Tài liệu Xác định hàm lượng crinamidin trong thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng sắc ký khí khối phổ.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ LIÊN XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CRINAMIDIN TRONG THUỐC VÀ THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ LIÊN XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CRINAMIDIN TRONG THUỐC VÀ THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: TS. Trần Nguyên Hà PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo HÀ NỘI 2018 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện luận văn này, tôi đã rất may mắn khi nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các chuyên gia, các nghiên cứu viên, các anh chị kỹ thuật viên cùng tình cảm và sự khích lệ mà gia đình và bạn bè đã dành cho tôi. Tôi xin được bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Nguyên Hà và PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo đã giao đề tài, luôn tâm huyết và tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn. Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành tới TS. Trần Cao Sơn đã cho tôi những lời khuyên quý báu, dành nhiều thời gian và tạo điều kiện tối đa giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Cao Công Khánh cùng các anh chị, các bạn khoa Nghiên cứu thực phẩm, khoa Độc học & dị nguyên, khoa Chất lượng, phụ gia và chất hỗ trợ chế biến thực phẩm – Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám Hiệu, phòng Sau đại học, bộ môn Hóa phân tích – trường Đại học Dược Hà Nội, cùng các thầy cô đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè – những người đồng hành không thể thiếu trong học tập và cuộc sống đã luôn động viên và khích lệ tôi những ngày qua. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 28 tháng 03 năm 2018 Học viên Lê Thị Liên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 PHẦN 1. TỔNG QUAN ............................................................................................ 3 1.1. Tổng quan về cây trinh nữ hoàng cung ......................................................... 3 1.1.1. Đặc điểm thực vật ......................................................................................... 3 1.1.2. Nguồn gốc và phân bố, bộ phận sử dụng ..................................................... 4 1.1.3. Thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L. ...................................... 4 1.1.4. Tác dụng sinh học ......................................................................................... 5 1.2. Tổng quan về crinamidin ................................................................................ 5 1.3. Một số nghiên cứu xác định crinamidin ........................................................ 7 PHẦN 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 15 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .................................................................................... 15 2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu ................................................................................ 15 2.2.1. Chất chuẩn .................................................................................................. 15 2.2.2. Hóa chất, dung môi ..................................................................................... 16 2.2.3. Thiết bị, dụng cụ ......................................................................................... 16 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 17 2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng crinamidin trong thuốc và TPBVSK .. 17 2.3.2. Thẩm định phương pháp định lượng crinamidin bằng kỹ thuật GC-MS/MS .... 19 2.4. Ứng dụng phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng crinamidin trong thuốc và TPBVSK ........................................................................................................... 