Tài liệu Xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng nước dựa vào động vật không xương sống cỡ lớn ở đáy cho hạ lưu hệ thống sông đồng nai

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VIỆN MÔI TRƯỜNG VÀ TÀI NGUYÊN ------------------ PHẠM ANH ĐỨC XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG NƯỚC DỰA VÀO ĐỘNG VẬT KHÔNG XƯƠNG SỐNG CỠ LỚN Ở ĐÁY CHO HẠ LƯU HỆ THỐNG SÔNG ĐỒNG NAI LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT TP. HỒ CHÍ MINH – Năm 2014 1 MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Lưu vực sông Đồng Nai nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, bắt nguồn của hai nhánh Đa Dung và Đa Nhim – Vùng sơn nguyên Đà Lạt đến hết đồng bằng miền Đông Nam Bộ với dân số ước tính khoảng 20 triệu người. Tổng diện tích tự nhiên khoảng 43.450 km2 (không kể phần diện tích thuộc lãnh thổ Campuchia) nằm ở vị trí địa lý: từ 105030'21'' đến 109001'20" kinh độ Đông và từ 10019'55" đến 12020'38" vĩ độ Bắc [29], [45]. Hạ lưu hệ thống sông Đồng Nai (HTSĐN) bao gồm các sông Đồng Nai đoạn từ ngã ba Hiếu Liêm (cửa sông Bé), sông Sài Gòn đoạn từ chân đập Dầu Tiếng, gần như toàn bộ sông Vàm Cỏ Đông và sông Vàm Cỏ Tây, và vùng phụ cận ven biển [25]. Tài nguyên nước đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình phát triển kinh tế - xã hội (KT-XH), bảo vệ môi trường, tạo ra các vùng sinh thái cảnh quan khác nhau trong lưu vực. Tiềm năng kinh tế phần hạ lưu của lưu vực sông Đồng Nai được đánh giá là rất lớn, quyết định đến sự phát triển của nhiều ngành nghề, lĩnh vực – Khu vực có tốc độ phát triển KT-XH mạnh nhất nước. Tuy nhiên, với nhu cầu phát triển hiện nay, chất lượng nước phần hạ lưu HTSĐN đang chịu áp lực ngày càng gia tăng do tiếp nhận lượng rất lớn nước thải sinh hoạt, nước thải sản xuất công nghiệp (SXCN), sản xuất nông nghiệp (SXNN), chất thải đô thị,… với hàm lượng các chất ô nhiễm cao làm giảm đáng kể khả năng tự làm sạch và đe dọa nghiêm trọng nguồn nước. Nhiều kênh, rạch chảy qua trung tâm các đô thị lớn có thể xem là dòng nước thải có màu đen và rất hôi. Kết quả quan trắc của các cơ quan liên quan trong những năm gần đây cho thấy ô nhiễm hữu cơ trên diện rộng, đặc biệt là khu vực hạ lưu. Hàm lượng oxy hòa tan (DO) đo ở hầu hết các vị trí thu mẫu sông Sài Gòn và sông Đồng Nai (bao gồm các khu vực thu nước thô phục vụ cấp nước) không đạt Quy chuẩn kỹ thuật về Chất lượng nước mặt (QCVN 08:2008) – Chất lượng nước loại A1. Đối với những vị trí thu mẫu trên kênh rạch nội thành thành phố Hồ Chí Minh (Tp.HCM) cho thấy mức 2 độ ô nhiễm hữu cơ ở mức rất cao, vượt QCVN – Chất lượng nước loại B1 từ 3 – 15 lần [2]. Ô nhiễm vi sinh ở mức cao, hầu hết các kết quả đo Coliform ở sông Sài Gòn và sông Đồng Nai đều vượt QCVN – Chất lượng nước loại A1 từ 2 – 100 lần, đặc biệt ở các hệ kênh rạch nội thành Tp.HCM (Kênh Tân Hóa – Lò Gốm, Tham Lương – Vàm Thuật, Tàu Hũ – Bến Nghé,…) có khi vượt tiêu chuẩn loại B đến 10.000 lần. Ngay cả những khu vực lấy nước thô phục vụ cấp nước, kết quả đo Coliform cũng vượt QCVN – Chất lượng nước loại A1 từ 2 – 31 lần [2]. Ô nhiễm dầu mỡ ở nhiều khu vực, kết quả đo cho thấy tất cả các vị trí quan trắc đều vượt QCVN – Chất lượng nước loại B1 [2]. Tác động tiềm ẩn của các sự cố tràn dầu ở khu vực Cát Lái, Nhà Bè, Cần Giờ, Vũng Tàu là rất lớn [41]. Ngoài ra, hạ lưu HTSĐN chịu ảnh hưởng mạnh của thủy triều biển Đông, nhiều khu vực bị nhiễm mặn cao và không thể sử dụng cho mục đích cấp nước sinh hoạt và tưới tiêu. Môi trường nước ở nhiều khu vực thuộc huyện Bình Chánh, Củ Chi, Hóc Môn,… nhiễm phèn cao, ảnh hưởng đến nhiều mục đích sử dụng nước [41]. Theo kết quả quan trắc chất lượng môi trường của Chi cục BVMT Tp.HCM năm 2011, chất lượng nước ở các vị trí quan trắc sông Đồng Nai, Sài Gòn và kênh rạch nội thành vẫn chưa được cải thiện rõ nét. Trong khi đó, ô nhiễm dầu mỡ còn có xu hướng tăng [3]. Ngoài ra, các ghi nhận cho thấy tài nguyên nước đang bị khai thác với tốc độ nhanh [25]. Nhằm góp phần quản lý tài nguyên nước và hoàn thiện các phương pháp quan trắc chất lượng môi trường, bên cạnh các phương pháp dựa vào thông số hóa-lý, việc sử dụng sinh vật trong đánh giá chất lượng nước, phục vụ giám sát sức khoẻ sinh thái đang được coi là phương pháp ứng dụng có nhiều ưu điểm. Nếu các thông số hóa-lý phản ảnh hiện trạng môi trường thì các yếu tố sinh học thể hiện áp lực mà môi trường đang phải chống chịu. Phương pháp nghiên cứu dựa vào thủy sinh vật giúp đánh giá đầy đủ hơn các tác động ô nhiễm đến môi trường, những đặc tính cũng như sự biến đổi của chất lượng nước theo không gian, thời gian hay