Tài liệu Xác định đồng thời axit xitric, benzoic và sorbic trong thực phẩm bằng phương pháp ce c4d

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- TRỊNH THỊ NHƢ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AXIT XITRIC, BENZOIC VÀ SORBIC TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP CE- C4D LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA H NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHI N --------------------- TRỊNH THỊ NHƢ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AXIT XITRIC, BENZOIC VÀ SORBIC TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP CE- C4D Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 8440112.03 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Lê Thị Hồng Hảo PGS. TS. Nguyễn Thị Ánh Hƣờng Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo, PGS.TS. Nguyễn Thị Ánh Hƣờng đã giao đề tài và tận tình hƣớng dẫn, truyền thụ kiến thức khoa học và hƣớng dẫn về chuyên môn trong quá trình em học tập, nghiên cứu, tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành luận văn Thạc sĩ khoa học này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo tại bộ môn Hóa Phân Tích, Trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Hà Nội đã truyền đạt cho em kiễn thức để em hoàn thành các môn học trong khóa học này. Đặc biệt em rất cảm ơn 2 bạn: CN. Nguyễn Thị Nữ sinh viên K58 và Đặng Thị Huyền My sinh viên K60 Trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ em để em có kết quả nhƣ ngày hôm nay. Em xin cảm ơn công ty 3Sanalysis (http: //www. 3sanalysis.vn/) đã cung cấp thiết bị để em thực hiện nghiên cứu này. Em xin cảm ơn Ban lãnh đạo, các anh chị em trong Trung Tâm Phân Tích, Viện Hóa Học Công Nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện, khích lệ em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua. Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm, động viên giúp em hoàn thành luận văn này. Hà Nội, ngày tháng Học viên Trịnh Thị Nhƣ năm 2019 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU……………………………………………………………………………… .1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ............................................................................................ 2 1. 1. Tổng quan về các chất bảo quản .............................................................................. 2 1.1.1. Giới thiệu về chất bảo quản.................................................................................... 2 1.1.2. Lợi ích và tác hại của phụ gia thực phẩm .............................................................. 2 1.2. Tổng quan về axit xitric, benzoic và sorbic .............................................................. 3 1.3. Ứng dụng và tác hại của axit xitric, benzoic và sorbic ............................................. 5 1.3.1. Axit xitric ............................................................................................................... 5 1.3.2. Axit benzoic ........................................................................................................... 5 1.3.3. Axit sorbic .............................................................................................................. 6 1.4. Tình hình sử dụng chất bảo quản trong thực phẩm hiện nay .................................... 6 1.5. Các phƣơng pháp xác định axit xitric, benzoic và sorbic ......................................... 8 1.5.1. Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) .............................................. 8 1.5.2. Phƣơng pháp sắc kí ................................................................................................ 9 1.5.3. Phƣơng pháp điện di mao quản ............................................................................ 13 1.6.Phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc ……...…19 1.6.1.Nguyên lý hoạt động C4D ...................................................................................... 18 1.6.2. Giới thiệu chung phương pháp ............................................................................ 19 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM ..................................................................................... 