Tài liệu Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp chất liên quan trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn cleistonkinensis a được phân lập từ quả của cây chà chôi

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI BÙI BÍCH PHƢƠNG XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG TẠP CHẤT LIÊN QUAN TRONG NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN CLEISTONKINENSIS A ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ QUẢ CỦA CÂY CHÀ CHÔI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI BÙI BÍCH PHƢƠNG Mã sinh viên: 1301322 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG TẠP CHẤT LIÊN QUAN TRONG NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN CLEISTONKINENSIS A ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ QUẢ CÂY CHÀ CHÔI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. ThS. Nguyễn Lâm Hồng 2. TS. Đoàn Thị Mai Hƣơng Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất 2. Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS. Nguyễn Lâm Hồng - Giảng viên Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất và Ts. Đoàn Thị Mai Hƣơng- Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, những ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn và tạo điều kiện về mọi mặt cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội cũng nhƣ Ths. Lê Công Vinh và các anh chị Phòng tổng hợp hữu cơ, Viện hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua. Cũng nhân đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, những ngƣời đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong suốt năm năm học tập tại trƣờng. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, những ngƣời đã luôn ở bên động viên, cổ vũ và giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành khóa luận này. Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2018 Sinh viên Bùi Bích Phƣơng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 3 1.1. Tổng quan về thực vật của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl. Euphorbiaceae) ............................................................................................................. 3 1.1.1. Vị trí phân loại ............................................................................................... 3 1.1.2. Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) ....................................................................... 3 1.1.3. Chi Cleistanthus .............................................................................................. 3 1.1.4. Loài Cleistanthus tonkinensis ......................................................................... 5 1.2. Sơ lƣợc về hợp chất cleistonkinensis A ............................................................... 6 1.3. Chất chuẩn và quy trình thiết lập chất chuẩn ........................................................ 6 1.3.1. Khái quát về chất chuẩn ................................................................................. 6 1.3.2. Quy trình thiết lập chất chuẩn ........................................................................ 7 1.4. Tổng quan về thẩm định phƣơng pháp định lƣợng tạp chất liên quan ................. 8 1.4.1. Khái niệm ........................................................................................................ 8 1.4.2. Các kỹ thuật phân tích tạp chất liên quan ...................................................... 9 1.4.3. Thẩm định phương pháp xác định tạp chất liên quan. ................................. 11 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 18 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ...................................................................................... 