Tài liệu Xác định thành phần loài và một số đặc điểm sinh học phân tử của sán lá gan lớn ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TRUNG ƢƠNG -----------------o0o----------------- ĐỖ NGỌC ÁNH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA SÁN LÁ GAN LỚN Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI-2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TRUNG ƢƠNG ------------------o0o----------------- ĐỖ NGỌC ÁNH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA SÁN LÁ GAN LỚN Ở VIỆT NAM Chuyên ngành : Ký sinh trùng Mã số : 62 72 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Khắc Lực 2. PGS.TS. Trần Thanh Dƣơng HÀ NỘI – 2017 i LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành đƣợc công trình nghiên cứu này, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ của các cá nhân, tổ chức. Tôi xin bày tỏ lòng cám ơn tới Đảng ủy – Ban giám đốc Học viện Quân y, Ban lãnh đạo Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Quy Nhơn, Phân viện thú y Miền Trung, Bộ môn Ký sinh trùng và Côn trùng – Học viện Quân y, Phòng Khoa học và Đào tạo – Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng, Trạm thú y huyện Nghĩa Đàn – Nghệ An, Đại học Đồng Tháp, Chi cục thú y Đồng Tháp, Chi cục thú y Cần Thơ… đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thu thập mẫu vật, triển khai đề tài. Đặc biệt, tôi xin tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, sự cảm ơn chân thành tới những ngƣời thầy đáng kính là PGS.TS. Nguyễn Khắc Lực – Chủ nhiệm Bộ môn Ký sinh trùng và Côn trùng – Học viện Quân y, PGS.TS. Trần Thanh Dƣơng - Viện trƣởng Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng đã luôn theo sát, động viên, đôn đốc, tận tình chỉ bảo và trực tiếp hƣớng dẫn tôi trong quá trình học tập, thu thập mẫu vật, triển khai thí nghiệm, phân tích số liệu cũng nhƣ trong quá trình hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn GS. TS. Lê Bách Quang, TS. Phạm Văn Minh, TS. Lê Trần Anh, PGS.TS. Nguyễn Duy Bắc và các anh/chị em Bộ môn Ký sinh trùng và Côn trùng – Học viện Quân y; PGS. TS. Cao Bá Lợi, PGS.TS. Nguyễn Thu Hƣơng và các cán bộ của Phòng Khoa học và Đào tạo Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng đã tạo điều kiện thuận lợi và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài cũng nhƣ cho tôi đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận án của mình. Tôi xin cảm ơn chân thành tới Đề tài cấp Nhà nƣớc “Đặc điểm dịch tễ học và biện pháp phòng chống bệnh sán lá gan lớn ở Việt Nam”, mã số ii KC.10.26/06-10 thuộc Chƣơng trình Khoa học và Công nghệ trọng điểm cấp Nhà nƣớc “Nghiên cứu phát triển và ứng dụng công nghệ phục vụ bảo vệ, chăm sóc và nâng cao sức khỏe cộng đồng”, mã số KC.10/06-10 đã tài trợ một phần kinh phí cho tôi thực hiện luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp đã ủng hộ và giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới Cha, Mẹ ngƣời đã vất vả sinh thành và nuôi tôi khôn lớn để tôi có đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm nay! Cảm ơn toàn thể gia đình đã luôn sát cánh, động viên, giúp đỡ, chia sẻ khó khăn và truyền nhiệt huyết cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án. Hà Nội, tháng 5 năm 2017 Tác giả Đỗ Ngọc Ánh iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là do chính tôi thực hiện. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về tính trung thực, khách quan, khoa học của các kết quả trong nghiên cứu này. Hà Nội, tháng 3 năm 2017 Tác giả iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt ADN ARN Bp BL BR BW BYT CT-scan CS cox1 cob CT dNTP ELISA GOT GPT ITS IUPAC Tên tiếng Anh đầy đủ Acid deoxyribonucleic Acid ribonucleic Base pair Body length Body roundness Body width Computer tomography scan Cytochorome c oxydase subunit 1 Cytochrome b Deoxynucleoside triphosphates Enzyme linked immunosorbent assay Glutamic oxaloacetic transaminase Glutamic pyruvic transaminase Internal Transcribed Spacer International