21 2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................................. 21 PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................... 22 3.1. Xây dựng phƣơng pháp phân tích ............................................................... 22 3.1.1. Kết quả khảo sát các điều kiện tối ưu cho phương pháp định lượng crinamidin bằng GC-MS/MS ................................................................................ 22 3.1.2. Kết quả khảo sát quá trình xử lý mẫu cho phương pháp định lượng crinamidin bằng GC-MS/MS ................................................................................ 29 3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích ............................................................. 39 3.2.1. Tính thích hợp của hệ thống ....................................................................... 39 3.2.2. Tính đặc hiệu, chọn lọc ............................................................................... 40 3.2.3. Khoảng tuyến tính ....................................................................................... 44 3.2.4. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng .................................................... 45 3.2.5. Độ lặp lại .................................................................................................... 46 3.2.6. Độ thu hồi ................................................................................................... 48 3.3. So sánh phƣơng pháp xây dựng với phƣơng pháp tiêu chuẩn Dƣợc điển Việt Nam IV .......................................................................................................... 52 3.3.2. So sánh về giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của hai phương pháp ......................................................................................................... 54 3.3.3. So sánh về hiệu suất của quy trình chiết trên nền mẫu lá TNHC của hai phương pháp ......................................................................................................... 55 3.4. Kết quả xác định hàm lƣợng crinamidin trên một số mẫu thuốc và TPBVSK .. 57 PHẦN 4. BÀN LUẬN .............................................................................................. 61 4.1. Về phƣơng pháp chiết xuất crinamidin từ các chế phẩm chứa TNHC .... 61 4.2. Về xác định hàm lƣợng crinamidin bằng GC-MS/MS .............................. 61 4.3. Ứng dụng phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng crinamidin trên mẫu thực ... 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 64 Kết luận ................................................................................................................. 64 Kiến nghị ............................................................................................................... 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ tiếng Việt (tiếng Anh) ACN Acetonitril AOAC Hiệp hội các cộng đồng phân tích chính thức (Association of Official Analytical Communities) CE Điện di mao quản (Capillary electrophoresis) CHCl3 Cloroform DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV EI Bắn phá electron (Electron ionization) GC Sắc ký khí (Gas Chromatography) HCl Acid hydrocloric H3PO4 Acid phosphoric HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantification) MEKC Sắc ký điện động micell (Micellar electrokinetic chromatography) MeOH Methanol m/z Tỷ số khối lượng và điện tích của ion (Mass-to-charge ratio) MRM Giám sát đa phản ứng (Multiple reaction monitoring) MS Khối phổ (Mass Spectrometry) NH3 Amoniac NXB Nhà xuất bản PDA Dãy diod quang (Photodiode array) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation) SFE Chiết lỏng siêu tới hạn (Supercritical