18 2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................................... 18 2.1.2. Hóa chất, dung môi, chất chuẩn ................................................................... 18 2.1.3. Dụng cụ, thiết bị ........................................................................................... 18 2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 19 2.2.1. Xác định hàm lượng tạp chất liên quan và độ tinh khiết sắc ký của cleistonkinensis A bằng HPLC/DAD ...................................................................... 19 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu..................................................................................... 19 2.3.1. Xác định hàm lượng tạp chất liên quan và đôk tinh khiết sắc ký của cleistonkinensis A bằng HPLC/DAD. ..................................................................... 19 2.4. Xử lý kết quả ....................................................................................................... 22 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................... 23 3.1. Xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan và độ tinh khiết sắc ký của cleistonkinensis A bằng HPLC/DAD ........................................................................ 23 3.1.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký .......................................................... 23 3.1.2. Thẩm định phương pháp ............................................................................... 27 3.2. Bàn luận .............................................................................................................. 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 41 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril APG Angiosperm Phylogeny Group ARS ASEAN Reference Standards ASEAN Association of Southeast Asian Nations d Độ chia nhỏ nhất dd Dung dịch DAD Diode Array Detector ĐTK Độ tinh khiết EPCRS European Pharmacopeia Reference Substances GC Gas Chromatography GC-MS Gas Chromatography – Mass Spectrometry HPLC High Performance Liquid Chromatography ICH International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals Human Use ICRS International Chemical Reference Substances IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry LC-MS Liquid Chromatography – Mass Spectrometry LOD Limit of Detection LOQ Limit of Quantitation MeOH Methanol N Số đĩa lý thuyết NIST National Institute of Standards and Technology RS Độ phân giải RSD Relative Standard Deviation of S Diện tích SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng S/N Signal/Noise T Hệ số đối xứng pic TB Trung bình TCCS Tiêu chuẩn cơ sở TLC Thin Layer Chromatography TLQ Tạp liên quan tR Thời gian lƣu USPRS United States Pharmacopeia Reference Substances UV-VIS Ultraviolet - Visible Spectroscopy WHO World Health Organization DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1: Tỷ lệ thu hồi chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) .............. 16 Bảng 1. 2: Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) ......... 17 Bảng 3. 1: Chƣơng trình sắc ký gradient 1.......... ..........................................................23 Bảng 3. 2: Chƣơng trình sắc ký gradient 2 .................................................................... 24 Bảng 3. 3: Kết quả khảo sát chƣơng trình sắc ký .......................................................... 24 Bảng 3. 4: Khảo sát bƣớc sóng ...................................................................................... 26 Bảng 3. 