Union of Pure and Applied Chemistry KST LAMP Max Min MgCl2 nad1 NCBI OS PCR PCR-SSCP RFLP SR VS VS-P WHO Loop Mediated Isothermal Amplification Maximum Minimum Magnesium chloride Nicotinamide dehydrogenase subunit 1 National Center for Biotechnology Information Oral sucker Polymerase Chain Reaction PCR - Single –Strand Conformation Polymorphism Restriction fragment length polymorphism Ventral sucker Distance between the ventral sucker and the posterior end of the body World Health Organization Nghĩa/Tên tiếng Việt Axít deoxyribonucleic Axít ribonucleic Cặp base của chuỗi ADN Chiều dài cơ thể Chu vi cơ thể Chiều rộng cơ thể Bộ Y tế Chụp X quang cắt lớp vi tính Cộng sự Một gen thuộc hệ gen ty thể Một gen thuộc hệ gen ty thể Côn trùng Đơn vị cấu tạo nên ADN Phản ứng miễn dịch gắn men Enzyme trao đổi acid amin Enzyme trao đổi acid amin Đoạn giao gen Hiệp hội Hóa học thuần túy và Hóa học ứng dụng Quốc tế Ký sinh trùng Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt ADN Giá trị lớn nhất Giá trị nhỏ nhất Một loại muối Một gen thuộc hệ gen ty thể Trung tâm tin sinh học Quốc gia - Mỹ Giác miệng Phản ứng chuỗi Polymerase Kỹ thuật phân tích đa dạng đoạn ADN sợi đơn Kỹ thuật xác định đa hình độ dài đoạn giới hạn Sốt rét Giác bụng Khoảng cách từ giác bụng đến điểm cuối thân Tổ chức Y tế thế giới v MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 1.1. Sán lá gan lớn Fasciola spp. và bệnh do sán lá gan lớn (Fasciolosis) ... 3 1.1.1. Đặc điểm sinh học của Fasciola spp. .......................................................... 3 1.1.2. Đặc điểm của bệnh do Fasciola spp. ......................................................... 12 1.2. Một số yếu tố tác động và tỷ lệ nhiễm SLGL ở ngƣời và động vật ..... 15 1.2.1. Một số yếu tố tác động tới nhiễm sán lá gan lớn ở ngƣời và động vật ... 15 1.2.2. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở ngƣời và động vật ............................... 16 1.3. Các phƣơng pháp xác định loài sán lá gan lớn ......................................... 21 1.3.1. Các phƣơng pháp xác định loài Fasciola sp. ............................................ 21 1.3.2. Tính đa hình di truyền và tầm quan trọng của tính đa hình di truyền ở sán lá gan lớn ................................................................................................................ 29 1.3.3. Tình hình nghiên cứu xác định loài sán lá gan lớn ở Việt Nam .............. 35 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 39 2.1. Đối tƣợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu....................................... 39 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................. 39 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................... 39 2.1.3. Thời gian nghiên cứu .................................................................................. 40 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu...................................................................... 40 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu..................................................................................... 40 2.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu ..................................................................................... 40 2.2.3. Các phƣơng pháp và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu hình thái......... 45 2.2.4. Các phƣơng pháp và kỹ thuật sử dụng trong giám định loài, phân tích các đặc điểm phân tử.................................................................................................... 49 2.2.5. Những hạn chế của phƣơng pháp nghiên cứu ................................... 63 2.3. Đạo đức và y đức trong nghiên cứu ..................................................... 64 vi 2.4. Xử lý và phân tích kết quả nghiên cứu................................................. 64 2.4.1. Xử lý số liệu hình thái ................................................................................. 