Tài liệu Xác định tần suất đột biến điểm vùng d loop trong hệ gen ty thể ở người việt nam

1 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT **************** LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC ĐỀ TÀI: XÁC ĐỊNH TẦN SUẤT ĐỘT BIẾN ĐIỂM VÙNG D – LOOP TRONG HỆ GEN TY THỂ Ở NGƯỜI VIỆT NAM Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 01 14 Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS. LÊ QUANG HUẤN Người thực hiện : NGUYỄN THÙY LINH Lớp : Cao học K17 Hà Nội – 2015 2 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề 1. Trong vài năm trở lại đây, hướng nghiên cứu sử dụng ADN ty thể (ADN ty thể) như một chỉ thị sinh học đang được phát triển nhanh chóng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Bên cạnh đó, những vấn đề về rối loạn ty thể liên quan đến bệnh ty thể, các bệnh chuyển hóa hiếm gặp, lão hóa….được xem là một trong những mục tiêu nghiên cứu cơ bản của di truyền học và y học. Với nhiều phát minh cũng như các nghiên cứu mới về di truyền từ các thế kỷ trước mà tiêu biểu là việc công bố trình tự hệ gen người hay còn gọi là “ trình tự tham chiếu” (Cambridge Reference Sequencing – CRS) được Anderson và cộng sự công bố đầu tiên vào năm 1981 và “trình tự tham chiếu sửa đổi” – rCRS (Andrew và cộng sự. 1991) đã tạo điều kiện thuận lợi cho các nhà khoa học nghiên cứu sinh học mà đặc biệt là những nghiên cứu về loài người. Sau khi có bản đồ gen người, người ta thấy rằng các cá thể người giống nhau đến 99.9% và chỉ khác nhau rất nhỏ (0.1%) về cấu trúc hệ gen. Trong 0.1% khác biệt giữa hai cá thể thì có đến hơn 80% là các đa hình nucleotit đơn (Single Nucleotide Polymorphism và được viết tắt là SNP). Chính vì thế SNP được sử dụng rộng rãi các mảng y dược học, hình sự và cung cấp những kiến thức hữu ích trong quá trình tiến hóa loài người ở các vùng địa lý trong bối cảnh và lịch sử khác nhau. Việc tìm được danh sách các SNP của người Việt Nam sẽ góp phần hỗ trợ vào nghiên cứu tiến hóa di truyền, đồng thời cũng cung cấp được thông tin về các đột biến có liên quan đến các căn bệnh ung thư, rối loạn ở người. Nhận thức được tầm quan trọng về việc tìm hiểu các dữ liệu di truyền về dân tộc Việt Nam chính vì thế trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Xác định tần suất đột biến điểm vùng D – Loop của hệ gen ty thể người Việt Nam”. 2. Mục tiêu: - Lập được danh sách các SNP trong vùng D – Loop của AND ty thể đặc trưng của người Việt Nam. 3. Nội dung đề tài: - Tách chiết ADN từ các mẫu móng tay - Giải trình tự gen vùng D – Loop 3 - Phân tích trình tự gen vùng D – Loop ở các mẫu và so sánh trình tự mẫu phân tích với trình tự tham chiếu sửa đổi (rCRS) và tìm đặc trưng SNPs ở chủng người Việt Nam. 4 CHƯƠNG I – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung về ty thể Ty thể (Mitochondrion) là bào quan có thể tìm thấy trong gần như tất cả các tế bào có nhân. Số lượng của ty thể trong mỗi tế bào ở mỗi loài là khác nhau. Ty thể là trung tâm hô hấp của tế bào, là nơi sản sinh ra ATP một dạng năng lượng có thể sử dụng cho các phản ứng của tế bào. Không có ty thể các tế bào sẽ phải dựa vào quá trình đường phân kỵ khí để cung cấp tất cả adenosin triphotphat (ATP) cho hoạt động của mình. Ty thể có hệ gen độc lập nên có khả năng tự sinh sản bằng cách phân đôi ty thể mẹ để sinh ra các ty thể con (Alberts B, Johnson A, Lewis