5: Chƣơng trình sắc ký ..................................................................................... 27 Bảng 3. 6: Kết quả độ tinh khiết sắc ký dung dịch Cleistonkinensis A 1000 ppm trong điều kiện chiếu tia UV ................................................................................................... 32 Bảng 3. 7: Kết quả thẩm định độ phù hợp hệ thống ...................................................... 35 Bảng 3. 8: Độ lặp lại tại LOQ........................................................................................ 36 Bảng 3. 9: Kết quả khảo sát độ tuyến tính ..................................................................... 37 Bảng 3. 10: Kết quả thẩm định độ lặp lại ...................................................................... 38 Bảng 3. 11: Kết quả độ ổn định của dung dịch cleistonkinensis A 1000 ppm:............. 39 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THI Hình 1. 1: Tiêu bản cây Cleistanthus tonkinensis ........................................................... 5 Hình 1. 2: Quả của cây Cleistanthus tonkinensis ............................................................ 5 Hình 1. 3: Signal/noise .................................................................................................. 14 Hình 3. 1: Sắc ký đồ khảo sát chƣơng trình sắc ký gradient 1 ...................................... 23 Hình 3. 2: Sắc ký đồ khảo sát chƣơng trình sắc ký gradient 2 ...................................... 24 Hình 3. 3: Phổ hấp thụ UV-VIS của cleistonkinensis A và các tạp chất liên quan ....... 25 Hình 3. 4: Kết quả khảo sát thể tích tiêm ...................................................................... 26 Hình 3. 5: SKĐ của mẫu trắng và dung dịch cleistonkinensis A 1000ppm .................. 29 Hình 3. 6: Độ tinh khiết pic sắc ký dung dịch cleistonkinensis A 1000ppm ................ 29 Hình 3. 7: Phổ 3D của dung dịch cleistonkinensis A 1000 ppm ................................... 29 Hình 3. 8: SKĐ Dung dịch phân giải Cleistonkinensis A - Cleistantoxin ................... 30 Hình 3. 9: Sắc ký đồ dung dịch cleistonkinensis A 1000 ppm phân hủy trong các điều kiện: H2O2 30% và đun cách thủy ở 1000C ................................................................... 30 Hình 3. 10: SKĐ cleistonkinensis A 1000 ppm phân hủy trong điều kiện chiếu tia UV ....................................................................................................................................... 31 Hình 3. 11: Độ tinh khiết pic sắc ký dung dịch cleistonkinensis A 1000ppm trong điều kiện chiếu tia UV ........................................................................................................... 31 Hình 3. 12: Cleistonkinensis A 1000 ppm phân hủy trong H2SO4 0,1 N...................... 32 Hình 3. 13: Cleistonkinensis A phân hủy trong NaOH 0,1 N ....................................... 33 Hình 3. 14: Sắc ký đồ dung dịch cleistonkinensis A 0,05 ppm ..................................... 35 Hình 3. 15: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ .... 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo Tổ chức Y tế Thể giới (WHO), ung thƣ là nguyên nhân dẫn đến tử vong đứng thứ hai trên toàn cầu với 8,8 triệu ngƣời chết trong năm 2015 [22]. Nhiều liệu trình điều trị đã đƣợc áp dụng nhƣ: hóa trị, xạ trị, can thiệp xâm lấn... tuy nhiên kết quả thu đƣợc vẫn chƣa nhƣ mong đợi. Điều đó càng thúc đẩy các nhà khoa học tìm tòi nghiên cứu ra các phƣơng pháp, các loại thuốc mới để chống lại căn bệnh này. Trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam, một hƣớng nghiên cứu đang rất đƣợc quan tâm đó là phát triển các thuốc điều trị ung thƣ có nguồn gốc từ dƣợc liệu. Năm 