Tài liệu Xác định mức độ thuần chủng của cá thể loài cá sấu xiêm (crocodylus siamensis) bằng sinh học phân tử nhằm hỗ trợ công tác bảo tồn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thắm XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ THUẦN CHỦNG CỦA CÁ THỂ LOÀI CÁ SẤU XIÊM (CROCODYLUS SIAMENSIS) BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ NHẰM HỖ TRỢ CÔNG TÁC BẢO TỒN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC H Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thắm XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ THUẦN CHỦNG CỦA CÁ THỂ LOÀI CÁ SẤU XIÊM (CROCODYLUS SIAMENSIS) BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ NHẰM HỖ TRỢ CÔNG TÁC BẢO TỒN Chuyên ngành : Sinh thái môi trƣờng Mã số : 8440301.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. LÊ ĐỨC MINH PGS. TS. NGUYỄN THỊ HỒNG VÂN H Nội - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học độc lập do chính tôi nghiên cứu và thực hiện. Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực, có nguồn gốc rõ ràng. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thắm LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới PGS. TS. Lê Đức Minh, người đã nhiệt tình, chu đáo hướng dẫn, động viên, cổ vũ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành bài luận văn này. Tôi xin gửi lời cám ơn tới PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân, cùng các thầy cô trong Phòng thí nghiệm Di truyền, bộ môn Di truyền, khoa Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành nghiên cứu này. Xin cảm ơn GS.TS Thomas Ziegler (Vườn thú Cologne, Đức), PGS. TS Nguyễn Quảng Trường (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), nhóm nghiên cứu của TS. Lưu Quang Vinh (Đại học Lâm nghiệp), và các vườn thú tại châu Âu đã hỗ trợ trong quá trình nghiên cứu và thu thập mẫu vật. Xin cảm ơn TS. Phạm Hữu Khánh cùng các cán bộ kiểm lâm, nhân viên tại Vườn quốc gia Cát Tiên đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện nghiên cứu này. Cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong Khoa Môi trường, các thầy cô trong Bộ môn Sinh thái môi trường đã trang bị những kiến thức nền tảng làm tiền đề cho tôi quá trình nghiên cứu. Cảm ơn CN. Ngô Thị Hạnh đã tận tình giúp đỡ tôi trong thí nghiệm, phân tích, thảo luận và góp ý để hoàn thànhluận văn. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ Quỹ Môi trường Thiên nhiên Nagao và Vườn thú Cologne. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã ủng hộ, động viên tôi trong quá trình học tập, làm việc và nghiên cứu. MỤC LỤC MỞ ĐẦU .....................................................................................................................8 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ...........................................11 1.1. Cá sấu Xiêm và hiện trạng loài....................................................................11 1.2. Các mối đe doạ đến loài và vấn đề lai tạo cá sấu trong các cơ sở nuôi nhốt 1.3. Các chỉ thị sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu ..............................18 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................23 2.1. Đối tƣợng, địa điểm và vật liệu nghiên cứu ...................................................23 2.1.