BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
PHẠM THỊ PHƯƠNG DUNG
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ
CAO KHÔ VÀ PHÂN LẬP PUERARIN
TỪ SẮN DÂY
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
HÀ NỘI - 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
PHẠM THỊ PHƯƠNG DUNG
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ
CAO KHÔ VÀ PHÂN LẬP PUERARIN
TỪ SẮN DÂY
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
C
Y
G À
C
G G
D
C
BÀO C Ế THUỐC
Ố: 60720402
gười hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Văn Hân
HÀ NỘI – 2014
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân
thành tới thầy giáo TS. Nguyễn Văn Hân, là người đã tận tình hướng dẫn và
giúp đỡ tôi nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô và anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Công
nghiệp Dược đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi về mọi mặt trong quá trình
nghiên cứu hoàn thành luận văn.
Tôi cũng xin gửi tới Ban giám hiệu, phòng đào tạo sau đại học, các thầy
cô giáo trường Đại học Dược
à
ội lòng biết ơn về sự quan tâm, giúp đỡ
trong thời gian học tập và nghiên cứu tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã
động viên, hỗ trợ tôi trong suốt thời gian qua.
à ội, tháng 07 năm 2014
ọc viên
Phạm Thị Phương Dung
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HI U, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤ ĐỀ.............................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN .........................................................................................2
1.1.
Vài nét về cây sắn dây .................................................................................2
1.1.1.
Đặc điểm thực vật và phân bố của cây sắn dây .....................................2
1.1.2.
Thành phần hóa học của rễ củ sắn dây ..................................................2
1.1.3.
Tác dụng dược lý ....................................................................................4
1.1.4.
Công dụng ...............................................................................................6
1.1.5.
Các nghiên cứu chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây ................................6
1.2.
Puerarin ......................................................................................................12
1.2.1.
Công thức hóa học ................................................................................12
1.2.2.
Tính chất lý hóa ....................................................................................12
1.2.3.
Kỹ thuật phân tích .................................................................................13
1.2.4.
Tác dụng sinh học của puerarin ...........................................................15
1.2.5.
Các nghiên cứu tinh chế puerarin hiện nay..........................................19
1.3.
Cao thuốc ....................................................................................................20
1.3.1.
Khái niệm ..............................................................................................20
1.3.2.
Phân loại ...............................................................................................20
1.3.3.
Kỹ thuật điều chế ..................................................................................21
1.3.4.
Các chỉ tiêu chất lượng của cao thuốc .................................................22
Chương 2. NGUYÊN VẬT LI U, TRANG THIẾT BỊ VÀ
Ơ G
Á
NGHIÊN CỨU ..........................................................................................................23
2.1.
Nguyên vật liệu, thiết bị ............................................................................23
2.1.1.
Nguyên liệu ...........................................................................................23
2.1.2.
Dụng cụ .................................................................................................23
2.1.3.
Phương tiện và máy móc.......................................................................23
2.2.
Nội dung nghiên cứu..................................................................................24
2.2.1.
Chiết xuất isoflavonoid từ nguyên liệu khô ..........................................24
2.2.2.
Chiết xuất isoflavonoid từ nguyên liệu tươi..........................................24
2.2.3.
Điều chế cao khô...................................................................................25
2.2.4.
Phân lập puerarin và daidzin ...............................................................25
2.3.
Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................25
2.3.1.
Phương pháp định lượng isoflavonoid toàn phần và puerarin ............25
2.3.2.
Phương pháp định tính các isoflavonoid bằng sắc ký lớp mỏng ..........29
2.3.3.
Phương pháp chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây khô ...........................30
2.3.4.
Phương pháp chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi ..................................30
2.3.5.
Phương pháp tinh chế dịch chiết sắn dây tươi .....................................31
2.3.6.
Phương pháp điều chế cao khô.............................................................32
2.3.7.
Phương pháp phân lập puerarin và daidzin .........................................35
2.3.8.
Phương pháp xác định cấu trúc puerarin và daidzin ...........................35
2.3.9.
Phương pháp xác định khối lượng cắn trong dịch chiết ......................35
2.3.10. Phương pháp xác định mất khối lượng do làm khô ..............................36
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU....................................................................37
3.1.
Định lượng isoflavonoid toàn phần trong nguyên liệu ...........................37
3.1.1.
Đường chuẩn isoflavonoid ..................................................................37
3.1.2.
Định lượng isoflavonoid trong nguyên liệu .......................................38
3.2.
Định lượng puerarin trong nguyên liệu...................................................39
3.3.
Chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây khô ...................................................40
3.3.1.
Khảo sát các dung môi chiết .................................................................40
3.3.2.
Tinh chế dịch chiết sắn dây khô ............................................................44
3.4.
Chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây tươi ...................................................45
3.4.1.
Chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi ........................................................45
3.4.2.
Tinh chế dịch chiết sắn dây tươi ...........................................................46
3.5.
Điều chế cao khô từ dịch chiết sắn dây tươi ............................................47
3.6.
Phân lập puerarin và daidzin ...................................................................49
3.6.1.
Phân lập daidzin ...................................................................................49
3.6.2.
Phân lập puerarin .................................................................................53
3.6.2.1. Tiến hành ..............................................................................................53
Chương 4. BÀ L ẬN ............................................................................................57
4.1.
Về nguyên liệu chiết xuất isoflavonoid ....................................................57
4.2.
Về phương pháp bào chế cao khô ............................................................57
4.3.
Về phương pháp phân lập puerarin và daidzin ......................................58
KẾT LUẬ VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................................60
KẾT LUẬN ...........................................................................................................60
ĐỀ XUẤT..............................................................................................................61
TÀI LI
Ụ LỤC
T A
K ẢO
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
AMPK
:
5'-adenosine monophosphat-activated protein kinase
ATP
:
Adenosine triphosphat
CV
:
Coefficient of variation
( ệ số phân tán)
DEPT
:
Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
DĐV
:
Dược điển Việt am
ESI – MS
:
ElectroSpray Ionization - Mass spectrometry
(Khối phổ - Ion hóa bằng phương pháp phun mù điện tử)
GOT
:
Glutamic oxaloacetic transaminase
HDL
:
High-density lipoprotein
HPLC
:
High Performance Liquid Chromatography
( ắc ký lỏng hiệu năng cao)
HSCCC
:
High Speed Counter Current Chromatography
( ắc ký ngược dòng tốc độ cao)
IL
:
Interleukin
IR
:
Infrared
( ồng ngoại)
LDL
:
Low-density lipoprotein
LPS
:
Lipopolysaccharid
mTOR
:
mammalian Target of Rapamycin
(Đích tác dụng trên động vật có vú của Rapamycin)
MAPK
:
Mitogen-activated-protein-kinase
NMR
:
Nuclear magnetic resonanc
(Cộng hưởng từ hạt nhân)
1
H-NMR
13
C-NMR
:
hổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
:
hổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13
PG
:
Pueraria glycosid
RSD
:
Relative standard deviation
(Độ lệch chuẩn)
TLC
:
Thin Layer Chromatography
( ắc ký bản mỏng)
TNF
:
Tumor necrosis factors
(Yếu tố hoại tử khối u)
UV
:
Ultraviolet
(Tử ngoại)
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng 1.1. Công thức cấu tạo của một số isoflavonoid thường gặp trong sắn dây ......3
Bảng 1.2. o sánh ba phương pháp chiết xuất sắn dây thường dùng..........................9
Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng ......................................................................................23
Bảng 3.1. Mật độ quang của dãy dung dịch chất đối chiếu tại bước sóng 250 nm. .37
Bảng 3.2. Kết quả định lượng isoflavonoid trong nguyên liệu .................................39
Bảng 3.3. Diện tích pic sắc ký của dãy dung dịch chuẩn ..........................................39
Bảng 3.4. àm lượng puerarin trong nguyên liệu thu mua ở Phú Thọ.....................40
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát các dung môi ethanol có nồng độ khác nhau ................41
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát chiết isoflavonoid từ sắn dây khô bằng dung môi nước
...................................................................................................................................43
Bảng 3.7. Kết quả tinh chế dịch chiết sắn dây khô ...................................................44
Bảng 3.8. Kết quả chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi ...............................................45
Bảng 3.9. Hiệu suất và hàm lượng cao đặc sau tinh chế (thu được từ 500 ml dịch
chiết, tương ứng khoảng 150 g dược liệu) ................................................................46
Bảng 3.10. Dịch tinh chế đem vào phun sấy .............................................................47
Bảng 3.11. Một số chỉ tiêu chất lượng của cao khô phun sấy...................................48
Bảng 3.12. Kết quả đo phổ hồng ngoại của daidzin .................................................51
Bảng 3.13. Kết quả đo phổ khối lượng (ESI-MS) của daidzin .................................52
Bảng 3.14. Kết quả đo phổ NMR của daidzin ..........................................................52