64 2.4.2. Xử lý số liệu về sinh học phân tử ............................................................... 64 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 68 3.1. Xác định một số chỉ số hình thái và phân loại sán lá gan lớn dựa vào hình thái học ................................................................................................ 68 3.1.1. Xác định một số chỉ số hình thái của sán lá gan lớn ................................. 68 3.1.2. Phân loại SLGL dựa vào một số chỉ số hình thái ..................................... 75 3.2. Kết quả xác định loài và phân tích một số đặc điểm phân tử sán lá gan lớn ở Việt Nam ............................................................................................ 77 3.2.1. Kết quả xác định loài và phân loại sán lá gan lớn ở Việt Nam................ 77 3.2.2. Kết quả xác định một số đặc điểm phân tử ............................................... 96 Chƣơng 4. BÀN LUẬN................................................................................. 112 4.1. Về kết quả xác định một số chỉ số hình thái và phân loài sán lá gan lớn dựa vào hình thái ........................................................................................ 112 4.1.1. Về kết quả xác định và phân tích một số chỉ số hình thái ...................... 112 4.1.2. Về kết quả phân loại sán lá gan lớn dựa vào hình thái ........................... 120 Về kết quả phân loại sán lá gan lớn.................................................................... 120 4.2. Kết quả xác định thành phần loài và phân tích một số đặc điểm phân tử của sán lá gan lớn ở Việt Nam ................................................................... 125 4.2.1. Về kết quả xác định thành phần loài sán lá gan lớn ở Việt Nam .......... 125 4.2.2. Về một số đặc điểm sinh học phân tử của sán lá gan lớn ở Việt Nam.. 134 KẾT LUẬN................................................................................................... 149 KIẾN NGHỊ.................................................................................................. 151 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ............................................. 152 DANH SÁCH CÁC BÀI BÁO KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ CÔNG BỐ ............................................................................................. 153 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 154 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn ở trâu/bò .............................................. 19 Bảng 1.2. Chiều dài và sự sai khác nucleotide của các gen thuộc hệ gen ty thể giữa Fasciola sp. (Fsp), F. gigantica (Fg) và F. hepatica (Fh) ..................... 30 Bảng 1.3. Số lƣợng các acid amin mã hóa bởi các gen và tỷ lệ sai khác acid amin giữa Fasciola sp. (Fsp), F. gigantica (Fg) và F. hepatica (Fh) ............ 31 Bảng 2.1. Danh sách các mẫu và gen đích giải trình tự ................................. 44 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ............................................................ 55 Bảng 2.3. Kích thƣớc sản phẩm PCR với mồi JB3, JB4.5 và kích thƣớc các mảnh cắt giới hạn với các enzyme RsaI, AluI ................................................ 60 Bảng 2.4. Kích thƣớc sản phẩm PCR với mồi ITS1-F, ITS1-R và kích thƣớc các mảnh cắt giới hạn với các enzyme RsaI ................................................... 61 Bảng 2.5. Danh sách các trình tự của SLGL tham khảo trên ngân hàng gen . 65 Bảng 3.1. Một số chỉ số hình thái của SLGL tại các khu vực nghiên cứu ..... 69 Bảng 3.2. Một số chỉ số hình thái của SLGL của các vật chủ khác nhau....... 70 Hình 3.3. Chiều dài SLGL thu từ dê, cừu tại Ninh Thuận và từ trâu tại Nghệ An 2015 .......................................................................................................... 71 Bảng 3.3. Kích thƣớc một số chỉ số hình thái của SLGL thu thập từ ngƣời .. 