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu ...........................................................23 2.1.2. Vật liệu nghiên cứu...................................................................................24 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................27 2.3.1. Thu mẫu, khảo sát ngoài thực địa ............................................................28 2.3.2. Tách chiết ADN tổng số, PCR, tinh sạch, giải trình tự và xác định kiểu gen ......................................................................................................................29 2.3.3. Xây dựng cây quan hệ di truyền ...............................................................34 2.3.4. Xác định mức độ thuần chủng ..................................................................35 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................36 3.1. Tạo dữ liệu di truyền cho quần thể mới tại Lào .............................................36 3.1.1. Sự khác biệt về mặt di truyền ...................................................................36 3.1.2. Mối quan hệ di truyền ..............................................................................36 3.2. Xác định mức độ thuần chủng ........................................................................39 3.2.1. Xác định dòng mẹ .....................................................................................39 3.2.2. Khuếch đại các locus microsatellite .........................................................40 3.2.3. Phân tích xác suất thuộc về nhóm thuần chủng .......................................42 3.2.4. Phân tích tỷ lệ loài trong từng cá thể .......................................................44 3.3. Đánh giá hiện trạng bảo tồn tại VQG Cát Tiên ..............................................47 3.3.1. Khảo sát hiện trạng bảo tồn tại Bàu Sấu .................................................47 3.1.2. Kết quả phỏng vấn người dân ..................................................................49 3.1.3. Kết quả phỏng vấn cán bộ VQG Cát Tiên ................................................51 KẾT LUẬN ...............................................................................................................52 KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................53 iii TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................54 PHỤ LỤC ..................................................................................................................58 iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic ARN Acid Ribonucleic CITES Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora - Công ƣớc về buôn bán quốc tế các loài động thực vật hoang dã nguy cấp CR Critical Endangerd - Cực kỳ nguy cấp IAM Infinite allede model - Mô hình alen vô hạn IUCN International Union for Conservation of Nature and Nature Resources Liên minh bảo tồn thiên nhiên quốc tế NCBI National Center for Biotechnology Information - Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (Hoa Kỳ) PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp SMM Stepwise mutation model - Mô hình đột biến từng bƣớc SSR Simple sequence repeats- Trình tự lặp lại đơn giản VQG Vƣờn quốc gia v DANH MỤC HÌNH ẢNH Nội dung Trang Hình 1. Bản đồ phân bố cá sấu Xiêm (Bezuijen và cộng sự 2012) Hình 2. Sai sót trong quá trình sao chép tạo nên alen mới có thể nhiều hơn, hoặc ít hơn số lƣợng đơn vị lặp Hình 3. Cây quan hệ di truyền dựa trên dữ liệu gen ty thể dài 790bp bằng phƣơng pháp Bayesian Hình 4. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR của một số mẫu khuếch đại đoạn gen ty thể trên gel Agarose 1%, TBE 1X 14 20 39 40 Hình 5. Tín hiệu tốt trong kết quả giải trình tự 40 Hình 6. Tín hiệu nhiễu ở đoạn đầu của phản ứng giải trình tự 41 Hình 7. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR của một số mẫu khuếch đại microsatellite Hình 8. Tín hiệu kiểu gen của locus Cj18 đƣợc đánh dấu huỳnh quang bằng HEX Hình 9. Tín hiệu kiểu gen của locus Cj16 và Cj101 đƣợc đánh dấu huỳnh quang bằng FAM 41 42 42 Hình 10. Thang đo để xác định kích thƣớc alen 43 Hình 11. Biểu đồ phân tích với bộ dữ liệu microsatellite với K=3 46 Hình 12. Phần bàu trƣớc cửa trạm (Bàu Sấu nhỏ) 49 Hình 13. Nguồn thức ăn dồi dào tại Bàu Sấu, VQG Cát Tiên 50 vi DANH MỤC BẢNG Nội dung Trang Bảng 1. Danh sách các mẫu sử dụng trong nghiên cứu 26 Bảng 2. Trình tự các mồi microsatellite sử dụng trong nghiên cứu 34 Bảng 3. Bảng khoảng cách di truyền các mẫu trong nghiên cứu 38 Bảng 4. Kết quả phân tích dữ liệu microsatellite bằng phần mềm GeneClassv2.0 thể hiện xác suất thuộc về nhóm cá thể thuần chủng 43 Bảng 5. Kết quả phân tích dữ liệu microsatellite bằng phần mềm STRUCTURE v2.3.4. Các mẫu tô đỏ là mẫu có khả năng thấp là mẫu thuần chủng vii 46 MỞ ĐẦU Do có sự đa dạng về địa hình, tiểu vùng khí hậu và các hệ sinh thái nên khu hệ động vật hoang dã của Việt Nam rất đa dạng về thành phần loài, phân bố ở hầu hết các vùng địa lý và cảnh quan khác nhau. Tuy nhiên, những ảnh hƣởng của suy thoái môi trƣờng do tác động của con ngƣời, tình trạng khai thác quá mức và biến đổi khí hậu, đã khiến nhiều loài động vật đứng trƣớc nguy cơ bị tuyệt chủng vì mất sinh cảnh sống và suy giảm số lƣợng quần thể, đặc biệt là các loài sống ở hệ sinh thái rừng nhiệt đới, trong đó có các loài cá sấu. Cá sấu xiêm (Crocodylus siamensis) là một loài cá sấu nƣớc ngọt đƣợc Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế xếp vào nhóm cực kỳ nguy cấp (CR). Loài này cũng đƣợc liệt vào phụ lục I theo công ƣớc CITES bởi sự phân mảnh quần thể và tình trạng săn bắt trái phép tăng mạnh . Tại Việt Nam, loài này đã từng đƣợc coi là tuyệt chủng ngoài tự nhiên . Cho tới đầu những năm 2000, nhóm các nhà khoa học tại Việt Nam và đại học Queensland đã thực hiện chƣơng trình tái thả cá sấu xiêm về vƣờn quốc gia Cát Tiên từ một số sơ sở nuôi động vật hoang dã . Nghiên cứu của Polet năm 2006 và kết quả điều tra, giám sát vào năm 2015, 2017 của VQG Cát Tiên cho thấy có sự xuất hiện con non và gia tăng số lƣợng cá thể phản ánh hiệu quả của chƣơng trình tái thả . Tại Lào và Việt Nam, lai không kiểm soát giữa các loài này thƣờng xuyên diễn ra tại các trại nuôi nhốt . Hai loài thƣờng đƣợc lai với cá sấu Xiêm là cá sấu nƣớc mặn (C. porosus) và cá sấu Cuba (C. rhombifer) . Con lai thƣờng có kích thƣớc lớn, có giá trị thẩm mỹ và khó phân biệt về mặt hình thái với cá sấu Xiêm thuần chủng. Sự tồn tại của cá thể lai ngoài tự nhiên sẽ gây tác động xấu đến sự tồn tại của cá thể thuần chủng bởi sự cạnh tranh về nơi ở, nguồn thức ăn và có thể làm ảnh hƣởng đến nguồn gen của loài. Bên cạnh đó, quần thể mới phát hiện tại bản Sóc, Khammouane, Lào chƣa đƣợc thực hiện nghiên cứu về sinh học phân tử. 8 Vì những lý do trên tôi thực hiện đề tài “Xác định mức độ thuần chủng của cá thể loài cá sấu Xiêm (Crocodylus siamensis) bằng sinh học phân tử nhằm hỗ trợ công tác bảo tồn”. Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng dữ liệu di truyền cho quần thể mới phát hiện tại Khammouane (Lào). - Xác định sự thuần chủng của các cá thể tại khu vực nuôi nhốt bao gồm một vƣờn thú tại Lào, vƣờn thú Thủ Lệ (Hà Nội), vƣờn thú Sài Gòn (Tp. Hồ Chí Minh). - Đánh giá hiện trạng bảo tồn loài tại VQG Cát Tiên. Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Xây dựng cơ sở dữ liệu di truyền cho quần thể mới Khuếch đại, giải trình tự đoạn gen ty thể có kích thƣớc 790bp, đồng thời xác định kiểu gen 8 locus microsatellite Xây dựng cây quan hệ di truyền dựa trên các mẫu vật của quần thể mới với các dữ liệu đã công bố trên ngân hàng gen (NCBI). - Nội dung 2: Đánh giá mức độ thuần chủng của các cá thể trong một số khu nuôi nhốt tại Lào và Việt Nam Xác định dòng mẹ: khuếch đại, giải trình tự đoạn gen ty thể, đối chiếu với các trình tự trên ngân hàng gen (NCBI) bằng công cụ Blast và xây dựng cây quan hệ di truyền dựa trên các dữ liệu thu đƣợc. Xác định độ thuần chủng: khuếch đại, xác định kiểu gen 8 locus microsatellite. Phân tích xác suất thuộc nhóm cá thể thuần chủng bằng phần mềm GeneClassv2 Phân tích tỷ lệ loài trong từng cá thể bằng phần mềm STRUCTUREv2.3.4 - Nội dung 3: Đánh giá hiện trạng bảo tồn loài tại VQG Cát Tiên Khảo sát hiện trạng bảo tồn loài tại Bàu Sấu Phỏng vấn các cán bộ, kiểm lâm thuộc VQG Cát Tiên và ngƣời dân xã Đăk Lua (huyện Tân Phú, tỉnh Đồng Nai) 9 10 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Cá sấu Xiêm và hiện trạng loài Sơ lược các nghiên cứu liên quan đến cá sấu Xiêm Cá sấu Xiêm (Crocodylus siamensis) hay còn đƣợc gọi là cá sấu Thái Lan hoặc cá sấu nƣớc ngọt là một trong 13 loài thuộc giống Cá sấu (Crocodylus), thuộc bộ Cá sấu (Crocodilia), lớp Bò sát (Reptilia). Loài này lần đầu đƣợc mô tả bởi Schneider vào năm 1801 [49]. Chúng cũng đƣợc mô tả bởi một số tác giả khác nhƣ Anonymous (1688), Du (1733), tuy nhiên công bố của Schneider đƣợc sử dụng chủ yếu [22]. Các nghiên cứu về hiện trạng loài đƣợc thực hiện nhiều bởi tình trạng suy giảm liên tục của loài này từ thập kỉ 70 của thế kỉ trƣớc [9, 43, 44]. Đó cũng là nguyên nhân mà các nghiên cứu về sinh thái học còn khá hạn chế và ít có sự thống nhất vì số lƣợng còn rất ít trong tự nhiên [35]. Năm 2005, nhóm Phothitay thực hiện nghiên cứu về thực trạng cá thể tại vƣờn thú Ban Kuen, Lào [41]. Tại đây chúng thƣờng đƣợc lai với cá sấu nƣớc mặn C.porosus. Hiện nay trình tự toàn bộ hệ gen ty thể và nghiên cứu quan hệ di truyền các loài trong giống Crocodylus đã đƣợc công bố bởi nhóm Ji và cộng sự (2008), Man và cộng sự (2011) [32, 35]. Đây là cơ sở dữ liệu hữu ích cho các nghiên cứu trên gen ty thể. Chỉ thị microsatellite cho giống Crocodylus nói chung và cho cá sấu Xiêm nói riêng đã đƣợc nghiên cứu và phát triển bởi nhóm FitzSimmons và cộng sự thuộc đại học Queensland (Úc), nhóm nghiên cứu của Chaeychomsri và cộng sự (2008) [16, 24, 36]. Nghiên cứu của FitzSimmons và cộng sự là cơ sở khoa học cho dự án tái thả cá sấu tại VQG Cát Tiên năm 2002.Nghiên cứu về nhiễm sắc thể cũng đƣợc thực hiện bởi Youngprapakorn (1991) [54]. Tuy nhiên, cho đến nay chƣa có nghiên cứu nào ngoài nghiên