Bảng 3.15. Kết quả đo phổ hồng ngoại của puerarin ................................................54
Bảng 3.16. Kết quả đo phổ khối lượng (ESI-MS) của puerarin ...............................54
Bảng 3.17. Kết quả đo phổ NMR của puerarin .........................................................55
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ình 1.1. Sắn dây ........................................................................................................2
ình 2.1. ơ đồ chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi ...................................................31
ình 2.2. Quy trình điều chế cao khô .......................................................................34
Hình 3.1. Phổ UV-VIS của dung dịch chất đối chiếu ...............................................37
ình 3.2. Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ puerarin và mật độ
quang .........................................................................................................................38
ình 3.3. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ puerarin và diện tích pic
sắc ký .........................................................................................................................40
ình 3.4. Biểu đồ so sánh lượng isoflavonoid chiết được bởi các dung môi ethanol
có nồng độ khác nhau. ...............................................................................................42
ình 3.5. Bột cao khô phun sấy ................................................................................48
ình 3.6. ình ảnh sắc ký lớp mỏng dưới đèn tử ngoại 254 nm của dịch chiết .......49
ình 3.7. Quy trình phân lập daidzin và puerarin .....................................................50
Hình 3.8. Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dưới đèn tử ngoại 254nm của daidzin ...........51
ình 3.9. Công thức cấu tạo của daidzin ..................................................................52
Hình 3.10. Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dưới đèn tử ngoại 254nm của puerarin ........53
ình 3.11. Công thức cấu tạo của puerarin ...............................................................55
ĐẶT VẤN ĐỀ
Sắn dây từ lâu đã được sử dụng trong dân gian. Theo y học cổ truyền, rễ sắn
dây là một vị thuốc mát, có tác dụng giải nhiệt, sinh tân, chống khát, làm ra mồ hôi,
dễ tiêu, chỉ tả, chữa các chứng sốt nóng, nhức đầu, mẩn ngứa, rôm sảy, viêm ruột,
đau dạ dày... Gần đây trên thế giới đã có khá nhiều công trình khoa học chứng minh
tác dụng của dịch chiết rễ sắn dây: chữa đau đầu [34], chống oxy hóa [9], [13], giải
rượu [23]. Thành phần isoflavonoid trong rễ được cho là chất có tác dụng. Trong số
các isoflavonoid sắn dây, puerarin là chất có hàm lượng lớn và được cho là thành
phần có tác dụng chủ đạo. Hiện nay ở Trung Quốc puerarin đã được chiết xuất và
phân lập thành công từ rễ sắn dây phục vụ cho cho việc bào chế các dạng thuốc quy
ước (viên nén, viên nang, thuốc tiêm) để chữa bệnh.
Tại Việt Nam, sắn dây được trồng khá phổ biến nhưng chủ yếu nhằm chế
tinh bột. Vai trò của sắn dây trong chiết xuất isoflavonoid chưa được quan tâm đầy
đủ. Hiện nay, isoflavonoid nguyên liệu và puerarin vẫn phải nhập chủ yếu từ Trung
Quốc với giá thành cao. Vì vậy nếu có thể nghiên cứu chiết xuất thành công
isoflavonoid và puerarin từ rễ củ sắn dây song song với việc chế tinh bột có thể giúp
chủ động về nguồn nguyên liệu isoflavonoid cũng như puerarin trong sản xuất và
tận dụng được phế phẩm của quá trình sản xuất tinh bột sắn.
Nhằm góp phần tìm ra phương pháp chiết xuất isoflavonoid từ rễ sắn dây
phù hợp với điều kiện thực tiễn ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Xây dựng phương pháp điều chế cao khô và phân lập puerarin từ sắn dây”
với hai mục tiêu chính sau:
1.
Xây dựng quy trình điều chế cao khô phun sấy từ rễ củ sắn dây.
2.
Phân lập được puerarin từ rễ củ sắn dây.
1
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về cây sắn dây
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố của cây sắn dây
Sắn dây có tên khoa học là Pueraria thomsonii
Benth., họ Đậu – Fabaceae. Một số tài liệu Trung Quốc
ghi loài Pueraria lobata (Willd.) Ohwi hoặc P.
pseudohirsuta Tang et Wang [3]. Dược điển Trung Quốc
ghi nhận cả hai loài Pueraria lobata và Pueraria
thomsonii [32].
Sắn dây là một loại dây leo, dài có thể đến 10m, lá
kép gồm ba lá chét. Cuống lá chét giữa dài, cuống lá chét
ình 1.1. ắn dây
hai bên ngắn. Lá chét có thể phân thành 2-3 thùy. Về mùa
hạ trổ hoa màu xanh tím, mọc thành chùm ở kẽ lá. Quả loại đậu có nhiều lông. Củ
dài to nặng có thể tới 20kg, nhiều xơ.
Muốn trồng người ta đào các hố sâu 50cm, đổ rác và mùn rồi lấp đất xốp lại.
Đến tháng 1-2 giâm cành vào các hố đó.
hiều nơi ở nước ta thường kết hợp làm
giàn lấy bóng mát. Cũng có những vùng chuyên trồng để chế tinh bột ví dụ làng
Cao Xá thuộc huyện Châu Thành, tỉnh Tây Ninh mỗi năm sản xuất khoảng 20 tấn
tinh bột [3].