dưới ảnh hưởng tổng hợp của các tác nhân gây ô nhiễm. Trên thế giới, động vật không xương sống cỡ lớn ở đáy (ĐVKXSCL) được ứng dụng phổ biến nhất trong các chương trình sinh quan trắc do những ưu điểm nổi bật 3 như (1) thành phần loài phong phú và phân bố rộng khắp hệ thống sông; (2) dễ thu mẫu; (3) tương đối dễ định danh; (4) thường sống cố định ở đáy, do đó chỉ thị tốt cho sự thay đổi chất lượng nước; (5) có đời sống đủ dài (> 6 tháng) nên không cần thu mẫu thường xuyên; (6) đa dạng khoảng nhạy cảm với ô nhiễm; (7) tổng hợp các ảnh hưởng của ô nhiễm trong thủy vực; (8) số lượng loài trong một lần thu mẫu khá cao, do đó có ít nhất vài loài sẽ bị tác động của thay đổi chất lượng nước; và, (9) tài liệu nghiên cứu phong phú [6], [63], [95]. Cho đến nay, việc ứng dụng ĐVKXSCL đánh giá chất lượng nước ở các thủy vực với những điều kiện sinh thái khác nhau ở Việt Nam còn rất hạn chế và chưa được kiểm chứng nhiều. Đặc biệt, hệ thống hóa để đưa ra phương pháp quan trắc thống nhất cho Việt Nam nhằm đánh giá sức khoẻ sinh thái các hệ thống sông chính hay những dạng thủy vực khác ít được đề cập đến. Trong khi đó, với điều kiện sinh thái đặc trưng của Việt Nam, việc sử dụng hệ thống điểm số đang được phổ biến ở Châu Âu, Bắc Mỹ và các quốc gia khác trên thế giới, được coi là thiếu chính xác, nên nghiên cứu ứng dụng ĐVKXSCL là rất cần thiết trong tình hình diễn biến ô nhiễm nguồn nước ngày một phức tạp hơn. Theo cách tiếp cận mới này, việc thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng nước dựa vào động vật không xương sống cỡ lớn ở đáy cho hạ lưu hệ thống sông Đồng Nai” sẽ giúp các nhà nghiên cứu và quản lý trong lĩnh vực sinh thái, tài nguyên và môi trường có thêm công cụ quan trắc sinh học để giám sát sức khỏe sinh thái hạ lưu HTSĐN nói riêng và toàn lưu vực sông Đồng Nai hay các lưu vực sông trên cả nước nói chung. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng nước dựa vào động vật không xương sống cỡ lớn ở đáy cho hạ lưu hệ thống sông Đồng Nai nhằm mục đích phát triển và ứng dụng những phương pháp mới xây dựng để đánh giá, phân loại chất lượng nước các thủy vực ở hạ lưu HTSĐN. 3. PHẠM VI VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Khu vực nghiên cứu: Hạ lưu HTSĐN bao gồm sông Sài Gòn – Khu vực từ thị trấn Dầu Tiếng đến ngã 3 Cát Lái (Đèn Đỏ), sông Đồng Nai – Khu vực từ Tân Uyên đến 4 các cửa sông. Từ các thông tin và dữ liệu, các điểm, tuyến khảo sát trong khu vực nghiên cứu được chọn dựa trên những mục đích như khu vực ít hoặc không bị ảnh hưởng trực tiếp của các nguồn ô nhiễm; khu vực bị tác động của các hoạt động phát triển KT-XH; khu vực có các nhu cầu nước riêng biệt (cấp nước cho các nhà máy nước, nước thủy lợi, nuôi thủy sản, nước sử dụng đa mục đích,…). Thời gian nghiên cứu: Thu mẫu ĐVKXSCL 4 đợt/năm (mùa khô, chuyển mùa khô sang mùa mưa, mùa mưa, chuyển mùa mưa sang mùa khô) kéo dài từ tháng 03/2007 đến 09/2009 phục vụ xây dựng phương pháp, và thu mẫu 2 đợt vào tháng 03 và tháng 09 năm 2010 để kiểm định phương pháp. Đối tượng nghiên cứu: Các nhóm loài ĐVKXSCL. 4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Để đạt những mục tiêu đặt ra, những nội dung dưới đây cần được thực hiện: 1. Thu mẫu và phân tích mẫu chất lượng nước; 2. Thu mẫu và phân tích mẫu ĐVKXCL; 3. Đánh giá hiện trạng môi trường và ĐVKXSCL ở hạ lưu HTSĐN; 4. Xác định mối quan hệ giữa các chỉ số sinh học của ĐVKXSCL và các thông số môi trường; 5. Xây dựng phương pháp đánh giá và phân vùng chất lượng nước dựa vào ĐVKXSCL ở hạ lưu HTSĐN; 6. Kiểm định phương pháp đã xây dựng; 7. Cải tiến mạng lưới quan trắc sinh học phần ĐVKXSCL cho hạ lưu HTSĐN; 8. Phát triển bộ chỉ báo ĐVKXSCL cho mục tiêu đánh giá nhanh chất lượng nước. Nội dung nghiên cứu của luận án gồm 3 chuyên đề sau: Chuyên đề 1: Tổng quan tài liệu về ĐVKXSCL và khả năng sử dụng quan trắc chất lượng nước cho hạ lưu HTSĐN. Chuyên đề 2: Xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng nước hạ lưu HTSĐN dựa vào các chỉ tiêu sinh học trên cơ sở ĐVKXSCL. Chuyên đề 3: Đánh giá chất lượng hạ lưu HTSĐN dựa vào các chỉ tiêu sinh học của ĐVKXSCL. 5 5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN Ý nghĩa khoa học: Dựa trên cơ sở số liệu có hệ thống, đầy đủ của nhóm ĐVKXSCL thuộc khu vực nghiên cứu, thông tin đa dạng sinh học của ĐVKXSCL, tương quan giữa ĐVKXSCL với các điều kiện sinh thái và môi trường khác nhau, luận án xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng nước dựa vào ĐVKXSCL cho hạ lưu HTSĐN. Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu sẽ đóng góp một công cụ quan trắc sinh học có độ tin cậy cao trong điều kiện sinh thái của Việt Nam. Góp phần hoàn thiện các công cụ quan trắc chất lượng nước ở hạ lưu HTSĐN vì hiện nay trong nhiều chương trình quan trắc thường chỉ sử dụng các thông số hóa-lý để đánh giá chất lượng nước. Trong một số chương trình quan trắc đã có phân tích và đánh giá các chỉ tiêu sinh học, nhưng các phương pháp sử dụng còn nhiều hạn chế và ít được kiểm chứng. 6. NHỮNG LUẬN ĐIỂM KHOA HỌC MỚI CẦN GIẢI QUYẾT Luận án xây dựng cơ sở khoa học, phương pháp luận đánh giá chất lượng nước dựa vào ĐVKXSCL phù hợp với điều kiện sinh thái và môi trường của khu vực nghiên cứu nhằm hoàn thiện các phương pháp đánh giá chất lượng nước hạ lưu HTSĐN cũng như những hệ thống sông tương tự. Dựa trên phương pháp xây dựng Điểm số ô nhiễm (Tolerance Score – TS) của Ủy hội Quốc tế Sông Mekong (MRC), luận án đã cải tiến những điểm hạn chế của phương pháp này để xây dựng TS cho từng loài ĐVKXSCL ở hạ lưu HTSĐN trên cơ sở khoa học và và khách quan hơn, từ đó tính toán điểm số ô nhiễm trung bình theo cá thể từng loài (average tolerance score per individuals – ATSPI) tại mỗi vị trí quan trắc. Hơn nữa, luận án còn xây dựng thang điểm đánh giá cho ATSPI và các chỉ số sinh học sử dụng phổ biến để đánh giá chất lượng nước ở hạ lưu HTSĐN. Đây là cũng là một trong những điểm mới của luận án vì trước đây hầu như chưa có tác giả nào ở Việt Nam xây dựng thang điểm đánh giá cho các chỉ số sinh học này. 6 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ QUAN TRẮC SINH HỌC DỰA VÀO ĐỘNG VẬT KHÔNG XƯƠNG SỐNG CỠ LỚN Ở ĐÁY TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.1.1. Các khái niệm về quan trắc sinh học Quan trắc sinh học là công cụ quan trọng để đánh giá các điều kiện của hệ sinh thái nước. Để hiểu rõ thêm, cần xem xét các khái niệm về quan trắc sinh học. Quan trắc sinh học (Biomonitoring): Cho đến nay, có nhiều định nghĩa về quan trắc sinh học, tuy nhiên định nghĩa được nhiều độc giả đồng ý và chọn lựa nhất là “Quan trắc sinh học là việc sử dụng có hệ thống các phản ứng sinh học để đánh giá sự thay đổi các điều kiện môi trường trong chương trình quan trắc chất lượng nước. Trong đó những thay đổi này thường là do các nguồn tác động của con người,…” [108]. Quan trắc sinh học thực sự là một công cụ thích hợp bởi vì nó sử dụng tổng hợp những thông tin về một hệ sinh thái. Việc lựa chọn kỹ các công cụ có thể cung cấp một hình ảnh của chất lượng nước hay tổ hợp hệ sinh thái nhanh hơn, rẻ hơn, và tổng hợp hơn so với quan trắc hóa nước [6], [57]. Đánh giá sinh học (Bioassessment): là hình thức đánh giá một số đặc điểm của sông ngòi (trong đó có chất lượng nước) dựa vào các nhóm sinh vật sống trong đó [109]. Tổ hợp sinh thái (Biotic integrity) đôi khi được gọi sức khỏe sinh thái (Ecosystem health) và là “khả năng của một hệ sinh thái nhằm hỗ trợ và đảm bảo một quần xã sinh vật cân bằng, hợp nhất và thích nghi có hệ chức năng và thành phần loài đa dạng so với điều kiện sống tự nhiên của vùng” [109]. Nói cách khác, phép đo tổ hợp sinh học là một phép đo sự hiểu biết về một hệ thống như sông suối, là tính “tự nhiên” trong khu hệ sinh vật và các chức năng của nó [57]. Chỉ thị sinh học (Bioindicator): là nhu cầu sinh thái của loài và phản ứng của nó với các chất ô nhiễm khác nhau tương ứng với một giá trị chỉ thị nào đó. Dùng chỉ thị sinh học có các ưu điểm chính là: (1) Các quần xã sinh vật có chức năng giống như 7 “lính canh” liên tục chất lượng nước, ngược lại với thu mẫu gián đoạn của phân tích hóa học; (2) Sự phản ứng của sinh vật là kết quả của sự thay đổi các điều kiện môi trường. Nếu một vài chất thải công nghiệp thải vào sẽ làm tăng tính phức tạp lên nhiều lần. Các quần xã sinh vật không phản ứng với một yếu tố riêng lẻ mà phản ứng với toàn bộ các tác động của môi trường [6], [62]. Loài chỉ thị (Indicator species): là những sinh vật có yêu cầu nhất định về điều kiện sinh thái liên quan đến nhu cầu dinh dưỡng, hàm lượng oxy cũng như khả năng chống chịu đối với hàm lượng nhất định các yếu tố độc hại trong môi trường sống và do đó sự hiện diện của chúng biểu thị điều kiện sinh thái của môi trường sống nằm trong giới hạn nhu cầu và khả năng chống chịu của sinh vật đó [6], [62]. Sinh vật cảm ứng (Bio-sensor): là những sinh vật chỉ thị có thể tiếp tục hiện diện trong môi trường ô nhiễm, nhưng có ít nhiều biến đổi như giảm tốc độ sinh trưởng, giảm khả năng sinh sản, biến đổi tập tính do tác động của chất ô nhiễm [6], [62]. Cá thể sinh vật chỉ thị (Individuals as an indicator): là những dấu hiệu mang tính chỉ thị về sinh lý, sinh hóa, tập tính, tổ chức tế bào của