71 Bảng 3.4. Sự khác biệt của các chỉ số hình thái của SLGL thu từ bò tại các khu vực nghiên cứu ........................................................................................ 72 Bảng 3.5. Sự khác biệt hình thái của SLGL thu từ trâu tại các khu vực nghiên cứu .................................................................................................................. 73 Bảng 3.6. Sự khác biệt về hình thái của SLGL thu từ bò và trâu ................... 74 Bảng 3.7. So sánh hình thái của F. gigantica và Fasciola sp. ở Việt Nam .... 74 Bảng 3.8. Phân nhóm SLGL ở động vật theo khu vực địa lý dựa vào chiều dài cơ thể .............................................................................................................. 75 viii Bảng 3.9. Phân nhóm SLGL thu thập ở động vật dựa vào chiều dài cơ thể... 75 Bảng 3.10. Kích thƣớc các chỉ số hình thái của các nhóm SLGL .................. 76 Bảng 3.11. Phân nhóm SLGL theo tỷ số Dài/Rộng ....................................... 76 Bảng 3.12. Kích thƣớc các chỉ số hình thái của các nhóm SLGL phân loại theo tỷ số chiều dài/chiều rộng ....................................................................... 77 Bảng 3.13. Kết quả phân nhóm của 17 mẫu SLGL dựa trên trình tự đoạn gen cox1 của hệ gen ty thể .................................................................................... 81 Bảng 3.14. Kết quả phân loại một số mẫu SLGL dựa vào gen nad1 ............. 84 Bảng 3.15. Kết quả phân loại loài SLGL bằng phƣơng pháp PCR-RFLP dựa vào chỉ thị gen ITS1 và enzyme RsaI ............................................................. 87 Bảng 3.16. Phân bố loài SLGL theo khu vực địa lý ....................................... 87 Bảng 3.17. Phân bố loài SLGL theo vật chủ .................................................. 88 Bảng 3.18. Phân bố loài theo nhóm kích thƣớc chiều dài SLGL ................... 88 Bảng 3.19. Kết quả phân nhóm của 16 chủng SLGL dựa trên trình tự đoạn gen ITS1 của hệ gen nhân .............................................................................. 89 Bảng 3.20. Kết quả phân nhóm của 16 mẫu SLGL dựa trên trình tự đoạn gen ITS-2 của hệ gen nhân .................................................................................... 92 Bảng 3.21. Bảng liên quan giữa phân loại hình thái với kết quả phân tích loài bằng PCR-RFLP của SLGL thu từ động vật .................................................. 95 Bảng 3.22. Bảng liên quan giữa phân loại hình thái với kết quả phân tích loài bằng PCR-RFLP của các mẫu đƣợc so sánh trình trình tự ............................. 95 Bảng 3.23. Tỷ lệ tƣơng đồng đoạn nucleotide chứa 1 phần gen cox 1 của các mẫu sán lá gan lớn Việt Nam với thế giới ...................................................... 97 Bảng 3.24. Các vị trí có sai khác đoạn nucleotide chứa 1 phần đoạn gen cox1 giữa các chủng SLGL của Việt Nam và thế giới ............................................ 98 Bảng 3.25. Tỷ lệ tƣơng đồng nucleotide gen nad1 của SLGL trong nghiên cứu với các chủng trên ngân hàng gen ................................................................ 101 ix Bảng 3.26. Các vị trí có sai khác nucleotide và acid amin trêm đoạn gen nad1 của SLGL Việt Nam so với thế giới ............................................................. 103 Bảng 3.27. Tỷ lệ tƣơng đồng nucleotide đoạn giao gen ITS1 của SLGL trong nghiên cứu với các chủng trên ngân hàng gen ............................................. 105 Bảng 3.28. Các vị trí có sai khác về nucleotide và acid amin của SLGL Việt Nam và SLGL thế giới của đoạn giao gen ITS1 .......................................... 106 Bảng 3.29. Tỷ lệ tƣơng đồng nucleotide đoạn giao gen ITS-2 của SLGL ở nghiên cứu với các chủng trên ngân hàng gen ............................................. 108 Bảng 3.30. Các vị trí sai khác nucleotide của đoạn giao gen ITS2 giữa SLGL Việt Nam và thế giới .................................................................................... 