23 2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu ............................................................................ 23 2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu............................................................................................. 23 2.1.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 23 2.2. Hóa chất và thiết bị ................................................................................................. 23 2.2.1. Hóa chất ............................................................................................................... 23 2.2.2. Thiết bị dụng cụ ................................................................................................... 25 2.3. Phƣơng pháp xử lý mẫu phân tích .......................................................................... 26 2.4. Các thông số đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích ................................ 27 2.4.1. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp phân tích .............. 27 2.4.2. Độ chụm của phƣơng pháp .................................................................................. 27 2.4.3. Độ đúng của phƣơng pháp ................................................................................... 28 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 29 3.1. Tối ƣu hóa các điều kiện phân tích ......................................................................... 29 3.1.1. Khảo sát dung dịch đệm điện di. .......................................................................... 29 3.1.5. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu .................. 40 3.1.6. Khảo sát 1 số chất ảnh hƣởng trong quá trình phân tích mẫu thực tế .................. 42 3.2. Xây dựng đƣờng chuẩn cho các chất phân tích và đánh giá phƣơng pháp ............. 43 3.2.1. Xây dựng đƣờng chuẩn ........................................................................................ 43 3.2.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp .............................. 46 3.3. Phân tích mẫu thực tế .............................................................................................. 47 3.4. Phân tích đối chứng phƣơng pháp CE – C4D với phƣơng pháp HPLC .................. 50 KẾT LUẬN .................................................................................................................... 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt ISO Tên tiếng anh International Organization for Standardization ML Maximum Level Ace Tris UV CE LOD LOQ RSD Acid acetic Tristidine Ultraviolet Capillary electrophoresis Capillary electrophoresis conductivity detection Ultra performance liquid chromatography photodiode array detector High performance liquid chromatography Gas Chromatography Flame Ionization Detector Dispersed Liquid-Liquid microextration Gas Chromatography Mass Spectometry Thermal Conductivity Detector Limit of Detection Limit of Quantitation Relative standard deviation MDL Method detection limit CE- C4D UPLC-PDA HPLC GC-FID DLLME GC-MS TCD Tên tiếng việt Tổ chức quốc tế về tiêu chuẩn hóa Giới hạn tối đa cho phép trong thực phẩm Acid axetic Tristidin Tử ngoại Điện di mao quản Điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc Sắc ký lỏng siêu hiệu năng sử dụng detector mảng điot Sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký khí sử dụng detector ion hóa ngọn lửa Vi chiết lỏng-lỏng phân tán Sắc ký khí khối phổ Detector dẫn nhiệt Giới hạn phát hiện Giới hạn định lƣợng Độ lệch chuẩn tƣơng đối Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp DANH MỤC BẢNG Bảng 1. 1. Thông tin chung về axit xitric, benzoic và sorbic…………………………..4 Bảng 1. 2. Tóm tắt một số nghiên cứu xác định acid hữu cơ bằng phƣơng pháp HPLC 9 Bảng 1. 3. Tóm tắt một số nghiên cứu xác định chất hữu cơ bằng phƣơng pháp sắc kí khí sử dụng detector ion hóa ngọn lửa (GC-FID) .......Error! Bookmark not defined. Bảng 1. 4. Tóm tắt một số nghiên cứu xác định chất hữu cơ bằng phƣơng pháp sắc kí khí khối phổ (GC-MS) .................................. Error! Bookmark not defined. Bảng 1. 