cá thể sinh vật chỉ thị [6], [62]. Quần thể sinh vật chỉ thị (Population as an indicator): thể hiện cấu trúc quần thể của các loài chỉ thị [6], [62]. Cấu trúc quần xã chỉ thị (Community structure as an indicator): bao gồm thành phần cấu trúc quần xã sinh vật, tùy theo chất lượng nước mà thành phần của quần xã và mật độ của từng quần thể sẽ khác nhau [6], [62]. Quan trắc sinh học chỉ thật sự hữu ích khi hiểu biết đầy đủ những kiến thức về khu hệ sinh vật để có thể chuyển tải những dữ liệu thu thập được thành kết quả. Hiện nay, những kỹ thuật này đang trở nên phổ biến để có thể đạt được những phản ánh đầy đủ về sinh học các hệ thống sông và chuyển tải thành kết quả. Và, việc sử dụng bất cứ những kỹ thuật nào, cần thiết phải thử nghiệm đối với các nhóm sinh vật và điều kiện địa phương nhằm đạt kết quả hữu ích [60]. 1.1.2. Tổng quan đánh giá chất lượng nước bằng phương pháp sinh học Hầu hết các nhóm sinh vật sống trong một thủy vực là nhạy cảm với những thay đổi của môi trường, cả về tự nhiên (như tăng độ đục trong mùa lũ) hay gây ra bởi con 8 người (như nhiễm bẩn hóa chất hay giảm DO do tiếp nhận nguồn nước thải đô thị). Các nhóm sinh vật khác nhau phản ứng theo những cách khác nhau. Những phản ứng nghiêm trọng nhất bao gồm sinh vật bị chết hay di cư đến các nơi khác. Những phản ứng ít hơn gồm có khả năng sinh sản giảm và ức chế một số hệ thống enzyme nào đó cần thiết cho sự trao đổi chất thông thường. Một khi đã xác định được những phản ứng của các nhóm sinh vật đặc biệt nào đó đối với những biến đổi của môi trường, có thể sử dụng chúng để đánh giá chất lượng nước [6], [57]. 1.1.2.1. Mục đích của quan trắc sinh học Dưới đây là những mục đích chính của quan trắc sinh học [6], [57]:  Đôi khi các chất ô nhiễm tác động lên hệ sinh thái ở nồng độ thấp hơn so với ngưỡng ảnh hưởng của chất đó;  Tác động của các chất ô nhiễm tổng hợp khác với khi chúng nằm riêng lẻ;  Ảnh hưởng của độc chất lên hệ sinh thái còn tùy thuộc vào các đặc tính của điều kiện tự nhiên. Ngày nay quan trắc sinh học được thiết lập như một phần của quan trắc chất lượng nước. Có hai loại quan trắc chính rất quan trọng đối với môi trường nước là thử nghiệm sinh học (bioassay) và đánh giá sinh học (bioassessment). Thử nghiệm sinh học bao gồm các loại xét nghiệm độc chất sinh thái, tích tụ sinh học, suy thoái sinh học, phú dưỡng hoá. Đánh giá sinh học bao gồm các phương pháp luận liên quan đến phân tích các quần xã sinh vật, các chức năng của chúng để cảnh báo, dự đoán xu hướng biến đổi và giám sát môi trường. 1.1.2.2. Những thuận lợi của các phương pháp sinh học Đánh giá sinh học thường chỉ ra những ảnh hưởng đến hệ sinh thái do các hoạt động nào đó diễn ra trong thủy vực. Nó còn hỗ trợ để xác định phạm vi của thiệt hại sinh thái. Một số loại thiệt hại có thể rất dễ nhận biết như màu bất thường của nước, độ đục tăng hay cá chết. Tuy nhiên, có rất nhiều hình thức thiệt hại không thể nhận biết nếu không kiểm tra chi tiết khu hệ thủy sinh vật. Các nhóm sinh vật được nghiên cứu có thể chỉ ra những ảnh hưởng tổng hợp của tất cả tác động đến thủy vực, và có thể sử dụng để so sánh những biến đổi chất lượng nước từ vị trí này với vị trí kia, 9 hay trong một khoảng thời gian. Do đó, chúng có thể phản ánh hiện trạng điều kiện sống trước khi nó có xu hướng nghiêm trọng hơn. Điều đó có thể giúp các nhà sinh học đánh giá tình trạng quá khứ cũng như hiện tại của môi trường. Chiều dài thời gian đánh giá tùy thuộc vào các nhóm sinh vật sử dụng trong điều tra. Những nhóm vi sinh vật như động vật nguyên sinh (protozoa), tảo bám (periphytic algae) hay vi khuẩn (bacteria) phản ánh chất lượng nước chỉ trong một hay hai tuần trước khi phân tích và thu mẫu chúng. Trong khi đó, ấu trùng côn trùng, giun, nhuyễn thể và các nhóm ĐVKXSCL khác phản ánh chất lượng nước trong thời gian một tháng hay có thể đến vài năm [6], [57]. Phương pháp sinh học có thể được tiến hành rất nhanh với chi phí thấp, và được kết hợp trong các nghiên cứu tổng hợp khác. So với phương pháp hóa-lý, dụng cụ thu mẫu và trang thiết bị yêu cầu trong quan trắc và phân tích sinh học ít tốn kém hơn và một vùng nghiên cứu lớn có thể hoàn thành khảo sát trong thời gian ngắn. Trong những năm gần đây việc sử dụng sinh vật để quan trắc chất lượng nước ứng dụng ở nhiều quốc gia trên thế giới, điển hình như các quốc gia châu Âu, Bắc Mỹ, Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Nhật Bản... Do số lượng các chất ô nhiễm xả vào thủy vực ngày càng nhiều và phức tạp. Vì vậy, chi phí cung cấp cho phương pháp hóa-lý là rất lớn, nên phương pháp sinh học được đề nghị nhằm tiết