Rễ củ thu hoạch từ tháng 10 đến tháng 3-4 năm sau. Ở Trung Quốc, người ta
thường thu hoạch sắn dây vào mùa thu và mùa đông [32]. Để chế vị Cát Căn thì rửa
sạch, bóc bỏ lớp vỏ dày bên ngoài, cắt thành khúc dài 10-15 cm. Nếu củ to thì bổ
dọc để có những thanh dày khoảng 1cm, sau đó xông diêm sinh rồi phơi hoặc sấy
khô. Loại trắng ít xơ là loại tốt. Muốn chế tinh bột sắn dây thì bóc vỏ, đem giã nhỏ
hoặc mài trên tấm sắt tây có đục thủng lỗ, hoặc xay bằng máy, cho thêm nước rồi
nhào lọc qua rây thưa, loại bã, sau đó lọc lại 1 lần nữa qua rây dày hơn, để lắng gạn
lấy tinh bột rồi đem phơi hoặc sấy khô [3].
1.1.2. Thành phần hóa học của rễ củ sắn dây
Rễ củ các loài ueraria đều chứa tinh bột, tỷ lệ khoảng 12-15% theo tươi [3]
đến 40% theo khô [4]. Ngoài ra còn có saponin [4], [20] và các flavonoid thuộc
2
nhóm isoflavonoid. Từ loài Pueraria lobata người ta đã phân lập được các
isoflavonoid sau puerarin (1), daidzin (2), daidzein (3), formonetin (4).
ăm 1987
các nhà nghiên cứu Nhật đã phát hiện thêm 13 chất mới, trong đó có genistein và
các glycosid của daidzein, genistein [20]. Các nghiên cứu sau này đều chỉ ra rằng
puerarin, daidzin, daidzein, genistein và genistin là các isoflavonoid chiếm tỷ lệ lớn
trong rễ củ các loài sắn dây, và cho các tác dụng sinh học đáng chú ý [46], [11],
[37].
R3
R2O
O
R1
O
R4
R1
R2
R3
R4
Puerarin
H
H
Glu
OH
Daidzin
H
Glu
H
OH
Daidzein
H
H
H
OH
Genistein
OH
H
H
OH
Genistin
OH
Glu
H
OH
Bảng 1.1. Công thức cấu tạo của một số isoflavonoid thường gặp trong sắn dây
Tính đến thời điểm hiện tại, người ta đã tìm ra khoảng 52 flavone từ các loài
Pueraria [44]. Trong đó Pueraria lobata là loài có hàm lượng flavones cao nhất và
có nhiều flavones được phân lập nhất (36 chất) [44].
àm lượng isoflavone trong rễ củ sắn dây phụ thuộc nhiều vào loài, vùng
trồng trọt [44] và thời gian thu hái [11].
àm lượng flavone trung bình ở loài
Pueraria lobata là 7,42% trong khi hàm lượng flavone trung bình ở loài Pueraria
thomsonii chỉ có 0,93% [44].
àm lượng flavone ở loài Pueraria lobata trồng tại
Shanxi lên tới 10,4% trong khi hàm lượng này khi trồng tại Jiangxi chỉ đạt 3,3%
[44]. Tuổi và thời gian thu hái cũng là yếu tố ảnh hưởng đáng kể tới hàm lượng
isoflavone của loài Pueraria lobata trồng tại Huoshan. Rễ củ 3 năm tuổi thu hái vào
khoảng tháng Giêng sẽ cho nồng độ isoflavone cao nhất, đạt 7,26%. Tuổi cao hơn
3
hoặc thời gian thu hái trước tháng Giêng đều làm giảm nồng độ isoflavone của sắn
dây [11].
1.1.3. Tác dụng dược lý
1.1.3.1. Tác dụng trên tim mạch
Thử nghiệm tác dụng trên chó bằng cách tiêm flavon toàn phần của sắn dây
cho thấy có tác dụng giãn động mạch vành đồng thời giảm lượng tiêu thụ oxy của
cơ tim và giảm sức kháng mạch vành. Trên chó đã dùng reserpin trước đó để làm
tiêu kiệt hết lượng catecholamin trong mô tim, dạng isoflavon toàn phần với liều 30
mg/kg và puerain với liều 20 mg/kg có tác dụng làm tăng lưu lượng mạch vành và
giảm sức kháng mạch vành. Những kết quả này giống với kết quả thí nghiệm trên
chó không dùng reserpin. Điều này chứng tỏ hiện tượng làm giãn mạch vành của
sắn dây không liên quan tới catecholamin mà là do tác dụng giãn cơ trực tiếp [8].