2009, dự án "Phòng thí nghiệm hợp tác Pháp - Việt, nghiên cứu hóa thực vật của hệ thực vật Việt Nam" đã đƣợc khởi động, dịch chiết ethyl acetat của hơn 2500 loài thực vật ở Việt Nam đã đƣợc đem thử sàng lọc hoạt tính kháng tế bào ung thƣ trên dòng ung thƣ biểu mô KB. Một trong những kết quả nổi bật nhất đó là dịch chiết từ quả của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis) và cây Cách Hoa Đông Dƣơng (Cleistanthus indochinensis) đã cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thƣ biểu mô KB đạt từ 88,40 - 95,17%. Từ dịch chiết này, nhóm nghiên cứu đã phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc đƣợc 9 hợp chất tinh khiết nhóm aryltetralin lignan, trong đó cleistantoxin có hoạt tính ức chế mạnh nhất trên các dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm (KB, MCF7, MCF7R, HT29) với giá trị IC50 trong khoảng 14 - 36 nM (tƣơng đƣơng với khoảng 0,006 - 0,014 μg/ml) [4]. Bên cạnh đó, các hợp chất glycosid của cleistantoxin phân lập đƣợc từ quả của cây Chà chôi có cấu trúc hóa học gần nhƣ tƣơng tự etoposid và teniposid là hai dẫn chất của podophyllotoxin đang đƣợc sử dụng làm thuốc điều trị ung thƣ phổi. Dựa trên các kết quả này, nhóm tác giả đang nghiên cứu chế tạo cao định chuẩn phân đoạn giàu cleistantoxin và các aryltetralin lignan đƣợc chiết xuất từ quả của cây Chà chôi để phát triển thành nguyên liệu làm thuốc điều trị ung thƣ. Nhằm xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao định chuẩn đang đƣợc nghiên cứu điều trị ung thƣ, các chất chuẩn rất cần đƣợc thiết lập để tiến hành định tính và định lƣợng các chất có mặt trong cao, trong đó chất chuẩn cleistonkinensis A đƣợc sử dụng làm dung dịch phân giải khi định lƣợng tạp chất liên quan và độ tinh khiết sắc ký của cleistantoxin trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: "Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp chất liên quan trong 1 nguyên liệu thiết lập chất chuẩn Cleistonkinensis A được phân lập từ quả của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis)” với mục tiêu: - Xây dựn và thẩm định phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan và độ tinh khiết sắc ký của cleistonkinensis A bằng HPLC/DAD. 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về thực vật của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl. Euphorbiaceae) 1.1.1. Vị trí phân loại Theo APG III [18], họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) đƣợc phân loại nhƣ sau: Thực vật có hoa (Angiosperms) Thực vật hai lá mầm thật sự (Eudicots) Nhánh Hoa hồng (Rosids) Bộ Sơ-ri (Malpighiales) Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) 1.1.2. Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae) hay còn gọi là họ Đại Kích là một họ lớn của thực vật có hoa với 240 chi và khoảng 6000 loài. Trƣớc đây chia thành 5 phân họ bao gồm Acalyphoideae, Crotonoideae, Euphorbioideae, Oldfieldioideae và Phyllanthoideae. Ba phân họ đầu tiên là các phân họ một lá mầm trong khi hai phân họ sau là hai lá mầm[19]. Phần lớn là thân cây thảo, ở khu vực nhiệt đới cũng tồn tại các loài cây bụi hoặc cây thân gỗ, phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới [5]. 1.1.3. Chi Cleistanthus 1.1.3.1. Đặc điểm thực vật Cleistanthus (do chữ Latin cleisto, bắt nguồn từ chữ Hy Lạp kleistos: đóng, không mở và anthos: hoa kết hợp thành) đƣợc dịch sang Tiếng Việt là cách hoa hoặc cọc rào. Là cây gỗ nhỏ hay nhỡ, lá mọc so le xếp hai dãy, nguyên. Cụm hoa ở nách lá, thành xim đơn hoặc bông, nhiều hoa hoặc ít hoa; lá bắc thƣờng ngắn hơn hoa; hoa không cuống hoặc có cuống, cùng gốc hoặc khác gốc; đài hợp ở gốc. Hoa đực có 4-6 lá đài, thƣờng là 5, xếp van. Cánh hoa 5 nhỏ, thƣờng nguyên. Đĩa mật phẳng hay lồi. Bầu không lông hoặc có lông nhung. Quả nang có 3 mảnh vỏ tròn ở lƣng; hạt hình trứng - 3 góc [19]. 