kiệm chi phí. Tuy nhiên, sự thuận lợi của phương pháp sinh học không phải để loại trừ sự cần thiết của phân tích hóa-lý. Những cơ quan và các cá nhân liên quan chịu trách nhiệm thiết lập chương trình đánh giá nên kết hợp phương pháp sinh học và hóa-lý để cung cấp những thông tin cần thiết nhằm đạt hiệu quả cao nhất [6], [57]. Đặc biệt, thử nghiệm độc tính cấp là rất hữu ích trong những trường hợp ô nhiễm tai biến và khẩn cấp, vì nó có thể giảm thiểu khối lượng phân tích hóa học. Khi khảo sát hiện tượng cá chết, thường người ta lấy mẫu nước phân tích các chỉ tiêu hóa-lý để xác định nguyên nhân và thường phải phân tích rất nhiều mẫu. Tuy nhiên, nếu thử nghiệm độc tính (thường sử dụng một nhóm thủy sinh vật) ngay lập tức, có thể biết chính xác nguyên nhân gây chết cá và nồng độ các chất gây độc có mặt ở trong nguồn nước hay không [57]. 10 1.1.2.3. Phân loại phương pháp đánh giá sinh học Hiện nay phương pháp đánh giá sinh học dựa trên 6 phương pháp chính sau: (1) Phương pháp sinh thái học; (2) Phương pháp vi sinh vật học; (3) Phương pháp sinh lý học và sinh hóa; (4) Phương pháp độc chất học; (5) Phương pháp tích tụ sinh học; và (6) Phương pháp hình thái học và mô học [6], [57]. Phạm vi nghiên cứu của luận án là nghiên cứu phương pháp sinh thái học dựa vào ĐVKXSCL để đánh giá chất lượng nước. Phương pháp sinh thái học gồm 02 kiểu chính là Phương pháp dựa vào cấu trúc quần xã, và Phương pháp dựa vào các nhóm chỉ thị. Phương pháp sinh thái học được xây dựng chủ yếu dựa vào những đặc tính dưới đây của các nhóm thủy sinh vật [6], [57]: - Phân tích cấu trúc các quần xã sinh vật trong thủy vực tự nhiên; - Phân tích các quần xã sinh vật thu ở nền đáy nhân tạo đặt trong thủy vực; - Nghiên cứu sự vắng mặt hay có mặt của các loài đặc trưng. Bất cứ loài nào cũng có thể là chỉ thị cho vài đặc tính nào đó của môi trường. Do đó, phải chọn những nhóm loài có tiềm năng hữu ích nhất cho từng vấn đề riêng biệt để giám sát chất lượng nước như cung cấp nước sinh hoạt, quản lý và kiểm soát chất thải, bảo vệ tài nguyên thủy sản, bảo tồn thiên nhiên… Các tiêu chí/đặc điểm của loài sinh vật chỉ thị lý tưởng cho môi trường [63], [79], [109], gồm: - Nhạy cảm đối với những tác động; - Khoảng nhạy cảm hẹp đối với từng điều kiện môi trường; - Dễ định danh; - Dễ thu mẫu; - Phân bố rộng, tốt nhất là phân bố toàn cầu; - Có nhiều dẫn liệu sinh thái của cá thể; - Có giá trị kinh tế khi sinh vật là tài nguyên hay vật gây hại; - Có khả năng tích tụ các chất ô nhiễm; - Dễ dàng nuôi trong phòng thí nghiệm; - Ít biến dị; 11 - Chi phí thấp dễ chấp nhận trong việc thu mẫu và phân tích. Trong thực tế chỉ rất ít loài đạt được các tiêu chí trên, do đó một loài nào đó đạt được đa số các tiêu chí trên thì là sinh vật chỉ thị tốt cho môi trường [63]. Để đánh giá mức độ ô nhiễm của thủy vực một cách chính xác, hiệu quả và đơn giản,… người ta đã xây dựng các hệ thống chỉ số hay điểm số sinh học. Có thể kể ra các hệ thống chỉ số thông dụng: chỉ số ô nhiễm – S (Saprobic indices), chỉ số sinh vật – B (Biotic indices), chỉ số đa dạng – D (Diversity indices), chỉ số dinh dưỡng – Q (Trophic indices), điểm số ô nhiễm – TS (Tolerance score)... Mỗi chỉ số, điểm số đều có những ưu nhược điểm riêng, thích ứng với những dạng nghiên cứu hay đánh giá khác nhau [62]. Đánh giá chung: Quan trắc sinh học có nhiều thuận lợi trong đánh giá chất lượng nước của các loại hình thủy vực khác nhau. Quan trắc chất lượng nước bằng phương pháp sinh học đã phát triển rất nhanh với nhiều phương pháp đa dạng và được tiêu chuẩn hóa ở nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ. Trong đó, phương pháp sinh thái học được ứng dụng phổ biến nhất nhờ có nhiều ưu điểm, đặc biệt là chi phí thấp do không yêu cầu cao về phòng thí nghiệm, thời gian thực hiện khảo sát và đưa ra kết quả đánh giá rất nhanh. 1.1.3. Vai trò của động vật không xương sống cỡ lớn ở đáy trong đánh giá chất lượng nước Động vật không xương sống cỡ lớn ở đáy (Benthic macroinvertebrates): là các nhóm sống ở nền đáy hoặc ít nhất có một giai đoạn trong chu kỳ phát triển sống ở nền đáy. Kích thước của ĐVKXSCL lớn hơn 200 m, mặc dù ở các giai đoạn phát triển ban đầu có thể nhỏ hơn kích thước này. Chúng có thể sống trên mặt hoặc vùi trong lớp bùn đáy hoặc bơi trong tầng nước. Hầu hết các nhóm ĐVKXSCL có kích thước lớn hơn 500 m, vì vậy trong các chương trình quan trắc thường sử dụng dụng cụ thu mẫu có kích thước mắt lưới 500 m. Với các chương trình nghiên cứu chuyên sâu cần thu đầy đủ thành phần loài, thường sử dụng dụng cụ có kích thước mắt lưới 250 m [6], [109]. 