J và cộng sự. 2002). Hình 1.1. Hình 1.1. Ty thể (Thepsychguru.com – 2012) 1.1. Cấu tạo và chức năng của ty thể 1.1.1. Cấu tạo Ty thể là bào quan có hình tròn hoặc hình trụ dài, có kích thước đường kính 0.1 – 0.5 µm, chiều dài 1 – 2 μm. Ty thể có cấu trúc màng kép bao gồm màng ngoài (outer membrane) và màng trong (inner membrane). Màng ngoài chứa các protein tạp kênh lớn (gọi là porin) và cho phép tất cả các phân tử nhỏ hơn 5kDa thấm qua được. Màng trong được cuộn gấp rất phức tạp tạo thành các cấu trúc gọi là mào hoặc răng lược (cristate). Khác với màng ngoài, màng trong chỉ thấm chọn lọc một số ion. Vùng bề mặt khá lớn của màng trong ty thể (intermembrane space) chứa các enzym tham gia vào quá trình oxy hóa - photphoryl hóa và tổng hợp ATP. Phần chất nền (matrix space) của ty thể chứa các enzym cần thiết cho sự oxy hóa pyruvat và các axit béo, các enzym tham gia vào chu trình axit tricacboxylic (ATC) (Cooper. 2000). Khoang nền cũng 5 chứa nhiều bản sao của ADN ty thể, các ribosome của ty thể, RNA vận chuyển (tRNA) và nhiều loại enzym cần thiết cho phiên mã và dịch mã của các gen ty thể. Hình 1.2. Hình 1.2. Cấu trúc ty thể (hallcpbio.com) 1.1.2. Chức năng của ty thể Ty thể là trung tâm giải phóng và chuyển hóa năng lượng của tế bào (photphoryl hóa – oxy hóa). Phần lớn năng lượng được tích lũy trong các nguyên liệu hữu cơ được giải phóng và chuyển thành dạng ATP sử dụng trong pha phân giải hiếu khí diễn ra ở ty thể. Vì vậy ty thể được xem là “nhà máy năng lượng” của tế bào (Dahout, Gonzalez . 2006). Trong mỗi tế bào số lượng ty thể dao động từ 50 – 1.000. Các tế bào hoạt động mạnh như tế bào cơ và tế bào gan có số lượng lớn ty thể. Ở nơi tế bào hoạt động nhiều thì số vách ngăn lại tăng lên, ứng với số enzym tăng lên. Bên trong tế bào ty thể phân bố ở nơi cần dùng nhiều năng lượng. Ví dụ trong tế bào gan, ty thể nằm chèn mạng lưới nội chất hạt nơi cần nhiều năng lượng cho tổng hợp protein. Tổng hợp năng lượng trong ty thể thông qua quá trình đường phân. Chỉ một phần rất nhỏ năng lượng dự trữ của gluco được chuyển hóa (2ATP). Sự chuyển hóa cacbohydrat được hoàn tất khi sản phẩm của quá trình đường phân (pyruvat) được chuyển vào trong ty thể và bị oxy hóa từ O2 thành CO2, nước và 36 ATP. Các protein liên quan trong quá trình oxy hóa – photphoryl hóa đều định vị ở màng trong ty thể, bao gồm các thành phần trong chuỗi truyền điện tử (phức hệ 1 đến 6 4), enzym F0F1 ATP synthase. Quá trình truyền điện tử và tổng hợp ATP được tóm tắt ở hình 1.3. Hình 1.3. Sơ đồ tổng hợp ATP trong ty thể Ty thể còn có khả năng tổng hợp các chất: photpholipit, axit béo và đặc biệt là protein (protein cấu trúc và các enzym). ADN trong ty thể chịu trách nhiệm tổng hợp phần protein ty thể. Ty thể có khả năng di truyền độc lập đối với nhân. Tuy nhiên vẫn có sự phối hợp giữa nhân, cơ chất của tế bào chất với cơ chất của ty thể trong quá trình biểu hiện của gen (phiên mã và tổng hợp protein). 