5. Tóm tắt một số nghiên cứu xác định chất hữu cơ bằng phƣơng pháp điện di mao quản ....................................................................................................... 16 Bảng 1. 6. Tóm tắt một số nghiên cứu xác định chất hữu cơ bằng phƣơng pháp .......... 20 Bảng 3. 1. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng pH của thành phần dung dịch đệm đến diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của axit xitric, benzoic và sorbic .... 32 Bảng 3. 2. Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của diện tích pic (Spic) vào nồng độ đệm Arg ...................................................................................................................... 36 Bảng 3. 3. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của điện thế tách đến diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của axit xitric, benzoic và sorbic. ......................... 38 Bảng 3. 4. Điều kiện thích hợp xác định đồng thời axit xitric, benzoic và sorbic bằng phƣơng pháp CE-C4D .................................................................................. 42 Bảng 3. 5. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ axit xitric, benzoic và sorbic ......... 43 Bảng 3. 6. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của axit xitric, benzoic và sorbic ...................... 45 Bảng 3. 7. Giới hạn phát hiện axit xitric, benzoic và sorbic .......................................... 46 bằng phƣơng pháp CE-C4D trong mẫu nƣớc ngọt cocacola .......................................... 46 Bảng 3. 8. . Độ lặp lại và độ thu hồi của phƣơng pháp CE-C4D xác định axit xitric .... 47 Bảng 3. 9. Hàm lƣợng axit xitric, benzoic, sorbic xác định đƣợc trong mẫu thực ........ 48 Bảng 3. 10 . Điều kiện phân tích axit xitric, benzoic và sorbic bằng phƣơng pháp HPLC ............................................................................................................ 50 Bảng 3. 11. Kết quả phân tích hàm lƣợng ba chất bảo quản trong thực phẩm bằng phƣơng pháp CE – C4D và phƣơng pháp tiêu chuẩn HPLC ........................ 51 DANH MỤC HÌNH Hình 1. 1. Sơ đồ phân tích hệ điện di mao quản ............................................................ 13 Hình 1. 2. Lớp điện tích kép trên bề mặt mao quản ....................................................... 14 Hình 1. 3. Ảnh hƣởng của dòng EOF đến tốc độ của các ion trong quá trình điện di ... 14 Hình 1. 4. Các kĩ thuật bơm mẫu trong phƣơng pháp điện di mao quản ....................... 16 Hình 1. 5. Nguyên lý hoạt động của cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc ..................... 18 Hình 2. 1. Hệ thiết bị điện di mao quản CE-C4D tự chế, bán tự động ........................... 25 Hình 3.1. Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng pH của thành phần dung dịch đệm (His/Ace) ......................................................................................................................... 30 Hình 3.2. Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng pH của thành phần dung dịch đệm (Arg/Ace) ......................................................................................................................... 31 Hình 3.3. Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng pH của thành phần dung dịch đệm (Tris/Ace) ......................................................................................................................... 31 Hình 3.4. Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của thành phần dung dịch đệm .................... 32 Hình 3.5: Biểu đồ diện tích pic của các chất phân tích khi thay đổi hệ đệm. ................ 33 Hình 3.6: Biểu đồ thời gian di chuyển của các chất phân tích khi thay đổi hệ đệm. ..... 33 Hình 3.7. Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của chất hoạt hóa bề mặt CTAB .................. 34 Hình 3.8. Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ dung dịch đệm arginin ............. 35 Hình 3.9: Biểu đồ diện tích pic các chất phân tích theo nồng độ đệm Arg/Ace ............ 