Tài liệu Xây dựng hệ thống tái sinh và ứng dụng trong nghiên cứu chuyển nạp gen hb & ag (tạo vỏ virus viêm gan b) vào cây cà chua bi

Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA [[[ \\\ LÊ HOÀN HẢO XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN HBsAg (TẠO VỎ VIRUS VIÊM GAN B) VÀO CÂY CÀ CHUA BI Lycopersicon esculentum var. Cerasiforme Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Hữu Hổ TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 8 năm 2008 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI – THỦ ĐỨC – TP.HCM --- oOo --- Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hữu Hổ Cán bộ chấm nhận xét 1: Cán bộ chấm nhận xét 2: Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày tháng năm 2008 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH CỘNG HÒA Xà HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC Tp. HCM, ngày tháng 08 năm 2008 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: LÊ HOÀN HẢO. Ngày, tháng, năm sinh: 04 – 04 – 1981. Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học. Phái: Nam. Nơi sinh: Tp.HCM. MSHV: 03106670. I- TÊN ĐỀ TÀI: XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN HBsAg (TẠO VỎ VIRUS VIÊM GAN B) VÀO CÂY CÀ CHUA BI Lycopersicon esculentum var. Cerasiforme II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Khảo sát khả năng khử trùng mẫu tối ưu. - Hệ thống tái sinh cho cà chua bi F1 TN84 cho tử diệp và trụ hạ diệp. - Thử kháng Kanamycin ở tử diệp và trụ hạ diệp. - Thử khả năng kháng Kanamycin ở cây cà chua bi con. - Chuyển gen vào cà chua bi. - Tách chiết DNA cà chua bi. - Kiểm tra sự hiện diện của gen nptII, gen gusA, gen mục tiêu HBsAg ở cây cà chua bi mang gen giả định bằng phương pháp phân tích PCR. III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 01/10/2007 IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 01/08/2008 V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS. NGUYỄN HỮU HỔ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CN BỘ MÔN QL CHUYÊN NGÀNH TS. NGUYỄN HỮU HỔ Nội dung và đề cương luận văn thạc sĩ đã được Hội đồng chuyên ngành thông qua. TRƯỞNG PHÒNG ĐT – SĐH Ngày tháng năm 2008 TRƯỞNG KHOA QL NGÀNH -a- MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN TÓM TẮT MỤC LỤC ............................................................................................................................. a DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................d DANH MỤC BẢNG................................................................................................... f DANH MỤC BIỂU ĐỒ ..............................................................................................g LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY CÀ CHUA ..................................................................3 1.1.1. GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG ........................................................................3 1.1.2. NGUỒN GỐC – PHÂN BỐ - Ý NGHĨA KINH TẾ ........................................... 4 1.1.2.1. NGUỒN GỐC ........................................................................................... 4 1.1.2.2. PHÂN BỐ ................................................................................................. 4 1.1.2.3. Ý NGHĨA KINH TẾ .................................................................................. 6 1.1.3. PHÂN LOẠI THỰC VẬT ............................................................................ 7 1.1.4. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT ........................................................................7 1.1.4.1. HỆ RỄ ........................................................................................7 1.1.4.2. THÂN ........................................................................................8 1.1.4.3. LÁ ............................................................................................9 1.1.4.4. HOA ..........................................................................................9 1.1.4.5. QUẢ ........................................................................................12 1.1.4.6. HẠT ........................................................................................14 1.1.5. GIỚI THIỆU MỘT SỐ GIỐNG CÀ CHUA BI .........................................14 1.2. GIỚI THIỆU VIRUS VIÊM GAN B (Hepatitis viruses) .................................15 1.2.