fluid extraction) tR Thời gian lưu TNHC Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) TPBVSK Thực phẩm bảo vệ sức khỏe UV-VIS Tử ngoại – khả kiến (Ultra violet – Visible) DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Tính chất lý hóa và tác dụng sinh học của crinamidin ..............................6 Bảng 1.2: Một số nghiên cứu xác định crinamidin và nhận xét .................................7 Bảng 3.1: Các mảnh ion mẹ và ion con của crinamidin sau khi bắn phá ................23 Bảng 3.2: Các mảnh ion mẹ và ion con của cafein sau khi bắn phá ........................23 Bảng 3.3: Điều kiện tối ưu hóa GC-MS/MS .............................................................28 Bảng 3.4: Khảo sát quy trình xử lý mẫu ...................................................................29 Bảng 3.5: Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu.......................................................30 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát số lần chiết mẫu............................................................33 Bảng 3.7: Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu .......................................................35 Bảng 3.8: Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi chiết ......................................................37 Bảng 3.9: Thời gian lưu và diện tích pic qua 6 lần tiêm mẫu ..................................40 Bảng 3.10: Tỷ lệ các ion crinamidin của dung dịch thêm chuẩn crinamidin ...........43 Bảng 3.11: Phương trình đường chuẩn crinamidin và hệ số tương quan tuyến tính ......44 Bảng 3.12: Giá trị LOD và LOQ của crinamidin .....................................................45 Bảng 3.13: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp trên nền viên nang cứng ......46 Bảng 3.14: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp trên nền trà túi lọc ........47 Bảng 3.15: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp trên nền cao lỏng..........47 Bảng 3.16: Kết quả độ thu hồi của crinamidin trên nền viên nang cứng .................49 Bảng 3.17: Kết quả độ thu hồi của crinamidin trên nền trà túi lọc ..........................50 Bảng 3.18: Kết quả độ thu hồi của crinamidin trên nền cao lỏng ............................51 Bảng 3.19: Quy trình xử lý mẫu và điều kiện sắc ký của phương pháp tiêu chuẩn và phương pháp xây dựng ..............................................................................................52 Bảng 3.20: Giá trị LOD và LOQ của crinamidin .....................................................54 Bảng 3.21: Kết quả phân tích hàm lượng crinamidin trong mẫu chuẩn và thử bằng phương pháp tiêu chuẩn và phương pháp xây dựng .................................................56 Bảng 3.22: Kết quả xác định hàm lượng crinamidin từ các mẫu thuốc và TPBVSK......58 Bảng 3.23: Kết quả xác định hàm lượng crinamidin từ các mẫu cao và trà túi lọc.59 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1: Cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) ....................................... 3 Hình 1.2: Công thức cấu tạo crinamidin .................................................................... 6 Hình 2.1: Hệ thống sắc ký khí khổi phổ 2 lần (GC-MS/MS) .................................... 