36 Hình 3.10: Biểu đồ thời gian di chuyển các chất phân tích theo nồng độ đệm Arg/Ace ......................................................................................................................... 37 Hình 3.11. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hƣởng của điện thế tách .................................... 38 Hình 3.12: Biểu đồ diện tích pic chất phân tích theo thế tách (kV) ............................... 39 Hình 3.13: Biểu đồ diện tích pic chất phân tích theo thế tách (kV) ............................... 39 Hình 3.14. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hƣởng của thời gian bơm mẫu .......................... 40 Hình 3.15. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hƣởng của chiều cao bơm mẫu ......................... 41 Hình 3.16. Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của formic, propionic, butyric và clorua. ... 42 Hình 3.17. Đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ acid citric 44 Hình 3.18. Đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ acid benzoic ...................................................................................................................... 45 Hình 3.19. Đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ acid sorbic ...................................................................................................................... 45 Hình 3.20.Điện di đồ phân tích axit xitric, benzoic và sorbic trong một số mẫu nƣớc ngọt ................................................................................................................................. 49 Hình 3.21.Điện di đồ phân tích axit xitric, benzoic và sorbic trong một số mẫu rắn .... 49 Hình 3.22: Biểu đồ tƣơng quan giữa kết quả phân tích bằng HPLC và CE-C4D đối với axit xitric trên một số nền mẫu thực ............................................................. 52 MỞ ĐẦU Cùng với xu thế phát triển công nghiệp hóa hiện đại hóa của nƣớc ta hiện nay thì nền công nghệ chế biến, sản xuất thực phẩm cũng đang phát triển với tốc độ chóng mặt, nhằm đáp ứng đƣợc nhu cầu tiêu dùng hàng ngày cũng nhƣ phù hợp với thị yếu của xã hội. Tuy nhiên, bản chất của các loại thực phẩm chế biến sẵn không thể để quá lâu ở điều kiện thƣờng, dễ bị hỏng, mốc… vì vậy các chất phụ gia trong thực phẩm với giá thành không quá cao, thƣờng đƣợc thêm vào để làm tăng thời gian bảo quản thực phẩm, đáp ứng đƣợc nhu cầu của thị trƣờng. Việc lựa chọn sử dụng các chất bảo quản và liều lƣợng phụ thuộc vào bản chất của thực phẩm và cách thức chế biến thực phẩm đó. Nhiều khi các nhà sản xuất đã không tuân thủ đúng mức độ cho phép của chất bảo quản, gây nên nhiều vụ ngộ độc thực phẩm, ảnh hƣởng lớn tới sức khỏe con ngƣời. Vì vậy, việc kiểm soát các chất bảo quản thực phẩm là cần thiết, bảo vệ quyền lợi ngƣời tiêu dùng và sức khỏe cộng đồng. Để xác định đồng thời hàm lƣợng các chất bảo quản nhƣ axit xitric, benzoic và sorbic trong thực phẩm, có rất nhiều phƣơng pháp có thể đáp ứng nhƣ: phƣơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), điện di mao quản (CE)… Tuy nhiên, phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc CE-C4D là phƣơng pháp mới, hiện đại với thiết bị nhỏ gọn, xử lý mẫu nhanh, có thể tự động hóa và triển khai phân tích tại hiện trƣờng, lƣợng mẫu và hóa chất sử dụng ít, chi phí thấp, đảm bảo đƣợc độ chính xác khi xác định các chất bảo quản trong thực phẩm. Do đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Xác định đồng thời axit xitric, benzoic và sorbic trong thực phẩm bằng phương pháp CE- C4D” với mục đích góp phần đánh giá các chất bảo quản thƣờng đƣợc sử dụng này trong một số loại thực phẩm hiện đƣợc bán trên thị trƣờng, đảm bảo an toàn thực phẩm và sức khỏe con ngƣời. 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1. 