Tài liệu Xác định đột biến mất đoạn gen dystrophin gây bệnh loạn dưỡng cơ duchenne ở mức độ mrna và phát hiện

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy-DMD) là một bệnh lý cơ do di truyền thường gặp nhất, được phát hiện ở tất cả các chủng tộc khác nhau trên thế giới. Tần suất bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai. Hầu hết trẻ trai mắc bệnh đều có dấu hiệu lâm sàng với triệu chứng yếu cơ, biểu hiện bằng khó đi lại, khó đứng lên ngồi xuống và khó khăn khi leo cầu thang. Trong giai đoạn nặng, bệnh nhân trở nên tàn phế, mất khả năng đi lại vào lứa tuổi 12 và thường tử vong ngoài 20 tuổi do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp [62], [146]. DMD là bệnh di truyền lặn liên kết giới tính, gây nên bởi đột biến gen dystrophin. Gen này nằm trên nhiễm sắc thể (NST) X ở locus Xp21, có chiều dài khoảng 2400 kb gồm 79 exon với 7 promotor khác nhau. Đây là gen lớn nhất của người được phát hiện cho đến nay. Gen này sao mã ra mRNA 14kb và tổng hợp sản phẩm protein tương ứng là dystrophin. Protein này có mặt ở màng bào tương của tế bào cơ và có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định màng, bảo vệ tế bào cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ. Khi gen bị đột biến, quá trình tổng hợp protein bị ảnh hưởng, hậu quả là tế bào cơ của bệnh nhân bị thoái hóa dần và gây nên bệnh DMD [96], [109]. Hiện nay, bản đồ đột biến gen dystrophin gần như đã được xác định. Dạng đột biến mất đoạn gen là phổ biến nhất, chiếm tỉ lệ 60%. Đột biến điểm đứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 20-30%. Đột biến lặp đoạn, khoảng 10-15% [106]. Nhiều công trình nghiờn cứu cho thấy đột biến mất đoạn gen thường tập trung vào hai vùng trọng điểm (hotspot) là vùng trung tâm ở giữa gen (exon 43-60) và vùng tận cùng 5’ (exon 1-19) [91], [107]. Vì vậy, để tiết kiệm về kinh phí và thời gian trong việc phát hiện đột biến mất đoạn gen, các tác giả thường sử dụng 19-25 cặp mồi tập trung đặc hiệu cho 19-25 exon trong vùng hay xảy ra mất đoạn [7], [20], [69]. 2 Những năm gần đây, nhờ vào sự phát triển của ngành sinh học phân tử, nhiều nhà khoa học nước ngoài cũng như trong nước đã tiến hành nghiên cứu và phát hiện được đột biến gen dystrophin ở các bệnh nhân DMD. Tuy nhiên ở Việt Nam, các nghiên cứu thường tập trung vào xác định dạng đột biến mất đoạn gen ở mức độ DNA và thường chỉ ưu tiên xác định đột biến trong 2 vùng trọng điểm [1], [7], [10]. Trong khi đó đột biến gen dystrophin có thể rải rác khắp 79 exon. Do vậy, các nghiên cứu trên thường bỏ sót đột biến ở những exon khác và cả đột biến xảy ra trong quá trình hoàn thiện các tiền mRNA. Một điều cần lưu ý là để xác định đột biến xảy ra ở gen dystrophin bằng phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) ở mức độ DNA, chúng ta phải khuếch đại toàn bộ chiều dài của gen, có nghĩa phải khuếch đại toàn bộ 79 exon để xác định đột biến. Trên phân tử DNA, các exon lại nằm xen kẽ với các intron có kích thước quá lớn nên để khuếch đại 79 exon ở mức độ DNA người ta phải thiết kế 79 cặp mồi bắt cặp đặc hiệu ở hai đầu mỗi exon. Điều này gây tốn kém cả về tài chính lẫn thời gian. Ngược lại, ở cấu trúc của mRNA, các đoạn intron đã bị cắt bỏ và 79 exon nằm liên tục nhau. Do vậy, để khuếch đại toàn bộ chiều dài đoạn mRNA chứa 79 exon này, người ta chỉ cần dùng 15 cặp mồi đặc hiệu đã có thể khuếch đại được cả chiều dài đoạn gen dystrophin [9], [77], [129]. Như vậy, việc xác định đột biến ở mức độ RNA giúp tiết kiệm rất nhiều công sức, thời gian cũng như hóa chất. Với những biểu hiện lâm sàng nặng nề cùng rối loạn về tinh thần và tử vong sớm do chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu, bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne thực sự là một tai họa đối với bản thân người bệnh và là gánh nặng của gia đình cũng như của cộng đồng. Theo nhiều nghiờn cứu, 2/3 bệnh nhân DMD nhận gen di truyền từ người mẹ dị hợp tử, 1/3 bệnh nhân bị đột biến mới phát sinh [66]. Do vậy, việc chẩn đoán người mẹ dị hợp tử, chẩn đoán 3 trước sinh phát hiện các thai nhi bất thường và phòng bệnh bằng phương pháp phá thai chủ động là sự lựa chọn được nhiều người đồng thuận, từ đó có thể giảm tỉ lệ mắc bệnh DMD trong cộng đồng [93], [107]. Ở Việt Nam, năm 1996, Nguyễn Thị Trang và CS nghiên cứu về lâm sàng, phân tích phả hệ, đo hoạt độ của creatine kinase (CK) trong chẩn đoán người mang gen bệnh và phát hiện được khoảng 50% trường hợp nghiên cứu có khả năng là người mang gen bệnh [20]. Trong một nghiên cứu khác, năm 2006, Nguyễn Văn Quyệt cho rằng, phối hợp giữa phân tích phả hệ và định lượng hoạt độ CK có thể phát hiện được 50% bà mẹ dị hợp tử [16]. Tuy nhiên, những kết quả trên chỉ mang tính chất gợi ý, không có cơ sở về tổn thương di truyền và chưa đủ sức thuyết phục để thực hiện tư vấn di truyền. Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài “Xác định đột biến mất đoạn gen dystrophin gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne ở mức độ mRNA và phát hiện người lành mang gen bệnh” được tiến hành với các mục tiêu sau: 1. Xác định đột biến mất đoạn gen trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne ở mức độ mRNA. 2. Chẩn đoán người lành mang gen bệnh (mẹ, chị em gái và dì) trong gia đình bệnh nhân đã được xác định đột biến mất đoạn gen ở trên. 3. Bước đầu thực hiện chẩn đoán trước sinh cho những bà mẹ dị hợp tử. 4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh DMD - Tháng 12-1851, Meryon, một thầy thuốc người Anh đã mô tả chi tiết về 8 trẻ trong 3 gia đình mắc cùng một bệnh mà về sau này được gọi là bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne. Ông cho rằng nguyên nhân của bệnh là do giảm các yếu tố dinh dưỡng [49]. - Năm 1861, Duchenne, một nhà thần kinh học người Pháp đã có công mô tả dạng giả phì đại của bệnh loạn dưỡng cơ thường gặp ở trẻ trai. Năm 1868, Duchenne thực hiện một nghiên cứu quy mô về bệnh lý này, ông đưa ra những tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh dựa trên kết quả giải phẫu bệnh và kích thích điện. Duchenne nhận thấy có sự thay thế mô cơ bằng những mô xơ hoặc mô liên kết trên tiêu bản sinh thiết cơ. Sau đó ụng đó sử dụng thủy trị liệu kết hợp với xoa bóp để điều trị cho bệnh nhân và nhận thấy có sự cải thiện bệnh ở một số bệnh nhân. Chính nhờ sự phát hiện quan trọng này mà sau đó bệnh được mang tờn ụng [34]. - Năm 1879, Gowers đã thu thập bệnh án 220 bệnh nhân và mô tả một cách kỹ lưỡng bệnh này với những hình ảnh lâm sàng điển hình và rất chi tiết. Ông cũng phát hiện một phụ nữ có những đứa con trai khác cha cùng bị bệnh. Gowers nhận thấy rằng các trẻ mắc bệnh có một đặc điểm giống nhau khi thay đổi tư thế từ nằm sang đứng. Từ đó, dấu hiệu này được xem là dấu hiệu điển hình của bệnh DMD và được mang tên ông: dấu hiệu Gowers [62]. - Nếu tớnh từ thời Meryon thì bệnh DMD đã được biết hơn 150 năm. Tuy nhiên, trong suốt một thời gian dài, bệnh chủ yếu chỉ được đánh giá ở mức độ lâm sàng và điều trị chỉ tập trung vào chăm sóc hỗ trợ trong quá trình của bệnh [140]. 5 - Trong những năm 1980, các nghiên cứu tập trung vào chẩn đoán và đặc biệt là chẩn đoán sớm bệnh DMD khi chưa có biểu hiện lâm sàng, phát hiện dị hợp tử bệnh DMD bằng đo hoạt độ enzym CK, phục vụ cho điều trị và tư vấn di truyền [58], [102]. - Năm 1981, Zatz và CS đã phát hiện ra gen dystrophin nằm ở vị trí Xp21.1 nhờ quan sát những trẻ gái mắc bệnh DMD. Những bệnh nhân nữ này mang chuyển đoạn giữa NST X và NST thường [140]. - Năm 1984-1987, Hoffman và CS đã phát hiện ra gen dystrophin và sản phẩm protein tương ứng của gen này [38], [65]. - Những năm sau 1987, ở một số nước tiên tiến, các phương pháp di truyền phân tử phát triển mạnh giúp việc phát hiện đột biến gen dystrophin, tiến tới chẩn đoán trước sinh và phát hiện người nữ lành mang gen bệnh để tư vấn di truyền nhằm hạn chế sinh ra những đứa trẻ bị bệnh DMD [29], [38]. - Năm 1987-1988, các nhà nghiên cứu cho biết gen dystrophin gồm 60 exon. - Năm 1989, gen dystrophin được phát hiện với kích thước 2300 kb [47]. - Năm 1993, thành phần và cấu trúc gen dystrophin đã được phát hiện đầy đủ gồm 79 exon với kích thước 2400 kb [106], [112]. - Từ năm 1993 trở lại đây, cơ chế sinh học phân tử của bệnh ngày càng được làm sáng tỏ, liệu pháp điều trị gen đã và đang được các nhà khoa học nỗ lực nghiên cứu nhằm tìm ra những giải pháp tốt nhất khắc phục hậu quả nặng nề do bệnh gây ra [92], [109]. 