – SðH NGÀNH TRƯỞNG KHOA QL Hoïc vieân Hoaøng Töôøng Vi 4 TÓM TẮT Một trong những khuynh hướng hiện nay trong ngành thủy sản là sử dụng chế phẩm sinh học ñể góp phần gia tăng sản lượng, chất lượng ñồng thời tạo sự phát triển bền vững với ñối với môi trường. Trong các chế phẩm sinh học yêu cầu bắt buộc là phải ñịnh danh chính xác các lòai vi sinh vật và ñầy ñủ hàm lượng ñể mang lại kết quả tốt nhất ñối với người sử dụng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xây dựng quá trình kiểm tra chất lượng chế phẩm sinh học trong thủy sản có Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis bằng phương pháp sinh học phân tử và phương pháp vi sinh. ðối với ñịnh danh, chúng tôi xây dựng quy trình ñịnh danh hai chủng vi khuẩn này bằng kỹ thuật giải trình tự rDNA 16S dựa trên cơ sở vùng rDNA 16S là vùng có tính bảo tồn và ñặc hiệu cao ñối với từng loài. ðối với ñịnh lượng, chúng tôi sử dụng vi sinh kỹ thuật ñịnh lượng gián tiếp khuẩn lạc trên môi trường BA (Bacillus subtilis), BAYK (Lactobacillus acidophilus). Áp dụng quy trình kiểm tra chất lượng này ñể kiểm tra 15 chế phẩm sinh học có Bacillus subtilis và 12 chế phẩm sinh học có Lactobacillus acidophilus, chúng tôi thu ñược kết quả 9/15 chế phẩm có kết quả ñịnh danh chính xác Bacillus subtilis, 8/9 chế phẩm có ñịnh danh Bacillus subtilis không ñạt so với hàm lượng ñã ñăng kí chất lượng; 1/12 chế phẩm sinh học có ñịnh danh là Lactobacillus acidophilus và hàm lượng cũng thấp hơn hàm lượng ñã ñăng kí Hoïc vieân Hoaøng Töôøng Vi 5 ABSTRACT Now one of the trends in aquaculture is using probiotic to increase quantity, quality and protect from the polluted environment in stable development. Probiotic requires the exact identified organism and adequate organism’s quantity to have great influence on aquaculture. In this research, we aimed to build a quality control procedure of aquaculture probiotic having Lactobacillus acidophilus and Bacillus subtilis by bio-molecular method and microbiological method. In terms of identification, we built the procedure based on rDNA 16S sequence analysis because rDNA 16S is a highly conserved region. In expression of enumberation, we used plate counting technic with BA medium (Bacillus subtilis), BAYK medium (Lactobacillus acidophilus). Using this quality control procedure to examine 15 probiotic products having Bacillus subtilis on labels and 12 probiotic products having Lactobacillus acidophilus on labels. We identified Bacillus subtilis in 9/15 products and the number of this species in 8/9 products is not as many as printed on labels. We identified Lactobacillus acidophilus in 1/12 products and the number of this species is less 100 times than printed on the labels. Hoïc vieân Hoaøng Töôøng Vi 6 Mục lục Trang Danh mục bảng ........................................................................................................... Danh mục hình ............................................................................................................ Danh mục chữ viết tắt ................................................................................................. ðẶT VẤN ðỀ ..........................................................................................................1 PHẦN MỘT 1.1. GIỚI THIỆU VỀ PROBIOTIC......................................................................3 1.1.1. Lịch sử của Probiotic .....................................................................................3 1.1.2. Tác dụng của Probiotic .................................................................................3 1.1.2.1. Tác dụng ñối với con người .....................................................................4 1.1.2.2. Tác dụng ñối với ñộng vật........................................................................5 1.1.2.3. Tác dụng ñối với môi trường....................................................................5 1.1.3. Các yêu cầu ñối với vi sinh vật trong probiotic .........................................6 1.1.4. Thực trạng việc sử dụng Probiotic trong hoạt ñộng nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam...................................................................................................6 1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS VÀ BACILLUS SUBTILIS....................................................................................9 1.2.1. Lactobacillus acidophilus ...........................................................................9 1.2.1.1. Lịch sử phát hiện Lactobacillus acidophilus............................................9 1.2.1.2. Phân loại ..................................................................................................9 1.2.1.3. ðặc ñiểm hình thái ................................................................................10 1.2.1.4. ðặc ñiểm sinh hóa .................................................................................10 1.2.1.5. ðiều kiện nuôi cấy .................................................................................10 1.2.1.6. Vai trò của L. acidophilus ......................................................................11 1.2.2. Bacillus subtilis........................................................................................12 1.2.2.1. Phân loại ................................................................................................12 1.2.2.2 ðặc ñiểm hình thái ................................................................................13 1.2.2.3. ðặc ñiểm sinh hóa .................................................................................13 1.2.2.4. ðiều kiện nuôi cấy..................................................................................14 1.2.2.5. Vai trò của B. subtilis .............................................................................14 1.2.2.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis ...............15 Hoïc vieân Hoaøng Töôøng Vi 7 1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP ..........................................................17 1.3.1. Các phương pháp ñịnh danh vi sinh vật ......................................................17 1.3..1.1. ðịnh danh bằng thử nghiệm sinh hóa.....................................................17 1.3..1.2. ðịnh danh bằng phương pháp giải trình tự gen ........................................18 a. Giải trình tự bằng phương pháp hóa học ......................................................18 b. Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy .................................................19 c. Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự ñộng....................................20 1.3.1.3. ðịnh danh bằng phương pháp giải trình tự rDNA 16S ..........................20 1.3.2 Các phương pháp ñịnh lượng vi sinh vật ................................................22 1.3.2.1. Phương pháp ñếm trực tiếp ....................................................................22 1.3.2.2. Phương pháp ñếm khuẩn lạc .................................................................22 1.3.2.3. Phương pháp màng lọc ...........................................................................23 1.3.2.4. Phương pháp MPN (Most Probable Number)........................................23 1.3.2.5. ðịnh lượng vi sinh vật bằng phương pháp ño mật ñộ quang ...............23 PHẦN HAI 2.1. VẬT LIỆU ...................................................................................................25 2.1.1. Mẫu thí nghiệm ............................................................................................25 2.1.2. ðịnh lượng vi sinh vật .................................................................................25 2.1.3. Tạo sản phẩm khuếch ñại .............................................................................25 2.1.3.1. Ly trích DNA vi khuẩn ...........................................................................25 2.1.3.2. Khuếch ñại DNA vi khuẩn và phát hiện sản phẩm..................................26 2.1.4. Giải trình tự sản phẩm khuếch ñại .............................................................27 2.1.4.1. Tinh sạch và kiểm tra sản phẩm...............................................................27 2.1.4.2 Chạy chu trình nhiệt giải trình tự.............................................................27 2.1.4.3 Tủa sản phẩm khuyếch ñại.......................................................................28 2.1.4.4. ðiện di mao quản .....................................................................................28 2.2. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN...................................................................29 2.2.1. Phương pháp xác ñịnh vi khuẩn yếm khí.....................................................29 2.2.2. Phương pháp cấy ñịnh lượng .......................................................................29 2.2.2.1. Pha loãng mẫu theo dãy thập phân ..........................................................29 2.2.2.2. Cấy ñịnh lượng.........................................................................................29 2.2.2.3. ðếm khuẩn lạc .........................................................................................30 2.2.3. Nhuộm gram ...............................................................................................30 2.2.4. Thử nghiệm catalase ...................................................................................31 2.2.5. Tạo sản phẩm khuếch ñại.............................................................................32 Hoïc vieân Hoaøng Töôøng Vi 8 2.2.5.1. 2.2.5.2. 2.2.5.3. 2.2.6. 2.2.6.1. 2.2.6.2. 2.2.6.3. 2.2.6.4. Ly trích DNA vi khuẩn ...........................................................................32 Khuếch ñại DNA vi khuẩn ......................................................................33 ðiện di phát hiện sản phẩm 16S – DNA .................................................35 Giải trình tự sản phẩm...............................................................................36 Tinh sạch sản phẩm..................................................................................37 Phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự..........................................................38 Tủa sản phẩm của phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự............................38 Chạy ñiện di mao quản giải trình tự ........................................................39 PHẦN BA 3.1. KẾT QUẢ KIỂM TRA ðẶC ðIỂM HÌNH THÁI VÀ SINH HÓA HAI CHỦNG B1 VÀ L1: ............................................................................40 3.1.1. B. subtilis B1 .............................................................................................40 3.1.2. L. acidophilus L1 ......................................................................................40 3.2. KẾT QUẢ XÂY DỰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ HAI CHỦNG VI KHUẨN B. SUBTILIS VÀ L. ACIDOPHILUS .....................................41 3.2.1. Ly trích và tạo sản phẩm khuếch ñại rDNA 16S: ........................................41 3.2.2. Tinh sạch sản phẩm PCR 16S......................................................................42 3.2.3. Phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự và tủa DNA .........................................43 3.2.4. ðiện di mao quản và phân tích kết quả........................................................44 3.3. XÂY DỰNG KỸ THUẬT ðỊNH LƯỢNG L.ACIDOPHILUS VÀ B. SUBTILIS TRONG CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG THỦY SẢN..............................................................................................................46 3.3.1. ðối với B. subtilis ........................................................................................46 3.3.2. ðối với L. acidophilus .................................................................................47 3.4. XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ PHƯƠNG PHÁP VI SINH ðỐI VỚI CÁC CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG THỦY SẢN CÓ L. ACIDOPHILUS VÀ B. SUBTILIS...............................48 3.5. Kết quả ứng dụng quy trình kiểm tra chất lượng ñối với các mẫu chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản ...........................................................50 3.5.1. ðối với B. subtilis ......................................................................................50 3.5.1.1. Kết quả ñịnh lượng bằng phương pháp vi sinh ......................................50 3.5.1.2. Kết quả ñịnh danh bằng phương pháp sinh học phân tử .........................51 3.5.2. ðối với L. acidophilus...............................................................................53 3.5.2.1. Kết quả ñịnh lượng bằng phương pháp vi sinh .......................................53 3.5.2.2. Kết quả ñịnh danh bằng phương pháp sinh học phân tử .........................54 Hoïc vieân Hoaøng Töôøng Vi 9 3.6. 3.6.1. a. b. 3.6.2. a. b. BÀN LUẬN ...............................................................................................56 Kết quả ñịnh danh: .....................................................................................57 ðối với B. subtilis:.....................................................................................57 ðối với L. acidophilus...............................................................................59 Kết quả ñịnh lượng ....................................................................................60 ðối với B. subtilis......................................................................................60 ðối với L. acidophilus...............................................................................61 PHẦN BỐN 4.1. KẾT LUẬN ....................................................................................................62 4.2. KIẾN NGHỊ....................................................................................................63 PHẦN NĂM TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT..........................................................64 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH ..........................................................65 Hoïc vieân Hoaøng Töôøng Vi 10 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Kết quả ñịnh danh của 15 mẫu chế phẩm sinh học có ñăng ký chất lượng B. subtilis Bảng 2: Kết quả ñịnh danh 12 mẫu chế phẩm sinh học có ñăng ký chất lượng L. acidophilus Bảng 3: Kết quả ñịnh lượng của 9 mẫu có kết quả ñịnh danh là B. subtilis DANH MỤC HÌNH Hình 1: Kết quả ñịnh danh bẳng sinh hóa Hình 2: Kết quả ñịnh lượng của mẫu V5 và V26 Hình 3: Quy trình kiểm tra chất lượng chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản có B. subtilis Hình 3: Quy trình kiểm tra chất lượng chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản có L. acidophilus Hoïc vieân Hoaøng Töôøng Vi 11 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A : Adenin AOAC : Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thống (Association of Official Analytical Chemists) bp : base pair (cặp base) C : Cytosin CFU : Colony Forming Unit (ñơn vị hình thành khuẩn dATP : 2’ – deoxyadenosin – 5’ – triphosphate dCTP : 2’ – deoxycytidin – 5’ – triphosphate ddNTP : 2’ – dideoxynucleoside – 5’ – triphosphate dGTP : 2’ – deoxyguanosin – 5’ – triphosphate DNA : deoxyribonucleic acid dNTP : 2’ – deoxynucleoside – 5’ – triphosphate DTCS : Dye Terminator Cycle Sequencing dTTP : 2’ – deoxythymidin – 5’ – triphosphate EDTA : ethylendiamin tetra – acetic acid lạc) FDA : Cơ quan quan lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) g : gam G : Guanin ml : mililit mm : milimet Hoïc vieân Hoaøng Töôøng Vi 12 mM : milimol µl : microlit µm : micromet µM : micromol MBS : dung MWS : dung dịch rửa (mambrane wash solution) nm : nanomet NCBI : National Center for Biotechnology Information PCR : polymerase chain reaction rDNA : trình tự DNA mã hoá cho rRNA RNA : ribonucleic acid rpm : vòng trên phút (revolution per minute) S : hệ số lắng SLS : dung dịch tải mẫu (sample loading solution) T : Thymin TAE : Tris – acetic acid – EDTA Taq : Thermus aquaticus TBE : Tris – boric acid – EDTA TE : Tris – EDTA U : Uracil dịch bám màng (membrane binding solution) Hoïc vieân Hoaøng Töôøng Vi 13 ðẶT VẤN ðỀ Ngày nay các chế phẩm