12 Các chương trình giám sát (Surveillance) dựa vào ĐVKXSCL là kiểu quan trắc sinh học được sử dụng thường xuyên nhất, bao gồm các khảo sát thực hiện trước và sau khi một dự án hoàn thành hay trước và sau khi một chất độc bị tràn ra. Hơn nữa, có thể còn sử dụng ĐVKXSCL để đánh giá các chương trình quản lý tài nguyên nước đang thực hiện hay xem xét những dự án bảo vệ nguồn nước có thành công hay không. Việc sử dụng ĐVKXSCL để dự đoán những tác động môi trường ưu tiên ở thời điểm khởi đầu của dự án là một hình thức đặc biệt của giám sát. Quan trắc sinh học lịch sử (Historical biomonitoring) hay giám sát dài hạn có thể cung cấp những chứng cứ cần thiết để đánh giá các vấn đề môi trường đã có hay nảy sinh. Quan trắc sinh học lịch sử có thể kéo dài từ vài năm đến vài thập kỷ [109]. Kiểu thứ hai của quan trắc sinh học là để đảm bảo sự tuân thủ hay đáp ứng ngay lập tức những quy định hay để kiểm soát chất lượng nước dài hạn. Có thể sử dụng ĐVKXSCL để xét nghiệm những ảnh hưởng và đảm bảo các tiêu chuẩn chất lượng nước, hay có thể sử dụng chúng để đảm bảo rằng những tiêu chuẩn được duy trì trong suốt quá trình xây dựng và kết thúc của một dự án [109]. Trong danh sách trên 100 chỉ số sinh học được dùng để giám sát chất lượng nước sông suối có đến 2/3 là dựa vào ĐVKXSCL [63]. Hellawell (1986) đã tổng kết các tài liệu chuyên ngành và nhận thấy rằng ĐVKXSCL là nhóm thông dụng nhất cho đánh giá sức khỏe sinh thái sông ngòi (bao gồm chất lượng nước), tiếp theo là vi tảo và động vật nguyên sinh (Bảng 1-1). [22], [79] Bảng 1-1. So sánh sử dụng các nhóm sinh vật trong việc quan trắc chất lượng nước Stt 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Taxon Virus Vi khuẩn Nấm Nấm men Vi tảo Thực vật lớn thủy sinh Động vật nguyên sinh ĐVKXSCL Cá Mức độ thường xuyên(%) 1,0 15,0 3,5 2,5 25,0 3,5 17,5 26,0 6,0 Nguồn: [22], [79] 13 Nói chung, các nhóm đều có thể sử dụng để làm sinh vật chỉ thị sinh học, tuy nhiên mỗi nhóm đều có ưu và nhược điểm nhất định. Các nghiên cứu do các quốc gia cộng đồng châu Âu (Đức, Anh, Italia, Bỉ,…) thực hiện đã chứng minh rằng phương pháp đánh giá chất lượng nước thành công nhất là dựa vào quần xã ĐVKXSCL (Bảng 1-2). Bảng 1-2. Ưu nhược điểm của các nhóm sinh vật sử dụng quan trắc chất lượng nước Các nhóm sinh vật Ưu điểm ĐVKXSCL (Benthic Nhiều nhóm sống định cư; macroinvertebrates) Đa dạng về hình thức và môi trường sống; Hệ thống định loại phát triển; Dễ quan sát và thu mẫu; Thời gian sống đủ dài để có thể chỉ thị cho những tác động ô nhiễm tổng hợp; Nhạy cảm với ô nhiễm; Khả năng thực nghiệm tốt; Dụng cụ thu mẫu đơn giản. Vi khuẩn (Bacteria) Phương pháp phòng thí nghiệm tốt; Phản ứng nhanh với những thay đổi của môi trường, bao gồm ô nhiễm; Chỉ thị cho ô nhiễm phân; Dễ thu mẫu; Dụng cụ thu mẫu đơn giản. Nhược điểm Khó thu mẫu định lượng ở những nơi có nền đáy rắn, gồ ghề. Phải có kiến thức đánh giá chu kỳ sinh trưởng và phát triển của loài. Các tế bào có thể không có nguồn gốc từ điểm thu mẫu; Quần thể được phục hồi nhanh chóng từ các nguồn ô nhiễm không liên tục; Khó định loại; Sự biến đổi tạm thời cao; Sự hiểu biết về nhóm này không nhiều; Yêu cầu một số trang thiết bị chuyên biệt. Động vật nguyên sinh Tài liệu về các giá trị phân loại Khó định loại; (Protozoa) mức độ nhiễm bẩn nhiều; Yêu cầu về trang thiết bị Phản ứng nhanh với những thay phòng thí nghiệm cao; đổi của môi trường; Các tế bào có thể không có Dễ thu mẫu; nguồn gốc từ điểm thu mẫu; Các loài chỉ thị còn có xu Dụng cụ thu mẫu đơn giản. hướng xuất hiện trong các môi trường thông thường. Thực vật phiêu sinh Nhiều tài liệu nghiên cứu; Khó định loại; (Phytoplankton) Ít hữu ích cho ô nhiễm phân và Dễ thu mẫu; Tính được sản phẩm sơ cấp hữu cơ; 14 Tảo silic (Diatoms) Động vật phiêu sinh (Zooplankton) ĐVKXS cỡ trung bình ở đáy (Benthic meioinvertebrates) Thực vật lớn thủy sinh (Macrophytes) Cá Chim, thú (Primary production); Chỉ thị hữu ích cho phú dưỡng hóa và tăng độ đục; Có thể đếm tự động; Dụng cụ thu mẫu đơn giản. Dễ thu mẫu; Vi tảo được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu sinh trưởng và phát triển; Dụng cụ thu mẫu đơn giản. Dễ thu mẫu; Các loài quan trọng ở vùng khơi có kích thước lớn; Nhiều loài nhạy cảm với ô nhiễm; Dụng cụ thu mẫu đơn giản. Dễ thu mẫu; Một số nhóm (Nematoda, Copepoda) có thể chỉ thị tốt cho môi trường; Dụng cụ thu mẫu đơn giản. Hệ thống phân loại phát triển tốt; Dễ quan sát và thu mẫu; Thời gian sống đủ dài để có thể chỉ thị cho những tác đổng ô nhiễm tổng hợp; Nhiều thông tin; Tương đối dễ định loại; Hệ thống phân loại phát triển tốt; Nhiều thông tin; Tương đối dễ định loại; Đóng