110 Bảng 4.1. So sánh một số chỉ số hình thái SLGL Việt Nam và SLGL thu từ các động vật khác nhau trên thế giới ............................................................ 118 Bảng 4.2. So sánh một số chỉ số hình thái của SLGL Việt Nam với các chỉ số hình thái của F. hepatica và F. gigantica thu từ bò trên thế giới .................. 119 x DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình thể SLGL trƣởng thành và trứng ............................................. 4 Hình 1.2. Vòng đời sinh học của sán lá gan lớn ............................................... 7 Hình 1.3. Ba loài ốc Lymnaea spp. tìm thấy ở Việt Nam ............................... 10 Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc hệ gen ty thể sán lá gan lớn .................................... 25 Hình 1.5. Ví trí của các đoạn giao gen ITS1 và ITS2 thuộc hệ gen nhân ...... 26 Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu ............................................................... 40 Hình 2.2. Minh họa cách đo các chỉ số hình thái của SLGL .......................... 47 Hình 2.3. Minh họa kết quả đo kích thƣớc bằng kính hiển vi Optika ............ 48 Hình 2.4. Sơ đồ các bƣớc điện di kiểm tra sản phẩm PCR và cắt giới hạn .... 58 Hình 3.1. Phân bố tỷ lệ SLGL ở các khu vực thu thập ................................... 68 Hình 3.2. Chiều dài SLGL thu từ Điện Biên và Bắc Giang năm 2010 .......... 68 Hình 3.3. Chiều dài SLGL thu từ dê, cừu tại Ninh Thuận và từ trâu tại Nghệ An 2015 .......................................................................................................... 71 Hình 3.4. Mẫu SLGL thu thập từ ngƣời ......................................................... 71 Hình 3.5. Ảnh điện di kết quả nhân gen bằng cặp mồi JB3, JB4.5 của các mẫu SLGL thu thập từ bò tại Vĩnh Phúc ................................................................ 78 Hình 3.6. Sản phẩm PCR (với các mồi JB3, JB4.5) và các mảnh cắt giới hạn bằng enzyme RsaI của một số mẫu SLGL thu từ bò tại Vĩnh Phúc ............... 79 Hình 3.7. Kết quả cắt giới hạn sản phẩm PCR (với mồi JB3, JB4.5) bằng enzyme RsaI và AluI của 4 mẫu SLGL thu từ bò tại Tây Ninh ...................... 80 Hình 3.8. Cây phả hệ xác định mối quan hệ về loài giữa các chủng Fasciola spp. dựa trên trình tự đoạn gen cox1 (447 bp), xây dựng bằng chƣơng trình MEGA6.06, sử dụng phƣơng pháp kết nối liền kề NJ (Neighbor-joining) với hệ số tin cậy bootstrap là 1.000 lần lặp lại ..................................................... 82 Hình 3.9. Ảnh điện di kết quả nhân đoạn gen nad1 một số mẫu SLGL ở Việt Nam bằng cặp mồi Ita10, Ita2 ........................................................................ 83 xi Hình 3.10. Cây phả hệ xác định mối quan hệ về loài giữa các chủng Fasciola spp. dựa trên trình tự đoạn gen nad1 (535 bp), xây dựng bằng chƣơng trình MEGA6.06, sử dụng phƣơng pháp kết nối liền kề NJ (Neighbor-joining) với hệ số tin cậy bootstrap là 1.000 lần lặp lại ..................................................... 85 Hình 3.11. Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1-F, ITS1-R các mẫu SLGL thu thập ở bò tại Quảng Nam và Đắk Lắk ............................................................ 86 Hình 3.12. Cây phả hệ xác định mối quan hệ về loài giữa các chủng Fasciola spp. dựa trên trình tự đoạn giao gen ITS1 (432 bp), xây dựng bằng chƣơng trình MEGA6.06, sử dụng phƣơng pháp kết nối liền kề NJ (Neighbor-joining) với hệ số tin cậy bootstrap là 1.000 lần lặp lại ............................................... 90 Hình 3.13. Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS2-F và ITS2-R của Fasciola spp. thu thập từ bò tại Vĩnh Phúc và Nghệ An....................................................... 91 Hình 3.14. Cây phả hệ xác định mối quan hệ về loài giữa các chủng Fasciola spp. dựa trên trình tự đoạn giao gen ITS2 (360 bp), xây dựng bằng chƣơng trình MEGA6.06, sử dụng phƣơng pháp kết nối liền kề NJ (Neighbor-joining) với hệ số tin cậy bootstrap là 1.000 lần lặp lại ............................................... 