1.1.3.2. Tác dụng hạ huyết áp của cao sắn dây
Tiêm tĩnh mạch với liều 5-30 mg trên chó, mèo có tác dụng hạ huyết áp. Cao
sắn dây với liều 750 mg/kg tiêm tĩnh mạch có khả năng đối kháng với tác dụng kích
thích tim của isoprenalin, ngoài ra còn làm giảm nhịp tim và gây hạ huyết áp [8].
1.1.3.3. Tác dụng chống loạn nhịp tim
So sánh tác dụng chống loạn nhịp tim của puerarin, daidzein và dạng chiết
cồn từ sắn dây trên chuột cống trắng và chuột nhắt trắng cho thấy tác dụng của
daidzein tương đối mạnh, cho hiệu quả rõ rệt. Dạng chiết cồn có tác dụng giống với
daidzein; điều này chứng tỏ daidzein là thành phần chủ yếu có tác dụng chống loạn
nhịp tim. Puerarin với liều tương đương có tác dụng kháng rõ rệt với loạn nhịp tim
do aconitin và bari clorid gây nên, giảm nhẹ mức độ loạn nhịp do thiếu máu cơ tim,
tác dụng đối kháng với rung thất không bằng daidzein [8].
1.1.3.4. Tác dụng đối với tuần hoàn não
Thử nghiệm trên chó gây mê, flavon toàn phần của sắn dây bằng đường tiêm
động mạch cảnh với liều 0,1-5,0 mg/kg làm lưu lượng máu qua não tăng 87,7134%, nếu cho thuốc bằng đường tiêm tĩnh mạch flavon toàn phần với liều 10-30
mg/kg chỉ làm lưu lượng máu qua não tăng 20%. Trên bệnh nhân cao huyết áp,
4
flavon toàn phần tiêm bắp với liều 200 mg giúp cái thiện tuần hoàn não cho 53%
bệnh nhân, làm giảm trợ lực mạch máu não [8].
1.1.3.5. Tác dụng đối với hệ thần kinh
Dịch chiết sắn dây với liều 2 g/kg cho thẳng vào dạ dày trên thỏ gây sốt bằng
vaccin thương hàn có tác dụng hạ nhiệt, bột sắn dây có tác dụng tương tự. ước sắn
dây với liều 6 g/kg cho thẳng vào dạ dày trên chuột nhắt trắng, có tác dụng cải thiện
hiện tượng trí nhớ bị tổn thương do scopolamin gây nên [8].
1.1.3.6. Tác dụng đối với cơ trơn
Trong các dịch chiết bằng aceton, methanol và nước từ sắn dây thì dạng
PA3, PA4 có tác dụng ức chế co bóp hồi tràng cô lập chuột lang kiểu papaverin,
dạng PM1, PM3 lại có tác dụng gây co thắt. Daidzein có tác dụng giải co thắt đối
với ruột non đã cô lập của chuột nhắt trắng, tác dụng này bằng khoảng 1/3 tác dụng
của papaverin [8].
1.1.3.7. Tác dung hạ đường huyết và lipid huyết
ước sắc sắn dây với liều 6-8 g/kg cho thẳng vào dạ dày thỏ bình thường có
tác dụng hạ đường huyết nhưng không thể đối kháng với hiện tượng đường huyết
tăng cao do adrenalin gây nên. Puerain với liều 500 mg/kg hoặc dùng liều thấp phối
hợp với aspirin 100 mg/kg dùng liên tục trong 9 ngày qua đường dạ dày, có tác
dụng làm giảm cholesterol huyết thanh của chuột nhắt trắng đã được gây tăng
cholesterol bằng alloxan. Aspirin dùng đơn độc không có tác dụng hạ đường huyết
hay lipid huyết [8].
1.1.3.8. Tác dụng chống ung thư
Dịch chiết cồn từ sắn dây với liều 10 g/kg trên động vật thí nghiệm có tác
dụng ức chế nhất định sự phát triển của tế bào sarcom 180, u báng Ehrlich và tế bào
ung thư phổi Lewis. Daidzein với nồng độ 14µg/ml có tác dụng ức chế sự tăng
trưởng của tế bào ung thư máu HL-60 (promyelocytic leukemia) [8].
1.1.3.9. Tác dụng chống oxy hóa
Thí nghiệm trên chuột gây tiểu đường bằng cách tiêm phúc mạc
streptozotocin. Thí nghiệm sử dụng cao sắn dây chứa khoảng 10,42% puerarin và
một vài chất liên quan, với liều 500 mg/kg, dùng đường uống trong 3 tuần, kết quả
5
cho thấy nồng độ malondialdehyd trong huyết tương-được sử dụng như một dấu
hiệu của chất béo bị oxy hóa, đã giảm xuống mức tương tự như ở chuột khỏe mạnh,
và giống như trong nhóm được điều trị tích cực hàng ngày bằng tocopherol acetat
với liều 50 mg/kg [8],[9].