cứu của nhóm FitzSimmons sử dụng chỉ thị microsatellite để xác định tính thuần chủng của các cá thể các sấu Xiêm phục vụ tái thả tại Vƣờn Quốc gia Cát Tiên. Nhƣ vậy, các nghiên 11 cứu ứng dụng chỉ thị microsatellite để xác định mức độ thuần chủng của các cá thể nuôi nhốt tại Lào và Việt Nam chƣa đƣợc thực hiện nhiều và chƣa có tính cập nhật. Phân bố Cá sấu Xiêm phân bố trên đất liền khu vực Đông Nam Á và một phần nhỏ thuộc In-đô-nê-xi-a. Quần thể thuộc In-đô-nê-xi-a có sự khác biệt lớn với quần thể trên đất liền. Dƣới nhiều áp lực lên các quần thể tự nhiên, khu vực phân bố của loài ngày càng giảm và bị phân mảnh mạnh mẽ. Hiện nay, cá sấu Xiêm phân bố ở các nƣớc Campuchia, Lào, Thái Lan, In-đô-nê-xi-a và Việt Nam [12]. Bản đồ phân bố loài đƣợc thể hiện ở Hình 1. Khu vực phân bố ngoài tự nhiên tại các nƣớc nhƣ sau: Campuchia: Cá sấu Xiêm phân bố ở 35 địa điểm trong hệ thống 21 sông thuộc về 11 tỉnh, chủ yếu ở các khu vực khó tiếp cận ở phía Tây Nam và Đông Bắc. Các quần thể lớn nhất còn tồn tại là hệ thống sông Sepro, Sekong, Sre Ambel thuộc thành phố Koh Kong (Kampong Saom), Pursat, Koi, Kep, Tatai, Areng và đầm Veal Veng [12, 52]. Tuy nhiên các đợt điều tra thực địa của nhóm Han và cộng sự vào năm 2015 chỉ phát hiện cá sấu Xiêm trong 50% địa điểm còn phân bố trƣớc đó [28]. Khu vực có cá sấu là các vùng rừng xung quanh dãy núi Cardamom và ở độ cao 500m so với mực nƣớc biển. Indonesia: Hồ Mesangat thuộc hệ thống sông Mahakam thuộc tỉnh Kalimantan, Borneo là nơi duy nhất hiện nay ghi nhận loài này ngoài khu vực đất liền. Báo cáo địa phƣơng từ năm 1998 cho thấy là có sự xuất hiện loài này tại tỉnh Central Kalimantan [12]. Lào: Các nghiên cứu của Bezuijen và cộng sự cho thấy loài xuất hiện tại hệ thống 7 sông Xe Champhone, Xe Banghiang, Xe Bangfai và Xe Xangxoy (tỉnh Savannakhet), Xe Pian-Xe Khampho (tỉnh Attapu), Xe Don River (tỉnh Salavan) và khu bảo tồn quốc gia Phou Khaokhouay (tỉnh Bolikhamxay). Nghiên cứu của nhóm Ziegler và cộng sự (2015) đã ghi nhận một quần thể mới tại Bansoc (tỉnh Khammoune) [55]. Thái Lan: Các quần thể chủ yếu còn tồn tại ở miền Trung và miền Tây Thái Lan bao gồm vƣờn quốc gia Pang Sida và vƣờn quốc gia Kaengkrachan [37]. 12 Việt Nam: Năm 2008, số lƣợng cá sấu Xiêm có khoảng hơn 50.000 cá thể còn tồn tại, chủ yếu ở các trang trại ở miền Nam. Trƣớc đó, loài này đã từng có khu vực phân bố khá rộng tại các khu vực khu bảo tồn thiên nhiên Krông Trai, Phú Yên; hồ Lắk thuộc tỉnh Đắk Lắk và sống nhiều ở khu vực sông Đồng Nai đặc biệt là Bàu Sấu thuộc VQG Cát Tiên [30]. Sau 5 chuyến khảo sát vào năm 2000 tại các địa điểm khác nhau, nhóm Platt và Ngô Văn Trí đã đƣa ra kết luận là cá sấu Xiêm tại Việt Nam đã bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên [43]. Sau các nỗ lực tái thả tại VQG Cát Tiên, quần thể ở Bàu Sấu đã đƣợc khôi phục và ngày càng phát triển [44]. Các chuyến khảo sát thực địa của nhóm Nguyễn và cộng sự ghi nhận sự tồn tại của ít nhất hai cá thể tại bàu Hà Lầm, Phú Yên vào năm 2005 [38]. Tuy nhiên, đến năm 2012, ngƣời dân phát hiện một cá thể cái trƣởng thành bị chết tại hồ Ea Lâm cùng thuộc xã Ea Lâm. Điều này cho thấy khả năng còn tồn tại cá sấu tại xã Ea Lâm, sông Hinh, Phú Yên là rất thấp. Nhƣ vậy, với các số liệu hiện tại, VQG Cát Tiên là nơi duy nhất tại Việt Nam còn tồn tại cá sấu Xiêm ngoài tự nhiên. Một số đặc