vai trò quan trọng trong chuỗi thức ăn; Tác động sinh lý có thể thấy ngay. Nhạy cảm với ô nhiễm nhiệt; Tác động đến chuỗi thức ăn có thể thấy được; Ngoại suy đến con người. Biến đổi theo mùa lớn. Tương đối ít nhạy cảm. Khó định loại; Khó thu mẫu lặp định lượng. Khó định loại; Phân loại đòi hỏi nhiều thời gian. Tương đối ít nhạy cảm; Khó thu mẫu lặp định lượng. Các loài có thể di cư để tránh ô nhiễm; Khó phân biệt tác động là do khai thác thủy sản hay nhiễm bẩn. Rất khó thu mẫu Nguồn: [6], [63] 15 Sử dụng ĐVKXSCL để giám sát chất lượng nước có những thuận lợi sau [63], [109]: - Thành phần loài phong phú và phân bố rộng khắp hệ thống sông, vì vậy chúng có thể chỉ thị cho những rối loạn của nhiều kiểu môi trường sống khác nhau; - Sống tương đối cố định ở đáy, do đó hạn chế về khả năng di cư nên chỉ thị tốt cho sự thay đổi chất lượng nước, và có đời sống đủ dài nên không cần thu mẫu thường xuyên; - Dễ thu mẫu; - Tương đối dễ định danh; - ĐVKXSCL là những sinh vật thứ cấp, vì vậy cho phép xác định phạm vi không gian của những rối loạn; - Số lượng taxa (loài) trong một lần thu mẫu tương đối cao, do đó có ít nhất vài loài sẽ bị tác động do sự thay đổi chất lượng nước. Biểu hiện là sự phản ứng của các loài đối với các kiểu ô nhiễm hay các đặc tính thủy vực khác nhau; - Có nhiều chọn lựa các phương án xử lý số liệu (chỉ số ô nhiễm, chỉ số sinh học, chỉ số đa dạng, chỉ số dinh dưỡng, điểm số ô nhiễm,…). Gần đây, với sự phát triển đa dạng của kỹ thuật đánh giá dựa vào ĐVKXSCL đã làm tăng thêm nhiều thuận lợi cho nhóm này trong chương trình quan trắc. Đầu tiên, thu mẫu định tính và phân tích mẫu có thể được thực hiện rất đơn giản với trang thiết bị rẻ tiền. Thứ hai, hệ thống phân loại và các khóa định loại của nhiều nhóm loài ĐVKXSCL phát triển rất tốt. Thứ ba, nhiều phương pháp phân tích số liệu dựa vào cấu trúc quần xã phát triển mạnh và đã được sử dụng rộng rãi như các chỉ số đa dạng và chỉ số sinh học. Thứ tư, đã thiết lập những phản ứng của nhiều nhóm loài đối với các kiểu ô nhiễm khác nhau. Thứ năm, ĐVKXSCL là đặc biệt thích hợp cho nghiên cứu thực nghiệm. Có thể kể đến một thuận lợi khác là tiến hành đo sinh hóa và sinh lý các cá thể ĐVKXSCL để đánh giá mức độ các tác động đến thủy vực [57]. 16 Đánh giá chung: Kết quả nghiên cứu cho thấy đánh giá chất lượng nước bằng phương pháp sinh học thành công nhất là dựa vào quần xã ĐVKXSCL vì có nhiều thuận lợi hơn cả. Hellawell (1986) đã tổng kết các tài liệu chuyên ngành và nhận thấy ĐVKXSCL là nhóm loài thông dụng nhất cho đánh giá sức khỏe sinh thái sông (bao gồm chất lượng nước). Đến nay, trên thế giới đưa ra hơn 100 chỉ số sinh học được dùng để giám sát chất lượng nước sông suối có đến 2/3 là dựa vào ĐVKXSCL. 1.1.4. Tình hình nghiên cứu động vật không xương sống cỡ lớn ở đáy đánh giá chất lượng nước ở trên thế giới và Việt Nam 1.1.4.1. Trên thế giới Quan trắc sinh học được biết đến từ đầu thế kỷ 20, trong đó các phương pháp đánh giá chất lượng nước dựa vào ĐVKXSCL phát triển mạnh vào nửa sau của thế kỷ này [109].  Quan điểm châu Âu Khái niệm chỉ thị sinh học của các đặc tính môi trường nước xuất phát từ nghiên cứu của Kolkwitz và Marsson [128]. Hai tác giả này đã phát triển ý tưởng độ nhiễm bẩn “saprobity” trong các hệ thống sông bằng cách đo mức độ nhiễm bẩn do các chất hữu cơ và đưa ra kết quả là nồng độ DO giảm. Năm 1908 quan điểm này được phát triển cho thực vật và năm 1909 đã mở rộng cho động vật. Sau đó hệ thống phân loại mức độ nhiễm bẩn dựa vào các loài chỉ thị phát triển cho nhiều nhóm loài sinh vật, bao gồm ĐVKXSCL. Hệ thống gốc phân loại ở đơn vị Lớp, sau đó Richardson và Gaufin phân loại tới Bộ, Họ [109]. Mỗi nhóm chỉ thị chất lượng nước ứng với 4 giai đoạn oxy hóa từ nghèo dinh dưỡng hay ít bẩn (Oligosaprobic), bẩn vừa ở hai mức độ β và α (β-Mesosaprobic và α-Mesosaprobic) đến rất bẩn với hàm lượng chất hữu cơ rất cao (Polysaprobic). (Bảng 1-3) 17 Bảng 1-3. Nhóm loài chỉ thị ô nhiễm sử dụng trong hệ thống phân loại ban đầu Nhóm loài chỉ thị Richardson (1925) Tubificidae, một số ấu trùng họ Chironomidae, một số loài Nhiễm bẩn lớp Gastropoda Nhiễm bẩn nhẹ, Sphaeriidae, Hirudinea, ấu chịu đựng được ô trùng họ Chironomidae nhiễm Nhiễm bẩn nhẹ, Ấu trùng họ Chironomidae nghi ngờ Chironomidae, Sphaeridae, Nhiễm bẩn nhẹ, một số loài lớp Oligochaeta chịu đựng kém Một số loài lớp Gastropoda, Ưa thích nước tĩnh côn trùng thở không khí Pleurocercidae, Isopoda, một Ưa thích nước chảy số loài Hydropsychidae Một số loài Crustacea, Odonata, Ephemeridae, Ít bẩn Trichoptera Phân loại Richardson (1929) Nhiễm bẩn Gaufin (1958) Chịu