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ VIRUS VIÊM GAN B (Hepatitis B virus – HBV) ............15 1.2.1.1. CẤU TRÚC CỦA HBV ............................................................................ 16 1.2.1.2. KHẢ NĂNG GÂY BỆNH ........................................................................ 18 1.2.2. DỊCH TỄ HỌC VỀ VIÊM GAN B .............................................................. 20 1.2.3. SỰ KHÁC BIỆT CHÍNH GIỮA VIRUS VIÊM GAN A, B VÀ C ...............21 1.2.4. KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT VIRUS VIÊM GAN B (HBsAg – Hepatitis B surface antigen) ...................................................................................22 1.2.4.1. PROTEIN NHỎ (SHBs) ................................................................23 1.2.4.2. PROTEIN TRUNG BÌNH (MHBs) ...................................................23 1.2.4.3. PROTEIN LỚN (LHBs) ................................................................23 1.2.4.4. CÁC KIỂU SHBs PHỤ .................................................................24 1.3. NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO ...........................................................25 1.3.1. NGUYÊN TẮC CỦA NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT ...................... 26 1.3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG .................27 -b- 1.4. CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ TẠO DÒNG .................................................. 28 1.4.1. TẠO DÒNG GEN ...............................................................................28 1.4.2. ENZYME GIỚI HẠN (restriction enzyme) ..............................................29 1.4.3. ENZYME NUCLEASE ........................................................................30 1.4.4. ENZYME NỐI DNA (ligase) .................................................................30 1.4.5. ENZYME POLYMERASE ...................................................................31 1.4.6. VECTOR ...........................................................................................31 1.5. GEN CHỌN LỌC VÀ GEN CHỈ THỊ ...........................................................36 1.5.1. GEN CHỌN LỌC KHÁNG Kanamycin – nptII ........................................36 1.5.2. GEN CHỈ THỊ - GusA ..........................................................................36 1.6. SỰ CHUYỂN GEN NHỜ A. TUMEFACIENS ...............................................37 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU ...................................................................................................41 2.1.1. NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT ................................................................41 2.1.2. CHỦNG VI KHUẨN ...........................................................................41 2.1.3. PLASMID ..........................................................................................42 2.1.4. MỒI VÀ THANG DNA CHUẨN ...........................................................43 2.1.4.1. MỒI CHO GEN HBsAg ............................................................................ 43 2.1.4.2. THANG DNA CHUẨN ............................................................................ 43 2.1.5. HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ..........................................44 2.1.5.1. HÓA CHẤT ...............................................................................44 2.1.5.2. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ...........................................................44 2.1.6. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ TRONG NGHIÊN CỨU ..................................45 2.2. PHƯƠNG PHÁP ..........................................................................................45 2.2.1. XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH CHO CÂY CÀ CHUA BI (Lycopersicon esculentum var. Cerasiforme) từ tử diệp và trụ hạ diệp ...........45 2.2.1.1. THÍ NGHIỆM 1: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG MẪU TỐI ƯU ............................................................................45 2.2.1.2. THÍ NGHIỆM 2: NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG TÁI SINH TỐI ƯU CHO TỬ DIỆP VÀ TRỤ HẠ DIỆP ........................................................... 