1. Tổng quan về các chất bảo quản 1.1.1. Giới thiệu về chất bảo quản Chất bảo quản là các hợp chất vô cơ hay hữu cơ có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp, chúng không phải là một phần của các thành phần chính trong thực phẩm. Chúng đƣợc phân thành 3 loại là: Chất sát khuẩn, các chất kháng sinh và chất chống oxy hóa. Chất bảo quản đƣợc thêm vào thực phẩm để tạo hƣơng vị, màu sắc và ngăn ngừa hoặc làm chậm lại sự thối rữa, hƣ hỏng gây ra bởi sự phát triển của các vi sinh vật hay do các thay đổi không mong muốn về mặt hóa học. Trong các loại chất bảo quản thực phẩm tự nhiên là: muối, đƣờng, rƣợu, giấm... Đây là những chất bảo quản truyền thống trong thực phẩm cũng đƣợc sử dụng tại nhà trong khi làm dƣa chua, mứt và nƣớc ép... Ngoài ra, đông lạnh, đun sôi, muối đƣợc coi là những cách tự nhiên để bảo quản thực phẩm. Trong phần này, các chất bảo quản thực phẩm nhƣ axit xitric và axit ascorbic hoạt động trên các enzyme và phá vỡ sự trao đổi chất của chúng dẫn đến việc bảo quản. Chất bảo quản thực phẩm tổng hợp cũng đang đƣợc sử dụng khá phổ biến. Chúng dƣờng nhƣ là tốt nhất và hiệu quả nhất cho việc kéo dài thời hạn sử dụng. Nhóm chất phụ gia bảo quản thực phẩm tổng hợp bao gồm: - Các chất sát khuẩn (axit acetic, axit sorbic, axit benzoic, natrinitrat…): có tác dụng ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn. - Các chất kháng sinh (steptomixin, cácloại penixilin...). - Các chất chống oxy hóa (axit ascorbic, axit xitric, dẫn xuất tocopherol…) có tác dụng làm chậm sự biến chất, ôi khét, biến màu của thực phẩm. 1.1.2. Lợi ích và tác hại của phụ gia thực phẩm Các phụ gia thực phẩm có tác dụng tích cực nhƣ tạo đƣợc nhiều sản phẩm phù hợp với sở thích và khẩu vị của ngƣời tiêu dùng, giữ đƣợc chất lƣợng toàn vẹn của thực phẩm cho tới khi sử dụng, tạo sự dễ dàng trong sản xuất, chế biến thực phẩm và làm 2 tăng giá trị thƣơng phẩm hấp dẫn trên thị trƣờng, kéo dài thời gian sử dụng của thực phẩm,….khi các nhà sản xuất sử dụng đúng liều lƣợng chất bảo quản. Khi sử dụng phụ gia thực phẩm một cách bừa bãi, nhất là những phụ gia không cho phép dùng trong thực phẩm sẽ gây những tác hại cho sức khỏe nhƣ gây ngộ độc cấp tính nếu dùng quá liều cho phép, gây ngộ độc mãn tính. Khi dùng liều lƣợng nhỏ, thƣờng xuyên, liên tục, một số chất phụ gia thực phẩm tích lũy trong cơ thể, gây tổn thƣơng lâu dài. Nguy cơ gây hình thành khối u, ung thƣ, đột biến gen, quái thai, nhất là các chất phụ gia tổng hợp. Nguy cơ ảnh hƣởng tới chất lƣợng thực phẩm nhƣ phá huỷ các chất dinh dƣỡng, vitamin [5]. Do đó, cần tuân thủ các quy định khi sử dụng chất bảo quản, cụ thể theo ISO (International Standard Organization) và Hội đồng tiêu chuẩn thực phẩm CAC (Codex Alimentarius Commision) gồm hơn 130 nƣớc thành viên, trong đó có Việt Nam. Các quy định cụ thể về các chất phụ gia thực phẩm là do từng quốc gia. Ở Việt Nam, các chất phụ gia thực phẩm phải nằm trong danh mục cho phép sử dụng và đảm bảo các yêu cầu về kĩ thuật, hàm lƣợng và vệ sinh an toàn thực phẩm theo quy định do Bộ Y tế ban hành. 1.2. Tổng quan về axit xitric, benzoic và sorbic Axit Xitric (E330) là axit hữu cơ đƣợc sản xuất và sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp (60%), dƣợc phẩm (10%) và các lĩnh vực khác. Axit xitric cung cấp bổ sung hƣơng vị trái cây, tăng hiệu quả chất bảo quản kháng khuẩn, điều chỉnh pH, tạo màu đậm trong kẹo cứng. Nó là chất nhũ hóa trong kem và phô mai chế biến sẵn… Ngoài ra, axit xitric là hợp chất tẩy rửa đƣợc ứng dụng nhiều trong ngành mạ điện, mạ đồng. [26] Axit Sorbic (E200) đƣợc sử dụng làm chất bảo quản và đƣợc tìm thấy trong thực phẩm, mỹ phẩm và các sản phẩm gia dụng khác. Nó ngăn chặn sự phát triển của nấm mốc, nấm men và nấm [23]. Axit sorbic đƣợc sử dụng là nguyên liệu chế biến cho muối chua hay làm sữa chua…Dùng nhiều cho chế biến rau quả, rƣợu vang, đồ hộp, chế biến sữa… 3 Axit Benzoic (E210) là chất bảo quản đƣợc sử dụng rất nhiều trong thực phẩm. Axit benzoic là một loại axit thơm đơn sắc, dạng tinh thể màu trắng, rất tan trong rƣợu, ete và benzen nhƣng ít tan trong nƣớc. Axit benzoic có ƣu điểm là không ảnh hƣởng đến mùi và vị của nƣớc ngọt nếu sử dụng với số lƣợng nhỏ. Axit benzoic tồn tại tự nhiên ở nhiều loại thực vật và động vật. Do đó nó là thành phần tự nhiên của nhiều loại thực phẩm bao gồm các sản phẩm sữa [30]. Axit benzoic tác dụng theo cơ chế trực tiếp. Khi các phân tử axit benzoic khuếch tán vào bên trong tế bào vi sinh vật, nó sẽ tác động lên một số enzyme gây hạn chế sự trao đổi chất, làm ức chế quá trình trao đổi chất của tế bào, ức chế sự phát triển của nấm men, nấm mốc… Axit