1.2. Đặc điểm của bệnh DMD 1.2.1. Biểu hiện lâm sàng của DMD Bệnh DMD được biểu hiện qua 3 giai đoạn: - Giai đoạn 1 (3-5 tuổi): trẻ có dấu hiệu chậm biết đi hoặc đi lại hay vấp ngã nhưng chưa có biểu hiện teo cơ. 6 - Giai đoạn 2 (6-7 tuổi): trẻ có biểu hiện yếu cơ và xuất hiện dấu hiệu Gowers rõ. Khi trẻ đang ngồi xổm muốn đứng thẳng lên hoặc đang nằm muốn ngồi dậy, trẻ phải quay người sang một bên, gấp đầu gối lại, hai tay chống nạng đỡ lấy thân để giữ ở tư thế như quỳ bắn; sau đó bằng cách tỳ hai tay lần lượt lên cẳng chân, đầu gối và đùi, trẻ đẩy cho thân thẳng dậy. Sự tiếp nối các động tác như vậy được xem là đặc hiệu của bệnh loạn dưỡng cơ tuần tiến. - Giai đoạn 3 (12-15 tuổi): trẻ thường mất khả năng đi lại lúc 12 tuổi. Sau đó dấu hiệu teo cơ xuất hiện do trẻ không đi lại được. Cuối cùng trẻ thường tử vong ở tuổi 20-25 do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp [62], [96]. 1.2.2. Xét nghiệm cận lâm sàng 1.2.2.1. Định lượng hoạt độ CK toàn phần CK được Lohman phát hiện vào năm 1934. CK là enzym xúc tác sự tạo năng lượng giúp cho quá trình co, duỗi cơ và quá trình chuyển hóa chất trong tế bào cơ. Năm 1959, Ebashi và CS là những người đầu tiên áp dụng việc định lượng hoạt độ CK huyết thanh trong chẩn đoán bệnh lý tổn thương cơ. Các tác giả nhận thấy hoạt độ CK tăng cao gấp hàng chục lần ở bệnh nhân loạn dưỡng cơ tiến triển. Manhoney (1977), Edward (1984) phát hiện CK tăng trong máu của các thai nhi bị bệnh DMD [48], [104]. Ở bệnh nhân DMD, hoạt độ CK huyết thanh thường tăng rất cao trước khi có dấu hiệu lâm sàng, thậm chí tăng từ thời kỳ sơ sinh. Hoạt độ CK huyết thanh ở bệnh nhân DMD khoảng từ 10000 đến 35000 UI/L (bình thường dưới 160 UI/L). Theo Matsuo (2002), hoạt độ CK huyết thanh bình thường có thể loại trừ chẩn đoán DMD. Tuy nhiên, trong giai đoạn muộn của quá trình bệnh, hoạt độ enzym này giảm thấp. Lý do của hiện tượng trên là vào giai đoạn cuối, khối cơ còn lại quỏ ớt, mặt khác bệnh nhân giảm vận động nên lượng cơ thoái hóa cũng ít đi [4], [91], [102]. 7 1.2.2.2. Phương pháp thăm dò điện sinh lý cơ Ghi điện cơ là phương pháp nghiên cứu hoạt động điện của cơ bằng cách ghi lại điện thế hoạt động của các sợi cơ ở những trạng thái khác nhau. Nhờ nghiên cứu của Kugelberg (1947), Buchtbal (1953), phương pháp ghi điện cơ được ứng dụng để chẩn đoán sớm các bệnh loạn dưỡng cơ tiến triển trước khi có biểu hiện lâm sàng. Năm 1979, Stalberg và Trontelj mô tả chi tiết hình ảnh tổn thương trên điện cơ đồ ở bệnh nhân loạn dưỡng cơ [103]. Trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne, điện cơ đồ cho thấy những biến đổi đặc trưng của bệnh lý cơ nhưng không đặc hiệu cho DMD, khụng có bằng chứng của hiện tượng suy giảm phân bố thần kinh trong cơ, tốc độ dẫn truyền thần kinh cảm giác và vận động bình thường [34]. 1.2.2.3. Sinh thiết cơ Vào thế kỷ 19, Meryon (1852) và Duchenne (1868) đã áp dụng phương pháp sinh thiết cơ để chẩn đoán bệnh DMD [34]. Trong nhiều năm sau đó, phương pháp này được xem là công cụ đắc lực để chẩn đoán xác định bệnh DMD và chẩn đoán phân biệt với các bệnh lý khác. Sinh thiết cơ có tác dụng chẩn đoán xác định dựa vào những thay đổi đặc trưng trờn mụ sinh thiết. Biến đổi mô bệnh học đặc trưng bao gồm tăng sinh tổ chức liên kết của mô bọc sợi cơ, các sợi cơ bị thoái hóa và tái sinh rải rác. Mô bệnh học cũng cho thấy các ổ thâm nhiễm tế bào viêm đơn nhân, đõy là hậu quả của phản ứng viêm được khởi động bởi quá trình hoại tử sợi cơ; song song các sợi cơ có chức năng bình thường cũng biểu hiện những thay đổi nhẹ về mặt cấu trúc. Ngoài ra, mô sinh thiết còn có rất nhiều sợi đậm đặc; các sợi cơ co rút thái quá này có thể là hậu quả của sự hoại tử ở một vị trí khỏc trờn chiều dài của sợi cơ, quỏ trình hoại tử này tạo điều kiện cho canxi đi vào nội bào qua chỗ tổn thương của màng sợi cơ vân, luồng canxi đi vào sẽ khởi động quá trình co rút của toàn bộ chiều dài sợi cơ [34]. Vị trí sinh thiết 8 thường sử dụng nhất trong lâm sàng ở cơ rộng ngoài của cơ tứ đầu đùi hoặc cơ sinh đôi ngoài [62]. 