18 Hình 3.1: Phổ khối của crinamidin sau khi bắn phá ion ..........................................23 Hình 3.2: Phổ khối của cafein sau khi bắn phá ion ..................................................23 Hình 3.3: Sắc ký đồ tổng (TIC) của crinamidin và chuẩn nội cafein .......................24 Hình 3.4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL trong dung môi MeOH.....25 Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL trong dung môi ACN ..25 Hình 3.6: Sắc ký đồ chuẩn crinamidin 20 µg/mL chế độ tiêm không chia dòng ......26 Hình 3.7: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL, chương trình nhiệt độ (*) .27 Hình 3.8: Sắc đồ của dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL trong dung môi CHCl3, chế độ tiêm chia dòng 10 : 1, chương trình nhiệt độ (**) ........................................27 Hình 3.9: Biểu đồ kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu trên ba nền mẫu ...............31 Hình 3.10: Sơ đồ quy trình chiết xuất crinamidin từ chế phẩm TNHC ....................32 Hình 3.11: Biểu đồ tương quan hàm lượng crinamidin và số lần chiết mẫu ...........34 Hình 3.12: Biểu đồ tương quan hàm lượng crinamidin và thời gian chiết mẫu .......36 Hình 3.13: Biểu đồ tương quan hàm lượng crinamidin và tỷ lệ dung môi chiết ......38 Hình 3.14: Quy trình xử lý mẫu tối ưu ......................................................................39 Hình 3.15: Sắc ký đồ dung môi CHCl3 .....................................................................41 Hình 3.16: Sắc ký đồ placebo viên nang thêm chuẩn nội cafein ..............................41 Hình 3.17: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL, chuẩn nội cafein ......42 Hình 3.18: Sắc ký đồ của dung dịch thêm chuẩn crinamidin ...................................42 Hình 3.19: Sắc ký đồ tỷ lệ ion của crinamidin và cafein của dung dịch chuẩn 20 µg/mL .43 Hình 3.20: Đồ thị đường chuẩn crinamidin, chuẩn nội cafein .................................44 Hình 3.21: Sắc ký đồ của crinamidin ở LOD 0,3 µg/mL ..........................................45 Hình 3.22: Sắc ký đồ độ lặp lại trên nền viên nang cứng .........................................48 Hình 3.23: Sắc ký đồ độ lặp lại trên nền trà túi lọc ..................................................48 Hình 3.24: Sắc ký đồ độ lặp lại trên nền cao lỏng....................................................48 Hình 3.25: Sắc ký đồ mẫu thực viên nang cứng .......................................................49 Hình 3.26: Sắc ký đồ mẫu viên nang cứng thêm 160 µg chuẩn crinamidin .............49 Hình 3.27: Sắc ký đồ mẫu viên nang cứng thêm 200 µg chuẩn crinamidin .............50 Hình 3.28: Sắc ký đồ mẫu viên nang cứng thêm 240 µg chuẩn crinamidin .............50 Hình 3.29: Sắc ký đồ của crinamidin ở LOD 2 µg/mL (HPLC) ...............................55 Hình 3.30: Sắc ký đồ của crinamidin ở LOD 0,3 µg/mL (GC-MS/MS)....................55 Hình 3.31: Đường chuẩn crinamidin từ 10 đến 100 µg/mL (HPLC) .......................57 Hình 3.32: Đường chuẩn crinamidin từ 5 đến 50 µg/mL, chuẩn nội cafein (GC-MS/MS) ..57 ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với sự phát triển của xã hội, mô hình bệnh tật ngày càng trở nên phức tạp. Bệnh tật không chỉ làm rút ngắn tuổi thọ mà còn ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng cuộc sống con người. Khoa học và y – dược học ngày nay đã có những bước tiến vượt bậc và đạt được nhiều thành tựu to lớn trong việc ngăn ngừa và điều trị bệnh. Sự phát triển này đã góp phần phong phú hóa số lượng và đa dạng hóa chủng loại thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) trên thị trường, trong đó thuốc và sản phẩm có nguồn gốc thảo dược ngày càng tỏ ra ưu thế và chiếm được niềm tin của người sử dụng vì sự an toàn của các hợp chất thiên nhiên. Tại Việt Nam, với mục tiêu bảo vệ, chăm sóc và nâng cao sức khỏe nhân dân, nhiều chính sách, chiến lược quốc gia trong lĩnh vực y – dược học được đưa ra, trong đó bảo tồn và phát triển ngành dược liệu Việt Nam là một định hướng quan trọng trong thời gian tới [6], [15]. Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) là loại dược liệu quý được biết đến với tác dụng hỗ trợ điều trị u xơ tử cung, phì đại tuyến tiền liệt và ung thư tuyến tiền liệt [10]. Lá trinh nữ hoàng cung (TNHC) chứa nhiều thành phần, trong đó đáng quan tâm nhất là nhóm alkaloid vì có tác dụng sinh học, điển hình như crinamidin, ambellin, lycorin,...Sự hiện diện của TNHC được biểu thị qua hoạt chất đặc trưng điển hình, đồng thời là hoạt chất chính trong cây cho tác dụng sinh học là crinamidin. Chế phẩm chứa TNHC được bán tại các nhà thuốc, quầy thuốc, cửa hàng đông y, thậm chí cửa hàng tạp hóa và các kênh bán hàng online. Mỗi chế phẩm lại có một công thức bào chế khác nhau, từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau, hệ quả là hàm lượng crinamidin trong từng chế phẩm cũng không như nhau. Trong khi tiêu chuẩn cho các chế phẩm này chưa được hoàn thiện, nhà sản xuất đã lợi dụng kẽ hở để trục lợi, sử dụng nhiều nguồn nguyên liệu không rõ nguồn gốc đưa vào sản xuất, sử dụng các nguyên liệu khác thay thế mà không có tác dụng sinh học theo công bố trên nhãn. Đây cũng chính là mấu chốt của vấn nạn thuốc và TPBVSK thật hay giả hiện đang là chủ đề mang tính thời sự, nhận được nhiều sự quan tâm của báo chí và dư luận thời gian qua. Vì vậy, việc tiêu chuẩn hóa chất lượng chế phẩm chứa TNHC là vô cùng quan trọng và cấp thiết. 1 Hiện nay, Dược điển Việt Nam IV bản bổ sung năm 2015 quy định hàm lượng crinamidin (C17H19NO5) trong nguyên liệu lá TNHC không thấp hơn 0,08% tính theo khối lượng khô kiệt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [3], mà chưa đưa ra quy định đối với các chế phẩm chứa thành phần TNHC. Để xác định chất lượng sản phẩm TNHC, hàm lượng crinamidin là đại lượng quy chiếu được lựa chọn. Bên cạnh đó, phương pháp sắc ký khí khối phổ hai lần (GCMS/MS) là phương pháp ưu việt, có khả năng xác định các hợp chất hữu cơ trong hỗn hợp với độ phân giải cao, chọn lọc và đặc hiệu hơn nhiều so với phương pháp HPLC. GC-MS/MS là phương pháp rất thích hợp cho việc định lượng hoạt chất trong các chế phẩm thuốc và TPBVSK với nền mẫu phức tạp đồng thời hàm lượng crinamidin giảm nhiều lần so với hàm lượng trong nguyên liệu lá TNHC. Để góp phần kiểm soát chất lượng của các chế phẩm trên thị trường, đảm bảo quyền lợi của người sử dụng và sự chặt chẽ trong quản lý, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: “Xác định hàm lượng crinamidin trong thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng sắc ký khí khối phổ”, với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng crinamidin trong thuốc và TPBVSK bằng sắc ký khí khối phổ. 2. Ứng dụng phương pháp xây dựng để xác định hàm lượng crinamidin trong thuốc và TPBVSK. 2 Phần 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây trinh nữ hoàng cung 1.1.1. Đặc điểm thực vật Cây trinh nữ hoàng cung (TNHC), còn gọi là hoàng cung trinh nữ, tây nam văn châu lan, thập bát học sĩ (Trung Quốc), tỏi Thái Lan, tỏi lơi lá rộng, có tên khoa học là Crinum latifolium L., thuộc họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) [7], [10]. TNHC là một loại cây cỏ, thân hành như củ hành tây to, đường kính 10 – 15cm, bẹ lá úp vào nhau thành một thân giả dài 10 – 15cm, có nhiều lá mỏng kéo dài từ 80 – 100cm, rộng 3 – 8cm, hai bên mép lá lượn sóng. Gân lá song song, mặt trên lá lõm thành rãnh, mặt dưới lá có một sống lá nổi rất rõ, đầu bẹ lá nơi sát đất có màu đỏ tím. Hoa mọc thành tán gồm 6 – 18 hoa, trên một cán hoa dài 30 – 60cm. Cánh hoa màu trắng có điểm màu tím đỏ, từ thân hành mọc rất nhiều củ con có thể tách ra trồng riêng dễ dàng [10], [14], [39]. Hình 1.1: Cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) 3 1.1.2. Nguồn gốc và phân bố, bộ phận sử dụng TNHC là cây ưa ẩm, ưa sáng hoặc có thể chịu bóng một phần, sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện khí hậu nóng và ẩm của vùng nhiệt đới. Cây TNHC hiện được trồng rộng rãi ở nhiều nước trong khu vực như Thái Lan, Malaysia, Philippin, Campuchia, Lào, Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc. Ở Việt Nam, cây mọc hoang ven suối trong rừng một số nơi thuộc tỉnh Đồng Nai và Bà Rịa-Vũng Tàu, tự mọc và được trồng chủ yếu ở Huế, Đà Nẵng, Nha Trang và một số tỉnh phía Nam, sau được trồng ở các tỉnh phía Bắc [7], [18]. TNHC được xếp vào nhóm Thanh nhiệt giải độc [5]. Bộ phận sử dụng là lá (Folium Crinii latifolii) dùng tươi hay phơi hoặc thái nhỏ sao vàng dùng dần. [10], [13], [18]. 