Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Giáo dục - Đào tạo Cao đẳng - Đại học Xây dựng chứng nội (internal amplification control) cho quy trình phát hiện thàn...

Tài liệu Xây dựng chứng nội (internal amplification control) cho quy trình phát hiện thành phần có nguồn gốc từ động vật trong thực phẩm chay dựa trên gen rdna.

.PDF
68
121
58

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: XÂY DỰNG CHỨNG NỘI (INTERNAL AMPLIFICATION CONTROL) CHO QUY TRÌNH PHÁT HIỆN THÀNH PHẦN CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT TRONG THỰC PHẨM CHAY DỰA TRÊN GEN 16S rDNA KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ GVHD: ThS. Lao Đức Thuận SVTH: Phan Thị Trâm MSSV: 1153010895 Khóa: 2011 – 2015 Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: XÂY DỰNG CHỨNG NỘI (INTERNAL AMPLIFICATION CONTROL) CHO QUY TRÌNH PHÁT HIỆN THÀNH PHẦN CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT TRONG THỰC PHẨM CHAY DỰA TRÊN GEN 16S rDNA KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ GVHD: ThS. Lao Đức Thuận SVTH: Phan Thị Trâm MSSV: 1153010895 Khóa: 2011 - 2015 Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015 LỜI CẢM ƠN Trong thực tế không có sự thành công nào không gắn liền với những sự hỗ trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác. Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập ở giảng đường đại học đến nay, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô Khoa Công Nghệ Sinh Học - Trường Đại Học Mở Tp. Hồ Chí Minh đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại trường. Và đặc biệt em xin chân thành cảm ơn thầy ThS. Lao Đức Thuận đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ em qua từng buổi nói chuyện, thảo luận về đề tài. Nếu không có những lời hướng dẫn, dạy bảo của thầy em nghĩ bài báo cáo này của em rất khó có thể hoàn thiện được. Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy. Con cảm ơn gia đình đã tiếp thêm nguồn động lực, luôn bên cạnh chăm sóc, an ủi, động viên lúc con gục ngã, yếu lòng và cảm ơn những người bạn tốt luôn ở bên tôi chia sẻ những vui buồn, bên tôi những lúc khó khăn nhất. Bài báo cáo được thực hiện trong khoảng thời gian 5 tháng. Kiến thức của em còn hạn chế và nhiều bỡ ngỡ. Do vậy, không tránh khỏi những thiếu sót là điều chắc chắn, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của quý Thầy Cô để kiến thức của em hoàn thiện hơn. Sau cùng, em xin kính chúc quý Thầy Cô Khoa Công Nghệ Sinh Học thật dồi dào sức khỏe, niềm tin để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau. Trân trọng. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015 Sinh viên thực hiện Phan Thị Trâm DANH MỤC VIẾT TẮT µL – microlit 16S rRNA – gen 16S ribosome RNA BLAST – Basic Local Alignment Search Tool bp – base pair DNA – Deoxyribo Nucleic Acid g – gam IDT – Integrated DNA Technologies mg – miligam mL – mililit mtRNA – mitochondria RNA NCBI – National Center for Biotechnology Information nm – nanomet OD – Optical Density PCR – Polymerase Chain Reaction RNA – Ribonucleic Acid S (16S) – đơn vị Svedberg (kí hiệu cho tốc độ lắng của các vật thể) Ta – nhiệt độ bắt cặp Tm – nhiệt độ nóng chảy của mồi Trang iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Biểu đồ thể hiện tình hình ăn chay của người Việt Nam Hình 1.2. Bản đồ bộ gen ty thể của con người Hình 1.3. Cấu trúc của lục lạp Hình 3.1. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của mồi TP1 Hình 3.2. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của mồi TP2 Hình 3.3. Cặp mồi TP1-TP2 được kiểm tra độ đặc hiệu và tương đồng bằng phần mềm Annhyb Hình 3.4. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của mồi xuôi CLO-1-F Hình 3.5. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của mồi ngược CLO-1-R Hình 3.6. Cặp mồi chứng nội được kiểm tra độ đặc hiệu và tương đồng bằng phần mềm Annhyb Hình 3.7. Kết quả điện di 6 mẫu thực phẩm chay trên thị trường Hình 3.8. Kết quả giải trình tự mẫu thực phẩm chay (mẫu 1) của mồi TP1 Hình 3.9. Kết quả giải trình tự mẫu thực phẩm chay (mẫu 1) của mồi TP2 Hình 3.10. Một số nucleotide đã hiệu chỉnh trên mạch xuôi (H1-F) bằng phần mềm Chromas lite 2.1.1 Hình 3.11. Kết quả BLAST giải trình tự mẫu 1 thực phẩm chay của mồi xuôi TP1 Hình 3.12. Trình tự DNA của mẫu 1 trên giao diện BLAST với kết quả loài tương đồng (Gallus gallus) Hình 3.13. Kết quả điện di với 1 mẫu thực vật, 1 mẫu động vật và 1 mẫu hỗn hợp thực vật : động vật Hình 3.14. Kết quả giải trình tự mẫu cải bắp của mồi CLO-1-F Hình 3.15. Kết quả giải trình tự mẫu cải bắp của mồi CLO-1-R Trang v Hình 3.16. Một số nucleotide đã hiệu chỉnh trên mạch xuôi (M1-F) bằng phần mềm Chromas lite 2.1.1 Hình 3.17. Kết quả BLAST giải trình tự mẫu cải bắp của mồi xuôi CLO-1-F Hình 3.18. Trình tự DNA của mẫu cải bắp trên giao diện BLAST với kết quả loài tương đồng (Brassica oleracea) Hình 3.19. Kết quả điện di với 5 mẫu thực phẩm chay trên thị trường Trang vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Bảng liệt kê các trình tự gen 16S rRNA của các loài động vật, thực vật và vi sinh vật Bảng 3.2. Các thông số đánh giá mồi của IDT cho phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA Bảng 3.3. Bảng cơ sở dữ liệu trình tự gen cpDNA Bảng 3.4. Các thông số đánh giá mồi của IDT cho phản ứng PCR khuếch đại gen lục lạp Bảng 3.5. Kết quả đo OD của 6 mẫu thực phẩm chay, 1 mẫu động vật, 1 mẫu thực vật Bảng 3.6. Bảng hiệu chỉnh các nucleotide tại các vị trí trên mạch xuôi (H1-F) Bảng 3.7. Bảng hiệu chỉnh các nucleotide tại các vị trí trên mạch xuôi (M1-F) Bảng 3.8. Kết quả đo OD của 5 mẫu thực phẩm chay, 1 mẫu động vật, 1 mẫu thực vật Trang vii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... iii DANH MỤC VIẾT TẮT ........................................................................................ iv DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................v DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... vii MỤC LỤC .............................................................................................................. viii ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1 PHẦN 1. TỔNG QUAN 1.1. THỰC PHẨM CHAY ...............................................................................3 1.1.1. Khái niệm ...................................................................................3 1.1.2. Lợi ích của việc ăn chay .............................................................3 1.1.3. Các thống kê/khảo sát về việc sử dụng thực phẩm chay ở Việt Nam và một số quốc gia trên thế giới ........................................4 1.2. THÔNG TIN VỀ GEN 16S rDNA ............................................................6 1.2.1. Ty thể ..........................................................................................6 1.2.2. Gen 16S rDNA ............................................................................8 1.3. CHỨNG NỘI - IAC (Internal Amplification Control) ..............................8 1.4. HƯỚNG NGHIÊN CỨU, PHÁT HIỆN DNA ĐỘNG VẬT TRONG THỰC PHẨM CHAY .............................................................................11 1.4.1. Trên thế giới .............................................................................11 1.4.2. Việt Nam ..................................................................................12 PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. KHẢO SÁT IN SILICO ...........................................................................14 2.1.1. Thu thập trình tự gen mục tiêu .................................................14 2.1.2. Kế thừa cặp mồi, kiểm tra độ đặc hiệu và tương đồng.............14 2.1.3. Danh mục các phần mềm sử dụng............................................14 2.2. THỰC NGHIỆM: KIỂM TRA TÍNH THUẦN CHAY CỦA 6 MẪU THỰC PHẨM CHAY .............................................................................15 Trang viii 2.2.1. Vật liệu .....................................................................................15 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu ..........................................................17 PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO TRÊN GEN TY THỂ 16S rRNA .24 3.1.1. Thu thập trình tự đích 16S rRNA .............................................24 3.1.2. Kế thừa và đánh giá mồi cho phản ứng PCR ...........................25 3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO CHỨNG NỘI.................................29 3.2.1. Thu thập trình tự gen mục tiêu .................................................29 3.2.2. Kế thừa và đánh giá mồi được chọn làm chứng nội.................31 3.3. THỰC NGHIỆM .....................................................................................34 3.3.1. Kiểm tra tính thuần chay của 6 mẫu thực phẩm chay ..............34 3.3.2. Kết quả đo mật độ quang sản phẩm tách chiết .........................35 3.3.3. Kết quả khảo sát với một số mẫu thực phẩm chay trên thị trường ..................................................................................36 3.3.4. Kết quả giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự của cặp mồi TP1-TP2 ...................................................................................37 3.3.5. Bước đầu thiết lập quy trình multi-PCR để khảo sát mồi chứng nội ...........................................................................41 3.3.6. Kết quả giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự của cặp mồi CLO-1 .......................................................................................42 3.3.7. Kết quả khảo sát multi-PCR với một số mẫu thực phẩm chay trên thị trường ...........................................................................46 PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN .............................................................................................50 4.2. ĐỀ NGHỊ .................................................................................................50 