sinh học (hay còn gọi là Probiotic) ñược ứng dụng rộng rãi ở rất nhiều lĩnh vực của ñời sống xã hội từ chăm sóc sức khỏe con người ñến chăn nuôi, trồng trọt, xử lý môi trường… Trong ñó ngành nuôi trồng thủy sản là một trong những ngành mà hằng năm tiêu thụ một khối lượng rất lớn các chế phẩm sinh học. Việc sử dụng chế phẩm sinh học trong ngành thủy sản ngoài việc nâng cao chất lượng, gia tăng sản lượng còn tạo ñược sự phát triển bền vững với môi trường sinh thái. Hiện nay, tại nước ta có khoảng hơn 120 loại chế phẩm sinh học ñược cấp phép lưu hành bao gồm chế phẩm trộn vào thức ăn và chế phẩm xử lý nước. Các chế phẩm này chủ yếu do các công ty cung cấp, phân phối, ñại lý cho các công ty nước ngoài hoặc sử dụng công nghệ của nước ngoài ñề sản xuất và phân phối tại Việt Nam. Với rất nhiều loài vi sinh vật hiện có trong các chế phẩm, thì hai chủng Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis có mặt ở hầu hết các sản phẩm.[4] ðối với những chủng vi khuẩn ñược sử dụng làm chế phẩm sinh học thì chúng ta cẩn phải ñịnh danh chinh xác ñến loài. ðể ñịnh danh các vi khuẩn này một cách chính xác ta có thể sử dụng các thử nghiệm sinh hóa. Tuy nhiên cần phải thực hiện hàng loạt các phản ứng sinh hóa cũng như việc biện luận kết quả vô cùng phức tạp, chính vì thế một số công ty dã cho ra ñời các bộ kit ñịnh danh. Tuy nhiên ñối với B. subtilis thì chưa có bộ kit ñịnh danh nào hoàn chỉnh. Còn ñối với L. acidophilus có thể sử dụng bộ kit API 20E nhưng ñây là bộ kit dùng ñể ñịnh danh vi khuẩn kỵ khí gây bệnh nên kết quả ñối với L. acidophilus trong nhiều trường hợp không chính xác. Vì vậy tôi thực hiện nghiên cứu: “Xây dựng quy trình ñịnh danh Lactobacillus acidophilus và Hoïc vieân Hoaøng Töôøng Vi 14 Bacillus subtilis trong chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản bằng kỹ thuật giải trình tự rDNA 16s”. Bên cạnh ñó, chất lượng chế phẩm sinh học còn phụ thuộc vào hàm lượng vi khuẩn có trong chế phẩm. Muốn xác ñịnh ñược chỉ tiêu này thì chỉ có thể thực hiện bằng phương pháp cấy ñịnh lượng. Do thời gian thực hiện luận văn cho phép nên tôi xin ñược thực hiện thêm phần xây dựng quy trình ñịnh lượng Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis trong chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản bằng phương pháp vi sinh”. Với quy trình ñịnh danh và ñịnh lượng ñược thiết lập tôi xin ñề xuất một quy trình kiểm tra chất lượng chế phẩm sinh học có Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis bằng phương pháp vi sinh và sinh học phân tử. Với những lý do như ñã trình bày chúng tôi tiến hành thực hiện ñề tài nghiên cứu với mục tiêu tổng quát là: “Xây dựng quy trình kiểm tra chất lượng chế phẩm sinh học có Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis dùng trong thủy sản bằng phương pháp vi sinh và sinh học phân tử”. MỤC TIÊU CHUYÊN BIỆT CỦA ðỀ TÀI - Xây dựng quy trình ñịnh danh bằng kỹ thuật giải trình tự rDNA 16S ñối với hai chủng Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis. - Xây dựng quy trình ñịnh lượng bằng phương pháp vi sinh - Kết hợp quy trình ñịnh danh bằng kỹ thuật giải trình tự rDNA 16S với phương pháp ñịnh lượng vi sinh vật ñể kiểm tra một số chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản ñang lưu hành trên thị trường. THỜI GIAN – ðỊA ðIỂM THỰC HIỆN - Thời gian tiến hành: từ tháng 1/2008 ñến tháng 7/2008. - ðịa ñiểm: Công ty TNHH-TM-DV Nam Khoa. Hoïc vieân Hoaøng Töôøng Vi 15 Phaàn moät TOÅNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ PROBIOTIC 1.1.1. Lịch sử của Probiotic [12, 13] Hoïc vieân Hoaøng Töôøng Vi 16 Probiotic bắt nguồn từ ngôn ngữ Hy Lạp có nghĩa là vì sự sống (fọr life). Năm 1974, Parker là người ñầu tiên sử dụng thuật ngữ probiotic và ông ñã ñịnh nghĩa:”Probiotic là những vi sinh vật và những chất góp phần vào sự cân bằng hệ vi sinh vật ñường ruột. ðến năm 1980, Yasuda và Taga ñã ñề xuất việc sử dụng probiotic như là một tác nhân kiểm soát sinh học trong nuôi trồng thủy sản. Sau ñó, vào năm 1989, Fuller ñã nghiên cứu và ñịnh nghiã lại dựa trên ñịnh nghĩa trước ñây của Parker về probiotic: probiotic là