benzoic còn có khả năng tác dụng lên màng tế bào để hạn chế hấp thu axit amin của tế bào vi sinh vật. Bảng 1.1. Thông tin chung về axit xitric, axit sorbic và axit benzoic Tên chất Tên hóa học Axit xitric Axit sorbic Axit benzoic Axit xitric Axit sorbic Axit benzoic Axit 2-hydroxypropan- Axit 2,4-hexadienoic 1,2,3 - tricacboxylic Công thức phân tử Axit benzencarboxylic Axit 2-propenylacrylic Axit phenyl carboxylic C6H8O7 C6H8O2 C6H5COOH 192,123 112,12 122,12 pKa = 4,76 pKa = 4,21 Công thức cấu tạo Khối lƣợng phân tử pKa pKa1= 3,15; pKa2 = 4,77; pKa3 = 6,40 Nhiệt độ sôi 1750C 2280C 2490C Nhiệt độ nóng chảy 1530C 134,50C 1220C 4 1.3. Ứng dụng và tác hại của axit xitric, axit benzoic, axit sorbic 1.3.1. Axit xitric: là một axit hữu cơ thuộc loại yếu, nó thƣờng đƣợc tìm thấy trong các loại quả chanh, cam, quýt và bƣởi. Axit xitric có rất nhiều ứng dụng trong việc bảo quản thực phẩm và đời sống nhƣ: - Đƣợc sử dụng nhƣ là chất tạo hƣơng vị và chất bảo quản trong thực phẩm và đồ uống, đặc biệt là các loại đồ uống nhẹ. - Ngăn chặn màu nâu của rƣợu vang trắng, ngăn chặn độ đục của rƣợu vang rƣợu táo, điều chỉnh pH. - Là chất nhũ hóa trong kem và phô mai chế biến sẵn, là chất chống oxy hóa trong nhiều sản phẩm phô mai. - Có tác dụng giảm tác hại của nƣớc cứng. - Sử dụng trong công nghệ sinh học, hoạt hóa một số dung dịch tẩy rửa. - Đánh giá vi chất dinh dƣỡng trong phân bón. - Là chất sủi bọt trong bột và là thuốc chống đông máu. [14] Ngoài những ứng dụng khá tốt của axit xitric thì nó còn có một số tác hại sau: - Việc tiếp xúc với axit xitric khô hay đậm đặc có thể gây ra kích ứng da và mắt. Tiếp xúc gần với mắt có thể gây bỏng và làm mất thị giác. - Việc sử dụng quá nhiều axit xitric cũng dễ làm tổn hại men răng. - Đôi khi hàm lƣợng quá cao axit xitric có thể gây tổn hại cho tóc, do nó mở lớp cutin của tóc. Nó có thể làm mất các chất cần thiết cho tóc và làm tóc bị bạc màu [5]. 1.3.2. Axit benzoic: Là dạng axit cacboxylic thơm đơn giản nhất. Nó có khả năng kháng nấm tốt nên đƣợc sử dụng làm chất bảo quản. Cụ thể: - Đƣợc dùng để bảo quản thực phẩm, thuốc lá, keo dính, sản xuất phẩm nhuộm, dƣợc phẩm và chất thơm. - Có khả năng tác động lên màng tế bào để hạn chế sự hấp thu các axit amin của tế bào vi sinh vật và các túi màng. - Trong y học làm thuốc sát trùng, diệt nấm. 5 Tuy nhiên, axit benzoic sẽ gây ra nhiều tác hại nếu sử dụng quá mức độ cho phép: - Ảnh hƣởng tới màu sắc và độ ngon của sản phẩm. - Nƣớc và các rau quả nghiền bảo quản bằng các benzoat thƣờng có màu thâm đen so với sản phẩm sunfit hóa [5]. - Sự kết hợp giữa natri benzoat và axit ascorbic (vitamin C, E300) hình thành benzene, một chất gây ung thƣ. - Các trƣờng hợp nổi mề đay, viêm mũi hoặc sốc phản vệ khi tiếp xúc bằng miệng, da hoặc đƣờng hô hấp với axit benzoic. Các triệu chứng xuất hiện trong thời gian ngắn khi dung liều thấp và biến mất trong vài giờ. [19] 1.3.3. Axit sorbic: Là axit hữu cơ đƣợc sử dụng là chất bảo quản trong thực phẩm vì nó có nhiều ứng dụng: - Có tác dụng sát trùng mạnh đối với nấm men và nấm mốc, dùng để bảo quản thực phẩm. - Việc sử dụng axit sorbic trong sản xuất đồ hộp có thể giảm đƣợc nhiệt thanh trùng. - Cản trở việc tăng trƣởng và sinh sản của các vi sinh vật độc hại nhƣ Pseudomonas. - Mặc dù vây, nếu sử dụng axit sorbic quá liều sẽ gây ra những ảnh hƣởng lớn đến sức khỏe con ngƣời nhƣ: - Gây dị ứng, đầy bụng, đầy hơi, khó tiêu. Nếu tích tụ lâu ngày sẽ gây hại cho gan, thận, thậm chí có thể gây ung thƣ [5]. 1.4. Tình hình sử dụng chất bảo quản trong thực phẩm hiện nay Hiện nay, việc sử dụng các chất phụ gia bảo quản thực phẩm là khá phổ biến.Ví dụ nhƣ các chất chống nấm mốc, chống mất màu, mất hƣơng vị, oxy hóa... Một số chất nhất định đƣợc sử dụng ở một mức độ cho phép hoàn toàn không gây hại cho ngƣời tiêu dùng. Bộ Y Tế đã có danh mục quy định các loại chất đƣợc phép sử dụng và giới hạn, chủng loại rất cụ thể. Thực tế có rất nhiều nhà sản xuất vì không chấp hành các quy định về giới hạn cho phép của chất bảo quản và không trang bị quy trình sản xuất đủ đáp ứng, nguyên liệu không tốt, sản phẩm làm ra tiêu thụ chậm đã lạm dụng các 6 chất bảo quản để kéo dài thời gian