điểm sinh thái của cá sấu Xiêm Cá sấu Xiêm là một loài cá sấu nƣớc ngọt có kích thƣớc trung bình. Sinh cảnh sống phù hợp với loài này khá đa dạng bao gồm các vùng nƣớc chảy nhƣ các sông và suối có dòng chảy chậm, đầm lầy, sông, hồ ngập nƣớc theo mùa, đầm lầy và đồng lầy [52]. Các nghiên cứu về sinh thái học của loài này vẫn còn khá ít. Thức ăn chủ yếu của chúng là cá, rắn, động vật lƣỡng cƣ và một số loài động vật có vú nhỏ và thậm chí cả xác thối [10]. Ngoài ra, chúng cũng ăn côn trùng, ốc sên [7]. Về sinh sản, ngoài tự nhiên cá sấu Xiêm đẻ từ 11-26 trứng và con số này trong điều kiện nuôi nhốt là 6-50 trứng [42, 51]. Tổ ấp trứng đƣợc con cái xây từ những mảnh vụn của cây và trộn với bùn [42]. Trứng sẽ nở sau khoảng 70-80 ngày ấp. Sau khi trứng nở, con cái sẽ giúp con non ra khỏi trứng, sau đó ngậm con trong hàm và đƣa chúng ra mặt nƣớc [4]. Cá sấu non sau 6 tháng tuổi thƣờng sẽ tách đàn và đi kiếm ăn riêng. Trong giai đoạn này chúng có thể bị đối mặt với nhiều kẻ thù hoặc tự tạo đàn mới. 13 Hình 1. Bản đồ phân bố cá sấu Xiêm (Bezuijen và cộng sự 2012) Hiện trạng loài Theo thang xếp hạng của Liên minh bảo tồn thế giới (IUCN), tình trạng bảo tồn của cá sấu Xiêm đang ở mức CR A2cd v3.1 tức là cực kỳ nguy cấp và dự đoán suy giảm ít nhất 80% trong 10 năm tới hoặc 3 thế hệ tới bởi sự suy giảm nơi cƣ trú, khu phân bố hoặc chất lƣợng sinh cảnh sống, và mức độ khai thác hiện tại [12]. Cá sấu Xiêm cũng đƣợc liệt vào phụ lục I của công ƣớc CITES tức là mức nguy cấp bị đe doạ tuyệt chủng do các hoạt đông khai thác buôn bán và bị kiểm soát nghiêm ngặt việc xuất nhập khẩu giữa các nƣớc [1]. Một mối đe doạ gần đây có thể có ảnh hƣởng rất lớn đến sự tồn tại của loài này là mức độ lai tạo không kiểm soát giữa các 14 loài cá sấu trong các trang trại nuôi nhốt vì con lai không bị kiểm soát bởi pháp luật nên có thể tự do buôn bán. Hiện trạng loài tại Việt Nam Việt Nam là nƣớc duy nhất có phân bố cá sấu Xiêm mà từng bị tuyên bố đã tuyệt chủng ngoài tự nhiên. Những số liệu về cá sấu Xiêm từ trƣớc những năm 1990 là không có. Tuy nhiên, các nghiên cứu cho rằng việc săn bắt cá sấu Xiêm bắt đầu từ những năm 1970 và thời kì đỉnh điểm là giai đoạn 1975-1980. Đến những năm 1999, có nhiều tranh cãi về sự tồn tại của cá sấu Xiêm ngoài tự nhiên tại Việt Nam [43]. Sau các cuộc khảo sát, điều tra, phân tích thực nghiệm, vào cuối năm 2001, các cá thể cá sấu Xiêm thuần chủng đầu tiên đã đƣợc tái thả vào Bàu Sấu, VQG Cát Tiên. Đây là nỗ lực nhằm hồi phục quần thể của loài này ở Việt Nam đƣợc thực hiện dựa trên các hoạt động hợp tác của các nhà khoa học từ đại học Queensland và các nhà khoa học Việt Nam [44]. Đến năm 2005, các cá thể cá sấu con đầu tiên đã đƣợc phát hiện khẳng định sự thành công của dự án tái thả [40]. Từ đó đến nay, các đợt điều tra, giám sát của các cán bộ VQG Cát Tiên cho thấy có sự gia tăng về mặt số lƣợng cá thể và số lƣợng đàn tại Bàu Sấu. Hiện trạng loài tại Lào Các đợt khảo sát từ năm 2003 đến 2008 ghi nhận 13 khu vực phân bố của cá sấu Xiêm với ít nhất là 36 cá thể xuất hiện với mật độ thấp. Các đợt khảo sát tại 35 địa điểm của nhóm Bezuijen và cộng sự vào năm 2013 đã ghi nhận sự có mặt của cá sấu Xiêm tại 13/15 địa điểm. Số lƣợng cá thể trong mỗi khu vực trong khoảng từ 111 cá thể và 13 địa điểm này nằm trong vào 6 hệ thống sông khác nhau [13]. Một số lƣợng lớn cá thể