1.1.3. Thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L. Các nhà khoa học Ấn Độ, Nhật Bản và Việt Nam đã nghiên cứu thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L. như sau: + Crinum latifolium L. Ấn Độ: 11-O-Acetylambellin, 11-O-Acetyl-1,2-βepoxyambellin, Ambelin, Crinafolidin, Crinafolin, (-) 2-Epilycorin, 2- Epipancrassidin, 1,2-β-epoxyambellin, Hippadin (Pratorin, Alkalois N3), Latindin, Latisodin, Latisolin (Latisodin-O-β-D-glucopyranosyl), (-) Lycorin, (-) Lycorin-10-β-glucosid, Pratorimin, Pratorinin, Pratosin, Pseudolycorin-1-0-β-D-glucosid [27]. + Crinum latifolium L. Nhật Bản: 3-O-Acetylhamayn, (-) Acetyllycorin, Cheryllin (S), (+) Crinamin, (-) Crinin (Vittatin, Crinidin), Hamayn (Bulbispermin, Demethylcrinamin), Hipeastrin, Latifin (S), Powellin, Undulatin [35]. + Crinum latifolium L. Việt Nam: 9-Octadecenamid, Dihydro-oxodemethoxyhaemanthamin, Augustamin, Oxoassoanin, Crinan-3-α-ol, Buphannidrin, Powellin, Undulatin, Ambellin, 6-hydroxybuphannidrin, 1β,2β-epoxyambellin, 6-hydroxycrinamidin, Epoxy-3,7-dimethoxycrinan-11-one, Lycorin và Pratorin (Hippadin) và các flavonoid: 4’7-dihydroxy-3-vinyloxyflavan, 4’7-dihydroxyflavan, kaemperol-3-O-β-glucopyranosid [8], [14], [39]. Từ lá cây TNHC, Võ Thị Bạch Huệ cũng đã tách được 18 vết bằng kỹ thuật sắc ký ghép khối phổ, trong đó xác định được cấu trúc của 3 vết là ambellin, 4 crinamidin và 6 – OH – crinamidin sau khi so sánh thời gian lưu, khối phổ với 3 alkaloid đơn chất [8]. Thành phần hóa học khác của cây Crinum latifolium L. + Crinum latifolium L. Nhật Bản có Glucan a và Glucan b. + Crinum latifolium L. Việt Nam có 32 chất bay hơi và saponin, acid hữu cơ, amino acid, p-hydroxycinnamat metyl, 3,4’-dihydroxycinnamat ethyl, keampferol3-4-di-O-β-D-glucopyranosit. 1.1.4. Tác dụng sinh học Ở Ấn Độ, người ta dùng bẹ của cây xào nóng giã đắp làm thuốc trị bệnh thấp khớp; cũng dùng đắp mụn nhọt và áp xe để gây mưng mủ. Còn dịch lá dùng làm thuốc nhỏ tai chữa đau tai [18]. Từ những năm 1989 – 1990, người dân Việt Nam đã biết cách sử dụng TNHC để chữa những trường hợp u xơ và ung thư cổ tử cung (ở phụ nữ) và ung thư tuyến tiền liệt (ở nam giới) [10], [31]. TNHC còn được sử dụng để hỗ trợ điều trị bệnh u xơ tử cung, ung thư vú, tử cung, dạ dày, phổi và tuyến tiền liệt, viêm da lở loét, dị ứng mẩn ngứa. Hoạt tính chống oxi hóa, giảm đau, chống viêm, chống lại sự tăng sinh quá mức của các tế bào và sự phát triển của khối u [32]. Ngoài ra còn có khả năng chống ngưng kết tiểu cầu, chống độc tế bào [29], ức chế sự hình thành mạch máu của các tế bào nội mô tĩnh mạch rốn của người (HUVECs) và điều hòa hệ miễn dịch của cơ thể [33], [40]. Các tác giả Nguyễn Thị Ngọc Trâm, E. Zvetkova và cộng sự cũng đã chứng minh dịch chiết nước nóng từ lá cây TNHC Việt Nam có thể kích thích hữu hiệu sự sinh sản của tế bào lympho T và đặc biệt có tác dụng kích thích trực tiếp lên các tế bào TCD3, TCD4 invitro [20]. Lá tươi và thân hành dùng ngoài, hơ nóng xoa bóp vào chỗ sưng đau do thấp khớp, sang chấn [3]. 1.2. Tổng quan về crinamidin Crinamidin là alkaloid trong cây TNHC (Crinum latifolium L.), có công thức cấu tạo như hình 1.2. 5 Hình 1.2: Công thức cấu tạo crinamidin Bảng 1.1: Tính chất lý hóa và tác dụng sinh học của crinamidin Crinamidin Công thức phân tử C17H19NO5 (Khối lượng phân (M = 317,34 g/mol) tử) (1β,2β,3α)-7-Methoxy-1,2-epoxycrinan-3-ol Tên IUPAC Phổ IR có các băng hấp thụ cực đại (cm-1) ở 3200 – 3400 (OH), 1499, 1278 (epoxy), 1035, 918 (-OCH2O-), 802 (epoxy). Phổ hấp thụ Phổ UV – VIS có bước sóng hấp thụ cực đại ở 220 và 285 nm. Phổ HR – MS cho mảnh có số khối 318,1369 m/z tương ứng với mảnh ion phân tử giả [M+H]+ [19], [26]. Tính chất vật lý, hóa Crinamidin là chất bột kết tinh màu trắng, điểm chảy 215 – học 217oC, – 10o (CHCl3; 0,1 g/ml) [19], [26]. 