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................51 Trang ix ĐẶT VẤN ĐỀ Những tiến bộ trong nghiên cứu về dinh dưỡng vài thập kỷ qua đã thay đổi hiểu biết của các nhà khoa học về lợi ích của chế độ ăn chay đối với sức khỏe con người và bệnh tật [36]. Vì những lý do như tôn giáo, y tế, nền kinh tế và bảo tồn sinh thái, những người ăn chay đã trở thành một phần lớn dân số, tạo ra cơ hội kinh doanh lớn trong ngành công nghiệp thực phẩm [24] . Hiện nay, trên thị trường Việt Nam có rất nhiều sản phẩm thực phẩm chay từ các công ty hoặc các tiểu thương ở chợ như: chả cá chay, bò lát chay, cá thu sốt cà chay,…nhưng tính “thuần chay” chưa được xác nhận và đảm bảo. Một chế độ ăn chay được định nghĩa là trong đó không bao gồm thịt, hải sản, hoặc các sản phẩm có chứa những thành phần kể trên [12] . Nhiều người ăn chay hiện nay rất chú trọng đến tính “thuần chay”, nghĩa là không lẫn bất kì thành phần nào có nguồn gốc từ động vật. Đây là một đặc tính quan trọng trong chế biến và sản xuất thực phẩm chay [2]. Trình tự gen 16S ribosome RNA (rRNA) là trình tự được sử dụng rộng rãi để xác định loài vi khuẩn và thực hiện các nghiên cứu phân loại [9]. Trình tự đích chúng tôi chọn thuộc gen 16S rRNA bởi các lí do sau: (i) hiện diện ở hầu hết các loài vi khuẩn, (ii) có nhiều bản sao trong tế bào, (iii) bảo tồn cao, chức năng qua thời gian thường không có sự thay đổi, (iv) gen 16S rRNA (1,500 bp) đủ lớn cho mục đích nghiên cứu thông tin [33] , (v) mtDNA di truyền theo dòng mẹ nên có tính ổn định cao [30]. Một nhược điểm chính của hầu hết các nghiên cứu sử dụng phương pháp PCR được công bố cho thấy chúng không chứa chứng nội - điều khiển khuếch đại bên trong (IAC) [18]. Ủy ban Tiêu chuẩn hóa châu Âu (CEN), phối hợp với tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế (ISO), đã đề xuất một hướng dẫn chung cho thử nghiệm PCR đòi hỏi phải có sự hiện diện của IAC trong hỗn hợp phản ứng. Vì vậy, chỉ PCR chứa IAC mới có thể trải qua thử nghiệm hợp tác đa trung tâm và là một điều kiện tiên quyết cho việc chuẩn hóa [8]. Trong việc thiết lập chứng nội cho phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành chọn trình tự gen đích là cpDNA (chloroplast DNA). Lý do lựa chọn trình tự gen đích này Trang 1 do: (i) lục lạp là bào quan đặc trưng cho thực vật, (ii) trong mỗi lục lạp có chứa khoảng 50 - 100 bản sao DNA [13] , (iii) nguyên liệu làm thực phẩm chay có thành phần chủ yếu từ thực vật [36], (iv) cpDNA có tình bảo tồn cao [3]. Nhằm bổ sung cho đề tài thực tập tốt nghiệp “Kiểm tra tính thuần chay ở một số mẫu thực phẩm chay dựa trên gen 16S rDNA” được hoàn thiện hơn chúng tôi đã tìm hiểu và thực hiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp: “Xây dựng chứng nội (internal amplification control) cho quy trình phát hiện thành phần có nguồn gốc từ động vật trong thực phẩm chay dựa trên gen 16S rDNA”. Mục tiêu của nghiên cứu: Mục tiêu của đề tài là xây dựng chứng nội - IAC (internal amplification control) cho quy trình phát hiện thành phần có nguồn gốc từ động vật trong thực phẩm chay dựa trên gen 16S rDNA. Trang 2 PHẦN 1. TỔNG QUAN 1.1. THỰC PHẨM CHAY 1.1.1. Khái niệm Các thành phần của một chế độ ăn chay lành mạnh bao gồm nhiều loại rau, trái cây, ngũ cốc nguyên hạt, các loại đậu và các loại hạt [37]. Trong