đang đƣợc nuôi nhốt trong các trang trại tại Lào. [41]. Tuy nhiên chƣa có nghiên cứu nào xác định độ thuần chủng của các cá thể này trong khi tình trạng lai không kiểm soát giữa các loài vẫn diễn ra 1.2. Các mối đe doạ và vấn đề lai tạo cá sấu trong các cơ sở nuôi nhốt Các mối đe doạ đến loài bao gồm săn bắt, suy giảm và mất môi trƣờng sống, phân mảnh khu vực phân bố. Tại các nƣớc trong khu vực, tình trạng săn bắt trái 15 phép trứng và cá sấu vẫn diễn ra. Trứng và các con non có thể dùng làm nguồn cho các trang trại nuôi nhốt. Cá sấu có kích thƣớc lớn bị giết để lấy da đem bán. Hoạt động của các trang trại này gây ra áp lực rất lớn lên các quần thể tự nhiên. Việc ngăn đập thuỷ điện có ảnh hƣởng đến chất lƣợng nƣớc và lƣợng nƣớc của môi trƣờng sống tại Campuchia và Việt Nam [12, 44]. Ví dụ, sông Đồng Nai có ảnh hƣởng đến các khu ngập nƣớc tại VQG Cát Tiên. Trên sông này có tất cả 5 đập thuỷ điện bao gồm Trị An, Đồng Nai 2,3,4,5. Thuỷ điện Trị An đã làm giảm lƣu lƣợng nƣớc vào các khu ngập nƣớc [3]. Hai dự án 6 và 6A đã bị huỷ vì những ảnh hƣởng đến đa dạng sinh học của VQG Cát Tiên. Các quần thể tự nhiên tại Lào có số lƣợng cá thể rất thấp và gần nhƣ không có sự kết nối giữa các quần thể [13]. Gia tăng biến đổi khí hậu làm nhiệt độ trung bình tăng 0,4 đến 1,2oC có thể ảnh hƣởng đến việc quyết định giới tính trong quá trình ấp trứng cũng nhƣ sự tăng trƣởng và tồn tại của các cá thể [53]. Vấn đề lai tạo cá sấu Xiêm là mối đe doạ tiềm tàng đến việc bảo tồn cá sấu Xiêm tại các nƣớc Đông Nam Á vì nó có thể gây ra sự xáo trộn di truyền giữa các loài nếu vô tình hoặc cố ý thả các con lai vào tự nhiên. Sự lai tạo giữa các loài khác nhau là hiếm gặp trong tự nhiên. Việc lai khác loài xảy ra với cả thực vật và nhiều lớp động vật khác nhau nhƣ côn trùng, cá, lƣỡng cƣ, chim, thú ăn thịt và linh trƣởng[40]. Lai khác loài diễn ra phổ biến hơn trong thời gian gần đây bởi việc di chuyển các loài từ khu vực phân bố tự nhiên của chúng sang các khu vực khác phục vụ nhu cầu của con ngƣời. Nghiên cứu về lai khác loài và khu vực lai có thể cung cấp thông tin về các quá trình tiến hoá nhƣ sự thích nghi, dòng gen và tách loài [8, 40]. Quá trình lai khác loài sẽ tạo ra các cá thể có kiểu gen, kiểu hình mới và khác biệt, bất thụ và đôi khi là con lai có sức sống tốt trội hơn cả hai loài gốc. Kết quả của quá trình này phụ thuộc vào hƣớng chọn lọc của tự nhiên. Có nhiều khả năng xảy ra do kết quả của quá trình lai tạo: hai loài hợp nhất thành một loài và hai loài bố mẹ hoàn toàn biến mất; hàng rào sinh sản sẽ đƣợc tạo ra giữa hai loài bố mẹ; vật liệu di truyền sẽ đƣợc chuyển vào hai loài và đƣợc giữ lại bởi quá trình chọn lọc thích nghi; một loài lai mới đƣợc hình thành; khu vực lai sẽ đƣợc tạo ra mà không làm ảnh hƣởng đến sự tồn tại của loài bố mẹ [6, 50]. 16 Đối với cá sấu Xiêm, các nghiên cứu về tác động của con lai với hai loài thƣờng đƣợc lai với nó là cá sấu nƣớc mặn (C. porosus) và cá sấu Cuba (C. rhombifer) hiện nay chƣa đƣợc thực hiện. Con lai sinh ra thƣờng có kích thƣớc lớn có thể sẽ cạnh tranh với những cá thể thuần chủng về nơi ở, nguồn thức ăn nếu đƣợc thả về tự nhiên. Điều này ảnh hƣởng đến sự tồn tại các quần thể ngoài tự nhiên. Do đó việc tách các con lai với các cá thể thuần chủng là cần thiết để tránh những mối nguy hại đến sự tồn tại của loài cá sấu Xiêm. Vì cá sấu