3 Chi Cleistanthus gồm khoảng 140 loài mọc tự nhiên từ châu Phi, Ấn Độ đến Australia. Ở nƣớc ta, theo sách "Cây cỏ Việt Nam" của tác giả Phạm Hoàng Hộ, chi Cleistanthus có 14 loài, phân bố khắp cả nƣớc, từ Hà Giang tới Phú Quốc [2]. 1.1.3.2. Tình hình nghiên cứu chi Cleistanthus  Trên thế giới Yixi Liu và các cộng sự thuộc trung tâm công nghệ Virginia, Mỹ đã nghiên cứu các hợp chất có tác dụng chống tăng sinh tế bào trong dịch chiết Ethanol của lá Cleistanthus boivinianus đƣợc thu hái từ khu vực rừng khô Madagascar. Trong đó các hợp chất 3α - O - (β - D - glucopyranosyl) desoxypodophyllotoxin; (±) - β apopicropodophyllin và (-) - desoxypodophyllotoxin cho thấy có tác dụng chống tăng sinh dòng tế bào ung thƣ buồng trứng A2780 mạnh, với giá trị IC50 tƣơng ứng là 33,0 ± 3,6; 63,1 ± 6,7 và 230 ± 1 nM [24]. Một nghiên cứu khác trên loài Cleistanthus collius đã đƣợc thực hiện bởi các nhà khoa học Ấn Độ. Phân tích phytochemical đã đƣợc thực hiện để chứng minh sự có mặt của các thành phần nhƣ terpenoids, đƣờng, steroid, flavonoid,... trong lá cây C. collius. Kết quả phân tích GC-MS dịch chiết aceton cho thấy sự có mặt của hợp chất mới dioctyl phthalat (cleistanthin A và cleistanthin B), chƣa đƣợc phân lập trƣớc đó. Dioctyl phthalat thể hiện khả năng liên kết với thụ thể p53 (còn đƣợc gọi là protein 53 hoặc protein khối u 53), là một loại protein ức chế khối u ở ngƣời đƣợc mã hóa bởi gen TP53 [16]. Trong đó, cleistanthin B đã đƣợc chứng minh có tác dụng chống ung thƣ trên dòng tế bào biểu mô và bạch huyết trên cơ thê chuột bạch Thụy Sĩ [20]. Các nghiên cứu trên chi Cleistanthus đã mở ra hƣớng nghiên cứu và phát triển dịch chiết thành cao định chuẩn làm thuốc điều trị ung thƣ có nguồn gốc tự nhiên.  Ở Việt Nam Một số cây thuộc chi cleistanthus: C.indokinensis, C.tonkinensis, C.eberhardtii là các loài đặc thù ở Việt Nam. Các hợp chất đƣợc phân lập từ các cây thuộc chi Cleistanthus có thể đƣợc phân loại nhƣ sau: Các hợp chất lignan, các hợp chất terpen và một vài hợp chất khác. Năm 2012, Trịnh Thị Thanh Vân và cộng sự đã tiến hành phân lập dịch chiết quả của cây Cách Hoa Đông Dƣơng (Cleistanthus indokinensis) và xác định đƣợc cấu trúc 4 của 11 hợp chất, trong đó có 9 hợp chất mới là: cleistantoxin, demethoxycleistantoxin, podocleistantoxin, cleindosid A, cleindosid B, cleindosid C, cleindosid D, cleindosid E, cleindosid F, và hai hợp chất đã biết là axit gallic và amentoflavon. Trong đó cleistantoxin có hoạt tính ức chế mạnh nhất trên các dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm (KB, MCF7, MCF7R, HT29) với giá trị IC50 trong khoảng 14 - 36 nM. Vì thế, dịch chiết từ quả cây thuộc chi cleistanthus đang đƣợc nghiên cứu, phát triển thành cao định chuẩn chứa hàm lƣợng cleistantoxin trên 50% làm nguyên liệu thuốc điều trị ung thƣ trong pha tiền lâm sàng [4]. 1.1.4. Loài Cleistanthus tonkinensis Hình 1. 1: Tiêu bản cây Cleistanthus tonkinensis Quả xanh Quả chín Hình 1. 2: Quả của cây Cleistanthus tonkinensis 1.1.4.1. Đặc điểm thực vật Loài Cleistanthus tonkinensis có tên Tiếng Việt là Chà chôi, thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), đƣợc miêu tả nhƣ sau: Cây gỗ nhỏ cao 1 - 3 m; nhánh láng, đen. Phiến lá tròn dài, to 7 - 13 x 2 - 5 cm, chót có mũi nhọn, đáy tròn, mỏng, cứng, láng, 5 gân phụ 7 - 8 cặp; cuống 1 cm, lá bẹ 2 - 3 mm. Chùm hoa cao 1 - 1,5 cm; hoa nhỏ, không cọng; cánh hoa 5, to 1 mm, tiểu nhụy 5, nhụy cái lép; hoa cái không cọng, cánh hoa 2 mm, đĩa mật quanh noãn sào có ít lông. Nang (quả) xoan, cao 1,3 cm, nở làm 3 mảnh; hột hoe, cao 7 mm. Cây phân bố ở khu vực rừng trên đá vôi từ Cao Bằng, Lạng Sơn đến Nghệ An, Hà Tĩnh [2]. 1.1.4.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học Từ các kết quả nghiên cứu trên cây Cách hoa đông dƣơng (C.indokinensis) các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu trên cây Chà Chôi (C. tonkinensis). Kết quả cho thấy dịch chiết ethyl acetat của quả cây Chà chôi Cleistanthus tonkinensis thể hiện khả năng ức chế mạnh sự phát triển của tế bào ung thƣ, cụ thể, nó cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thƣ biểu mô KB lên tới 88,40 - 95,17%. Từ cao cồn khô chiết từ quả cây Chà Chôi các nhà khoa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam đã phân lập đƣợc các hợp chất: cleistantoxin, cleisindosid D, cleisindosid A, cleistonkinensis A,.... [4]. 1.2. Sơ lƣợc về hợp chất cleistonkinensis A Cleistonkinensis A là một hợp chất toàn toàn mới, trên thế giới có một số nghiên cứu về các cây thuộc chi Cleistanthus, nhƣng chƣa có nghiên cứu nào công bố về hoạt chất cleistonkinensis A. Sau đây là một số thông tin về hợp chất cleistonkinensis A: Danh pháp IUPAC: (8aR, 9R) - 5(benzo[d][1,3]dioxol - 5 - yl) - 9 - hydroxyl - 10 methoxy - 8a,9 - dihydrofuro[3’,4’:6,7]naphtho[2,3 - d][1,3]dioxol - 6(8H) - one. Công thức phân tử: C21H16O8 Tính chất: Tinh thể rắn, màu trắng. Tan tốt trong dicloromethan, aceton và ACN, kém tan trong MeOH. pKa dự kiến bằng phần mềm ChemBioDraw: 12,934. 1.3. Chất chuẩn và quy trình thiết lập chất chuẩn 1.3.1. Khái quát về chất chuẩn  Khái niệm: Theo Dƣợc điển Việt Nam V [1], chất chuẩn (chất đối chiếu) là chất đồng nhất đã đƣợc xác định là đúng để dùng trong các phép thử đã đƣợc quy định về hóa học, vật lý và sinh học. Trong các phép thử đó, các tính chất của chất đối chiếu đƣợc so sánh với 6 các tính chất của chất cần thử. Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng.  Phân loại chất chuẩn: [23] - Chuẩn gốc: Chất chuẩn đƣợc xác định hoặc thừa nhận rộng rãi là có chất lƣợng đo lƣờng cao nhất và giá trị của nó đƣợc chấp nhận mà không quy chiếu về các chất chuẩn khác của cùng đại lƣợng, trong tình huống cụ thể. Một số chất chuẩn đƣợc coi là chuẩn gốc nhƣ chuẩn Quốc tế (ICRS), chuẩn Dƣợc điển Mỹ (USPRS), chuẩn Dƣợc điển châu Âu (EPCRS), chất chuẩn do Viện Tiêu chuẩn và Công nghệ Quốc gia Mỹ (NIST) thiết lập. Ngoài ra, đối với các hoạt chất mới, chất chuẩn gốc theo TCCS của nhà phát minh cũng đƣợc xếp vào nhóm này. - Chuẩn thứ cấp: Chất chuẩn có giá trị đƣợc xác định bằng cách so sánh với chuẩn gốc của cùng một đại lƣợng. Ví dụ nhƣ chuẩn ASEAN (ARS), chuẩn Dƣợc điển Việt Nam, chuẩn làm việc... 1.3.2. Quy trình thiết lập chất chuẩn Theo hƣớng dẫn của WHO và ASEAN, quy trình thiết lập chất chuẩn gồm các bƣớc cơ bản sau:  Lựa chọn nguyên liệu  Xây dựng quy trình  Đánh giá nguyên liệu  Đóng lọ/ống  Kiểm tra độ đồng nhất của quá trình đóng gói  Đánh giá liên phòng  Tập hợp và xử lý số liệu, hoàn thành hồ sơ  Phê duyệt kết quả  Đóng gói, bảo quản, phân phối  Kiểm tra định kỳ [9],[23]. Tuy nhiên, trong phạm vi của khóa luận này chúng tôi chỉ đề cập chi tiết những nội dung liên quan trực tiếp tới đề tài:  Lựa chọn nguyên liệu: Nguồn nguyên liệu với chất lƣợng tốt có thể đƣợc lựa chọn từ một lô chất có nguồn gốc từ quá trình sản xuất thông thƣờng, nếu độ tinh khiết đạt tiêu chuẩn. Các yêu cầu 7 về độ tinh khiết đối với một chất đối chiếu hóa học phụ thuộc vào mục đích sử dụng của nó. Chất chuẩn sử dụng trong phép thử định lƣợng bắt buộc phải có độ tinh khiết cao; đối với chất chuẩn gốc, hàm lƣợng cần đạt trên 99,5% (tính trên nguyên liệu khan hoặc không chứa các chất dễ bay hơi). Trong khi đó, chất chuẩn sử dụng cho phép thử định tính không đòi hỏi độ tinh khiết quá cao do sự hiện diện của tạp chất ở một hàm lƣợng nhỏ không ảnh hƣởng đáng kể đến kết quả của phép thử. Đối với tạp chuẩn, nguồn nguyên liệu có thể lấy từ các nhà cung ứng thƣơng mại, nếu độ tinh khiết đạt trên 95% (hoặc 90% nếu sử dụng cho TLC) [23].  