1.2. Đặc điểm của ADN ty thể người và ứng dụng trong nghiên cứu Ty thể đóng vai trò quan trọng đối với sự tiến hóa của động vật. Những nghiên cứu phổ biến hiện nay đối với di truyền ở người là trên ADN ty thể (mitochondrial DNA – ADN ty thể). Mặc dù bộ gen ty thể người chỉ bằng 0.0005% so với toàn bộ kích thước bộ gen trong nhân nhưng các SNP được tìm thấy trong gen ty thể có liên quan đến nhiều bệnh chuyển hóa, rối loạn cũng như các đặc trưng ở người và đặc biệt là các SNP ở vùng D – Loop. 1.2.1. Đặc điểm của hệ gen ty thể người Hệ gen ty thể người có chiều dài khoảng 16.569 bp, là một phân tử mạch vòng kín nằm trong chất nền ty thể và có hàng ngàn bản sao trong một tế bào. Phân tử ADN ty thể có hai chuỗi khác nhau về thành phần nucleotit:  Chuỗi nặng có chứa nhiều Guanin (H – strand), mã hóa cho 28 gen. 7  Chuỗi nhẹ chứa nhiều Cytosin (L – strand), mã hóa cho 9 gen trong tổng số 37 gen của hệ gen ty thể. Trong 37 gen này có 13 gen mã hóa cho 13 chuỗi polypeptide cần thiết cho hệ thống photphoryl hóa – oxy hóa, bao gồm 7 tiểu đơn vị của phức hệ I (complex I), một tiểu đơn vị của phức hệ III (complex III), 3 tiểu đơn vị cửa phức hệ VI (complex VI) và hai tiểu đơn vị của phức hệ V (complex V). Số gen còn lại mã hóa cho 22 tRNA, 2 rRNA (12S và 16S) phục vụ quá trình dịch mã của ty thể (Anderson S. 1981). Các chuỗi polypeptit khác cần thiết cho cấu trúc và chức năng của ty thể được mã hóa bởi gen nhân và được tổng hợp trong ribosom của tế bào chất. Một đặc điểm đáng chú ý là hệ gen ty thể người có rất ít phần trình tự không mã hóa. Chỉ có khoảng 7% gen ty thể người không mã hóa các protein, rRNA, tRNA trong khi phần lớn hệ gen nhân là các vùng ADN không mã hóa (intron). Đoạn ADN ở giữa các gen ty thể hoặc là không có hoặc là ngắn hơn 10 bp. Ở một vài gen thay vì có mã kết thúc mRNA cần được polyadenin hóa để tạo thành mã kết thúc. Khoảng 90% số gen ty thể không mã hóa lại nằm trong vùng điều khiển hay D – Loop. Phần lớn các trình tự liên quan tới quá trình nhân đôi của ADN ty thể hay quá trình phiên mã đều nằm trong hoặc gần vùng D – Loop. Đoạn D – Loop có kích thước khoảng 1.1 kb ADN ty thể có một số vùng bất biến nằm trong vùng D – Loop bao gồm vùng promoter và vùng CSB (Conserved Sequence Block) I, II và III. Vì các trình tự bất biến này đều nằm ở D – Loop và được bảo tồn ở rất nhiều loài động vật có xương sống nên chúng được cho rằng có vai trò quan trọng trong quá trình nhân đôi của ADN ty thể. Ví dụ, CSB I có vị trí ngay gần vùng khởi đầu của quá trình nhân đôi chuỗi nặng (Wallberg and Clayton. 1981). Thêm nữa, vùng D – Loop còn chứa các vùng siêu biến (hypervariable regions) HVI, HVII và HVIII. Những vùng này có tần suất đột biến cao hơn đáng kể so với các vùng khác của hệ gen ty thể (Greenberg. 1983). 8 Hình 1.4. Cấu trúc ty thể người (Innovitaresearch – 2003) 1.2.2. Vị trí và độ dài vùng gen điều khiển D – Loop Như đã giới thiệu ở trên, vùng gen điều khiển D – Loop có chiều dài xấp xỉ 1.100 bp và chứa các trình tự khởi đầu cho quá trình tái bản hệ gen ty thể và các đoạn điều khiển cho quá trình phiên mã của các gen chức năng trong vùng được mã hóa (Anderson. 1981, Lightowlers. 2001). Hệ thống đánh số bazơ bắt đầu tại điểm gần giữa vùng điều khiển và đi về hai phía, vì thế vùng điều khiển trải dài từ vị trí 16024 đến 16569, sau đó tiếp tục từ vị trí bazơ 1 cho đến 576. Đây là vùng xuất hiện nhiều đột biến nhất với tần số đột biến cao hơn so với các vùng khác của hệ gen ty thể (Horai. 1995, Sorenson, Fleischer. 1996). Hình 1.5 Hình 1.5. Vùng điều khiển D – Loop của ty thể người (http://www.alphabiolab.com) 9  Vùng siêu biến 1 (HV1) kéo dài từ vị trí 16024 đến 16365.  Vùng siêu biến 2 (HV2) kéo dài từ vị trí 73 đến 340.  Vùng siêu biến 3 (HV3) kéo dài từ nucleotit 438 đến 574. 