Xiêm bị liệt vào phụ lục I của CITES [1] và các nƣớc có phân bố loài đều tham gia vào công ƣớc này nên các hoạt động buôn bán, xuất nhập khẩu là trái phép. Tuy nhiên việc lai với loài khác và các hoạt động thƣơng mại lại không bị ngăn cấm. Thêm vào đó, thực trạng quản lý thiếu nghiêm ngặt dẫn đến tình trạng lai khác loài diễn ra tràn lan tại các khu vực nuôi nhốt nhƣ các vƣờn thú nhà nƣớc, các trang trại cá sấu tƣ nhân. Tại Việt Nam, các trang trại nuôi cá sấu chủ yếu tập trung ở các tỉnh phía Nam. Tại các trang trại này, cá sấu Xiêm chủ yếu đƣợc lai với cá sấu nƣớc mặn (C. porosus) do con lai sinh ra sẽ có kích thƣớc lớn nhƣ cá sấu nƣớc mặn và có hoa văn đẹp nhƣ cá sấu Xiêm. Tình trạng tƣơng tự cũng xảy ra tại các cơ sở nuôi nhốt ở Thái Lan. Ngoài ra, cá sấu Xiêm cũng vô tình bị lai với cá sấu Cuba (C. rhombifer) bởi một số cá thể loài này đƣợc tặng cho cho chính phủ Việt Nam từ năm 1985. Các bằng chứng về việc lai cá sấu Xiêm với hai loài cá sấu nƣớc mặn (C. porosus) và cá sấu Cuba (C. rhombifer) đƣợc công bố dựa trên các nghiên cứu sử dụng chỉ thị microsatellite và các đợt điều tra, khảo sát của FitzSimmons và cộng sự (2000, 2002), Phothitay và cộng sự (2005) [13, 18, 24]. Tại Lào, các chƣơng trình bảo vệ cá sấu Xiêm với sự tham gia của cộng đồng đã đƣợc thực hiện từ những năm 2006 [11]. Các đợt khảo sát nhằm tìm thêm quần thể mới vẫn đang liên tục đƣợc thực hiện tại các khu vực tiềm năng [13, 55]. Việt Nam có chƣơng trình tái thả vào VQG Cát Tiên từ năm 2000. Từ đó đến nay quần thể tái thả đã có sự tăng về số lƣợng và mở rộng đàn nhờ có sự bảo vệ nghiêm ngặt [3, 37]. Tuy nhiên hiện nay, khu vực hồ Hà Lâm và Ea Lâm tại Sông Hinh, Phú Yên không đƣợc bảo vệ và giám sát. Năm 2017, nhóm Lapbenjakul và cộng sự đã công 17 bố nghiên cứu đa dạng di truyền của cá sấu Xiêm và cá sấu nƣớc mặn nhằm mục đích tái thả vào tự nhiên tại Thái Lan [33]. 1.3. Các chỉ thị sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu Chỉ thị Microsatellite Microsatellite là những đoạn lặp lại nhất định trong hệ gen nhân có chiều dài từ 1-6 bp và lặp lại khoảng 5-50 lần [14]. Microsatellite là một công cụ hữu ích trong việc lập bản đồ gen và nghiên cứu cấu trúc di truyền của các quần thể đồng thời là một chỉ thị di truyền giúp phân biệt các quần thể với nhau do chúng đơn giản, phân bố đều trên hệ gen nhân và tốc độ biến đổi của chúng khá nhanh. Microsatellite còn đƣợc biết đến với các thuật ngữ nhƣ STR’s (Short tandem repeats), VNTR (Variable number tandem repeats), SSR’s (simple sequence repepeats), SSTR (sequence tandem repeats), SSLP (simple sequence length), STMS (sequence tagged microsatellites) [14, 20]. Mỗi đơn vị lặp của microsatellite thƣờng có từ 1-5 nucleotide [47]. Có 4 cách lặp có thể là: - Mononucleotide: AAAAAAAAAAAAAAAA=(A)16 (bp) - Dinucleotide: GCGCGCGCGCGCGCGCGCGC=(GC)10(bp) - Dinucleotide repeats đƣợc tìm thấy nhiều ở động vật có vú chủ yếu là GT/AC ở thực vật là AA /TT, AT/TA - Trinucleotide: GTCGTCGTCGTCGTCGTC=(GTC)6(bp) - Tetranucleotide: ATGCATGCATGCATGC=(ATGC)4(bp) Sự sắp xếp có thể phân ra 3 loại: - Trình tự lặp lại hoàn hảo: Ví dụ: TGTGTGTGTG - Trình tự kết hợp: Ví dụ: CACACACAGAGAGA (kết hợp giữa CA và GA) - Trình tự ngắt quãng: Ví dụ: CACATTCACACATTCATT (các đoạn CA bị ngắt quãng) Vì microsatellite thuộc hệ gen nhân nên chúng tồn tại ở hai trạng thái : 18