Xác định tạp chất trong nguyên liệu: Các kỹ thuật phân tích cơ bản nhằm xác định tạp chất trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gồm: - Tạp hữu cơ: sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC/DAD [21],[23] ; sắc ký lỏng khối phổ LC - MS; sắc ký khí khối phổ GC - MS [17] - Tạp vô cơ: Xác định tro sulfat [1],[7]; cắn sau nung [21]; quang phổ nguyên tử, quang phổ phát xạ plasma, huỳnh quang tia X [7],[13]. - Tạp bay hơi: Mất khối lƣợng do làm khô; chuẩn độ Karl Fisher [1],[7],[21],[23]; sắc kí khí GC [1]. 1.4. Tổng quan về thẩm định phƣơng pháp định lƣợng tạp chất liên quan 1.4.1. Khái niệm Tạp chất là bất kỳ thành phần nào có mặt cùng với hợp chất chính phát sinh trong quá trình tổng hợp, phân hủy, phát sinh từ dung môi phản ứng, chất xúc tác,... Hợp chất chính bị giảm độ tinh khiết ngay cả khi chứa một chất không có tác dụng dƣợc lý cũng nhƣ độc tính. Một lƣợng dù rất nhỏ tạp chất cũng có thể ảnh hƣởng đến chất lƣợng và độ an toàn của các sản phẩm thuốc [11],[17]. Tạp chất liên quan là tạp chất thu đƣợc từ hợp chất chính và không bao gồm tạp chất từ tá dƣợc, bao gồm các sản phẩm phân hủy, sản phẩm phụ, sản phẩm trung gian trong quá trình tổng hợp hoặc có sẵn trong nguyên liệu ban đầu nhƣ đồng phân đối quang của hoạt chất [8]. 8 1.4.2. Các kỹ thuật phân tích tạp chất liên quan Theo tham khảo các kỹ thuật trong dƣợc điển và một số tài liệu việc định lƣợng tạp chất liên quan có thể thực hiện theo các kỹ thuật sau: - Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC/DAD [7],[21],[23]. - Sắc ký lỏng khối phổ LC - MS [10],[14]. Tuy nhiên trong phạm vi khóa luận chúng tôi chỉ đề cập chi tiết đến phƣơng pháp HPLC/DAD 1.4.2.1. Chuẩn hóa diện tích Phần trăm tạp chất liên quan đƣợc tính theo công thức: ừ % Tạp chất liên quan 100% Đây là phƣơng pháp đơn giản vì không cần phải sử dụng chất chuẩn, thích hợp khi không có chất chuẩn hoặc chất chuẩn không có sẵn. Độ tuyến tính: Do các hàm lƣợng các tạp chất liên quan thƣờng dƣới 1% và hoạt chất trên 95% do đó điều quan trọng là phải có sự tuyến tính từ ngƣỡng nồng độ các chất liên quan (ví dụ, 1%) đến nồng độ của hoạt chất (ví dụ, 95%). Tuy nhiên trong một số trƣờng hợp hình dạng đỉnh của pic chính không cân đối tại nồng độ cao do vậy sẽ không tuyến tính và cho kết quả không chính xác. Nồng độ mẫu (độ nhạy của phƣơng pháp): Để duy trì khoảng nồng độ tuyến tính các nhà khoa học phải giảm nộng độ mẫu để cải thiện hình dạng pic chính. Tuy nhiên nếu nồng độ mẫu quá thấp sẽ ảnh hƣởng đến độ nhạy của phƣơng pháp và khả năng phát hiện tạp nồng độ thấp [8]. 1.4.2.2. Phương pháp pha loãng dung dịch thử Trong phƣơng pháp này cần chuẩn bị một mẫu ở nồng độ cao tƣơng tự phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích và một mẫu khác đƣợc pha loãng từ mẫu có nồng độ cao theo tỷ lệ thích hợp (thƣờng pha loãng theo tỷ lệ tạp liên quan so với hợp chất chính trong mẫu nồng độ cao). Kết quả sau khi phân tích cho thấy, tất cả các tạp chất liên quan đều đƣợc phát hiện trong mẫu có nồng độ cao và trong mẫu nồng độ thấp hầu nhƣ chỉ xuất hiện pic của hợp chất chính ( sau khi pha loãng hàm lƣợng tạp chất liên qua quá nhỏ) 9 Sau khi pha loãng, nồng độ của tạp liên quan ở mẫu nồng độ cao sẽ tỷ lệ với nồng độ của hợp chất chính ở mẫu nồng độ thấp Phƣơng pháp này khắc phục đƣợc nhƣợc điểm của phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích tuy nhiên mẫu phải đƣợc tiêm ít nhất hai lần do đó thời gian phân tích kéo dài hơn và sai sót trong quá trình pha loãng mẫu có thể dẫn đến kết quả không chính xác [8]. 