45 2.2.2. ỨNG DỤNG MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU TRONG CHUYỂN GEN VÀO CÂY CÀ CHUA BI (Lycopersicon esculentum var. Cerasiforme) nhờ vi khuẩn A. tumefaciens ........................................................................46 2.2.2.1. THÍ NGHIỆM 3: XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ CHỌN LỌC TỐI ƯU CHUẨN BỊ CHO CÁC THÍ NGHIỆM CHUYỂN GEN ..........................47 2.2.2.2. THÍ NGHIỆM 4: CHUYỂN GEN VÀO CÂY CÀ CHUA BI NHỜ A. TUMEFACIENS .......................................................................47 2.2.3. KIỂM TRA SỰ HIỆN DIỆN CỦA GEN MỤC TIÊU HBsAg BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PCR ........................................................... 49 2.2.3.1. TÁCH CHIẾT DNA NHIỄM SẮC THỂ CÂY CÀ CHUA BI Đà ĐƯỢC CHUYỂN GEN ...........................................................................49 2.2.3.2. PHƯƠNG PHÁP PCR KIỂM TRA SỰ HIỆN DIỆN CỦA GEN nptII, GEN gusA, GEN HBsAg Ở CÂY CÀ CHUA BI MANG GEN GIẢ ĐỊNH ...50 -c- CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1. XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH CHO CÂY CÀ CHUA BI (Lycopersicon esculentum var. Cerasiforme) từ tử diệp và trụ hạ diệp .............52 3.1.1. THÍ NGHIỆM 1: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG MẪU TỐI ƯU .............................................................................................52 3.1.1.1. QUY TRÌNH THỰC HIỆN ............................................................52 3.1.1.2. NHẬN XÉT – THẢO LUẬN ..........................................................53 3.1.2. THÍ NGHIỆM 2: NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG TÁI SINH TỐI ƯU CHO TỬ DIỆP VÀ TRỤ HẠ DIỆP ........................................................54 3.1.2.1. QUY TRÌNH THỰC HIỆN ............................................................54 3.1.2.2. NHẬN XÉT – THẢO LUẬN ..........................................................56 3.2. ỨNG DỤNG MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU TRONG CHUYỂN GEN VÀO CÂY CÀ CHUA BI (Lycopersicon esculentum var. Cerasiforme) nhờ vi khuẩn A. tumefaciens.........................................................................65 3.2.1. THÍ NGHIỆM 3: XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ CHỌN LỌC TỐI ƯU CHUẨN BỊ CHO CÁC THÍ NGHIỆM CHUYỂN GEN ............................... 65 3.2.1.1. THÍ NGHIỆM 3a: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ Kanamycin LÊN SỰ TÁI SINH CỦA TỬ DIỆP VÀ TRỤ HẠ DIỆP ............ 65 3.2.1.2. THÍ NGHIỆM 3b: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ Kanamycin LÊN SỰ TÁI SINH CỦA CÀ CHUA BI CON ......................69 3.2.2. THÍ NGHIỆM 4: CHUYỂN GEN VÀO CÂY CÀ CHUA BI NHỜ A. TUMEFACIENS..................................................................................... 72 3.2.2.1. QUY TRÌNH THỰC HIỆN ............................................................72 3.2.2.2. NHẬN XÉT – THẢO LUẬN ..........................................................75 3.3. KIỂM TRA SỰ HIỆN DIỆN CỦA GEN MỤC TIÊU HBsAg BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PCR .............................................................79 3.3.1. CHIẾT XUẤT THU NHẬN DNA ..........................................................80 3.3.2. PHÂN TÍCH PCR ................................................................................80 3.3.2.1. SỰ HIỆN DIỆN CỦA GEN nptII TRONG CÀ CHUA BI F1 TN84 MANG GEN GIẢ ĐỊNH ĐƯỢC KIỂM TRA BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR .........................................................80 3.3.2.2. SỰ HIỆN DIỆNCỦA GEN gusA (uidA) TRONG CÀ CHUA BI F1 TN84 MANG GEN GIẢ ĐỊNH ĐƯỢC KIỂM TRA BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR .........................................................81 3.3.2.3. SỰ HIỆN DIỆNCỦA GEN HBsAg TRONG CÀ CHUA BI F1 TN84 MANG GEN GIẢ ĐỊNH ĐƯỢC KIỂM TRA BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR .........................................................83 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN .................................................................................................85 4.2. ĐỀ NGHỊ.....................................................................................................86 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................87 PHỤ LỤC 1 & 2 -d- DANH MỤC HÌNH --- oOo --- SỐ 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10 1.11 1.12 1.13 1.14 1.15 1.16 1.17 2.1 2.2 2.3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 NỘI DUNG Quả cà chua bi F1 TN84 thương phẩm của công ty Trang Nông Trồng cà chua bi trong máy AeroGarden in black Hoa và quả cà chua bi Cấu trúc không gian của virus HBV Virus HBV dưới kính hiển vi điện tử Sự tổ chức bộ gen của virus HBV Chu trình tái bản của HBV Sự phản ứng của tế bào trước sự xâm nhiễm của virus HBV Sự phân bố địa lý của bệnh biêm gan siêu vi B Ba vùng của gen S (S, tiền S1, tiền S2) và các protein được gen này mã hóa Các protein bề mặt Cấu tạo của enzyme DNA polymerase I Cấu trúc phage lamda dạng vòng Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bám trên rễ cây dưới kính hiển vi điện tử Nốt sần ở rễ cây được tạo bởi Agrobacterium tumefaciens Sơ đồ xâm nhiễm của Agrobacterium tumefaciens vào tế bào thực vật Sự chuyển gen vào tế bào thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens Túi hạt giống cà chua bi F1 TN84 của công ty Trang Nông được dùng trong thí nghiệm Cấu trúc plasmid pITB – HBsAg Phương pháp PCR _ Polymerase Chain Reaction Hạt cà chua bi F1 TN84 mới gieo Cây cà chua bi F1 TN84 sau 14 ngày gieo hạt Cách xử lý lấy mẫu ở cà chua bi F1 TN84 Sự tái sinh của tử diệp và trụ hạ diệp cà chua bi F1 TN84 ở nghiệm thức từ I1 đến I9 Ảnh hưởng của kanamycin từ 0 mg/l đến 50 mg/l lên sự tái sinh mô tử diệp và trụ hạ diệp cà chua bi F1 TN84 Ảnh hưởng của kanamycin lên sự phát triển của cà chua bi F1 TN84 Các mô chuyển gen tái nhiễm và mô chuyển gen không mang gen mục tiêu TRANG 3 5 12 15 16 17 18 19 20 23 24 31 33 37 38 39 40 41 42 51 52 53 55 64 68 71 74 -e- 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 Mô chuyển gen tái nhiễm và mô chuyển gen giả định chưa nhiễm Chồi cây cà chua bi F1 TN84 bị tái nhiễm Chồi cà chua bi F1 TN84 giả định đã mọc rễ tạo cây hoàn chỉnh và các chồi cà chua bi F1 TN84 giả định bị héo úa mà chết sau 5 tháng chọn lọc trong môi trường MS có kháng sinh Kết quả phân tích PCR kiểm tra sự hiện diện của gen nptII ở cà chua bi F1 TN84 mang gen giả định Kết quả phân tích PCR kiểm tra sự hiện diện của gen gusA ở cà chua bi F1 TN84 mang gen giả định Kết quả phân tích PCR kiểm tra sự hiện diện của gen HBsAg ở cà chua bi F1 TN84 mang gen giả định 74 77 79 81 82 84 -f- DANH MỤC BẢNG --- oOo --- SỐ NỘI DUNG TRANG 1.1 2.1 2.2 2.3 3.1 Số lượng hoa và tỷ lệ rụng hoa của 3 loại hình sinh trưởng Thang λ-HindIII Thang 1Kb Môi trường khảo sát trong nghiên cứu tối ưu Kết quả phương pháp khử trùng Kết quả khảo sát các môi trường tái sinh tử diệp của cà chua bi F1 TN84 sau 60 ngày Kết quả khảo sát các môi trường tái sinh trụ hạ diệp của cà chua bi F1 TN84 sau 60 ngày Khảo sát ảnh hưởng của kanamycin lên sự tái sinh của tử diệp và trụ hạ diệp tự nhiên của cà chua bi F1 TN84 Khảo sát ảnh hưởng của kanamycin lên sự sống của cà chua bi F1 TN84 Kết quả chuyển gen vào mô tử diệp cà chua bi F1 TN84 11 43 43 46 53 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 57 60 66 70 75 -g- DANH MỤC BIỂU ĐỒ --- oOo --- SỐ 3.1 3.2 NỘI DUNG Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các nghiệm thức lên sự tái sinh của tử diệp cà chua bi F1 TN84 sau 60 ngày Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các nghiệm thức lên sự tái sinh của trụ hạ diệp cà chua bi F1 TN84 sau 60 ngày TRANG 59 62 - Trang 1 - V iêm gan B là một bệnh nguy hiểm gây ra bởi virus tấn công vào gan. Virus ấy có tên gọi là virus viêm gan B có thể gây ra sự lây nhiễm suốt đời, xơ gan, ung thư gan và chết. Sự chủng ngừa bằng vaccine viêm gan B là một trong những biện pháp hữu hiệu nhất để ngăn chặn sự truyền nhiễm và những hệ quả của nó. Những vaccine này có giá trị sử dụng từ những năm 1980 và hơn một tỷ liều đã được dùng. Khoảng 100 quốc gia, phù hợp với chính sách của WHO, thêm vào sự chủng ngừa viêm gan B tới chương trình chủng ngừa trẻ em thường lệ và hơn nữa, hầu hết các quốc gia đã nhận một chính sách để chủng ngừa những trẻ trưởng thành ở mức rủi ro cao. Vaccine viêm gan B có khả năng ngăn ngừa khoảng 95% tình trạng mang HBV mạn tính và sự giảm trực tiếp của ung thư gan đã được chứng minh ở sự miễn dịch trẻ em. Trong những năm gần đây, tuy việc sản xuất vaccine đã gặt hái được nhiều thành công nhưng ở nhiều nước vaccine vẫn là quá đắt khi cần dùng trên diện rộng, khó khăn nhất vẫn là điều kiện bảo quản lạnh, đường xá, .... Thật vậy, tại Việt Nam đã xảy ra sự cố khi tiêm phòng chống viêm gan B bằng các lô vaccine viêm gan B Euvax B, UVX-06007 do LG (Hàn Quốc) và r-Hbvax B, B-BR-010406 do Công ty vaccine và sinh phẩm số 1 (Việt Nam) sản xuất trên diện rộng trong thời gian từ tháng tư đến tháng sáu năm 2007 do bảo quản không đúng cách đã làm bảy trẻ tử vong và một trẻ tai biến nặng sau khi tiêm [Tuổi Trẻ, 20-10-2007; 01-02-2008]. Việc sản xuất, đóng gói khiến các vaccine thương mại thường đắt và phải cần nhân viên được đào tạo để tiêm. Vì vậy, việc sản xuất vaccine dưới dạng ăn được trên diện rộng sẽ ít tốn kém hơn, tức là một thành phần của hoa quả và rau. Khi vaccine được đưa bằng đường miệng, nó có thể kích thích trực tiếp hệ miễn dịch. Một vaccine ăn được, khác với các loại vaccine truyền thống, không cần các cơ sở sản xuất phức tạp, sự tinh sạch, sự thanh trùng, sự đóng gói hoặc các hệ thống chuyển giao chuyên biệt. Hơn nữa, không như nhiều hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp hiện nay, thực vật glycosol hóa protein, một yếu tố có thể góp phần làm tăng độ miễn dịch và làm bền protein đích. Nhiều công trình về vaccine ăn được đã được công bố cho đến nay sử dụng khoai tây làm phương tiện chuyển giao. Khoai tây sở HVTH: Leâ Hoaøn Haûo Lôøi môû ñaàu - Trang 2 - dĩ bước đầu được chọn cho công trình này vì có thể thao tác với chúng dễ dàng. Khoai tây chưa bao giờ được xem là cây chuyển giao vaccine; chúng đòi hỏi phải nấu chín mới ăn được và quá trình nấu sẽ phá hủy (bất hoạt) hầu hết kháng nguyên protein. Cây được xem là nguồn chuyển giao vaccine ăn được gồm chuối, cà chua, xà lách, cà rốt, lạc và ngô. Vì vậy, theo sự phân công của bộ môn chuyên ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Bách Khoa TP.HCM, dưới sự hướng dẫn của Tiến sĩ Nguyễn Hữu Hổ, Phòng Công Nghệ Gen, Viện Sinh học Nhiệt đới, tôi thực hiện đề tài: “XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN HBsAg (TẠO VỎ VIRUS VIÊM GAN B) VÀO CÂY CÀ CHUA BI Lycopersicon esculentum var. Cerasiforme” Mục tiêu của đề tài là xác định được môi trường tối ưu cho sự tái sinh của cây cà chua bi, từ đó thực hiện bước chuyển gen HBsAg vào cây cà chua bi nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Giới hạn đề tài là chỉ tập trung xây dựng hệ thống tái sinh in vitro, chỉ thực hiện các bước chuyển gen vào cây cà chua bi, và nuôi các cây cà chua bi có mang gen giả định trong môi trường có chất chọn lọc. Sau đó, thực hiện phân tích bằng phương pháp PCR nhằm xác định gen mục tiêu trên cây cà chua bi đó. HVTH: Leâ Hoaøn Haûo Lôøi môû ñaàu - Trang 3 - 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY CÀ CHUA: Hình 1.1: Quả cà chua bi F1 TN84 thương phẩm của công ty Trang Nông Theo A. Gray, 1878: [46] Bộ: Solanales Họ: Solanaceae Phụ họ: Solanoideae Giống: Lycopersicon esculentum var Cerasiforme Cà chua có nhiều tên gọi khác nhau như: L.Kort, L.Lycopersicum, S.Lycopersicon, L.esculentum. Từ “tomato” là của Nam Mỹ, có nguồn gốc từ những từ hoặc nhóm từ Xitomate hoặc là Zitotomate và Mexican Tomati. Trước đây, người ta đặt tên cho cà chua là quả táo vàng (Golden apple). [10,34] 1.1.1. Giá trị dinh dưỡng: [10,34,47] Cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao, được sử dụng rộng rãi trên thế giới hơn 150 năm nay. Trong quả cà chua chín có chất dinh dưỡng như: đường, HVTH: Leâ Hoaøn Haûo Toång quan taøi lieäu - Trang 4 - vitamin A, vitamin C và các chất khoáng quan trọng như: canxi, sắt, photpho, kali, magie, …. Theo EDWaDC. Tigchelear (1989), thành phần hóa học trong quả cà chua chín như sau: Nước 94% − 95%; vật chất còn lại: 5% − 6% bao gồm các chất sau: - 55% đường (fructo, gluco, sucro). - 21% chất không hòa tan trong rượu (protein, xenlulo, pectin, pictin, polysaccarit). - 12% axit hữu cơ (citric, malic, galacturonic, pyrrolidonk cacboxylic). - 7% chất vô cơ, 5% các chất khác (carotenoit, axit ascorlic, amino axit, …). Trên 100 mẫu giống trồng tại vùng Gia Lâm, Hà Nội có thành phần hóa học chủ yếu như sau: - Chất khô: 4,3% − 6,4%. - Đường tổng số: 2,6% − 3,5%. - Hàm lượng các chất tan: 3,6% − 6,2%. - Axit tổng số: 0,22% − 0,72%. - Hàm lượng vitamin C: 17,1% − 38,81%. 