1.2.2.4. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang (MDHQ) Protein dystrophin định vị ở màng sợi cơ. Bởi vậy với phương pháp miễn dịch huỳnh quang trên tiêu bản sinh thiết, đường viền các sợi cơ bình thường xuất hiện sự phát sáng huỳnh quang liên tục, không ngắt quãng; trong khi đó ở tiêu bản sinh thiết cơ của những bệnh nhân DMD không có sự bắt màu, không thấy rõ ranh giới màng tế bào cơ, phản ánh sự vắng mặt của protein dystrophin trên màng tế bào cơ của bệnh nhân DMD [62], [89]. Một thể bệnh nhẹ của DMD rất hay gặp là loạn dưỡng cơ Becker (BMD). Triệu chứng lâm sàng ở bệnh nhân BMD xuất hiện muộn hơn so với ở bệnh nhân DMD, mức độ biểu hiện nhẹ hơn và thời gian tiến triển chậm hơn. Trên tiêu bản sinh thiết cơ, protein dystrophin giảm đáng kể trên màng tế bào sợi cơ song không vắng mặt hoàn toàn như trong thể nặng DMD [28]. Người bình thường Bệnh nhân BMD Bệnh nhân DMD Hình 1.1. Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang của protein dystrophin (Nguồn: Matsuo, 2002) 1.2.2.5. Phương pháp di truyền phân tử xác định gen đột biến Sự thành công của Kunkel và CS (1985) trong việc phát hiện sự mất đoạn lớn của NST X ở 1 bệnh nhân nam DMD đã khởi đầu cho một loạt những nghiên cứu xác định gen ở bệnh nhân DMD. Hiện nay, có rất nhiều kỹ thuật sinh học phân tử giúp xác định đột biến gen dystrophin như kỹ thuật PCR, Reverse transcriptase-PCR (RT-PCR), Fluorescence in situ Hybridization 9 (FISH), Southern blot, Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) [90], [91], [107]. Các kỹ thuật này sẽ được trình bày ở phần 1.4. 1.2.3. Tần số của bệnh DMD là một bệnh di truyền phổ biến, có tần suất cao trong nhóm bệnh loạn dưỡng cơ tuần tiến với tỉ lệ 1/3500 trẻ trai [34]. Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu rõ ràng về tần suất mắc bệnh DMD. Theo Nguyễn Thu Nhạn và CS những năm 1981-1990 có 131 bệnh nhân vào điều trị tại Khoa Nội tiết-Chuyển hoá-Di truyền, Bệnh Viện Nhi Trung Ương, chiếm 0,6% trong tổng số bệnh nhân vào điều trị [13]. Theo Nguyễn Thị Phượng, Vũ Chí Dũng giai đoạn 1991-1996 có 88 bệnh nhân DMD vào điều trị tại viện Bệnh Viện Nhi Trung Ương, chiếm 19,4% trong các bệnh di truyền của Khoa Nội tiết-Chuyển hóa-Di truyền và chiếm khoảng 0,11% trong tổng số bệnh nhân vào điều trị tại bệnh viện [14]. 1.2.4. Di truyền học bệnh DMD DMD là bệnh di truyền đơn gen, tuân theo quy luật di truyền lặn liên kết NST X không có alen tương ứng trên NST Y. Bệnh thường gặp ở trẻ trai mà rất hiếm gặp ở trẻ gái. Trẻ trai chỉ cần nhận một gen bệnh trên NST X của người mẹ mang gen (XDXd) là có biểu hiện bệnh, trong khi đó trẻ gỏi đòi hỏi phải nhận 2 gen X mang bệnh, một gen bệnh từ mẹ và một gen bệnh từ bố mới có khả năng biểu hiện bệnh. Tuy nhiên, trẻ trai bị bệnh DMD thường chết sớm ở tuổi từ 20 đến 25 nên không có khả năng lập gia đình. Do vậy, trong sáu trường hợp ở bảng 1.1, khả năng thứ hai là hay gặp nhất, người mẹ mang gen bệnh có khả năng truyền bệnh cho 50% số con trai và truyền gen bệnh cho 50% số con gái của họ [96]. Trong một vài trường hợp, người nữ mang gen có biểu hiện bệnh khi NST X không mang gen bệnh bị bất hoạt và dẫn đến NST X còn lại mang gen bệnh sẽ biểu hiện bệnh [54], [56]. 