nghiên cứu này thực phẩm chay được hiểu là thực phẩm không chứa các thành phần có nguồn gốc từ động vật. Những người ăn chay hình thành các nhóm không đồng nhất bao gồm [15]: + Nhóm semivegetarians (thực vật, sản phẩm sữa, trứng và cá) + Nhóm lacto - ovo vegetarians (thực vật, sản phẩm sữa, trứng) + Nhóm người thuần chay (chỉ ăn thực vật) 1.1.2. Lợi ích của việc ăn chay Ngày nay, ăn chay đang phát triển toàn cầu và ngày càng được chấp nhận. Nguyên nhân chính của xu hướng này là vấn đề sức khỏe, đạo đức, sinh thái học và các vấn đề xã hội. Tương lai của việc ăn chay đầy hứa hẹn bởi vì dinh dưỡng đầy đủ là rất quan trọng cho sức khỏe con người. Ngày càng có nhiều người không muốn giết động vật, không muốn biến đổi khí hậu, để phòng tránh một số bệnh và đảm bảo một tương lai sống tốt hơn cho thế hệ mai sau [23]. Chế độ ăn chay thường có ít chất béo, đặc biệt là ít chất béo bão hòa, có nhiều chất xơ hơn. Nó cũng có thể bao gồm nhiều loại ngũ cốc nguyên hạt, các loại đậu, các loại hạt, protein đậu nành, và không hiện diện thịt màu đỏ, chế độ ăn chay này có thể cung cấp nhiều lợi ích về các vấn đề sức khỏe mãn tính, phòng ngừa và điều trị bệnh béo phì, bệnh tiểu đường và cả bệnh tim mạch. Mặc dù ăn chay có thể đáp ứng tất cả các nhu cầu dinh dưỡng của một cá nhân, nhưng cần đặc biệt chú ý đến một số chất dinh dưỡng để đảm bảo khẩu phần đầy đủ, đặc biệt là nếu người đó là người chỉ ăn chay [26]. Hiện nay có một số lượng đáng kể các nghiên cứu cho thấy những lợi ích sức khỏe của chế độ ăn chay và thực vật, trong đó có liên quan đến việc giảm nguy cơ béo phì, tiểu đường, bệnh tim, và một số loại ung thư cũng như tăng tuổi thọ. Trong một nghiên cứu bệnh chứng ở một bệnh viện cựu chiến binh tại Trang 3 Đài Loan, cho thấy việc tiêu thụ các loại thực phẩm chay địa phương có lượng chất béo thấp có tác dụng bảo vệ chống lại ung thư tuyến tiền liệt đối với nam giới trong quần thể nghiên cứu này [10]. Quan điểm cho rằng chế độ ăn uống có thể ảnh hưởng đến bệnh viêm thấp khớp (Rheumatoid Arthritis - RA) là một trong văn hóa dân gian, nhưng thông tin hỗ trợ khoa học cho quan điểm này còn ít. Kết quả nghiên cứu cho thấy điều trị bằng chế độ ăn uống có thể là một loại thuốc hỗ trợ có giá trị cho việc điều trị cho RA [22]. Các nghiên cứu dịch tễ học cũng cho rằng một chế độ ăn chay cân bằng cũng có nhiều lợi ích sức khỏe, tỷ lệ mắc các bệnh về hệ tuần hoàn ở người ăn chay thấp hơn so với người ăn động vật. Nghiên cứu này còn đưa ra một lối sống thường xuyên ăn chay không có tác động tiêu cực đến tình trạng sức khỏe ở người cao tuổi [14]. Nghiên cứu của Sharma S. và cs (2014) cho rằng ăn chay là một lựa chọn an toàn và hữu hiệu đối với các bệnh nhân bị bỏng [38] . Và một trong những phát hiện bất ngờ nhất trong dịch tễ học dinh dưỡng cho rằng ăn các loại hạt dường như giúp bảo vệ chống lại bệnh tim do thiếu máu cục bộ (Ischaemic Heart Disease - IHD). Tần suất tiêu thụ các loại hạt được phát hiện tỷ lệ nghịch với tất cả các nguyên nhân gây tử vong ở một số nhóm dân số như người da trắng, da đen và đặc biệt đối với người già. Như vậy, tiêu thụ hạt có thể không chỉ giúp bảo vệ chống lại IHD, mà còn làm tăng tuổi thọ [35]. 