1.3. Đa hình nucleotit đơn (Single Nucleotide Polymophisms – SNPs) 1.3.1. Đa hình nucleotit đơn là gì? Đa hình nucleotit đơn hay còn gọi là SNPs, được định nghĩa là biến thể trình tự ADN xảy ra khi một nucleotit đơn A, T, G hay C trong hệ gen khác biệt so với các cá thể khác trong cùng một loài. Hình 1.6. Đa hình nucleotit đơn (learn.genetics.utah.edu) Ở cá thể người, có 99.9% là giống nhau, chỉ 0.1% là khác biệt. Sự khác biệt này có thể là các đặc trưng tính trạng. Ví dụ như các sự phát triển bệnh nào đó ở người hoặc kiểu hình … Những biến đổi này có thể không có hại (những thay đổi về kiểu hình), có hại (gây bệnh ung thư, bệnh tim, Huntington’s, bệnh tan huyết bẩm sinh), hoặc phát triển sau khi về già (đây là những biến đổi được tìm thấy trong vùng mã hóa và điều hòa gen). 1.3.2. Các vị trí SNP trên gen SNP có thể nằm trong vùng mã hóa các gen, vùng không mang mã hoặc trong vùng xen giữa các gen. Các SNP trong trình tự mã hóa không nhất thiết sẽ làm thay đổi trình tự các axit amin. 10 Các SNP xuất hiện ở ngoài gen thì thường không ảnh hưởng đến chức năng và sản phẩm của protein. Các SNP xảy ra trong vùng gen không mã hóa làm thay đổi hàm lượng protein được tạo ra. Các SNP xuất hiện trong vùng gen mã hóa (từ đó dẫn đến thay đổi biểu hiện gen như hình 1.7. Hình 1.7. Vị trí SNPs trong gen (http://www.cell.com) Tuy nhiên trong một số trường hợp, SNP không nằm trong vùng mã hóa protein vẫn có thể gây ảnh hưởng đến sự nối ghép các gen, tác động lên các yếu tố phiên mã, làm suy thoái RNA thông tin…. Sự biểu hiện gen bị ảnh hưởng bởi dạng này được gọi là một eSNP (sự biểu hiện SNP) và có thể biểu hiện tăng hoặc giảm trong gen. 1.3.3. Ứng dụng và tầm quan trọng Ứng dụng đầu tiên của SNPs phải kể đến đó là chìa khóa tiềm năng trong việc tiến hành y học cá nhân. Các biến thể trong trình tự ADN của con người có thể ảnh hưởng đến cách cơ thể phát triển bệnh, cách cơ thể đáp ứng với các tác nhân gây bệnh, các hóa chất, thuốc, vacxin và các loại tác nhân khác. Tuy nhiên, vai trò quan trọng nhất của chúng trong các nghiên cứu y học là để so sánh các vùng của hệ gen giữa các nhóm người (có thể là giữa bệnh nhân và người khỏe mạnh trong các nghiên cứu ở mức toàn bộ hệ gen (Genome Wide Association studies – GWAS)). Một SNP có thể là nguyên nhân gây ra một bệnh di truyền. Đối với các bệnh phức tạp, các SNP thường không hoạt động đơn lẻ, chúng thường hoạt động trong một 11 sự kết hợp với các SNP khác để biểu hiện một trình trạng bệnh như ta thấy ở bệnh loãng xương. Các nghiên cứu về SNP không những tạo ra điều kiện thuận lợi trong quá trình phát hiện các biến thể di truyền và bệnh di truyền mà còn phát triển nghiên cứu nhằm tìm ra cách phòng ngừa và chữa bệnh trong tương lai. Các SNP có thể mang lại các phản ứng khác nhau đối với thuốc điều trị. Ngoài ra nhiều SNP được sử dụng làm chỉ thị giúp cho việc lập bản đồ gen liên quan đến bệnh hoặc một đặc điểm nào đó. Những SNP có liên hệ với các bệnh ở người như ung thư, các bệnh truyền nhiễm, các bệnh tự miễn, bệnh thần kinh có thể được sử dụng để tìm ra đích tác dụng của thuốc và các liệu pháp chữa trị(John M. Butler và cộng sự., 2004). Năm 2004, John M.Butler và cộng sự cũng đã chỉ ra một vai trò khác của SNP đó là đặc trưng cho dân tộc người nào đó, những dân tộc phân bố ở các khu vực địa lý, không gian, thời tiết khác nhau thường có những đặc trưng riêng. 