10 Bảng 1.1. Kiểu gen bố mẹ và tỷ lệ bị bệnh ở thế hệ con Genotyp và phenotyp của cha mẹ Cha Mẹ XDY lành XDXD lành XDXd lành mang gen bệnh XDY lành XDY lành XdY bệnh XdY bệnh XdY bệnh XdXd bệnh XDXD lành XDXd lành mang gen bệnh XdXd bệnh Tần số con với các genotyp khác nhau Trai Gái XDXd XDY XdY XDXD XdXd lành mang lành bệnh lành bệnh gen bệnh 1 0 1 0 0 1/2 1/2 1/2 1/2 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1/2 1/2 0 1/2 1/2 0 1 0 0 1 Theo nghiên cứu của White (2002), Hung (2006), khoảng 30% bệnh nhân DMD có nguyên nhân không phải di truyền từ bố mẹ mà do quá trình đột biến mới phát sinh trong giai đoạn tạo giao tử ở bố hoặc mẹ. Khoảng 70% bệnh nhân DMD là do nhận gen bệnh từ người mẹ [66], [137]. Phụ nữ mang gen bệnh thường không có triệu chứng yếu cơ hoặc bất kỳ một dấu hiệu lâm sàng nào của bệnh. Norman (1989) cho rằng khoảng 2/3 người lành mang gen bệnh có hoạt độ CK huyết thanh tăng [99]. 1.2.5. Điều trị bệnh DMD Điều trị bệnh DMD vẫn còn là vấn đề khó khăn đối với nền y học. Hiện tại, chưa có những biện pháp điều trị đặc hiệu cũng như ngăn cản sự tiến triển của bệnh. Tuy nhiên, chúng ta vẫn có thể điều trị các triệu chứng, các biến chứng của bệnh và nâng cao chất lượng sống cho đứa trẻ. 11 1.2.5.1. Điều trị nội khoa Điều trị bệnh DMD chủ yếu phối hợp điều trị nội khoa và phục hồi chức năng nhằm trì hoãn sự tiến triển của bệnh. Các thuốc điều trị nội khoa cho bệnh nhân DMD như prednison, prednisolon và deflazacort (thuộc nhóm steroid) hoặc aminoglycoside (kháng sinh) có thể làm chậm mức độ phá hủy tế bào cơ. Vật lý trị liệu có tác dụng làm chậm lại các biến chứng thoái hóa, co rút cơ [92]. 1.2.5.2. Liệu pháp thay thế gen Mục đích là đưa vào trong tế bào gen có khả năng tổng hợp ra protein dystrophin và làm cho protein biểu hiện được ở màng tế bào cơ. Hai phương pháp đã được thực nghiệm trên động vật là tiêm vào cơ những plasmid chứa đoạn gen dystrophin và sử dụng vật truyền trung gian. Tuy nhiên phương pháp này gặp những khó khăn sau: (1) trở ngại khi tiến hành đưa một gen lớn vào vật truyền trung gian, (2) đưa vào bộ máy di truyền ở bên trong tế bào cơ sau phân bào, (3) sự tồn tại của gen đưa vào cơ thể và sự thải ghép của hệ thống miễn dịch. Vì những trở ngại đú nờn hiện nay các phương pháp này vẫn chưa được áp dụng để điều trị bệnh DMD ở người [53], [96]. Trong vài năm trở lại đây, một hướng điều trị gen mới đã thu được nhiều thành quả, đó là việc chuyển từ thể bệnh nặng DMD sang thể bệnh nhẹ BMD. Ở bệnh nhân DMD, đột biến gen dystrophin đã tạo ra mã kết thúc sớm hoặc làm thay đổi toàn bộ khung dịch mã, kết quả là protein dystrophin không được sản xuất. Sau khi xác định được dạng đột biến của bệnh nhõn, các nhà khoa học đã chọn lọc xúa thêm một, hai hoặc nhiều exon của đoạn gen bị đột biến nhằm tạo ra một cắt đoạn lớn bên trong gen nhưng vẫn duy trì được khung dịch mã và protein vẫn được sản xuất bán phần. Phương pháp này đã được áp dụng để điều trị trên người và thu được những kết quả ban đầu đáng khích lệ [93], [144]. 12 1.2.5.3. Liệu pháp điều trị tế bào - Chuyển ghộp nguyờn bào cơ: kỹ thuật này được thực hiện bằng cách nuôi cấy in vitro cỏc nguyên bào cơ lấy từ cơ trưởng thành của một người thân không mắc bệnh DMD, thường là người cha. Các tế bào hình sao hiện diện trong cơ được xem là những nguyên bào cơ có nguồn gốc phôi thai nhưng ở trạng thái ngủ. Trong quá trình sửa chữa cơ bị tổn thương, dưới các tác động khác nhau, tế bào hình sao sẽ tăng sinh và biệt hóa thành các tế bào cơ. Nguyên bào cơ nuôi cấy được tiêm vào cơ loạn dưỡng của người bệnh. Các tế bào cơ không thiếu protein dystrophin sẽ thay thế các tế bào cơ bệnh lý, nhờ đó chức năng của cơ được tái lập. Trước khi thực hiện chuyển ghộp nguyờn bào cơ, bệnh nhân phải được điều trị ức chế miễn dịch để ngăn cản phản ứng thải ghép tương tự như trong điều trị ghép tạng và vì vậy liệu pháp này có thể có nhiều tác dụng phụ như nhiễm khuẩn, ung thư,...