6 Crinamidin là một alkaloid trong cây TNHC, cùng với các alkaloid khác cho tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư tử cung, ung thư tuyến tiền liệt, kháng khối u, kháng viêm, chống oxi hóa và kích thích miễn dịch [20], [32]. Các nhà khoa học đã chứng minh tác dụng đối một số bệnh Tác dụng sinh học ung thư như ung thư vú, tử cung, dạ dày, phổi và các bệnh viêm da lở loét, dị ứng mẩn ngứa, chống oxi hóa, giảm đau, chống viêm, chống lại sự tăng sinh quá mức của các tế bào và sự phát triển của khối u [32]. Ngoài ra còn có khả năng chống ngưng kết tiểu cầu, chống độc tế bào [29], ức chế sự hình thành mạch máu của các tế bào nội mô tĩnh mạch rốn của người [33], [40]. 1.3. Một số nghiên cứu xác định crinamidin Các nghiên cứu xác định crinamidin bao gồm khảo sát, định tính, định lượng và tinh chế, trong đó có tiêu chuẩn DĐVN IV đưa ra quy định về hàm lượng crinamidin trong lá TNHC. Kỹ thuật chính được sử dụng để định lượng là HPLC. Kỹ thuật GC-MS được sử dụng để khảo sát thành phần trong cây và định tính. Chưa có nghiên cứu về định lượng crinamidin bằng GC-MS/MS. Các nghiên cứu xác định crinamidin được tổng hợp trong bảng 1.2. Bảng 1.2: Một số nghiên cứu xác định crinamidin và nhận xét Tài liệu Phương pháp nghiên cứu Kết quả [2]  Điều kiện phân tích HPLC: Nhận xét Thời gian lưu của Thời gian sắc ký Cột C18. Pha động: ACN – đệm crinamidin khoảng dài, quy trình chiết phosphat 100 mM, pH 3,0. 33 phút. chưa thực sự tối Khoảng tuyến tính ưu, cụ thể: Gradient thành phần pha động (0 – 65 phút). Detector UV 285 của crinamidin từ - Quy trình áp nm. Tốc độ dòng: 1 – 1,5 30 µg/mL đến 300 dụng cho lá: phải mL/phút. Thể tích tiêm: 50 µL. µg/mL. 7 siêu âm và lọc  Phương pháp xử lý mẫu: LOQ - Lá: Làm ẩm bột dược liệu bằng TNHC trong lá nhiều lần, phương là 4,2 pháp chưa có bước NH3, sau 1 giờ, thêm 50 mL µg/mL, trong viên loại tạp. CHCl3 – MeOH (3:1), siêu âm 30 nang là 4,9 µg/mL. - Quy trình áp phút, lọc. Bã chiết thêm 4 lần. Cô dụng cho viên dịch chiết. Hòa cắn bằng 20 mL nang: quy trình HCl 0,1N. chiết xuất mất - Viên nang: Làm ẩm bột bằng nhiều thời gian do NH3, sau 1 giờ, chiết Soxhlet, thời gian ngấm kiệt ngâm qua đêm. Đun hồi lưu 5 kéo dài và một số giờ. Cô dịch chiết. Hòa cắn bằng giai đoạn tiến hành HCl nhiều lần. Kiềm hóa đến pH làm lặp nhiều lần 10 – 11, lắc với CHCl3 5 lần. Cô dịch CHCl3. Hòa cắn bằng 20 mL HCl 0,1N. [3]  Điều kiện phân tích HPLC: Yêu cầu hàm Thời gian sắc ký Cột C18. Pha động: ACN – đệm lượng crinamidin dài, quy trình chiết phosphat 100 mM, pH 3,0. không nhỏ hơn chưa thực sự tối 0,08% (theo khối ưu, phải siêu âm và Gradient thành phần pha động (0 – 65 phút). Detector UV, bước lượng) crinamidin lọc nhiều lần, tính phương pháp chưa sóng phát hiện 285 nm. (C17H19NO5) Tốc độ dòng: 1 – 1,5 mL/phút. theo dược liệu khô có bước loại tạp. Thể tích tiêm: 50 µL. kiệt.  Phương pháp xử lý mẫu: Làm ẩm bột lá bằng NH3, sau 1 giờ, thêm 50 mL CHCl3 – MeOH (3:1), siêu âm 30 phút, lọc. Bã được chiết thêm 4 lần. Cô dịch chiết. Hòa cắn bằng HCl 0,1N. 8 [17]  Điều kiện phân tích HPLC: Xây dựng được bộ Cao alkaloid toàn Cột C8. Pha động: MeOH – dữ liệu chuẩn phần có thể chất H3PO4 pH 2,3 (15 : 85). Nhiệt độ crinamidin và thiết sạch, ít tạp nhày, cột 40oC. Thể tích tiêm 10 µL. lập được 500 mg nhựa, tuy nhiên hệ Detector PDA 214 nm. chất chuẩn với độ thống chiết SFE  Phương pháp xử lý mẫu: tinh khiết 98,74%. không phổ biến tại Bột lá TNHC được chiết với CO2 các lỏng siêu tới hạn (SFE), chiết cao nghiệm, vận hành toàn phần bằng cách ngấm kiệt. phức tạp, tốn kém. GĐ1: Làm ẩm bột lá TNHC bằng