phần bổ sung vào thực phẩm những vi sinh vật sống tạo ảnh hưởng có lợi lên trên ñộng vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật ñường ruột của vật chủ. Mãi ñến năm 1992, Havenaar và Huis In’t Veld ñã nghiên cứu và ñưa ra một ñịnh nghĩa ñầy ñủ hơn:”probiotic là một hỗn hợp vi khuẩn có thể tồn tại ñược khi ñưa vào cơ thể ñộng vật hoặc con người và tạo nên những tác ñộng có ích trên vật củ bằng cách cải thiện ñặc tính hệ vsv vật chủ.” Vào năm 1998, một ñịnh nghĩa khác cũng ñược Guarner và Schafsma ñưa ra: probiotic là những vi sinh vật sống khi ñược tiêu thụ một lượng thích hợp sẽ tạo nên hiệu quả tốt cho sức khỏe của cơ thể chủ. Tất cả các ñịnh nghĩa trên ñều nhấn mạnh tác dụng của probiotic ñối với việc bảo vệ sức khỏe con người, ñộng vật cũng như môi trường và trong trồng trọt, chăn nuôi. 1.1.2. Tác dụng của Probiotic Ngày nay chế phẩm sinh học ñược ứng dụng rộng rãi ở rất nhiều lĩnh vực của ñời sống xã hội từ chăm sóc sức khỏe con người ñến chăn nuôi, trồng trọt, xử lý môi trường… Các tác dụng của probiotic có thể kể ñến như sau: 1.1.2.1. Tác dụng ñối với con người • Cân bằng hệ vi sinh vật ñường ruột Hoïc vieân Hoaøng Töôøng Vi 17 Probiotic có khả năng ức chế, cạnh tranh với các vi khuẩn có hại trong ruột, làm thay ñổi hệ vi sinh vật nội tại theo hướng có lợi. Khả năng này ñược giải thích nhờ: - Tranh giành vị trí bám trên niêm mạc - Tranh giành thức ăn với những sinh vật khác - Tạo ra môi trường acid, các chất kháng khuẩn, ức chế các vi sinh vật khác. Vì vậy, probiotic ñược sử dụng ñể ñiều trị tiêu chảy do loạn khuẩn ñường ruột. • Tăng cường khả năng tiêu hóa sữa Một số sản phẩm sữa hiện nay bổ sung thêm probiotic do các vi sinh vật probiotic có khả năng sinh ra lactase, số ñơn vị lactase này tùy thuộc từng loại vi khuẩn. Việc bổ sung probiotic sẽ cải thiện dung nạp lactose, tăng cường khả năng tiêu hóa và dung nạp sữa cho người dùng. • Tăng cường khả năng miễn dịch Probiotic kích thích miễn dịch tại chỗ, ñặc biệt kích thích làm tăng số tế bào sản xuất IgA, làm ức chế khả năng ñính, cư trú cũng như khả năng hoạt ñộng và gắn ñộc tố vi khuẩn. • Chống ung thư Có thể do chúng cạnh tranh với các vi khuẩn tạo amin trong ruột, hạn chế sự tạo những sản phẩm ñồng hóa có hại là các chất gây ung thư. • Một số tác dụng khác Làm giảm cholesterol; tăng và cân bằng oestrogen, phòng chống loãng xương; trị viêm khớp, viêm niệu, bệnh nấm Candida… 1.1.2.2. Tác dụng ñối với ñộng vật Hoïc vieân Hoaøng Töôøng Vi 18 Khi probiotic ñược ñưa vào ñường ruột, các vi sinh vật hữu ích trong các chế phẩm có khả năng cân bằng hệ vi sinh vật ñường ruột, ức chế các vi sinh vật có hại hoặc gây bệnh, loại bỏ các quá trình lên men bất lợi do các vi sinh vật có hại gây ra. Từ ñó giúp cho các chức năng của ñường rụôt hoạt ñộng tốt hơn. Ngoài ra, probiotic còn làm tăng cường hệ số tiêu hóa của thức ăn tức là tăng hệ số hấp thu và sử dụng các chất dinh dưỡng trong thức ăn. Probiotic còn giúp ñộng vật tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể. Các probiotic có nhóm vi khuẩn lactic và Bacillus có tác dụng ức chế vi sinh vật gây bệnh như Salmonella, Shigella, Vibrio. Ngaòi ra axit lactic ñược tạo ngoài tác dụng cân bằng hệ vi sinh vật ñường ruột còn là cơ chất dinh dưỡng cho ñộng vật tiêu hóa. Các chất kháng sinh do các vi khuẩn này tạo ra còn có tác dụng ức chế các vi khuẩn gây hại khác. Hiện nay, probiotic sử dụng cho ñộng vật thường ñược dùng theo nhiều cách khác nhau nhưng thtường thấy nhất là trộn vào thức ăn của vật nuôi hoặc phun rắc vào môi trường với dạng bột hoặc dạng dịch. 1.1.2.3. Tác dụng ñối với môi trường [4] Các nhóm vi khuẩn trong probiotic, ñặc biệt là nhóm Bacillus có khả năng sinh các laọi enzyme thủy phân ngoại bào có tác dụng ngăn chặn sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh và phân hủy các chất hữu cơ do thức ăn dư thừa và phân bài tiết từ ñộng vật nuôi ñể làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Ngoài ra, trong các chế phẩm sinh học có sự hiện diện của các nhóm vi khuẩn có khả năng sử dụng các loại cơ chất như H2S, NH3, CO2… làm cơ chất dẫn ñến việc làm giảm