1.4.2.3. Phương pháp sử dụng chất chuẩn tạp Trong kỹ thuật này, nồng độ các tạp chất liên quan đƣợc xác định dựa trên một đƣờng chuẩn. Nồng độ của các tạp chất liên quan đƣợc xác định bởi đáp ứng (diện tích pic của mỗi tạp) với đƣờng cong hiệu chỉnh. Một chất chuẩn đối chiếu của hoạt chất đƣợc sử dụng trong việc hiệu chuẩn. Do đó, cần phải tính đến hệ số hiệu chỉnh nếu đáp ứng của tạp chất liên quan và hoạt chất rất khác nhau. Đƣờng chuẩn một điểm áp dụng khi hệ số chắn trục tung không đáng kể. Nếu không, phải sử dụng đƣờng chuẩn đa điểm. Kỹ thuật này có một số lợi thế so với phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích Thu hẹp phạm vi tuyến tính: Không giống nhƣ chuẩn hóa diện tích và phƣơng pháp pha loãng dung dịch thử, sử dụng đáp ứng của hoạt chất trong mẫu để tính toán, phƣơng pháp chuẩn ngoại sử dụng một đƣờng chuẩn. Thông thƣờng phạm vi nồng độ của đƣờng cong hiệu chuẩn tƣơng đƣơng nồng độ các tạp chất liên quan trong mẫu (ví dụ 1% đến 5% nồng độ mẫu danh nghĩa). Do đó, phƣơng pháp này chỉ yêu cầu dải tuyến tính nhỏ. Cải thiện độ nhạy của phương pháp. Trong cách tiếp cận này, chỉ tính riêng đáp ứng của các tạp chất liên quan riêng lẻ. Vì diện tích pic hoạt chất trong mẫu tiêm không cần thiết cho việc tính toán nên có thể sử dụng nồng độ mẫu cao mà không lo lắng về đáp ứng ngoài khoảng tuyến tính của hoạt chất. Cách tiếp cận này đặc biệt hữu ích khi các nhà khoa học muốn cải thiện độ nhạy của phƣơng pháp bằng cách tăng nồng độ mẫu Một trong những hạn chế của phƣơng pháp chuẩn ngoại là cần thiết phải có một chất chuẩn đối chiếu tốt. Thêm vào đó, mỗi phép phân tích đòi hỏi phải cân chính xác một lƣợng nhỏ (ví dụ, 10 mg) chất chuẩn đối chiếu. Do đó, sai sót khi cân có thể ảnh hƣởng đến độ đúng và độ chính xác của phƣơng pháp [8]. 10 Một điểm lƣu ý khi thu thấp dữ liệu là phải có một ngƣỡng giá trị mà khi diện tích pic dƣới giá trị này sẽ bỏ qua. Mức "bỏ qua" thƣờng bằng 0,1% hoặc 0,05% chất đang đƣợc kiểm tra [21],[23]. 1.4.3. Thẩm định phương pháp xác định tạp chất liên quan. 1.4.3.1. Độ đặc hiệu/chọn lọc  Khái niệm: Độ chọn lọc của phƣơng pháp phân tích đƣợc định nghĩa là mức độ mà một phƣơng pháp có thể định lƣợng đƣợc chất phân tích trong sự có mặt của các thành phần khác. Các thành phần khác có thể có mặt bao gồm tạp chất, chất phân hủy, nền mẫu,... Thuật ngữ tính đặc hiệu và tính chọn lọc thƣờng đƣợc sử dụng thay thế cho nhau. Thuật ngữ độ đặc hiệu đƣợc dùng khi nói đến một phƣơng pháp chỉ tạo ra đáp ứng với một chất phân tích duy nhất, trong khi thuật ngữ chọn lọc đề cập đến một phƣơng pháp tạo ra đáp ứng cho một số thực thể hóa học có thể hoặc không thể phân biệt đƣợc với nhau [8],[12].  Cách tiến hành: - Tiến hành sắc ký mẫu trắng và mẫu thử - Mẫu đƣợc chuẩn bị trong các điều kiện khắc nghiệt nhƣ nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, thủy phân trong acid/base và quá trình oxy hóa,… sau đó đƣợc tiến hành sắc ký [8].  Yêu cầu: Độ chọn lọc của phƣơng pháp có thể đƣợc đánh giá bằng cách kiểm tra độ tinh khiết pic. Một pic đƣợc gọi là tinh khiết nếu pic đó không lẫn bất kỳ thành phần mẫu nào khác, đƣợc phản ánh thông qua hệ số purity factor. Giá trị purity factor phải 990,00. 1.4.3.2. Độ phù hợp hệ thống  Cách tiến hành - Tiêm lặp lại 06 lần dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn. - Ghi nhận SKĐ và xác định các giá trị thời gian lƣu, diện tích, hệ số đối xứng của pic và số đĩa lý thuyết của cột. Tính RSD (%) của thời gian lƣu và diện tích pic. RSD% = ̅ √ ∑ 11 ̅