1.1.3. Các thống kê/khảo sát về việc sử dụng thực phẩm chay ở Việt Nam và một số quốc gia trên thế giới 1.1.3.1. Việt Nam Tháng 8 - 2012, công ty nghiên cứu thị trường trực tuyến W&S đã thực hiện một cuộc khảo sát nhanh trên 659 người về “Xu hướng ăn chay của người Việt Nam” nhằm tìm hiểu về nét văn hóa ẩm thực đặc biệt này. Cuộc khảo sát được tiến hành điều tra trên 355 nam và 304 nữ từ 16 tuổi trở lên. Trong tổng số 659 người tham gia khảo sát thì có hơn một nửa thường xuyên ăn chay (chiếm 58,9%). Trang 4 Hình 1.1. Biểu đồ thể hiện tình hình ăn chay của ngƣời Việt Nam Đa số thường ăn chay vào các thời điểm như ngày rằm và mồng một hàng tháng, hay vào những dịp lễ lớn của Phật giáo. Giữa nam giới và nữ giới không có sự khác biệt nhiều về mức độ thường xuyên ăn chay. Kết quả khảo sát còn cho thấy có 3 lý do ăn chay được nhiều người đồng tình nhất: (i) vì ăn chay giúp tâm hồn thanh thản, nhẹ nhàng (40,7%), (ii) vì họ muốn cầu nguyện (39%) và (iii) ăn chay giúp mọi người bổ sung/ngăn ngừa một số chất, giúp tăng cường bảo vệ sức khỏe (33,1%). 46% trong tổng số 659 người tham gia trả lời khảo sát cho biết ăn chay là một việc có ý nghĩa đối với cuộc sống của họ. Ăn chay ngày nay không còn đơn thuần là vì sức khỏe của mỗi cá nhân, con người riêng biệt mà còn được nâng lên một tầm cao mới. Mọi người còn ăn chay để hướng tới cộng đồng nhân loại toàn cầu, bảo vệ môi trường sinh thái, hệ động thực vật trên Trái Đất. 1.1.3.2. Một số quốc gia trên thế giới Theo một cuộc thăm dò ý kiến của Hiệp hội các Nhà hàng Quốc gia thì người dân Hoa Kỳ đang quan tâm nhiều hơn đến món ăn chay trong các thực đơn. Từ năm 1970 đến năm 2007, số người ăn chay gia tăng khoảng 30%. Sự phổ biến các thông tin sự liên hệ mật thiết giữa chế độ ăn uống và bệnh tật là một nguyên do thúc đẩy phong trào ăn chay gia tăng ở Mỹ và những nước Tây Âu [6]. Vào năm 2009, cuộc thăm dò của Vegetarian Resource Group cho biết ở Hoa Kỳ có 8% số người trưởng thành nói họ không bao giờ ăn thịt và các loại hải sản. Cũng theo thăm dò của nhóm này vào năm 2010, có 7% trẻ em tuổi từ 8 - 18 và Trang 5 12% trẻ em nam tuổi từ 10 - 12 không bao giờ ăn thịt. Ngoài ra, qua sách sử từ xưa còn ghi nhận, việc ăn chay đã được sự ủng hộ bởi các danh nhân thế giới như: nhà toán học Pythagoras, nhà thi họa điêu khắc Leonard da Vinci, triết gia Pháp Jean Jacques Rousseau, nhà kinh tế Adam Smith, nhà tiểu thuyết Nga Leo Tolstoy, Tổng thống Mỹ Thomas Jefferson, Benjamin Franklin, và Mahatma Gandhi,…[6]. Ở Ấn Độ, đất nước đông dân thứ hai trên thế giới, với dân số hơn 1,2 tỷ người có khoảng 500 triệu người ăn chay [55]. Tính đến năm 2007, tổ chức Lương thực và Nông nghiệp của Liên hiệp quốc (FAO) đã thống kê và chỉ ra rằng người Ấn Độ có tỷ lệ tiêu thụ thịt thấp nhất trên thế giới [46]. Theo tổ chức Almanac of Food Consumption Survey in Taiwan (AFCST) thuộc Hội đồng Nông nghiệp năm 2007 số người ăn chay chiếm 14% dân số của Đài Loan, tăng 2% so với hai năm trước đây [16]. 