1.4. Đột biến ty thể và bệnh ty thể Do hệ gen ty thể chỉ mã hóa cho một số lượng rất ít protein/enzym. Chính vì vậy chức năng ty thể còn được thực hiện nhờ vào hàng loạt các protein/enzym do gen nhân quyết định và được tổng hợp trong tế bào chất rồi được vận chuyển đến ty thể. Chính vì vậy, các rối loạn ty thể (hay bệnh do ty thể có thể phát sinh do những đột biến ở gen nhân hoặc gen ty thể (ADN ty thể). Một số rối loạn ảnh hưởng đến một cơ quan như bệnh thần kinh thị giác di truyền Leber. Nhưng cũng có những rối loạn ảnh hưởng đến rất nhiều cơ quan và thường có những đặc điểm nổi trội về thần kinh – cơ. Hiện nay người ta đã biết đến có trên 150 bệnh di truyền khá nhau theo mẫu hệ do ty thể quyết định. Các bệnh do rối loạn ADN ty thể thường rất đa dạng. Chúng có thể liên quan đến rối loạn quá trình mã hóa protein hoặc đơn thuần chỉ là những đột biến điểm thay đổi các nucleotit (Sevidei et al. 2002). 1.4.1. Đột biến ty thể trong vùng D – Loop Đột biến điểm Phân tích đột biến ADN ty thể ở bệnh ung thư vú (Tan và cộng sự. 2002) đã giải trình tự hệ gen ty thể trên 19 cặp mô ung thư và mô bình thường của bệnh nhân và đã cho thấy 74% bệnh nhân mang đột biến soma, trong đó có 81.5% đột biến thuộc vùng D – Loop. 12 Với bệnh ung thư buồng trứng (Liu và cộng sự. 2004) đã xác định được 60% đột biến ADN ty thể, trong đó phần lớn là dạng đồng nhất (homoplasmy) và hầu hết là đột biến điểm T – C hoặc G – A. Bốn vùng có đột biến điểm này là D – Loop, 12sRNA, 16S rRNA và cytochrome b, chứng tỏ các vùng này là những vùng nóng có tần suất đột biến cao trong bệnh ung thư buồng trứng. Phân tích ở bệnh ung thư dạ dày (Wu và cộng sự. 2001) đã xác định được 48% mang đột biến soma ở vùng D – Loop, trong số đó có tới 67% là đột biến thêm hoặc mất bazơ tại vị trí nucleotide 303 – 309 (Vị trí D310). Trong các nghiên cứu khác (Burgart và cộng sự. 2001) đã tìm thấy đột biến mất đoạn nhỏ (50 bp) trong vùng D – Loop ở 4/32 (12.5%) ở bệnh nhân ung thư dạ dày. Thêm đoạn (Wu và cộng sự. 2001) đã xác định được đột biến thêm đoạn nhỏ (≈ 260 bp và ≈ 520 bp) trong vùng D – Loop của ADN ty thể trong mô ung thư của một bệnh nhân ung thư dạ dày. Hai đột biến này đặc trưng bởi có 2 hoặc 3 đoạn lặp lại kế tiếp nhau. 1.4.2. Đột biến ty thể nằm ngoài vùng D – Loop Các bệnh như liệt mắt tăng tiến kinh niên (Chronic Progressive External Ophthalmoplegia, CPRO), hội chứng Kearn – Sayre (Kearn – Sayre syndrome, KSS), đái đường và câm điếc (Diabetes and deafness) đều do mất đoạn hoặc sắp xếp lại trong gen tại vị trí 1555G. Các đột biến G1177A, T14484C, G3460A, 14459A, cũng làm biến đổi protein, dẫn đến liệt thần kinh thị giác di truyền Leber (Leber hereditary optic neuropathy, LHON). Đột biến trong gen cytb gây bệnh không dung nạp vận động và myoglobin niệu (Chia-Chi Hsu và cộng sự. 2013) Cho đến nay nhiều dạng đột biến ADN ty thể được xác định, các đột biến này bao gồm: đột biến điểm, đột biến thêm hoặc mất bazơ, đột biến lặp đoạn, mất đoạn hay thay đổi số lượng bản sao ADN ty thể. Đột biến điểm Tan và cộng sự. 2002 phân tích đột biến ADN ty thể ở bệnh ung thư vú và chỉ ra 18.5% bệnh nhân mang đột biếnđược xác định trong các gen 16S rRNA, ND2 và ATPase 6. Trong số các đột biến trên đột biến thêm hoặc mất bazơ chiếm 42% thuộc vùng D – Loop, còn lại 52% là đột biến điểm thuộc vùng mã hóa