chờ phân phối trên thị trƣờng. Vì vậy, chúng lại trở nên vô cùng nguy hiểm cho ngƣời tiêu dùng. Các vấn đề liên quan đến an toàn thực phẩm để đảm bảo sức khỏe ngƣời tiêu dùng và thực hiện chức năng quản lý nhà nƣớc, Bộ Y tế đã ban hành thông tƣ 27/2012/TT-BYT ngày 30 tháng 11 năm 2012 hƣớng dẫn việc quản lý phụ gia thực phẩm (thay thế cho Quy định danh mục các chất phụ gia đƣợc phép sử dụng trong thực phẩm ban hành kèm theo Quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT ngày 31 tháng 8 năm 2001 và quy định về điều kiện bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm trong sản xuất, kinh doanh, sử dụng phụ gia thực phẩm ban hành kèm theo Quyết định số 928/2002/QĐBYT ngày 21 tháng 3 năm 2002 của Bộ trƣởng Bộ Y tế). Hiện nay, hai chất bảo quản là axit benzoic, axit sorbic vẫn đƣợc phép sử dụng trong thực phẩm với liều lƣợng khác nhau, giới hạn cho phép đối với axit benzoic từ 200-5000 mg/kg sản phẩm, axit sorbic từ 100 – 3000 mg/kg sản phẩm [1]. Năm 2012, nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Hƣơng trên địa bàn tỉnh Quảng Bình cho thấy: Tổng số mẫu xét nghiệm axit benzoic là 291 có 69 mẫu thực phẩm sử dụng chất bảo quản axit benzoic chiếm là 23,7%, trong các thực phẩm sử dụng chất bảo quản axit benzoic tỷ lệ mẫu thực phẩm sử dụng vƣợt quá giới hạn cho phép là 46,4%. Tổng số mẫu xét nghiệm axit sorbic là 286 có 50 mẫu thực phẩm sử dụng chất bảo quản axit sorbic chiếm là 17,5%, trong các thực phẩm sử dụng chất bảo quản axit sorbic tỷ lệ mẫu thực phẩm sử dụng vƣợt quá giới hạn cho phép là 50% [6]. Khoa Kiểm Nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm thuộc Trung Tâm Y Tế dự phòng TPHCM tiến hành phân tích 349 mẫu thực phẩm là các loại nƣớc giải khát , nƣớc tƣơng, tƣơng cà, tƣơng ớt, thịt chế biến sẵn .v.v…. Kết quả có tới 20,3% số mẫu không đạt chỉ tiêu an toàn do sử dụng quá mức natri benzoat và kali sorbat. Cụ thể số mẫu vi phạm là 12,2% mẫu nƣớc giải khát, 28,95 mẫu nƣớc tƣơng và 44,44% mẫu tƣơng cà và tƣơng ớt. Đối với các mẫu tƣơng ớt, tƣơng cà thì liều lƣợng natri benzoat có những mẫu vƣợt gấp 27 lần giới hạn tiêu chuẩn an toàn [4]. 7 Tình hình trên thị trƣờng hiện nay các chất bảo quản đƣợc bán khá phổ biến. Trên các trang web thông tin và hình ảnh về các chất phụ gia đƣợc đƣa ra cụ thể, mô tả chi tiết nhƣng không đƣa ra giới hạn sử dụng và tác hại của chúng. Trong rất nhiều mẫu thực phẩm sử dụng chất bảo quản nhƣ natri benzoat, natri sorbic hay axit xitric không ghi rõ lƣợng đã sử dụng là bao nhiêu. Điều này gây ra một hiện tƣợng đáng lo ngại cho ngƣời tiêu dùng khi sử dụng các sản phẩm không rõ ràng về chất lƣợng thực phẩm, trong đó có hàm lƣợng của các chất bảo quản. 1.5. Các phƣơng pháp xác định axit benzoic, axit sorbic, axit xitric 1.5.1. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) Phổ hấp thụ phân tử UV- Vis là phổ của tổ hợp sự chuyển mức của các điện tử liên kết, sự quay và dao động phân tử, do sự tƣơng tác của các điện tử hóa trị ở trong phân tử hay nhóm phân tử khi bị chiếu chùm sáng kích thích.. Vì thế nó là phổ đám, có các cực đại và cực tiểu của phổ thƣờng nằm trong những vùng sóng nhất định tùy theo cấu trúc và loại liên kết của phân tử hay nhóm nguyên tử có trong hợp chất. Các tác giả Yan Qing Chen và Yong Nian Ni đã xác định các chất bảo quản thực phẩm axit benzoic (BA), methylparaben (MP), propylparaben (PP) và axit sorbic (SA) dựa vào các ƣu điểm nổi trội của phƣơng pháp hấp thụ phân tử [27]. Khi ứng dụng phƣơng pháp thì quang phổ của các hợp chất chồng lên nhau và không thể định lƣợng thành công bởi phƣơng pháp hiệu chuẩn thông thƣờng. Do vậy phƣơng pháp chemometric đƣợc áp dụng cho việc giải quyết các UV quang phổ chồng chéo. Độ hấp thụ tối đa của benzoic và sorbic bắt đầu giảm và bƣớc sóng đã chuyển từ 229nm và 263nm đến 223nm và 254nm ở pH= 4,0. Giới hạn phát hiện (LOD) là 0,22mg/l và 0,085mg/l cho benzoic và sorbic.Tuy nhiên, áp dụng phƣơng pháp UV-Vis để xác định thì quang phổ của benzoic và sorbic sẽ bị trộn lẫn và khó xác định vị trí của chúng. Vì vậy phƣơng pháp này không đƣợc ứng dụng nhiều trong việc định lƣợng các chất bảo quản trong thực phẩm. 8 1.5.2. Phương pháp sắc kí 1.5.2.