Thời cồn 96% trong 12 giờ. Nạp vào xuất kéo dài. phòng gian thí chiết bình chiết, thu hồi dung môi được cao SFE. GD2: Chiết cao alkaloid toàn phần bằng phương pháp ngấm kiệt. [19]  Điều kiện phân tích HPLC: Crinamidin cho Quy trình được xây thời gian lưu ~ 6,8 dựng để thiết lập Cột C8. Pha động: chuẩn MeOH – H3PO4 0,1% (35 : 65). phút. crinamidin Tốc độ dòng: 1 mL/phút. Nhiệt Thu được 1,5 g và phương pháp độ cột: 30oC. Thể tích tiêm: 20 crinamidin đạt tiêu này chưa thật sự µL. chuẩn chuẩn gốc phù hợp để cải tiến  Phương pháp xử lý mẫu: với hàm lượng thành phương pháp Bột lá TNHC (100kg) được chiết 99,85%. định lượng ngấm kiệt với ethanol 96%, cô crinamidin trong thu hồi dung môi được cao TNHC do thời gian ethanol. chiết xuất kéo dài. Tiếp tục chiết xuất thu được cao chiết pH = 4 (2,5kg), cao chiết 9 pH = 9 (210g). Cao pH 9 (130g) được sắc ký cột nhanh (VLC) trên silicagel với hệ dung môi: dicloromethan – MeOH. [16]  Điều kiện phân tích HPLC: Xây dựng Cột: C8. Pha động: MeOH – quy H3PO4 pH 3,0 và trình được Kết hợp định alkaloid 0,2% lượng đồng thời 6 flavonoid, alkaloid Triethanolamin. pháp được 30 phút). Detector PDA ở 214 HPLC. Chiết Tốc độ dòng: 1 mL/phút. Thể tích được và định bằng lượng đồng thời Gradient thành phần pha động (0- phương nm. chiết nhiều alkaloid SFE thu flavonoid. và Tuy alkaloid nhiên trang thiết bị 0,24%, ngấm kiệt SFE tốn kém, vận tiêm: 10 µL. Nhiệt độ cột: 40oC.  Phương pháp xử lý mẫu được 0,60%. hành phức tạp, cần Không có sự khác phải (HPLC) thực hiện Chiết cao cồn: làm ẩm dược liệu biệt kết quả định nhiều khảo sát để bằng dung môi chiết 12 giờ, lượng alkaloid và tìm các thông số ngâm dược liệu 24 giờ. Gộp dịch flavonoid trong lá tối ưu áp suất, thời chiết, cô cách thủy được cao cồn. TNHC bằng gian, nhiệt độ, khối Hòa tan cao cồn trong HCl. Lắc phương pháp lượng mẫu, dung dịch acid với ethyl acetat. Kiềm HPLC hoặc CE. môi hỗ trợ và tỷ lệ hóa dịch acid, lắc với CHCl3. Cô dung môi hỗ trợ. thu hồi dung môi CHCl3 được Phương pháp này phân đoạn alkaloid. tốn nhiều thời gian  Phương pháp xử lý mẫu (CE): và chi phí cao, khó Chiết SFE bột lá thu được cao phổ biến trên thực SFE và dược liệu sau SFE. Hòa tế. tan cao trong acid, kiềm hóa, lắc Alkaloid trong cây 10 với CHCl3 được phân đoạn tồn tại chủ yếu ở alkaloid. dạng muối cũng là Dược liệu sau SFE được chiết trở ngại lớn trong ngấm kiệt với cồn. Lấy phần dịch chiết SFE. chiết đã loại cồn, acid hóa, lắc với ethyl acetat. Dịch chiết được kiềm hóa, thêm CHCl3 được phân đoạn alkaloid. [8]  Điều kiện sắc ký: Kết quả (A) tách Nghiên cứu này Cột DB 15m silica tan chảy, khí được 17 vết có nêu phương thức mang heli. Chương trình nhiệt thời gian lưu từ 15 chuyển đổi 60oC/phút, tăng đến 120oC đến 35 phút. Còn alkaloid chiết xuất (30oC/phút) rồi tăng đến 320oC (B) tách không tốt từ lá TNHC thành (10oC/phút), 1µL không chia nên được tạo thành những chất dễ bay dòng (1 phút). dẫn chất dễ bay hơi để có thể dễ GC – EIMS, cột silica tan chảy hơi để tách bằng dàng tách bằng sắc 30m x 0,25 mm x 0,25 µm. Tiêm sắc ký khí. Kết quả ký khí. mẫu chia dòng 1/30, 1 µL, nhiệt (B) tách được 18 Nghiên cứu này độ interface 280oC. Chương trình vết có thời gian mới chỉ dừng ở nhiệt 60oC/phút, tăng dần đến lưu từ 3 đến 15 việc khảo sát sơ bộ 120oC (30oC/phút) rồi tăng đến phút, trong đó xác các alkaloid chiết 320oC (10oC/phút). Thế năng 70 định được cấu trúc từ cây TNHC, xác eV. EIMS với nhiệt độ nguồn của 3 vết ambellin, định sự hiện diện 200oC, thế năng 70 eV, dòng bẫy crinamidin và 6- của một số chất 200 µA. Chương trình nhiệt 300C hydroxo- phân lập từ cắn tăng lên đến 520oC (1oC/giây). crinamidin sau khi alkaloid toàn phần  Phương pháp xử lý mẫu: so sánh thời gian (phải qua giai Lá TNHC ngấm kiệt bằng cồn lưu, khối phổ với 3 đoạn tinh chế) mà 50o chứa HCl (pH = 6). Dịch alkaloid đơn chất. 11 chưa đưa ra