93 Hình 3.15. Trình tự đoạn gen ITS-2 không hoàn thiện của mẫu SLGL ......... 94 Hình 3.16. Minh họa 1 số vị trí có sai khác nucleotide đoạn gen cox1 của 17 mẫu SLGL ở Việt Nam so với SLGL trên thế giới ........................................ 99 Hình 3.17. Minh họa một số vị trí có sai khác acid amin dựa trên cơ sở đoạn gen cox1 của SLGL Việt Nam với thế giới .................................................. 100 Hình 3.18. Minh họa sự tƣơng đồng nucleotide đoạn gen nad1 của SLGL Việt Nam và SLGL đã đƣợc công bố ................................................................... 102 Hình 3.19. So sánh sự tƣơng đồng acid amin dựa trên đoạn gen nad1 của SLGL ở Việt Nam và thế giới ...................................................................... 103 Hình 3.20. Minh họa các vị trị có sai khác nucleotide trên đoạn giao gen ITS2 của SLGL ở Việt Nam so với SLGL thế giới ............................................... 109 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh do sán lá gan lớn (SLGL) rất phổ biến ở động vật nhai lại nhƣ trâu, bò, dê, cừu… do Fasciola hepatica (Linnaeus, 1758) và Fasciola gigantica (Cobbold, 1885) gây ra [5], [70]. Fasciola hepatica và Fasciola gigantica có phân bố khác nhau, F. hepatica phân bố trên khắp thế giới nhƣng chủ yếu ở các khu vực có khí hậu ôn đới nhƣ Châu Âu, Châu Mỹ và Châu Úc, trong khi F. gigantica lại phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới nhƣ ở Châu Phi và Châu Á. Cả hai loài cùng xuất hiện ở khu vực khí hậu cận nhiệt đới [102], [104]. Ngƣời là vật chủ tình cờ, nhiễm SLGL do ăn rau sống hoặc uống nƣớc lã có nang ấu trùng còn sống. Bệnh do SLGL ở ngƣời đƣợc xem là một bệnh nhiệt đới bị lãng quên. Tuy nhiên gần đây bệnh có xu hƣớng tăng trở lại [47]. Tại một số khu vực trên thế giới, nhiễm SLGL ở ngƣời có tỷ lệ rất cao và là vấn đề y tế rất đƣợc quan tâm [108], [109]. Trong 25 năm qua, toàn thế giới có khoảng 17 triệu ngƣời mắc bệnh và 180 triệu ngƣời sống trong vùng nguy cơ nhiễm SLGL [69], [104], [110]. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ít nhất 2,4 triệu ngƣời tại hơn 70 quốc gia bị ảnh hƣởng bởi bệnh do SLGL [55], [144]. Fasciola spp. có cấu tạo lƣỡng giới, bình thƣờng chúng sinh sản bằng cách tự giao phối [85], nhƣng chúng cũng có thể giao phối chéo và một số trƣờng hợp sinh sản vô tính [69], [55]. Hai loài SLGL có thể đƣợc phân biệt dựa vào hình thái ngoài, F. gigantica có hình dạng thon, dài còn F. hepatica ngắn và rộng [33], [141]. Một số chỉ số hình thái có sự khác biệt giữa F. hepatica và F. gigantica nên cũng đƣợc sử dụng để phân biệt 2 loài SLGL nhƣ khoảng cách từ giác bụng đến cuối thân, chu vi cơ thể và tỷ số chiều dài/chiều rộng [60], [119], [120]. Tuy nhiên, kích thƣớc và hình dạng của SLGL rất thay đổi, phụ thuộc vào tuổi của sán, vật chủ ký sinh, số lƣợng sán nhiễm và tình trạng dinh dƣỡng của vật chủ, thể nhị bội, tam bội hay hỗn hợp… [9], [68], [70], [122]. Vì vậy, chỉ dựa vào hình thái rất khó có thể phân biệt và xác định SLGL là F. hepatica hay F. gigantica [9], [38], [70], [104]. Dạng trung gian với hình thái và kiểu gen hỗn 2 hợp giữa 2 loài đã đƣợc thông báo ở nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam [55], [89], [96], [100]. Dạng này bị rối loạn khả năng phân bào, chúng không có hoặc có rất ít tinh trùng trong túi tinh nên sinh sản theo kiểu vô tính. Chúng có những bất thƣờng về hình thái và phân tử theo kiểu trung gian của 2 loài nên rất khó phân loại là F. hepatica hay F. gigantica [63], [135]. Do những hạn chế của phƣơng pháp hình thái học, các kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau đã đƣợc phát triển để xác định và phân biệt các loài SLGL [2], [16], [50]. Sinh học phân tử không những xác định đƣợc dạng trung gian hay hiện tƣợng lai mà còn cho phép xác định các đặc điểm phân tử, di truyền của SLGL, trong khi điều này khó thực hiện bởi phƣơng pháp hình thái [50]. Một số chỉ thị phân tử thƣờng đƣợc sử dụng là cox1, nad1 thuộc hệ gen ty thể và các đoạn giao gen ITS1, ITS2 thuộc hệ gen nhân [3], [50], [77]… Ở Việt Nam, trƣớc đây một số tác giả cho rằng có cả F. hepatica và F. gigantica [44], [45]. Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây với sự hỗ trợ của sinh học phân tử lại cho rằng SLGL ở Việt Nam là F. gigantica hoặc dạng trung gian Fasciola sp. [11], [38], [46], [116]. Mặt khác, những năm gần đây việc nhập khẩu gia súc trong ngành nông nghiệp rất có thể đã gián tiếp đƣa SLGL từ nƣớc ngoài vào làm phát sinh những điểm mới về thành phần loài và di truyền trong quần thể SLGL tại Việt Nam. Điều này đặt ra câu hỏi: hiện tại Việt Nam có mặt những loài SLGL nào, đặc điểm phân tử của chúng ra sao? Những câu hỏi trên đã đặt ra yêu cầu cần phải có một nghiên cứu quy mô để xác định loài và đặc điểm phân tử nhằm cung cấp các dữ liệu góp phần phòng chống hiệu quả bệnh do SLGL gây ra cho ngƣời và động vật tại Việt Nam. Đề tài “Xác định thành ph n loài và một số đ c đi m sinh h c phân tử của sán lá gan lớn t i Việt Nam” đƣợc thực hiện nhằm các mục tiêu: 1. Xác định một số chỉ số hình thái và phân loại sán lá gan lớn tại Việt Nam bằng phƣơng pháp hình thái học. 2. Xác định thành phần loài và phân tích một số đặc điểm sinh học phân tử của sán lá gan lớn ở Việt Nam. 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sán lá gan lớn Fasciola spp. và bệnh do sán lá gan lớn (Fasciolosis) 1.1.1. Đặc điểm sinh học của Fasciola spp. Phân loại sinh học [70], [104], [111] Theo một số tác giả, phân loại của sán lá gan lớn trong sinh giới nhƣ sau: Ngành: Giun sán Lớp: Giun dẹt Dƣới lớp: Lƣỡng tính Bộ: Echinostomida Họ: Sán lá Giống (chi): Fasciola Loài: Fasciola hepatica Linnaeus, 1758 và Fasciola gigantica Cobbold, 1885 Các loài sán lá gan lớn Đến thời điểm hiện tại, giống Fasciola ghi nhận có 4 loài, gồm: F. hepatica (Linnaeus, 1758), F. gigantica (Cobbold, 1855), F. nyanzae (Leiper, 1910) và F. jacksoni (Cobbold, 1869) [104]. Trong đó F. hepatica và F. gigantica là hai loài gây bệnh chủ yếu ở ngƣời và động vật [107]. F. hepatica: thƣờng đƣợc tìm thấy ở đƣờng dẫn mật và túi mật của các động vật nhai lại nhƣ dê, cừu, trâu, bò. Tuy nhiên, loài này cũng có thể đƣợc tìm thấy ký sinh ở các vật nuôi khác nhƣ ngựa, lừa, la, lạc đà và lợn. Chúng cũng có thể đƣợc phát hiện ký sinh ở các động vật hoang dã nhƣ hƣơu, các loài động vật có túi, thỏ, chuột... [104]. Loài này phân bố rộng rãi trên khắp thế giới, nhất là các khu vực có khí hậu hàn đới và cận nhiệt đới [104], [107]. 4 F. gigantica: đây là ký sinh trùng phổ biến của đƣờng dẫn mật các động vật nuôi và động vật hoang dã. Loài này gặp chủ yếu ở khu vực có khí hậu ôn đới và nhiệt đới nhƣ Châu Á và Châu Phi [104], [107]. Đặc điểm hình thái của sán lá gan lớn Hình 1.1. Hình thể SLGL trƣởng thành và trứng [141] (a: SLGL trƣởng thành F. hepatica; b: SLGL trƣờng thành F. gigantica; c: trứng của F. hepatica; d: trứng của F. gigantica) Hình thể sán trưởng thành Con trƣởng thành của F. hepatica có dạng hình lá, dẹt (Hình 1.1a), hình dạng đặc trƣng cho các loài sán lá. Kích thƣớc chiều dài từ 20 đến 30 mm và 5 8 – 15 cm chiều rộng. Cơ thể của nó kéo dài về phía trƣớc sau, phía đầu có dạng hình nón, trên đó có giác miệng, phần giữa ngay chỗ eo giữa phần đầu và thân có giác bụng. Kích thƣớc của giác bụng và giác miệng xấp xỉ nhƣ nhau. Ruột của con trƣởng thành chia nhiều nhánh với các túi thừa chạy dọc từ trƣớc ra sau. Hai tinh hoàn cũng phân nhánh và nằm ở nửa sau cơ thể. Các buồng trứng tƣơng đối nhỏ gọn nằm ngay phía trên tinh hoàn và đƣợc đổ vào tử cung. Tử cung đổ vào lỗ sinh dục nằm ngay sau giác bụng. Hình thể của F. gigantica khá giống với F. hepatica, tuy nhiên kích thƣớc có khác nhau, chiều dài tối đa có thể lên tới 75 mm chiều rộng tối đa 12 mm (Hình 1.1b). Ở F. gigantica, tỷ lệ phần đầu hình nón nhỏ hơn ở F. hepatica và phần cơ thể của nó hình dạng giống chiếc lá hơn [104]. Ngoài ra, hình thái ngoài thƣờng thấy F. gigantica