[34]. Hiện nay, phương pháp này vẫn chưa được áp dụng để điều trị bệnh DMD một cách rộng rãi. - Phương pháp sử dụng tế bào gốc: trong những năm gần đây, tế bào gốc từ tủy xương được nghiên cứu rất nhiều do không gặp phải cản trở về vấn đề đạo đức và nguồn cung cấp dễ dàng. Trong tủy xương, ngoài dòng tế bào tạo mỏu cũn có nhiều dòng tế bào khác và các tế bào đó có khả năng biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác nhau như tế bào cơ hệ vận động, tế bào cơ tim, tế bào nội mạc, tế bào thần kinh,... Nghiên cứu thực nghiệm cho thấy, khi tiêm trực tiếp tế bào tủy xương vào cơ sẽ có một lượng nhỏ sợi cơ được tạo ra [143], [138]. 1.2.6. Phòng bệnh DMD DMD là bệnh di truyền có tiên lượng nặng, làm hạn chế và mất khả năng đi lại, dẫn đến tàn phế và chết trước tuổi trưởng thành. Hiện nay, chưa có phương pháp điều trị bệnh hiệu quả. Những nhà khoa học quan tâm đến bệnh DMD đều nhận định rằng, cho tới khi chưa tìm được phương pháp điều trị có hiệu quả cho bệnh DMD thì việc nghiên cứu nhằm phát hiện những người 13 lành mang gen bệnh (mẹ và chị, em gái) trong gia đình bệnh nhân, hoặc chẩn đoán trước sinh trên những bà mẹ có nguy cơ cao giúp tư vấn di truyền vẫn là biện pháp cơ bản để phòng ngừa bệnh DMD [93], [107]. 1.3. Cơ chế bệnh sinh và các dạng đột biến gen dystrophin 1.3.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen dystrophin 1.3.1.1. Vị trí của gen dystrophin Hình 1.2. Sơ đồ NST X và vị trí của gen dystrophin (Nguồn: www.ghr.nlm.nih.gov/gene) Gen dystrophin nằm trên NST X, nhánh ngắn vùng 2, băng 1, băng phụ 2. 1.3.1.2. Cấu trúc của gen dystrophin Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc của gen dystrophin (Nguồn: Yaffe, 2002) Gen dystrophin là một phức hợp gồm: - Bộ phận khởi động (promotor): cho phép gen hoạt động, khi đóng, khi mở và sản xuất ra các sản phẩm protein đặc hiệu mô tương ứng. Có bảy 14 promotor đặc hiệu là: promotor não, promotor cơ, promotor tiểu não, promotor Dp260, Dp140, Dp116, Dp71 [139]. - Các exon: gen dystrophin chứa 79 exon, đây là vùng của gen được phiờn mó có mặt trong mRNA trưởng thành, chứa đựng thông tin di truyền để tổng hợp ra protein tương ứng. - Các intron: là những đoạn DNA của gen xen kẽ giữa những exon, được sao mã thành mRNA tiền thân, nhưng bị loại bỏ trong quá trình tạo mRNA trưởng thành [136], [139]. 1.3.1.3. Chức năng của gen dystrophin Gen dystrophin có chiều dài khoảng 2400 kb, gen sao mã ra mRNA trưởng thành có chiều dài 14 kb. Phân tử mRNA này tổng hợp nên protein tương ứng là dystrophin [136]. 1.3.2. Cấu trúc và chức năng của protein dystrophin 1.3.2.1. Cấu trúc của protein dystrophin Là protein được mã hóa bởi gen dystrophin có trọng lượng phân tử 427 kD với khoảng 3685 acid amin. Protein dystrophin nằm ở màng bào tương của tế bào cơ và được chia làm 4 vùng: 1. Vùng N-tận gồm 240 acid amin, là vùng gắn với actin. 2. Vùng trung tâm rod có 2700 acid amin. 3. Vùng giàu cystein gồm 280 acid amin 4. Vùng C-tận chứa 420 acid amin, có chức năng liên kết với màng tế bào. Vùng 5’-tận, vùng giàu base cystein và vùng C-tận là những vùng tương đối quan trọng đối với chức năng của dystrophin. Những vùng này là vị trí bám của actin và phức hợp dystrophin-glycoprotein (DystrophinGlycoprotein Complex-DGC). Trong khi đú vùng rod được coi là vựng ớt chức năng nhất [65], [107]. 15 Khung xương ngoài tế bào Vùng N tận Vùng giàu Cystein Vùng C- tận Phức hợp Dystroglycan Cấu trúc xoắn giống spectrin Vùng nối Phức hợp Sarcoglycan Hình 1.4. Cấu trúc mô phỏng của protein dystrophin và một số protein tương tác với nó (Nguồn: www.jennyndesign.com) 1.3.2.2. Chức năng của protein dystrophin Protein dystrophin có mặt ở màng bào tương của tế bào cơ xương, đúng vai trò quan trọng trong cấu trúc của cơ. Nhiều protein màng tế bào liên kết với protein dystrophin tạo thành phức hợp DGC (Dystrophin-Glycoprotein Complex). Phức hợp này cho phép nối những sợi actin với khung xương ngoài tế bào xuyên qua màng sợi cơ [109]. Đầu amin tận của protein dystrophin gắn với F-actin và đầu carboxyl tận gắn với phức hợp DGC tại màng sợi cơ (hình 1.4). Các thành phần quan trọng của phức hợp DGC bao gồm dystroglycan, sarcoglycan, dystrobrevin, syntrophin và NOS. Sự đột biến xảy ra ở bất cứ vị trí nào trong các thành phần này đều gây ra bệnh loạn dưỡng cơ di truyền. Phức hợp DGC sẽ bị mất ổn định khi protein dystrophin vắng mặt. Sự mất ổn định này dẫn đến hoại tử dần dần các sợi cơ và tổn thương màng. Phức hợp DGC cũn có vai trò như một tín hiệu hóa học. Sự mất tín hiệu này cũng góp phần gây bệnh [65], [109]. 