1.2. THÔNG TIN VỀ GEN 16S rDNA 1.2.1. Ty thể Ty thể có trong tất cả các tế bào sinh vật nhân chuẩn. Ty thể được xem là trung tâm năng lượng của tế bào [5]. Ty thể khác với hầu hết các bào quan khác vì nó có DNA dạng vòng và sao chép một cách độc lập trong tế bào. Nó còn là một ví dụ rõ ràng của thuyết nội cộng sinh [51]. MtDNA (mitochondrial DNA – gen ty thể) có đặc điểm là đơn bội, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ [30]. Ngoài ra, một ty thể chứa 2 - 10 bản sao mtDNA và có 100 – 10.000 bản sao của mtDNA trong một tế bào [30]. Chiều dài của mtDNA là 16.569 bp [52] , mtDNA có chứa thông tin về protein ribosome thuộc ty thể như tRNAs, rRNAs và protein. Ty thể chứa ribosome, chịu trách nhiệm cho tất cả các hoạt động tổng hợp protein xảy ra trong ty thể. mRNA được tổng hợp tại ty thể vẫn có trong các cơ quan khác và được dịch mã bởi ribosome ty thể. Các phân tử mtDNA đã được nghiên cứu trong một loạt các sinh vật, và vì nó tương đối nhỏ nên rất nhiều tiến bộ đạt được trong việc xác định các tổ chức gen chính xác của nó [21] . Không giống như DNA trong nhân, mtDNA không bị xáo trộn ở mọi thế hệ, do đó nó được cho là thay đổi với một tốc độ chậm hơn, Trang 6 rất hữu ích cho việc nghiên cứu về tiến hóa. mtDNA còn được sử dụng trong khoa học pháp y như một công cụ để xác định xác chết hoặc các bộ phận cơ thể, và chúng cũng liên quan đến một số bệnh di truyền, chẳng hạn như bệnh Alzheimer và bệnh tiểu đường [51] . mtDNA mã hóa cho 37 gen: 13 tiểu đơn vị peptide của ty thể, 2 rRNAs, 22 tRNA. Chuỗi nặng (H) - vòng ngoài: giàu guanines, có 28 gen còn chuỗi nhẹ (L) - vòng trong: giàu cytosines, có 9 gen: gồm ND6 và 8 tRNA [52]. Hình 1.2. Bản đồ bộ gen ty thể của con ngƣời [44] (Các gen mã hóa cho các tiểu đơn vị của phức hợp I (ND1-ND6 và ND4L) được thể hiện bằng màu xanh; cytochrome c oxidase (COI-COIII) màu đỏ; cytochrome b của phức III màu xanh lá cây; và các tiểu đơn vị tổng hợp ATP (ATPase 6 và 8) màu vàng. Hai RNA ribosome (12S và 16S được thể hiện bằng màu tím) và 22 tRNA được đánh dấu bởi các đường màu đen và được ký hiệu bằng chữ cái, nó cần thiết cho sự tổng hợp protein của ty thể. Các vòng lặp (D-loop), khu vực kiểm soát không mã hóa, bao gồm các trình tự quan trọng cho sự khởi đầu của sao chép và phiên mã Trang 7 của mtDNA, trong đó có vùng khởi đầu sao chép cho chuỗi nặng (OH), chuỗi nhẹ (OL) [44]) 1.2.2. Gen 16S rDNA Các rRNA có mặt trong tất cả các loài [31]. Trong hệ gen của tất cả các sinh vật có trình tự DNA mã hóa cho các RNA ribosome (rRNA), thành phần cần thiết cho sự tổng hợp protein của tế bào. Ở thực vật DNA ribosome (rDNA) được tìm thấy trong gen hạt nhân, ty thể, lục lạp. Sự tồn tại khắp nơi của rDNA trong tự nhiên và sự phát triển của các kỹ thuật để xác định nhanh các trình tự nucleotide chủ yếu của các phân tử rRNA trong rDNA phát triển ở mức tương tự, vì vậy một số khu vực thuộc gen này rất có ích cho việc so sánh bằng hoặc thấp hơn mức chi, các khu vực khác chỉ có ích ở cấp độ họ hoặc mức cao hơn [17]. Gen 16S rRNA có chiều dài khoảng 1,500 bp [39]. Trình tự gen 16S rRNA bảo tồn mức độ cao trong giới vi khuẩn >60% ngay cả các vi khuẩn có khoảng cách tiến hóa xa nhất. Tỉ lệ đột biến trên gen 16S rRNA cũng giống các gen khác trên nhiễm sắc thể vi khuẩn. Tuy nhiên, chúng thay đổi chậm và phần nào coi như là hằng số [39]. Gen 16S rDNA có một số vùng bảo tồn mạnh mẽ trên khắp các loài, thích hợp cho việc thiết kế mồi khuếch đại đoạn gen của nhiều loài khác nhau, xen kẽ với các vùng ngắn khác ít được bảo tồn hơn thể hiện đặc trưng cho các loài khác nhau và đây là giá trị về phát sinh loài của gen ty thể [20]. Trình tự gen 16S rRNA là trình tự được sử dụng rộng rãi để xác định loài vi khuẩn và thực hiện các nghiên cứu phân loại [9]. Trình tự đích chúng tôi chọn thuộc gen 16S rRNA bởi các lí