1.1.2. Nguồn gốc – Phân bố – Ý nghĩa kinh tế: 1.1.2.1. Nguồn gốc: Cà chua có nguồn gốc ở Peru, Bôlivia, Equador. Trước khi Christophe Colombo phát hiện ra châu Mỹ thì ở Pêru và Mêhico đã trồng cà chua. [10,34] Những loài cà chua hoang dại gần gũi với cà chua được trồng ngày nay vẫn tìm thấy dọc theo dãy núi Andes (Pêru), Equador và Bôlivia, như ở đảo Galapagos. [10,34] 1.1.2.2. Phân bố: Quá trình thuần hóa và du nhập của cà chua đến các châu lục có thể tóm lược như sau: HVTH: Leâ Hoaøn Haûo Toång quan taøi lieäu - Trang 5 - - Cà chua được người Aztec và người Toltec mang đến châu Âu. Đầu tiên, người Tây Ban Nha đem cà chua từ châu Âu về, sau đó đem đến vùng Địa Trung Hải. [10,34] - Năm 1554, nhà nghiên cứ thực vật Pier Andrea Mattioli giới thiệu những giống cà chua từ Mêhicô có màu vàng và đỏ nhạt, đây cũng chính là thời điểm chứng minh sự tồn tại của cà chua trên thế giới. Ở Bắc Âu, lúc đầu người ta trồng cà chua là để trang trí và thỏa tính tò mò, đó là những năm thuộc thế kỷ 17. Năm 1710, Thomas Jefferson đã trồng cà chua trong vườn nhưng không thu được kết quả đáng kể trong việc cải tiến giống. Đến năm 1750, cà chua được trồng ở Anh để làm thực phẩm. Cà chua được gọi với nhiều tên khác nhau; ở Ý, cà chua được gọi là Pomid’oro hay Golden apple (quả táo vàng); ở Pháp, người ta gọi chua là Pomme d’amour (táo tình yêu). Mặc dù cà chua có nhiều tên khác nhau nhưng vào thời đó người ta vẫn chưa được chấp nhận là cây thực phẩm. Vì đâu đó người ta vẫn còn quan điểm cho rằng cà chua có chất độc vì cây cà chua có họ hàng với cây cà độc dược, quan niệm này vẫn tồn tại ở một vài nơi cho đến thế kỷ 20. Đầu thế kỷ 18, giống cà chua trở nên phong phú, đa dạng, nhiều vùng đã dùng nó làm thực phẩm. Vào cuối thế kỷ này, cà chua mới được dùng làm thực phẩm ở Nga. Đến thế kỷ 19, cà chua đã trở thành thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn hàng ngày của nhiều nước. Năm 1860, những giống cà chua mới đã được giới thiệu ở Mỹ và cũng là thời điểm cà chua trở thành cây trồng chính ở Pháp. [10,34] Hình 1.2: Trồng cà chua bi trong máy AeroGarden in black HVTH: Leâ Hoaøn Haûo Toång quan taøi lieäu - Trang 6 - - Những tiến bộ ban đầu về dòng, giống cà chua hoàn toàn xuất phát từ châu Âu. Năm 1863, 23 giống cà chua được giới thiệu, trong đó giống Trophy được coi là giống có chất lượng tốt với giá 5 USD 1 gói nhỏ gồm 20 hạt giống. [10,34] - Chương trình thử nghiệm của Liberty, Hyde Bailey tại trường nông nghiệp Michigan (Mỹ) bắt đầu từ năm 1886, tác giả đã tiến hành chọn lọc, phân loại giống cà chua trồng trọt. Từ năm 1870 đến năm 1893, A.W.Livingston đã giới thiệu 13 giống cà chua trồng trọt được chọn lọc theo phương pháp chọn lọc cá thể. Cuối thế kỷ 19 có trên 200 dòng, giống cà chua đã được giới thiệu rộng rãi. Quá trình chọn tạo giống cà chua vẫn được tiến hành thường xuyên cho đến ngày nay. [10,34] 1.1.2.3. Ý nghĩa kinh tế: Cà chua là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao được trồng rộng rãi trên thế giới. Theo số liệu thống kê của FAO năm 2004 thì diện tích và sản lượng cà chua năm 2003 trên thế giới như sau: 4.310.669 ha và 113.308.298 tấn. [10,34] Châu Á là khu vực đứng đầu về sản xuất cà chua, thứ đến là châu Âu. Mỹ là nước đứng đầu về cả 2 lĩnh vực năng suất và giá trị trên 1 ha gieo trồng. Trên thế giới, sản xuất cà chua đứng thứ hai sau khoai tây.