đựng được nhiễm bẩn Tùy nghi Ưa thích nước sạch Ít bẩn Nhạy cảm với nhiễm bẩn Nguồn: [6], [109] Từ kết quả nghiên cứu này, các nhà khoa học châu Âu đã chỉnh sửa và phát triển hệ thống phân loại mức độ nhiễm bẩn. Liebmann (1962) đã đưa ra phương pháp khoa học cho việc phân loại tác động của nhiễm bẩn hữu cơ ở các thủy vực nước chảy. Hệ thống này ngày càng được ứng dụng và phát triển để xây dựng nên chỉ số ô nhiễm S (Saprobic Index) và chỉ số biến đổi (Modified Index) bao gồm các giá trị ô nhiễm [6], [109]. Đến năm 1973, Sladecek đã tổng kết và phát triển các phương pháp đánh giá chất lượng nước trên quan điểm sinh học. Ông đã xuất bản một ấn phẩm “Danh mục các loài chỉ thị cho ô nhiễm nước ngọt“, bao gồm danh sách các nhóm thủy sinh vật chỉ thị của ô nhiễm, trong đó có ĐVKXSCL. Hiện nay hệ thống này vẫn đang được ứng dụng ở nhiều quốc gia châu Âu [6], [109]. Sử dụng mức độ nhiễm bẩn hữu cơ và nồng độ DO để phân vùng sinh học khá phổ biến ở các lục địa; đến nay khái niệm này vẫn chưa lỗi thời và không chỉ giới hạn ở châu Âu. 18 Khái niệm “độ nhiễm bẩn” có ảnh hưởng sâu sắc đến sự phát triển của các bộ luật và quy định quản lý nước mặt ở châu Âu. Ví dụ, Đạo luật Bảo vệ Môi trường của Đan Mạch (the Danish Environmental Protection Act) năm 1973 đã ghi rõ 4 kiểu phân loại sinh học dựa vào hệ thống độ nhiễm bẩn cổ điển, DO, BOD và chỉ thị sinh học làm tham chiếu cho chất lượng nước (Bảng 1-4). Tương tự, ở Anh, từ năm 1995 Ủy ban Hoàng gia về Xả nước thải (the Royal Commission on Sewage Disposal) đã hạn chế tải lượng thải BOD và TSS [6], [108]. Thực tế, những đối tượng xả thải rất tán thưởng nếu chương trình quan trắc sinh học không được chấp nhận. Lý do là đánh giá chất lượng nước bằng phương pháp sinh học sẽ thấy rõ hơn những biến đổi của môi trường và các hệ sinh thái nước theo chiều hướng xấu dần do xả thải từ các nhà máy công nghiệp so với các ngưỡng định lượng theo tiêu chuẩn hóa-lý [79]. Bảng 1-4. Phân loại chất lượng nước dựa các nhóm loài chỉ thị ở Đan Mạch Mức I II III IV Phân loại nồng độ nhiễm bẩn Oligosaprobic (Ít bẩn) β-mesosaprobic (Bẩn vừa mức β) -mesosaprobic (Bẩn vừa mức ) Polysaprobic (Rất bẩn) Các nhóm loài chỉ thị Các nhóm loài nước sạch thuộc hai Bộ Trichoptera, Plecoptera Các nhóm loài thích ứng được với ô nhiễm phát triển phong phú về số loài, nhưng Chironomus và Tubifex không chiếm ưu thế Các nhóm loài chỉ thị cho nước nhiễm bẩn gồm Chironomus, Tubifex, Asellus, Erpobdella Chỉ gồm các nhóm loài Eristalis, Tubifex, Chirnomus phát triển với số lượng cao Nguồn: [109] Một số chỉ số được phát triển dựa trên các đặc tính chung như sự chịu đựng của các nhóm, sự phân bố và giá trị chỉ thị (Bảng 1-5). Những chỉ số này tính toán định lượng và bán định lượng để đánh giá điều kiện sinh học và gần với những ứng dụng sinh học ĐVKXS ở Bắc Mỹ [6], [109]. 19 Bảng 1-5. Những chỉ số được chọn sử dụng trong quan trắc sinh học Chỉ số Loài chỉ thị Chỉ số nhiễm bẩn Đa dạng Đa dạng Simpson Đa dạng Shannon Đa dạng Brillourin Margalef So sánh tuần tự Số liệu đầu vào Mức độ chính xác của phân loại Ghi chú1 Chỉ số nhiễm bẩn, mật độ của Cao từng loài (1) Mật độ của từng loài hay mật Tương đối cao độ của từng nhóm Mật độ của từng loài Mật độ của từng loài Số loài, tổng số cá thể Cao So sánh tuần tự, tổng số cá Thấp thể, số loài (2) Sinh học Điểm số BMWP2 và Điểm số các họ Thấp 3 BBI Chỉ số quần xã Mật độ của từng loài, giá trị Tương đối cao mong muốn, điểm số xếp ĐVKXS hạng Chỉ số tổ hợp sinh Tổ hợp 10 chỉ số sinh học học IBI (3) (4) (5) (6) (7, 8, 9) (10) (11) Nguồn: [6], [109] Ghi chú: Các loài chỉ thị và chỉ số đa dạng là những điểm số có tính liên tục, trong khi chỉ số sinh học là điểm số có tính rời rạc. (1) Pantle and Buck (1955); (2) Simpson (1949); (3) Shannon và Weaver (1949); (4) Brillouin (1951); (5) Margalef (1958); (6) Cairns and Dickson (1971); (7) Woodiwiss (1964); (8) Armitage et al (1983); (9) De Pawn and Vanhooren (1983); (10) Ohio EPA (1987); (11) Karr et al (1986). 2Biological Monitoring Working Party. 3Belgian Biotic Index. Bảng 1-6 thống kê các chỉ số chính đang sử dụng ở các quốc gia châu Âu. Ngoại trừ Hy Lạp, những quốc gia khác xây dựng hệ thống chỉ số dựa vào ĐVKXSCL và hiện đang được sử dụng phổ biến. Ở 7 quốc gia (Bỉ, Đan Mạch, Pháp, Đức, Ai Len, Luxxemburg và Anh), chỉ số sinh học hay phương pháp cho điểm được chấp nhận ở cấp tiêu chuẩn quốc gia. Các phương pháp đánh giá ở Hà Lan và Italia được chấp nhận ở cấp vùng. Một số quốc gia như Bồ Đào Nha và Tây Ban Nha chưa được đồng ý sử dụng ở cấp quốc gia, mặc dù họ đã có những phương pháp đánh giá rõ 20