và không mã hóa. 13 Đột biến ADN ty thể được tìm thấy ở bệnh ung thư đại trực tràng (Polyak và cộng sự. 1998) đã tìm thấy đột biến ADN ty thể trong các vùng mã hóa ND1, ND4, ND5, cytochrome b, COXI, COXII và COXIII cũng như các gen rRNA 12S và 16S. Mất đoạn ADN ty thể bị mất một đoạn lớn như mất đoạn 4977 bp đã được xác định ở ung thư vú, ung thư đại trực tràng. Thay đổi số bản sao ADN ty thể Biến đổi về số bản sao ADN ty thể đã được phát hiện ở nhiều loại bệnh ung thư. Số bản sao ADN ty thể tăng ở ung thư tuyến giáp, ung thư phổi, ung thư đại trực tràng. Biến đổi theo hướng giảm số bản sao ADN ty thể được xác định thấy ở bệnh nhân ung thư vú, ung thư biểu mô tế bào gan, ung thư buồng trứng. Như vậy biến đổi về hàm lượng ADN ty thể có liên quan với loại ung thư. Người ta cho rằng số lượng bản sao ADN ty thể trong bệnh ung thư có thể phụ thuộc vào vị trí của đột biến trong bệnh ung thư đó. Ví dụ như các đột biến trong vùng D – Loop điều khiển sự sao chép ADN ty thể sẽ làm giảm số bản sao. Mặt khác đột biến ADN ty thể ở các gen mã hóa cho các protein của chuỗi photphoryl hóa – oxy hóa lại có thể làm tăng số bản sao như là một cách để đáp ứng lại sự mất chức năng của ty thể. 14 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Phương pháp lấy mẫu Mẫu sinh phẩm được dùng để tách chiết ADN là móng tay hoặc móng chân của những người khỏe mạnh, không có quan hệ huyết thống, kích cỡ mẫu (n=200). Quy trình thu thập mẫu được tiến hành theo các bước như trong hình 2.1 . (A) (B) (C) (D) (E) Hình 2.1. Các bước tiến hành thu thập mẫu sinh phẩm (A) Móng tay/móng chân được rửa sạch bằng xà phòng và nước trước khi lấy mẫu (B) Đeo găng tay để tránh nhiễm ADN từ người này sang người khác (C) Sử dụng cắt móng tay mới hoặc đã được khử trùng hoàn toàn bằng cách đun trong nước 5 phút. Mẫu được lấy ít nhất là 1 bên bàn tay, nếu có thể sẽ lấy ở cả 2 bàn tay/chân để thu được nhiều mẫu hơn. (D) Mẫu móng tay/chân được đựng trong dụng cụ chứa mẫu đã được khử trùng như túi nhựa hoặc phong bì để dễ dàng gửi đi. (E) Đóng gói và chuyển mẫu đi theo hướng dẫn. 2.1.2. Hóa chất Agarose (Sigma) Bộ kit tinh sạch DNA tổng số (Fermentas) Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR (Fermentas) Bộ kit dùng cho phản ứng PCR (Roche) Các mồi cho phản ứng PCR đặt của (Sigma) Proteinase K (Fermentas) Dung dịch: Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25:24:1) Dung dịch : Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1) Etanol (Fermentas) RNase A (Fermentas) H2O vô trùng (Fermentas), Marker 1 kb (Fermentas) 15 2.2. Trang thiết bị Các thiết bị khác phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu được liệt kê trong Bảng 2.1. Ứng dụng Thiết bị Hãng sản xuất Eppendorf CHLB Đức Ly tâm nhanh Ly tâm Avanti TM 30 centifuge Ly tâm lạnh Beckman So màu Đo OD Hewlett Packard, Mỹ Đo pH S20 Metter Toledo Cân Cân 10-4 Ohaus Điện di Điện di Agarose Bio-rad Pipetman Khử trùng Giải trình tự DNA PCR 10µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1ml Eppendorf HVE-50 Hirayama, Nhật Bản ABI 3100 Avant (Applied, Biosystem). PCR 9700 (Applied, Biosystem). Máy khuấy từ RotoLab, OSI Vortex Rotolab, OSI Ổn/gia nhiệt Bể ổn nhiệt Techne, OSI Lò vi sóng Samsung Tủ lạnh sâu – 750C, Tủ lạnh -200C Tủ lạnh Chụp ảnh Sanyo, Nhật Bản Tủ lạnh thường Sanyo, Nhật Bản Máy soi chụp ảnh gel Phamarcia Tủ cấy Sanyo, Nhật Bản Bảng 2.1. Danh sách các trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu 2.3. Phần mềm tin sinh học Các phần mềm tin sinh học được sử dụng trong nghiên cứu này và chức năng của chúng được liệt kê theo Bảng 2.2. 