[10,34] Trung Quốc có diện tích trồng cà chua lớn nhất thế giới (trên 753 ngàn ha), tiếp theo là Ấn Độ (365 ngàn ha), Anh (300 ngàn ha), Ai Cập (180 ngàn ha), Mỹ (170 ngàn ha) và Anh (140 ngàn ha). [10,34] Về năng suất (tấn/ha) đạt cao nhất phải kể đến Mỹ (66,5), tiếp theo là Hà Lan (42,85), Anh (37,76), Ai Cập (35,5), Bỉ (33,33), Trung Quốc (25,62), …. [10,34] Nhìn chung châu Á có diện tích trồng lớn nhưng năng suất còn thấp (23,8 tạ/ha), năng suất cà chua toàn thế giới khoảng 27,51 tấn/ha. [10,34] Ở Việt Nam, cà chua được trồng trên 100 năm nay, diện tích trồng trọt hàng năm diễn biến từ 15 – 17 ngàn ha, sản lượng 280 ngàn tấn, bình quân đầu người 3 kg/năm, tiêu thụ cà chua của người Việt Nam hiện nay chỉ bằng 1/5 của người Trung Quốc (16kg/người/năm). [10,34] Nơi tiêu thụ cà chua lớn nhất là châu Âu rồi đến châu Á, Bắc Mỹ và Nam Mỹ. [10,34] HVTH: Leâ Hoaøn Haûo Toång quan taøi lieäu - Trang 7 - Cà chua có thể dùng làm quả tươi, xào, nấu, nước giải khát. Cà chua còn là nguyên liệu chế biến thành nhiều sản phẩm như: cà chua cô đặc, nước quả, nước sốt, tương cà chua, tương ớt, cà chua đóng hộp, …. [10,34] 1.1.3. Phân loại thực vật: Cà chua là thành viên trong họ cà, chi Lycopersicon, thông thường phân loại thành 2 chi phụ dựa vào màu sắc quả. [10,34] Chi phụ Eulycopersicon (red fruited): quả của chi phụ này có màu đỏ hoặc vàng, hoa to, cho quả quanh năm. [10,34] Chi phụ Eriopersicon (green fruited): quả của chi phụ này có màu xanh, trên quả có sọc tía, có lông, hạt nhỏ. [10,34] Cà chua là cây thân thảo hàng năm hoặc thân thảo lưu niên. [10,34] Sự phân loại của chi Lycopersicon: [10,34] ƒ Chi phụ Eulycopersicon (quả đỏ) gồm 2 loài: - Lycopersicon Esculentum: cà chua thông thường - Lycopersicon Pimpinellifolium: cà chua nho. ƒ Chi phụ Eriopersicon (quả xanh) gồm 5 loài: - L.Cheesmanii: hoang dại - L.Chilense: hoang dại - L.Glandulosum: hoang dại - L.Hirstum: hoang dại - L.Peruvianum: hoang dại. 1.1.4. Đặc điểm thực vật: 1.1.4.1. Hệ rễ: Hệ rễ cà chua thuộc loại rễ chùm, ăn sâu trung bình, rễ phụ cấp 2 phân bố dày đặc trong đất khi cây sinh trưởng mạnh. Khi gieo thẳng, rễ cà chua có thể ăn sâu tới 1,5 m; nhìn chung ở độ sâu dưới 1 m, rễ ít; khả năng hút nước và dinh dưỡng ở độ sâu 0,5 m yếu. Hệ rễ phân bố chủ yếu ở tầng đất 0 – 30 cm. Khả năng tái sinh của hệ rễ cà chua mạnh, khi rễ chính bị đứt, rễ phụ phát triển mạnh. Khi nhổ hoặc vận chuyển cây giống, một số rễ sẽ bị rơi rụng rồi khô héo, nhưng rễ mới sẽ nhanh HVTH: Leâ Hoaøn Haûo Toång quan taøi lieäu - Trang 8 - chóng phát triển, rễ cà chua hóa bần chậm nên nhanh chóng hút nước và chất dinh dưỡng sau khi trồng. Cây cà chua còn có khả năng sinh ra rễ bất định, loại rễ này tập trung chủ yếu ở đoạn thân dưới 2 lá mầm. Sự phát triển của hệ rễ phụ thuộc vào bộ phận trên mặt đất và các yếu tố khác (điều kiện ngoại cảnh và kỹ thuật trồng trọt). Rễ phụ phát triển tốt ở nhiệt độ 18 – 200C; còn ở nhiệt độ 14 – 160C, sự phát triển của hệ rễ chậm lại 15 – 20 ngày, nhiệt độ đất trên 390C thì hệ rễ cà chua sinh trưởng kém. Hệ rễ cà chua chịu hạn tương đối tốt, nhưng rễ sinh trưởng tốt ở độ ẩm đất 70 % – 80 %. [10,34] 1.1.4.2. Thân: [10,34] Đặc tính của thân cà chua là bò lan ra xung quanh hoặc mọc thành bụi, là loại thân nho, có thể phân chia thành 3 loại theo chiều cao cây: - Loại lùn: cây mập, thấp lùn, lóng ngắn, cây thường mọc thành bụi, chiều cao cây thấp hơn 65 cm. Trong kỹ thuật trồng trọt, không cần làm giàn, tạo hình 3 – 4 cành/cây, tăng mật độ hợp lý để tăng năng suất trên đơn vị diện tích. - Loại cao: cây cao trên 120 cm trở lên, thân lá phát triển mạnh, có những giống cao 150 – 200 cm như LV200, P375, …. Trong kỹ thuật trồng trọt, ta cần làm giàn, tỉa cành tạo hình, tỉa hoa, quả. - Loại cao trung bình: một số tác giả D.H. Van Sloten (1975) và Tạ Thu Cúc (1985) … phát hiện thấy giữa hai loại thấp cây và cao cây còn có loại trung gian, những giống thuộc loại này có chiều cây cao 65 cm < h ≤ 120 cm, thân lá sinh trưởng mạnh, là loại hình thích hợp cho nhiều mùa vụ và nhiều vùng sinh thái. Trong sản xuất cần phải làm giàn, tỉa cành, tạo hình. Thân cây cà chua thay đổi trong quá trình sinh trưởng, ở thời kỳ vườn ươm, thân cây tròn, thường có màu tím nhạt, giòn, dễ gãy. Khi trưởng thành, thân cây có màu xanh nhạt, trên thân cây có lông tơ tập trung ở phần non. Cây trưởng thành, thân thường có tiết diện đa giác, cứng, phần gốc hóa gỗ. Đặc điểm của thân cà chua là phát triển theo kiểu lưỡng phân, các chùm hoa được sinh ra từ thân chính. Vì vậy, thân chính có vị trí quan trọng đối với sản lượng quả trên cây. HVTH: Leâ Hoaøn Haûo Toång quan taøi lieäu - Trang 9 - Nhìn chung, chiều