thon và dài, trong khi F. hepatica thƣờng ngắn và rộng [33], [100]. Gần đây, hình thái trứng và sán trƣởng thành của dạng trung gian đã đƣợc đƣợc mô tả có nhiều điểm giống với cả F. gigantica và F. hepatica [104]. Vài nghiên cứu còn cho thấy, SLGL có hình thái rất thay đổi khi ký sinh ở các vật chủ khác nhau [68], [122], [141]. Hình thể trứng Trứng sán F. hepatica thƣờng có kích thƣớc 150 x 90 μm và hình dạng cũng rất giống với trứng của F. gigantica. Có thể thấy các trứng của F. gigantica với kích thƣớc lớn hơn (200 x 100 μm). Trứng của Fasciola cần phân biệt với trứng của các sán lá khác, đặc biệt với trứng của sán Paramphistome. Trứng SLGL có vỏ màu vàng nâu với một nắp không rõ ràng và các tế bào phôi nằm bên trong. Trong khi đó Paramphistome vỏ có màu trong suốt, nắp rõ ràng và các tế bào phôi sáng màu bên trong trứng và một gai nhỏ nằm phía sau [104]. Vòng đời sinh học Vòng đời của sán lá gan lớn rất đặc biệt trong lớp sán lá. Chúng chỉ có 1 vật chủ phụ là ốc, sau đó hình thành nang ở thực vật thủy sinh trƣớc khi 6 nhiễm vào vật chủ theo con đƣờng ăn uống. Trong khi đó, hầu hết các loại sán lá khác vòng đời qua 2 vật chủ phụ trƣớc khi xâm nhập vào vật chủ chính [32]. Vòng đời của SLGL đƣợc mô tả chi tiết nhƣ dƣới đây: Sán lá gan lớn trƣởng thành đẻ trứng ở đƣờng dẫn mật của vật chủ, trứng theo dịch mật vào đƣờng tiêu hóa. Sau đó trứng theo phân rời khỏi cơ thể vật chủ ra ngoài môi trƣờng. Ngay sau khi ra ngoài môi trƣờng trứng vẫn chƣa có phôi, trứng mất khoảng chừng 2 tuần để phát triển thành trứng chín (trứng có ấu trùng lông bên trong), sau đó ấu trùng lông (miracidium) thoát vỏ di chuyển ngoài môi trƣờng và bơi lội trong nƣớc. Ở điều kiện thuận lợi, ấu trùng lông có thể bơi với vận tốc 1 mm/s. Đặc điểm bơi lội giúp cho ấu trùng lông có thể tìm và xâm nhập vào vật chủ phụ (vật chủ trung gian) là ốc thuộc giống Lymnae. Ấu trùng lông sau khi ra môi trƣờng rất nhanh chóng tìm một vật chủ thích hợp để xâm nhập, những ấu trùng lông không tìm đƣợc vật chủ sẽ chết trong vòng 24 giờ [104]. Trong khoảng pH môi trƣờng từ 6 - 8, hiện chƣa có bằng chứng nào cho thấy sự khác biệt tỷ lệ chết của ấu trùng lông. Sau khi xâm nhập vào ốc, ấu trùng mất lông và trở thành bào nang (sporocyst). Bào nang phân chia và phát triển thành redia (giai đoạn này nó bắt đầu hình thành giác và ruột nguyên thủy). Redia tiếp tục phát triển thành ấu trùng đuôi (cercaria). Các ấu trùng đuôi của sán lá gan lớn Fasciola spp. có chiều dài cơ thể vào khoảng 0,25 đến 0,35 mm với một đuôi dài, mảnh, không chia nhánh, kích thƣớc khoảng 0,5 mm. Nhìn chung, 4 - 7 tuần sau khi nhiễm, cƣ trú và phát triển trong cơ thể ốc ấu trùng đuôi sẽ rời khỏi ốc ra ngoài môi trƣờng. Trong thời gian ở ngoài môi trƣờng, ấu trùng đuôi cần có điều kiện độ ẩm và nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ tới hạn là 10 oC. Khi mới rời khỏi ốc, ấu trùng đuôi bám vào lá cỏ hoặc là các loài rau ngập nƣớc khác giống nhƣ cải xoong. Sau đó ấu trùng rụng đuôi tạo thành nang ấu trùng (metacercaria) với 4 lớp bao bọc. Các lớp bao bọc này đƣợc hình thành từ 7 các chất tiết của các tuyến nang nằm bên trong cơ thể ấu trùng đuôi. Lớp vỏ ngoài hoạt động nhƣ một hàng rào chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn và vi nấm. Việc hình thành vỏ nang có thể mất đến 2 ngày. Các nang ấu trùng có sức chịu đựng cao và là dạng lây nhiễm cho các vật chủ cuối cùng của sán lá gan lớn. Nói chung, các nang ấu trùng đƣợc lây nhiễm cho các động vật nhai lại giống nhƣ trâu, bò và cừu; nhƣng cũng có thể lây cho các động vật có vú khác bao gồm cả con ngƣời. Một ấu trùng lông đƣợc tạo ra từ trứng sán có thể tạo ra 4.000 nang ấu trùng do quá trình phân chia ở các giai đoạn bào nang và redia. Nang ấu trùng chỉ tồn tại khi nhiệt độ và độ ẩm thuận lợi, trong điều kiện khô ráo chúng không thể sống sót nhƣng trong khi độ ẩm cao và nhiệt độ thích hợp nang ấu trùng có thể sống sót đến 1 năm [58]. Hình 1.2. Vòng đời sinh học của sán lá gan lớn [33]