1.1.3.10. Các tác dụng khác:
Dung dịch puerarin 0,2-1,6% với liều 0,2 ml tiêm dưới da chuột lang theo
dõi phản ứng giác mạc và da cho thấy tác dụng gây mê cục bộ. Thí nghiệm trên
chuột hamster, cao sắn dây có tác dụng chống nghiện rượu, trên chuột cống trắng,
daidzein có tác dụng hạ thấp lượng rượu trong máu và rút ngắn thời gian ngủ do
rượu gây nên. Đối với gan của chuột nhắt trắng gây nhiễm độc bằng CCl4,
isoflavonoid chiết từ cát căn với liều 250 mg/kg có tác dụng ức chế 30,7% hoạt độ
men GOT [8].
Nghiên cứu của Đỗ Thị oa Viên đã chứng minh rằng cao chiết isoflavonoid
từ củ sắn dây Pueraria thomsonii Benth. có hoạt tính nội tiết kiểu estrogen trên
51,5% chuột nhắt trắng cái với liều uống 150 mg/con/ngày. Điều này cho thấy hoạt
tính estrogen của hỗn hợp isoflavonoid chiết xuất từ củ sắn dây là khá rõ rệt [7].
1.1.4. Công dụng
Theo y học cổ truyền, cát căn là một vị thuốc chữa sốt nhức đầu, khát nước,
kiết lỵ, ban sởi. Cát căn đã được ghi vào dược điển Việt Nam. Tinh bột sắn dây pha
với nước thêm đường uống để giải khát [3]. Ngoài ra trong y học cổ truyền còn
dùng hoa của dây sắn dây với tên “Cát hoa” để làm thuốc giã rượu [3].
Theo Dược điển Trung Quốc, sắn dây có tác dụng hạ sốt, kích thích tiết dịch
cơ thể, cầm ỉa chảy. Do vậy, sắn dây được sử dụng để điều trị sốt, đau đầu, khát
nước, tiểu đường, ban sởi, kiết lỵ hoặc ỉa chảy cấp, cứng gáy và đau trong tăng
huyết áp [32].
1.1.5. Các nghiên cứu chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây
1.1.5.1. Chiết kiểu truyền thống
Mặc dù với sự phát triển của khoa học kỹ thuật hiện đại đã có rất nhiều
phương pháp chiết hiệu quả được đưa vào ứng dụng nhưng chiết xuất theo kiểu
6
truyền thống vẫn được nghĩ đến đầu tiên khi nghiên cứu về các dược liệu mới.
Chỉ có hiểu rõ đặc điểm chiết các dược liệu này theo phương pháp hồi lưu đơn
giản mới có thể áp dụng các biện pháp cải tiến để nâng cao hiệu suất cũng như
chất lượng sản phẩm chiết. Cũng vì thế, trong rất nhiều nghiên cứu chiết sắn dây
đã được thực hiện trên thế giới, phương pháp chiết hồi lưu vẫn được các nhà khoa
học quan tâm thực hiện. Mục tiêu của các nghiên cứu này hầu hết là để tìm ra
được loại dung môi, nhiệt độ, thời gian… tối ưu cho việc chiết isoflavonoid từ
sắn dây.
Ngay từ năm 1998, Li Wehong và cộng sự đã xác định được giữa hai dung
môi nước và cồn, dung môi cồn cho hiệu suất chiết cao hơn và dễ tinh chế sản
phẩm hơn. Cũng từ đó, nhóm nguyên cứu đã tìm ra được điều kiện chiết xuất tối
ưu cho sắn dây là chiết bằng ethanol 60% trong 6 giờ ở 60C [25].
Đến năm 2007,
an Jian và cộng sự vẫn tiếp tục nghiên cứu chiết
isoflavonoid từ sắn dây bằng phương pháp truyền thống nhưng sử dụng dung môi
chiết là nước. Mặc dù không phải là một dung môi được đánh giá cao trong nhiều
nghiên cứu song nếu tiến hành theo phương pháp của Han Jian vẫn có thể chiết
được lượng lớn puerarin từ sắn dây. Chiết nước ở điều kiện tối ưu là chiết 2 lần,
mỗi lần với 10 lần thể tích nước, thời gian chiết lần lượt là 1,5 giờ và 1 giờ [14].
Để nâng cao hiệu suất chiết người ta đã tiến hành thay đổi dung môi chiết,
sử dụng hệ dung môi thay vì các dung môi đơn thông thường. Đáng kể đến là
chuỗi nghiên cứu của Hua-Neng Xu và cộng sự. Đầu tiên, nhóm nghiên cứu đã
tìm ra hệ dung môi hai pha n-butanol/nước tỷ lệ 1:1 (v/v) không những dùng
được cho quá trình chiết rắn – lỏng và tinh chế lỏng-lỏng mà còn giúp chiết được
daidzein và isoflavonoid toàn phần với hiệu suất cao hơn nhiều so với dung môi
chiết một pha thông thường [15]. Với hệ dung môi hai pha như trên, daidzein dễ
dàng được tách và tinh chế từ pha n-butanol [15]. uerarin được tinh chế từ phần
pha nước bằng cách điều chỉnh pH và lắc với n-butanol. Quá trình tinh chế tương
đối đơn giản nhưng lại cho ra sản phẩm tinh chế sạch khi phân tích sắc ký [16].
Với những kết quả thu được, các tác giả đã tiến hành tiếp những đánh giá toàn
diện hơn về các yếu tố có thể ảnh hưởng đến quá trình chiết isoflavonoid từ sắn
7
dây bằng hệ dung môi hai pha n-butanol/nước. Cuối cùng, rút ra những kết luận
như sau thành phần của hệ dung môi hai pha và nhiệt độ chiết là những yếu tố
chính ảnh hưởng tới tốc độ và hiệu suất chiết isoflavonoid toàn phần; hệ dung
môi n-butanol/nước với tỷ lệ 1:1 là có hiệu quả hơn cả; hiệu suất chiết và hệ số
phân bố tăng lên ở tất cả các hệ dung môi đã khảo sát khi tăng nhiệt độ; những
kết quả tính toán được từ mô hình là hoàn toàn phù hợp với dữ liệu thực nghiệm
[17].
Tại Việt
am, năm 2009 Dược sĩ Lê Thùy Linh đã nghiên cứu chiết
isoflavonoid từ sắn dây bằng dung môi phân cực theo phương pháp chiết hồi lưu.
Khảo sát ba dung môi chiết là ethanol 90o, methanol và ethyl acetat. Dựa vào tỷ
lệ phần trăm hàm lượng cắn thu được và kết quả định tính isoflavonoid trong dịch
chiết tác giả chọn ethanol 90o là dung môi sử dụng để chiết isoflavonoid từ sắn
dây [5].
1.1.5.2. Chiết dưới áp suất cao
So với phương pháp chiết hồi lưu, chiết dưới áp suất cao cho hiệu suất
chiết cao hơn hẳn. Khi sử dụng cùng dung môi chiết là ethanol 95%, chiết dưới
áp suất cao giúp chiết được lượng puerarin cao gấp 1,8 – 2,4 lần, lượng daidzin
cao gấp 1,4 – 1,8 lần và lượng daidzein cao gấp 2,6 – 3,7 lần so với phương pháp
hồi lưu [31].
gười ta cũng nhận thấy rằng, hiệu suất chiết isoflavonoid phụ thuộc vào
nhiệt độ chiết khi chiết dưới áp suất cao. Hiệu suất chiết tăng khi tăng nhiệt độ
[31].
1.1.5.3. Chiết bằng siêu âm
Khi so sánh phương pháp chiết bằng siêu âm với phương pháp chiết
truyền thống, Yang Hu và cộng sự nhận thấy rằng sử dụng siêu âm có thể rút
ngắn thời gian chiết xuống 20 lần so với phương pháp chiết hồi lưu.
iệu suất
chiết của phương pháp chiết bằng siêu âm đạt 19% sau 20 phút, trong khi hiệu
suất chiết của phương pháp chiết hồi lưu chỉ đạt được 14,3% và 16,5% sau 1 và 2
giờ. Chiết bằng siêu âm đạt được hiệu suất này sau 5 phút. Mặt khác, siêu âm
không làm phân hủy tới các thành phần hoạt chất có trong dịch chiết [45].
8
Cũng trong nghiên cứu này, Yang Hu và cộng sự đã chứng minh rằng,
hiệu suất chiết khi sử dụng siêu âm bị ảnh hưởng bởi dung môi chiết [45], tỷ lệ
dung môi và năng lượng siêu âm [31]. Trong các dung môi chiết nước,
methanol, ethanol và ethyl acetat người ta nhận thấy dung môi chiết tối ưu là
ethanol nước tỷ lệ 7:3. Mặc dù nước là dung môi chiết cho hiệu suất cao nhưng
lại hòa tan nhiều tinh bột trong dịch chiết gây khó khăn cho quá trình lọc, dịch
chiết thu được không trong và cao dẻo dính khó thu hồi [45].