1.3.3. Cơ chế bệnh sinh của DMD Sự thiếu hụt protein dystrophin làm mất tính ổn định của phức hợp DGC, từ đó sẽ gây ra bất thường ở màng tế bào với rách màng tế bào khu trú, tạo điều kiện cho ion Ca++ đi vào tế bào. Ion Ca++ vào tế bào sẽ hoạt hóa các enzym protease, gây phân hủy các protein của sợi cơ và bộ khung tế bào. Do 16 vậy, màng tế bào bị tổn thương rộng hơn và ion Ca++ lại ồ ạt đi vào tế bào tạo ra một vòng luẩn quẩn và dẫn đến rối loạn cân bằng nội mô canxi. Hậu quả cuối cùng là sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis) và hoại tử tế bào [109]. Hình 1.5. Cơ chế bệnh sinh của DMD (Nguồn: Rando, 2004) 1.3.4. Các dạng đột biến cấu trúc của gen dystrophin 1.3.4.1. Đột biến mất đoạn gen dystrophin Đột biến mất đoạn gen là dạng thường gặp nhất ở bệnh nhân DMD, chiếm khoảng 60-65% các dạng đột biến gây bệnh DMD. Những đột biến mất đoạn làm lệch khung dịch mã của mRNA, tạo ra protein dystrophin không có chức năng và gây nên bệnh cảnh lâm sàng nặng DMD. Những mất đoạn gen khụng gây lệch khung dịch mã có thể tạo ra protein dystrophin bị cắt ngắn ở giữa nhưng còn một phần chức năng và gây bệnh cảnh lâm sàng nhẹ hơn là BMD. Tuy nhiên, khả năng gây lệch khung dịch mã được xác định trên 90% các trường hợp có đột biến mất đoạn [90], [106]. Đột biến mất đoạn của gen dystrophin chiếm tỷ lệ 2/3 các trường hợp DMD/BMD và tập trung chủ yếu ở hai vùng “hotspot” - vùng trung tâm và đầu 5’ của gen dystrophin [106]. Các đột biến mất đoạn gen được phát hiện bằng phân tích Southern blot và hầu hết (90-95%) được phát hiện bởi phương pháp PCR với việc sử dụng các cặp mồi tập trung vào hai vùng “hotspot” [63], [75]. 17 1.3.4.2. Đột biến điểm Đột biến điểm đứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 25-30%. Hầu hết đột biến điểm trong bệnh DMD tạo ra mã kết thúc sớm và gây thể bệnh nặng. Đột biến điểm nằm rải rác khắp chiều dài gen tạo ra trở ngại lớn trong việc xác định đột biến. Hiện nay có khoảng trên 200 đột biến điểm của gen dystrophin đã được xác định [106], [112]. 1.4.3.3. Đột biến lặp đoạn, thêm đoạn Đột biến lặp đoạn, thêm đoạn là nguyên nhân gây nên DMD trong hầu hết các trường hợp còn lại. Prior (2005) cho rằng 80% đột biến lặp đoạn xảy ra ở đầu tận 5’ và 20% ở vùng trung tâm [107]. Ngoài ra, một tỷ lệ nhỏ bệnh nhân DMD có đột biến nhỏ rải rác khó phát hiện [107]. 1.4. Các phương pháp phát hiện đột biến gen dystrophin Có nhiều phương pháp sử dụng các kỹ thuật di truyền phân tử để phát hiện bất thường của gen dystrophin. 1.4.1. Kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR được một nhà khoa học người Mỹ tên là Kary Mullis phát minh vào năm 1985 [121]. 1.4.1.1. Nguyên tắc của phản ứng PCR Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNA polymerase. Với nguyên liệu là bốn loại nucleotid, enzym DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn. Phản ứng đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước: - Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA 18 được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94oC-95oC trong vòng 30-60 giây. - Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40oC-70oC tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài 30-60 giây. - Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được tăng lên 72oC để DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút [121]. Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành tiếp tục được dùng làm DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản phẩm cuối của phản ứng PCR là những đoạn DNA chuỗi đụi cú chiều dài bằng khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi [94]. Hình 1.6. Các bước cơ bản của phản ứng PCR (Nguồn: Vierstraete, 1999) 19 Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuôn DNA ban đầu, thường không vượt quá 40 chu kỳ. Mỗi chu kỳ sẽ làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Như vậy sau n chu kỳ, một DNA đớch đó nhân bản thành 2n bản sao. Đó là số lượng DNA đủ để có thể tách ra khi điện di và có thể phát hiện được sau khi nhuộm, đủ để có thể tạo dòng hoặc giải trình tự [6], [17], [81]. 1.4.1.2. Các kỹ thuật PCR thường được sử dụng trong chẩn đoán bệnh DMD * PCR đơn mồi (monoplex PCR): đõy là kỹ thuật PCR kinh điển nhất. Mỗi phản ứng PCR sử dụng duy nhất một cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại một đoạn gen đặc hiệu từ phân tử DNA của tế bào [22], [138]. Trong chẩn đoán đột biến mất đoạn gen dystrophin, các tác giả đã sử dụng từng cặp mồi để khuếch đại từng exon của gen dystrophin bằng phản ứng PCR, sau đó điện di sản phẩm trên gel agarose. Mẫu bệnh nhân được tiến hành song song với mẫu đối chứng. Nếu mẫu đối chứng xuất hiện vạch DNA tương ứng với kích thước của exon được khuếch đại, trong khi mẫu bệnh nhân không xuất hiện vạch thì bệnh nhân bị đột biến mất đoạn exon đó. Ở Việt Nam, Nguyễn Đức Bách (2003), Đặng Thị Diễm Hồng (2004) đã sử dụng phương pháp PCR đơn mồi để xác định đột biến mất đoạn gen ở bệnh nhân DMD. Năm 2006, Nguyễn Thị Hoàn và CS đã khuếch đại 22 exon (1, 3, 4, 6, 8, 11, 12, 13, 17, 19, 20, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 và 60) của 84 bệnh nhân DMD và phát hiện được 32 bệnh nhân (chiếm 38%) có đột biến mất đoạn [1], [7], [8]. * PCR đa mồi (multiplex PCR): là phương pháp PCR sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi đặc hiệu khác nhau, để nhõn cỏc đoạn DNA đặc trưng khác nhau trên một phân tử DNA, hoặc trờn cỏc phân tử DNA khác nhau [114]. Điều quan trọng nhất là phải thiết kế các cặp mồi cú cựng nhiệt độ bắt cặp lên DNA đích, đồng thời các mồi này không bắt cặp với nhau. Tuy nhiên, rất khó để đạt được các điều kiện như vậy nên phương pháp PCR đa mồi có nhược điểm là đôi khi cho kết quả không chính xác như PCR đơn mồi [41], [74]. 20 Ứng dụng trong chẩn đoán DMD: Do gen dystrophin có số lượng lớn exon (79 exon) nên để phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin, các tác giả thường sử dụng phương pháp PCR đa mồi hơn là phương pháp PCR đơn mồi nhằm tiết kiệm thời gian, công sức và hóa chất. Trước đây và cho đến hiện nay, phương pháp multiplex PCR vẫn là phương pháp được ưu tiên sử dụng để phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin như trong nghiên cứu của Coutelle (1989), Lee (1993), Prior (2005), Basak (2006), Sura (2008),... Năm 2006, Trần Võn Khỏnh đó sử dụng phương pháp này để phát hiện đột biến trên 85 bệnh nhân DMD. Kết quả cho thấy tỷ lệ đột biến mất đoạn gen dystrophin của bệnh nhân DMD ở Việt Nam là 38% [10], [32], [33], [43], [82], [125]. Hiện nay, phương pháp multiplex PCR là một trong những phương pháp được sử dụng để chẩn đoán đột biến mất đoạn gen dystrophin ở Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein của trường Đại học Y Hà Nội. Nước Control BN1 BN2 BN3 BN4 BN5 BN6 BN7 Marker Exon 47 Exon 42 Exon 68 Exon 77 Hình 1.7. Phản ứng multiplex PCR xác định đột biến mất đoạn gen dystrophin (Trung tâm Nghiờn cứu Gen-Protein, Đại học Y Hà Nội) * Kỹ thuật PCR lồng (nested PCR): nguyờn lý của kỹ thuật nested PCR là sử dụng 2 cặp mồi có trình tự nucleotid lồng vào nhau để khuếch đại đoạn DNA đích, nghĩa là cặp mồi thứ 2 có trình tự các nucleotid nằm bên trong cặp mồi thứ nhất. Sản phẩm PCR được tổng hợp bởi cặp mồi thứ nhất được dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR lần thứ 2. Phương pháp này làm tăng chất lượng và độ đặc hiệu cho phản ứng PCR [6], [18], [74]. * Kỹ thuật PCR sao chép ngược (RT-PCR): trước hết, mRNA được chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược. Mồi được sử dụng hoặc là oligonucleotid oligodT (để bắt cặp với đuôi polyA của các mRNA), hoặc là các