cao cây thay đổi theo giống nhưng cũng thay đổi theo điều kiện ngoại cảnh và kỹ thuật trồng trọt. Các chồi ở nách lá phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ không khí thích hợp. Chồi nách khi trưởng thành đều có khả năng ra hoa, đậu quả, nhưng sản lượng của cành, nhánh thay đổi theo vị trí trên cây. Những cành ở sát ngay dưới chùm hoa thứ nhất của thân chính cho năng suất quả tương đương thân chính. Vì vậy, khi tạo hình, tỉa cành nên để thân chính và một thân phụ dưới chùm hoa thứ nhất. Những nhánh khác cần tỉa bỏ kịp thời để tập trung dinh dưỡng vào quả. 1.1.4.3. Lá: Lá cà chua thuộc loại lá kép lông chim lẻ, mỗi lá hoàn chỉnh có 3 – 4 đôi lá chét, ngọn lá có một phiến lá riêng rẽ gọi là lá đỉnh. Trên lá còn có những lá giữa nằm giữa những đôi lá chét, lá bên nằm ngay trên gốc những lá chét. [10,34] Lá là đặc trưng hình thái để phân biệt giống. Màu sắc lá thay đổi từ xanh vàng đến xanh thẫm. Số lá trên cây là đặc tính di truyền của giống, nhưng cũng chịu chi phối bởi nhiệt độ. Để hình thành 10 lá đầu sau khi trồng cần nhiệt độ trung bình trên 130C, khi hình thành 20 lá cần nhiệt độ trung bình ngày đêm là 240C, nhiệt độ cao trên mức để xuất hiện một lá mới được xem là ngưỡng của nhiệt độ. [10,34] 1.1.4.4. Hoa: Hoa cà chua là loại hoa hoàn chỉnh (gồm lá đài, cánh hoa, nhị, nhụy). Cà chua là cây tự thụ phấn chủ yếu, do đặc điểm cấu tạo của hoa; các bao phấn quanh nhụy thường cao hơn nhụy, núm nhụy thông thường chín sớm hơn phấn hoa, hoa cà chua nhỏ, màu sắc hoa và mùi vị không hấp dẫn côn trùng. Tuy vậy, hiện tượng thụ phấn chéo cũng xảy ra là do cấu tạo của hoa (nhụy cao hơn nhị), giống và thời vụ gieo trồng …. [10,34] Ở vùng ôn đới, thụ phấn chéo chiếm tỷ lệ 0,5 – 4%; ở vùng nhiệt đới từ 10 – 15%. Ở ngoài trời, phấn hoa di chuyển nhờ gió, gió làm cho hạt phấn rơi ra dễ dàng và thực hiện quá trình tự thụ phấn. [10,34] Trồng cà chua trong nhà kính, nhà lưới cần tác động bằng cách rung cây, rung cành để giúp cho hạt phấn ra khỏi bao phấn. [10,34] HVTH: Leâ Hoaøn Haûo Toång quan taøi lieäu - Trang 10 - Màu sắc của hoa thay đổi theo quá trình phát triển từ màu vàng xanh đến vàng tươi rồi vàng úa. Trong kỹ thuật lai, người tạo giống thường khử đực trên cây mẹ khi hoa có màu vàng xanh, tràng hoa chưa tách rời. Lấy phấn hoa trên cây bố khi hoa nở cực đại, có màu vàng tươi là tốt nhất. [10,34] Hoa cà chua mọc thành chùm, hoa đính vào chùm bởi cuống ngắn. Một lớp tế bào riêng rẽ hình thành ở cuống hoa, vì một nguyên nhân nào đó (nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm,…) tầng rời sẽ được hình thành, lớp tế bào ở đó bị chết và hoa rụng. [10,34] Chùm hoa cà chua có 3 loại: đơn giản, trung gian, phức tạp. Loại chùm đơn giản chỉ có một trục chính, hoa mọc so le trên trên trục. [10,34] Loại chùm trung gian thường có 2 nhánh, loại chùm phức tạp có nhiều nhánh. Số chùm hoa trên cây trong một chu kỳ sống khoảng 20 chùm, cũng có thể nhiều hơn, điều đó phụ thuộc vào giống và điều kiện ngoại cảnh. [10,34] Số hoa trên chùm của loài trồng trọt từ 3 – 20 hoa, thông thường từ 5 – 7 hoa. [10,34] Điều kiện cần thiết cho quá trình phân hóa mầm hoa và hình thành hoa: nhiệt độ ban ngày 20 – 250C, nhiệt độ ban đêm 13 – 150C, độ ẩm đất 60 – 70 %, độ ẩm không khí 55 – 65 %, cường độ ánh sáng tối thiểu là 400 lux. [10,34] Khi nhiệt độ là 200C thì hoa to, tỷ lệ đậu hoa cao. Chất dinh dưỡng cũng rất quan trọng trong quá trình ra hoa, khi cây có đầy đủ nước, đạm và đường được dự trữ trong quá trình sinh trưởng thì cây sẽ hình thành nhiều mầm hoa. Trong quá trình phát triển, hạt phấn chịu ảnh hưởng của nhiệt độ rất lớn, nhiệt độ thấp dưới 150C và cao trên 350C hạt phấn bị ức chế, phát triển không bình thường gây ra hiện tượng thụ phấn không đầy đủ. Bầu quả phát triển không bình thường tạo thành những vết lõm sâu, làm cho quả bị nhăn, quả dị hình làm giảm giá trị hàng hóa. [10] Nhiệt độ thích hợp cho hạt phấn cà chua phát triển từ 21 – 240C, hạt phấn không nảy mầm khi nhiệt độ đất dưới 100C và trên 350C. Nghiên cứu sự phát triển của hạt phấn trong điều kiện nhiệt độ cao được xem là phương pháp hữu hiệu để chọn tạo ra giống cà chua nhiệt. [10,34] Căn cứ vào đặc điểm ra hoa của cà chua có thể phân chia thành 3 loại: HVTH: Leâ Hoaøn Haûo Toång quan taøi lieäu