16 Chức năng Địa chỉ Kiểm tra chất lượng trình tự và so http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bi sánh trình tự oedit.html Phần mềm BioEdit BLAST So sánh trình tự với gen chuẩn công bố trên ngân hàng gen SOFTGEN Bao gồm các phần mềm bổ trợ tìm ETICS đột biến điểm http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ http://www.softgenetics.com/ Bảng 2.2. Phần mềm sử dụng 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp tách chiết ADN từ móng tay Dựa theo phương pháp tách ADN từ móng tay sử dụng Phenol: Chroloform (Sambrook và cộng sự. 1989) và quy trình được tóm tắt như sau: - Mẫu móng tay được cho vào ống Eppendorf 1.5 ml, rửa 5 – 10 lần bằng nước khử trùng - Rửa lại bằng cồn 70% - Bổ sung 200 µl EDTA (pH 8, 0.5M) - Đảo nhẹ, ủ trong 1h ở nhiệt độ phòng - Loại dịch, bổ sung 200 µl SDS trong EDTA + proteinase K (5 µl) - Ủ trong 1h - Rửa lại bằng nước khử trùng - Bổ sung 400 µl NaOH 2N rồi ủ qua đêm - Chỉnh pH về 6 – 7 - Bổ sung dung dịch 25:24:1 theo tỉ lệ 1:1 - Ly tâm 12000 v/p trong 10 phút - Thu dịch trong - Bổ sung Etanol 100% + Natri Axetat NaOAc 3M - Để trong tủ -200C trong 30 phút - Ly tâm thu tủa - Rửa lại tủa bằng cồn Etanol 700 - Ly tâm - Làm khô và hòa tan lại bằng nước 17 2.4.2. Định lượng ADN tách chiết bằng phương pháp quang phổ kế Phương pháp quang phổ kế cho phép xác định một cách tương đối nồng độ ADN đồng thời kiểm tra được độ tinh sạch của mẫu ADN tách chiết. Nguyên tắc: Dựa vào sự hấp thụ cực đại ánh sáng tử ngoại ở bước sống 260 nm (OD260) đối với axit nucleic và ở bước sóng 280 nm (OD280) đối với protein. Mức độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm của mẫu đó cho phép xác định nồng độ axit nucleic trong mẫu theo tương quan: Một đơn vị OD260 tương ứng với nồng độ 50 µg/ml ADN sợi kép. Do vậy, nồng độA sẽ được tính theo công thức: CDNA = OD260 x 50 x d Trong đó: d = Độ pha loãng mẫu khi đo; CADN =Nồng độ ADN Tuy vậy, cách tính trên chỉ chính xác khi dung dịch axit nucleic là sạch, nếu dung dịch chứa ADN còn có lẫn protein hoặc 1 số dung môi, hóa chất tách chiết thì protein cũng sẽ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm và 230 nm do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ ADN trong mẫu. Để khẳng định cho kết quả chính xác hơn, chúng tôi đo thêm giá trị OD280 để đánh giá độ tinh sạch của dung dịch ADN. Nếu tỷ lệ OD260/OD280> 1,8 thì mẫu ADN tách chiết được đánh giá là đạt yêu cầu về mức độ tinh sạch cho các thí nghiệm sinh học phân tử tiếp theo. 2.4.3. Nhân đoạn gen bằng phản ứng PCR Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình sao chép ADN với sự tham gia của một loại enzym DNA polymerase chịu nhiệt, có 2 đoạn ngắn ADN một sợi làm mồi và dùng các đoạn ADN mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với nó. Vì vậy để khởi đầu quá trình tổng hợp ADN cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotit (có độ dài từ 6 – 30 nucleotit). Đoạn này gắn kết với ADN khuôn tại điểm khởi đầu sao chép, và được enzym DNA polymerase điều khiển để tổng hợp nên một sợi ADN đặc thù. Các sợi ADN mạch đơn làm khuôn được tạo ra theo cách đơn giản là nâng nhiệt độ lên trên 900C (92 – 980C) mà thường là 940C cho chuỗi xoắn kép ADN bung ra (Lê Thanh Hoà và cộng sự. 2001b). Cả 2 sợi ADN đều được dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các đoạn mồi (gọi là oligonucleotit hay primer) được cung cấp để bám vào vị trí tương ứng cho cả 2 sợi. Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi được chọn nằm ở 2 đầu đoạn ADN cần nhân lên, sao cho các sợi ADN tổng hợp mới được bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài 18 về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài nằm giữa 2 đoạn mồi này. Độ dài của sản phẩm PCR có thể từ vài trăm cho đến hàng ngàn, thậm chí hàng chục ngàn cặp nucleotit. Như vậy, sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi ADN mới được tổng hợp. Hỗn hợp phản ứng lại được nâng nhiệt độ lên thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này sau đó được dùng làm khuôn cho chu kỳ tiếp theo, bao gồm các bước: gắn mồi, tổng hợp ADN và tách rời các đoạn. Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ của phản ứng, tính theo lý thuyết, ta sẽ có 2n bản sao các phân tử ADN mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi (Hình 2.2). Như vậy, kết quả là một đoạn ADN định trước được “nhân lên” với một lượng rất lớn. Ví dụ sau 30 chu kỳ số lượng bản sao ADN của PCR sẽ là 230 = 1.073.741.824. Hình 2.2. Sơ đồ nguyên lý phản ứng PCR PCR là một kỹ thuật phòng thí nghiệm đa năng và phổ ứng dụng hết sức rộng rãi. Vật liệu khởi đầu cho PCR là ADN có chứa đoạn cần nhân lên, gọi là khuôn ADN. Không phải lúc nào cũng cần thiết phải tách chiết đoạn cần nhân lên vì việc đó đã được các đoạn mồi dùng trong phản ứng xác định. Tuy nhiên nếu ADN làm khuôn tinh khiết thì phản ứng PCR sẽ rất nhạy và đặc hiệu. Hàm lượng ADN khuôn cần cho phản ứng PCR rất nhỏ. Trong các thí nghiệm bình thường ở phòng thí nghiệm chỉ cần 1 – 19 100 ng DNA tổng số của hệ gen là đủ. Tuy nhiên ngày nay trong nhiều trường hợp, phản ứng PCR có thể nhân các đoạn ADN chỉ từ một phân tử ADN riêng lẻ. Thành phần chủ yếu của phản ứng PCR bao gồm: - ADN làm khuôn - Hai đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN (primer) - Enzym chịu nhiệt DNA - polymerase (hiện nay được dùng phổ biến nhất là Taq, chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus). - Hỗn hợp của tất cả 4 tiền chất deoxynucleotit (ở dạng dNTP). - Môi trường đệm cung cấp ion Magie (Mg++). - Nước tinh khiết (không có DNAase; RNase v.v...) - Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR là 50 l hoặc 25 l. Có 3 giai đoạn (ba bước điều chỉnh nhiệt độ) cho 1 chu kỳ (Hình 2.3). Bung liên kết của ADN (Denaturation): Được thực hiện ở nhiệt độ 90C - 98C trong vài giây đến vài phút. Tại nhiệt độ này, các phân tử ADN mạch kép sẽ bị tách ra tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzym RNA Polymerase xúc tác tổng hợp. Mồi bám (hay còn gọi là ủ với mồi – Annealing). Sau bước 1, ngay lập tức, nhiệt độ được hạ xuống 37 – 68°C để các đoạn mồi bám vào với các trình tự bổ sung tương ứng trên các phân tử ADN làm khuôn. Tổng hợp (hay còn gọi là kéo dài – Extension): Nhiệt độ ngay lập tức được nâng lên 68°C – 72°C (thông thường 72C) trong vài chục giây đến vài chục phút để các sợi ADN vừa được tổng hợp xoắn vào nhau tạo nên ADN sợi kép, chính là sản phẩm PCR. Hình 2.3. Các bước của một chu kỳ PCR 20