thiểu các chất này trong môi trường nuôi. 1.1.3. Các yêu cầu ñối với vi sinh vật trong probiotic Vi sinh vật trong chế phẩm probiotic muốn ñạt ñược hiệu quả mong muốn cần phải ñáp ứng ñúng một số yêu cầu : Hoïc vieân Hoaøng Töôøng Vi 19 - Chủng loại vi sinh vật phải ñược ñịnh danh chính xác. - Chủng loại vi sinh vật cần thiết là vi sinh vật cư trú bình thường ở người, không ñộc, không gây bệnh. - ðủ số lượng ñể trị liệu: thường liều ñiều trị trong một ngày khoảng 108 – 109 tế bào. - Có khả năng tồn tại khi ñi qua dạ dày, nơi có pH thay ñổi từ 1 – 4. - Có khả năng chịu ñựng ñược khi ñi qua ruột non, nơi mà dịch mật toàn phần tiết ra có thể có nồng ñộ cao nhất khoảng 2%. - Có khả năng ñề kháng với một số loại kháng sinh. - Di truyền ổn ñịnh. - Không có khả năng chuyển gen ñề kháng kháng sinh sang những vi sinh vật khác. - Không ñược mang vào cơ thể những vi sinh vật gây bệnh. - Có khả năng cạnh tranh và lấn át với những vi sinh vật gây bệnh và bám vào niêm mạc ñường tiêu hóa. 1.1.4. Thực trạng việc sử dụng Probiotic trong hoạt ñộng nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam [4] Nuôi trồng thủy sản là một trong những ngành nghề sử dụng nguồn tài nguyên thiên nhiên nhiên là dất và nước – hai nhân tố gắn liền với môi trường sinh thái. Vì vậy bên cạnh việc phải nâng cao năng suất, sản lượng tiêu thụ còn phải phát triển một cách bền vững. Những ao hồ nuôi thâm canh có môi trường nước rất phú dưỡng do sử dụng nhiều thức ăn tổng hợp có thành phần ñạm cao 30 – 45%. Do ñó ô nhiễm trong các ao hồ chủ yếu có nguồn gốc từ thức ăn dư thừa, kế ñến là do hoạt ñộng bài tiết của vật nuôi. Khi môi trường nước bị ô nhiễm thì dịch bệnh có cơ hội phát triển. Như vậy, ñể hạn chế dịch bệnh, người nuôi phải dùng thường xuyên chất diệt khuẩn như Clorin, Iodin,…Biện pháp hóa học này ñều có hậu quả nguy hiểm ñối với sức khỏe của vật nuôi và sức khỏe người sử dụng. Khi vật nuôi có dấu hiệu nhiễm bệnh thì người nuôi sử dụng các chất kháng sinh ñể trị bệnh. Hoïc vieân Hoaøng Töôøng Vi 20 Việc lạm dụng chất kháng sinh dẫn ñến sự nhờn thuốc của các vi sinh vật gây bệnh và có thể không kiểm soát ñược dịch bệnh, Ngoài ra việc dùng hóa chất và kháng sinh là một trở ngại ñối với các loại thủy sản xuất khẩu. Chính vì vậy, việc sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản ñể xử lý môi trường là biện pháp tối ưu ñang ñược sử dụng khá phổ biến tại Việt Nam. Chế phẩm sinh học ñược sử dụng có tác dụng ñiều chỉnh hệ vi sinh vật theo hướng hạn chế các vi sinh vật gây bệnh, tăng cường sự phân hủy các chất hữu cơ do thức ăn thừa, do ñộng vật nuôi bài tiết, do xác ñộng thực vật thối rữa … ñể cải thiện môi trường, ñồng thời làm tăng khả năng miễn dịch của vật nuôi với vi sinh vật gây bệnh. Bên cạnh ñó, việc sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản sẽ hạn chế sử dụng hóa chất và kháng sinh tạo ñiều kiện thuận lợi cho ngành thủy sản của nước ta tiến vào thị trường các nước mà không gặp phải rào cản gì. Hiện nay, tại nước ta có khoảng hơn 120 loại chế phẩm sinh học ñược cấp phép lưu hành bao gồm chế phẩm trộn vào thức ăn và chế phẩm xử lý nước. Các chế phẩm này chủ yếu do các công ty cung cấp, phân phối, ñại lý cho các công ty nước ngoài hoặc sử dụng công nghệ của nước ngoài ñề sản xuất và phân phối tại Việt Nam. Mặc dù nhiều công ty tham gia chuyển giao tiến bộ khoa học kỹ thuật ñến người nuôi nhưng do vì mục ñích thương mại ñể có thể thu ñược nhiều lợi nhuận nên các sản phẩm này ña phần không ñáp ứng ñúng với chất lượng ñã công bố. Chưa kể ñến các chế phẩm ngoại nhập hay chủng vi sinh vật từ nước ngoài ñưa vào Việt Nam có phù hợp với ñiều kiện của Việt Nam hay không, tác dụng như thế nào nhưng xét về khía cạnh an toàn sinh học thì việc ñưa các chủng vi sinh vật vào nước ta cũng là một mối nguy hiểm tiềm tàng. Vì vậy yêu cầu cần có một quy trình hoàn thiện ñể kiểm tra chất lượng vi sinh vật có trong các chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản là ñiều cần thiết phải thực hiện trong giai ñoạn hiện nay. Quy trình này cần phải có sự chính xác và mức ñộ tin cậy cao. Hoïc vieân Hoaøng Töôøng Vi