Không chỉ có hiệu quả hơn phương pháp chiết hồi lưu truyền thống, MeiHwa và cộng sự còn chứng minh được rằng, chiết bằng siêu âm còn cho hiệu suất
chiết cao hơn phương pháp chiết dưới áp suất cao [31]. Dưới đây là bảng so sánh
ba phương pháp chiết hồi lưu truyền thống, áp suất cao và siêu âm:
Bảng 1.2. o sánh ba phương pháp chiết xuất sắn dây thường dùng
Yếu tố
Truyền thống
Dưới áp suất cao
Siêu âm
Thời gian chiết
Tốn thời gian
Ngắn (≤ 1 giờ)
Trung bình (1-2h)
Hiệu suất chiết
Thấp
Trung bình hoặc cao
Cao
Dung môi
Tốn kém
Nhiệt độ
Cao hoặc
nhiệt độ phòng
Tốn nhiều
để duy trì áp suất cao
Nhiệt độ cao
áp suất cao
Chi phí
Thấp
Cao
ăm 2007, Xu
Trung bình
Nhiệt độ phòng
Trung bình
uaneng và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu chiết
isoflavonoid từ rễ Pueraria lobata bằng siêu âm (20k z, điện năng đầu vào thay
đổi từ 0-650W). Tác giả nhận thấy điện năng đầu vào và thời gian chiết là các
yếu tố chính ảnh hưởng tới hiệu suất chiết khi sử dụng dung môi chiết là nước, nbutanol, ethanol 96% và ethanol 50%. Dung môi chiết là ethanol 50% và nước
cho hiệu suất chiết cao ethanol 95% và n-butanol. Tốc độ chiết và hiệu suất chiết
tăng lên rõ rệt khi phối hợp thêm siêu âm với tất cả các dung môi chiết kể trên.
ăng lượng điện đầu vào càng lớn trong khoảng 0-650W thì hiệu suất chiết đạt
9
được càng cao. Đồng thời, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng hiệu suất chiết
isoflavonoid toàn phần cao hơn khi sử dụng siêu âm [41].
1.1.5.4. Chiết bằng vi sóng
ăm 2001, Zhenku Guo và cộng sự đã tiến hành chiết isoflavonoid từ sắn
dây bằng vi sóng. Kết quả gây bất ngờ khi thời gian chiết của phương pháp chỉ
kéo dài 1 phút, ngắn hơn rất nhiều so với các phương pháp chiết truyền thống.
Nhóm nghiên cứu cũng nhận thấy rằng dung môi chiết, thời gian chiết, nhiệt độ
và áp suất chiết là những yếu tố ảnh hưởng đáng kể tới hiệu suất chiết của
phương pháp. Trong số các dung môi thử nghiệm, ethanol 70% cho là dung môi
hiệu suất chiết isoflavonoid cao nhất, song để chiết puerarin thì nước lại là dung
môi tốt hơn [47].
Vi sóng không chỉ giúp rút ngắn thời gian chiết mà còn làm cho quá trình cô
cao trở nên nhanh chóng hơn rất nhiều. Yang Hu và cộng sự đã chứng minh được
rằng, sử dụng vi sóng có thể rút ngắn thời gian sấy khô dịch chiết xuống 10 lần
so với phương pháp cất thu hồi dung môi thông thường [45]. ơn nữa, sóng viba
không gây ra những tác động nào làm ảnh hưởng tới cấu trúc và thành phần các
chất trong dịch chiết sắn dây thu được [45].
1.1.5.5. Chiết bằng dung môi siêu tới hạn
Trong những năm gần đây chiết xuất bằng dung môi tới hạn đã được áp dụng
rộng rãi trong thực phẩm và y học. CO2 siêu tới hạn là dung môi chủ yếu được sử
dụng trong phương pháp này.
u điểm của CO2 siêu tới hạn là không độc, không
gây cháy nổ, giá thành rẻ và dễ loại khỏi sản phẩm cuối.
Nghiên cứu chiết puerarin từ rễ củ sắn dây Pueraria lobata, Lingzhao Wang
và cộng sự nhận thấy bốn yếu tố chính ảnh hưởng tới hiệu suất chiết puerarin từ
rễ củ Pueraria lobata là áp suất, nhiệt độ, thời gian chiết và thể tích đồng dung
môi. Ở áp suất 20 Mpa hiệu suất chiết đạt được là 5,8 ± 0,3 mg/g, áp suất cao hơn
và thấp hơn đều làm giảm hiệu suất chiết puerarin. Tương tự như vậy, chiết ở
nhiệt độ 50C sẽ cho hiệu suất chiết cao nhất, nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn đều
làm giảm hiệu suất. Thời gian chiết càng lớn, khả năng chiết kiệt puerarin càng
cao, đặc biệt là trong khoảng thời gian dưới 100 phút. Hiệu suất chiết puerarin
10
- Xem thêm -