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) HPLC là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình vừa có tính chất hóa học lại vừa có tính chất lý học. Nó là những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động, là sự vận chuyển và phân bố liên tục của các chất tan (hỗn hợp mẫu phân tích) theo từng lớp qua chất nhồi cột (pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách [2]. Phƣơng pháp HPLC ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phƣơng pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay, phƣơng pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích. Hiện nay nó áp dụng trong nhiều lĩnh vực, xác định nhiều loại chất khác nhau trong đó nhiều tác giả đã dùng phƣơng pháp này để xác định benzoic, sorbic và xitric. Dƣới đây là tóm tắt một số nghiên cứu xác định axit hữu cơ, trong đó có axit xitric, benzoic và sorbic: Bảng 1.2. Tóm tắt một số nghiên cứu xác định axit hữu cơ bằng phương pháp HPLC Tác giả Chất phân Pha động LOD Jankana Dung dịch đệm Axit sorbic Burana- amoni acetat là 0,32 (pH 4,4) và mg/l methanol theo Axit (2014) tỷ lệ thể tích 60: benzoic là [28] 40. 0,42 mg/l Dossi.N Dung dịch đệm tích osot và Axit sorbic cộng sự Axit benzoic Mẫu Mì Cột tách Silica C18 và cộng Axit benzoic Nƣớc giải LiChrosorb photphat 0,1M 0,1-3,0 sự (2006) Axit sorbic khát RP18 (pH4,0) và mg/l [15] methanol. 9 Đệm kali Li XiuQin và cộng sự (2008) [25] dihydro 10 chất bảo photphat 20mM quản (có axit Thực (pH 4,29) và 0,1÷20µg/ sorbic và axit phẩm acetonitrin với ml chƣơng trình benzoic) rửa giải gradient. Khaskhali KH2PO4(25%) MH và và cộng sự Axit xitric Nƣớc tiểu (C4H9)4NHSO4 (1996) (2,5 mmol) ở [21] pH 2,0 Axit sorbic Yi Wen Methanol và là 0,9 và cộng Axit benzoic Thực 0,02mol/l ng/ml sự (2007) Axit sorbic phẩm ammoni axetat Axit (30:70) benzoic là [39] 1,2 ng/ml Gồm 81% Tfouni. S.A.V và cộng sự (2002) nƣớc,17% Axit benzoic Thực và axit sorbic phẩm C18 axetonitrivà 2% 0,005M ammoni axetat [36] ở pH = 4,2 10 Axit sorbic là 0,05- 0,2 µg/ml Axit benzoic là 0,06- 0,2 µg/ml 1.5.2.2. Phương pháp sắc kí khí sử dụng detector ion hóa ngọn lửa (GC-FID) Sắc ký khí là một phƣơng pháp sắc ký mà pha động là chất khí hoặc ở dạng hơi và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn hoặc chất lỏng phủ trên bề mặt chất mang dạng rắn hay phủ đều lên phía trong của cột tạo lớp màng phim mỏng. Các hợp chất hữu cơ đƣợc tách khỏi nhau nhờ sự phân bố khác nhau giữa pha động và pha tĩnh trong cột. Pha động ở dạng khí liên tục chạy qua pha tĩnh, các chất tách ra do sự tƣơng tác khác nhau với pha tĩnh [8]. Detector ion hóa ngọn lửa (FID) là một trong những detector có độ nhạy cao. Nguyên tắc làm việc của nó dựa trên sự biến đổi độ dẫn điện của ngọn lửa của hydro đặt trong một điện trƣờng khi có chất hữu cơ cần tách chuyển qua. Nhờ nhiệt độ cao của ngọn lửa hydro, các chất hữu cơ từ cột tách đi vào detector bị bẻ gãy, bị ion hóa nhờ có oxy của không khí để tạo thành các ion trái dấu tƣơng ứng. Tác giả Abdol-Samad Abedi và cộng sự đã sử dụng phƣơng pháp chiết vi lƣợng lỏng-lỏng phân tán (DLLME) kết hợp với phƣơng pháp sắc ký khí sử dụng detector ion hóa ngọn lửa để xác định trực tiếp benzoic và sorbic trong các sản phẩm sữa[7]. Pha phân tán axeton và dung môi chiết 1-octan với tỉ lệ 475µl :60µl, pH=2,5 và 2g natri clorua. Với điều kiện tối ƣu, khoảng tuyến tính từ 0,1-50µg/ml, độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD%) tƣơng ứng là 6,13% và 3,07% (n = 5) cho acid sorbic và acid benzoic. Hiệu suất thu hồi của sorbic và benzoic lần lƣợt là 88% và 103,7%. LOD và LOQ là 150ng/g và 500 ng/g đối với sorbic, 142ng/g và 473ng/g đối với benzoic. Phƣơng pháp có hiệu suất thu hồi cao,tiêu thụ ít dung môi,chi phí thấp, thời gian phân tích ngắn, LOD thấp và khoảng tuyến tính rộng. 1.5.2.3. Phương pháp sắc ký khối phổ (GC-MS) Phƣơng pháp GC-MS là sự kết hợp thành công của kỹ thuật GC (sắc ký khí) và MS (khối phổ), là một phƣơng pháp mạnh với độ nhạy cao chủ yếu đƣợc sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về thành phần các chất trong không khí, đặc biệt nó giúp phát hiện các cấu tử trong hỗn hợp phức tạp. 11