do sau: (i) hiện diện ở hầu hết các loài vi khuẩn, (ii) có nhiều bản sao trong tế bào, (iii) bảo tồn cao, chức năng qua thời gian thường không có sự thay đổi, (iv) gen 16S rRNA (1,500 bp) đủ lớn cho mục đích nghiên cứu thông tin [33], (v) mtDNA di truyền theo dòng mẹ nên có tính ổn định cao. 1.3. CHỨNG NỘI - IAC (Internal Amplification Control) Một nhược điểm chính của hầu hết các nghiên cứu sử dụng phương pháp PCR được công bố cho thấy chúng không kèm theo chứng nội - (IAC) [18]. Trang 8 Ủy ban Tiêu chuẩn hóa châu Âu (CEN), phối hợp với tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế (ISO), đã đề xuất một hướng dẫn chung cho thử nghiệm PCR đòi hỏi phải có sự hiện diện của IAC trong hỗn hợp phản ứng. Vì vậy, chỉ PCR chứa IAC mới có thể trải qua thử nghiệm hợp tác đa trung tâm và là một điều kiện tiên quyết cho việc chuẩn hóa [8]. Chứng nội là một chuỗi DNA (không phải chuỗi gen mục tiêu) được khuếch đại trong cùng một phản ứng PCR với DNA mục tiêu. Trong một phản ứng PCR không có sự hiện diện của IAC, nếu kết quả phản ứng không như mong đợi (không có băng hoặc tín hiệu xuất hiện) có thể do không có trình tự gen mục tiêu trong phản ứng hoặc cũng có thể những lý do sau: sự cố của chu trình nhiệt, hỗn hợp phản ứng PCR không chính xác, polymerase hoạt động yếu hoặc quá ít và sự hiện diện của chất ức chế trong phản ứng PCR. Ngược lại, trong một phản ứng PCR có hiện diện của IAC, một tín hiệu điều khiển sẽ luôn luôn được tạo ra ngay cả khi không có gen mục tiêu. Khi không có tín hiệu của IAC hoặc tín hiệu của gen mục tiêu thì phản ứng PCR thất bại. Vì vậy, khi phương pháp PCR được sử dụng trong phân tích thường quy với một IAC, nếu nồng độ được điều chỉnh một cách chính xác sẽ phát hiện được kết quả âm tính giả. Kết quả âm tính giả gây ảnh hưởng lớn đến kết quả nghiên cứu, trong khi với kết quả dương tính giả chỉ cần lặp lại thí nghiệm tái kiểm tra mẫu để kiểm tra độ tin cậy [18]. Gen lục lạp Lục lạp là đơn vị cơ năng quang hợp nhờ đó mà cây xanh thu nhận năng lượng mặt trời tổng hợp nên chất hữu cơ từ CO2 và H2O, không cần phải lấy năng lượng ở dạng các chất hữu cơ có sẵn, nên các sinh vật quang hợp được gọi là tự dưỡng [5]. Trang 9 Hình 1.3. Cấu trúc của lục lạp [50] Chú thích: 1 – Màng ngoài 7 – Grana 2 – Khoảng giữa 2 màng 8 – Phiến thylakoid 3 – Màng trong (1+2+3: màng bao) 9 – Tinh bột 4 – Chất nền stroma 10 – Ribosome 5 – Thylakoid (bên trong) 11 – DNA 6 – Màng thylakoid 12 - Plastoglobule (túi chứa lipid) Các lục lạp có cấu trúc màng gồm màng ngoài và màng trong. Màng trong bao quanh một vùng không có màu xanh lục được gọi là chất nền (stroma), chất nền chứa các enzyme, các ribosome, RNA và DNA. Lục lạp có bộ gen độc lập và nguồn gốc tiến hóa giống với ty thể. Hệ thống quang hợp hấp thụ ánh sáng, chuỗi chuyền điện tử và ATP synthetase tất cả đều được chứa trong màng thứ ba tách biệt. Màng này hình thành một tập hợp các túi dẹp hình đĩa các thylakoid (bản mỏng), các thylakoid có xu hướng xếp chồng lên nhau tạo phức hợp grana [5]. Chloroplast DNA (cpDNA) - bộ gen lục lạp của thực vật là một gen được quan tâm của nhiều nghiên cứu về quá trình tiến hóa phân tử và hệ thống thực vật học. Một số tính năng của gen này đã tạo điều kiện phân tích tiến hóa phân tử. Bộ gen có Trang 10
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan