Tài liệu Xác ðịnh ðộc tố gây liệt cơ (psp) trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lân khôi phổ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN CAO TUẤN MINH XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ (PSP) TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN 2010 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN CAO TUẤN MINH XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ (PSP) TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths.PHẠM VĂN HÙNG Ths.HUỲNH THỊ NGỌC LIÊN 2010 LỜI CẢM TẠ Trong suốt quá trình học tập tại trường ngoài những nỗ lực của bản thân, em còn nhận được sự giúp đỡ của nhiều người. Em xin chân thành cảm ơn thầy cô trong bộ môn Dinh dưỡng & Chế biến Thủy Sản - khoa Thủy Sản Trường Đại học Cần Thơ đã tận tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức bổ ích và đầy ý nghĩa trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và nghiên cứu tại trường. Em xin bày tỏ sự cảm ơn sâu sắc đến thầy Phạm Văn Hùng phó giám đốc Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng 6 (NAFIQAD 6), chị Huỳnh Thị Ngọc Liên trưởng phòng Kiểm nghiệm Hóa Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ em và tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn. Xin chân thành cảm ơn anh Sơn và các anh chị phòng Kiểm nghiệm Hóa Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản vùng 6 đã nhiệt tình giúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Cuối cùng tôi xin cảm ơn các bạn lớp chế biến thủy sản K32 và gia đình đã gắn bó chia sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Cần Thơ, tháng 05 năm 2010 Sinh viên thực hiện Cao Tuấn Minh i TÓM TẮT Đề tài “Xác định độc tố gây liệt cơ (PSP) trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ” được thực hiện từ tháng 01/2010 đến tháng 05/2010. Mục tiêu của đề tài là xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp xác định hàm lượng độc tố gây liệt cơ (PSP) trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu áp ghép hai lần khối phổ (UPLC-MS/MS). Nội dung cơ bản của đề tài là tối ưu hóa các điều kiện thiết bị UPLC-MS/MS như thành phần pha động, điện thế đầu cone, năng lượng va chạm….Xác định giới hạn phát hiện (LOD), tính tuyến tính, độ lặp lại, độ tái lặp và độ thu hồi của phương pháp. Kết quả nghiên cứu cho thấy: các điều kiện của UPLC-MS/MS đã được tối ưu để kết quả phân tích chính xác. Giới hạn phát hiện của thiết bị UPLCMS/MS: STX 1 ng/g, NEO 1 ng/g, GTX1,3 10 ng/g, GTX2,4 10 ng/g. Giới hạn phát hiện của phương pháp: STX 10 ng/g, NEO 10 ng/g, GTX1,4 40 ng/g, GTX2,3 40 ng/g. Đường chuẩn của các độc tố đều có giá trị R2 lớn hơn 0,99, do đó các khoảng nồng độ được chọn để xây dựng đường chuẩn đều phù hợp. Độ thu hồi trung bình đạt được đều lớn hơn 90%. Độ lệch chuẩn nội bộ phòng SW/L của STX là 0,511; NEO là 0,339; GTX1,4 là 0,461; GTX2,3 là 0,442. Tỉ lệ đáp ứng của mẫu chuẩn pha trong dung dịch và mẫu MMS sai lệch không quá 10% cho thấy nền mẫu không ảnh hưởng đến chất phân tích. Các thông số được đánh giá trong quá trình xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp đã đáp ứng được yêu cầu theo quy định của AOAC. Vì vậy việc xác định hàm lượng độc tố PSP trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ là hoàn toàn thích hợp để ứng dụng trong các phòng kiểm nghiệm. Do thời gian có hạn nên đề tài chỉ có thể nghiên cứu và khảo sát các điều kiện của UPLC-MS/MS và các thông số để xác định giá trị sử dụng của phương pháp. Nếu có điều kiện các nghiên cứu tiếp theo cần khảo sát các độc tố khác trong nhóm PSP và xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp trên thiết bị HPLC để có thể so sánh với thiết bị UPLC-MS/MS. ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ ................................................................................................. i TÓM TẮT...................................................................................................... ii MỤC LỤC .................................................................................................... iii DANH SÁCH BẢNG .....................................................................................v DANH SÁCH HÌNH..................................................................................... vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .............................................................. vii CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ.......................................................................... 1 1.1 Giới thiệu.............................................................................................. 1 1.2 Mục tiêu của đề tài................................................................................ 2 1.3 Nội dung của đề tài ............................................................................... 2 1.4 Thời gian thực hiện ............................................................................... 2 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 3 2.1 Tìm hiểu về độc tố gây liệt cơ (PSP) ..................................................... 3 2.1.1 PSP là gì? ....................................................................................... 3 2.1.2 Phân loại học và công thức cấu tạo của độc tố PSP......................... 3 2.2 Nhuyễn thể hai mảnh vỏ và độc tố PSP................................................. 5 2.2.1 Nhuyễn thể hai mảnh vỏ ................................................................ 5 2.2.2 Mối liên hệ giữa PSP và thủy triều đỏ/tảo nở hoa (red tide) ............ 5 2.2.3 Độc tố PSP trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ...................................... 6 2.2.4 Giới hạn cho phép của PSP trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ ............. 7 2.2.5 Một số trường hợp ngộ độc PSP ở Việt Nam và thế giới................. 7 2.3 Các phương pháp xác định hàm lượng độc tố gây liệt cơ (PSP)............. 8 2.3.1 Xác định PSP bằng phương pháp thử sinh hoá trên chuột ............... 8 2.3.2 Phương pháp HPLC với đầu dò huỳnh quang ................................. 8 2.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS).................................. 8 2.3.4 Phương pháp ELISA ...................................................................... 9 2.3.5 Phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC-MS/MS) ....... 9 2.4 Sắc kí lỏng hai lần khối phổ LC-MS/MS..............................................10 2.4.1 Giới thiệu về sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ..................10 2.4.2 Nguyên tắc hoạt động của LC-MS/MS ........................................10 2.4.3 Loại hợp chất phù hợp phân tích bằng sắc ký lỏng.........................13 2.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách của các chất trong cột ....13 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................15 iii 3.1 Vật liệu, thiết bị sử dụng và qui trình phân tích ....................................15 3.1.1 Địa điểm........................................................................................15 3.1.2 Nguyên vật liệu .............................................................................15 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ............................................................................15 3.1.4 Hóa chất, chất chuẩn......................................................................15 3.1.5 Qui trình phân tích PSP bằng LC-MS/MS .....................................17 3.2 Xác định các thông số tối ưu:...............................................................19 3.2.1 Xác định điều kiện của thiết bị UPLC............................................19 3.2.2 Xác định các phân mảnh của các độc tố.........................................20 3.2.3 Xác định điều kiện của đầu dò MS ................................................20 3.2.4 Xác định giới hạn phát hiện của thiết bị (ILOD) ...........................22 3.2.5 Khảo sát khoảng tuyến tính của đường chuẩn:...............................22 3.2.6. Xác định giới hạn phát hiện của phương pháp (MLOD) ...............22 3.2.7 Đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu đến chất cần phân tích ..............22 3.2.8 Độ lặp lại, độ tái lặp và độ thu hồi của phương pháp .....................23 3.3 Phương pháp tính toán .........................................................................23 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................26 4.1 Xác định các thông số tối ưu:...............................................................26 4.1.1 Điều kiện của thiết bị UPLC..........................................................26 4.1.2 Điều kiện của đầu dò MS...............................................................26 4.1.3 Các phân mảnh ion của độc tố .......................................................27 4.2 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp...........................................27 4.2.1 Xác định giới hạn phát hiện của thiết bị (ILOD) ............................27 4.2.2 Xác định khoảng tuyến tính của đường chuẩn................................28 4.2.3 Xác định giới hạn phát hiện của phương pháp (MLOD) ................31 4.2.4 Ảnh hưởng của nền mẫu đến chất cần phân tích ............................33 4.2.5 Độ lặp lại và độ tái lặp và độ thu hồi của phương pháp..................33 4.3 Tổng hợp kết quả .................................................................................35 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.....................................................36 5.1 Kết luận ...............................................................................................36 5.2 Đề xuất ................................................................................................36 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................37 PHỤ LỤC .....................................................................................................38 iv DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1: Cấu tạo, trọng lượng phân tử và độc tính của PSP .......................... 4 Bảng 3.1: Bảng pha nồng độ các dãy chuẩn...................................................17 Bảng 3.2: Các giá trị đề nghị của nhà sản xuất cho nguồn ESI (+).................21 Bảng 3.3: Các giá trị đề nghị của nhà sản xuất cho bộ phận Analyser............21 Bảng 3.4: Một số mảnh ion con dự kiến ........................................................22 Bảng 3.5: Độ lệch tương đối của tỉ lệ ion giữa chuẩn và mẫu ........................22 Bảng 4.1: Các phân mảnh của độc tố STX, NEO, GTX 1,4, GTX 2,3 ...........27 Bảng 4.2: Kết quả khảo sát giá trị ILOD........................................................28 Bảng 4.3: Nồng độ và độ đáp ứng của STX...................................................28 Bảng 4.4: Nồng độ và độ đáp ứng của NEO ..................................................29 Bảng 4.5: Nồng độ và độ đáp ứng của GTX1,4 .............................................30 Bảng 4.6: Nồng độ và độ đáp ứng của GTX 2,3 ............................................30 Bảng 4.7: Tổng hợp kết quả khảo sát độ tuyến tính .......................................31 Bảng 4.8: Kết quả xác định giới hạn phát hiện của phương pháp...................32 Bảng 4.9: Kết quả ảnh hưởng của nền mẫu đến chất cần phân tích ................33 Bảng 4.10: Kết quả tính toán độ lặp lại, độ tái lặp, độ thu hồi........................34 Bảng 4.11: Tổng hợp kết quả.........................................................................35 v DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1: Công thức cấu tạo của độc tố PSP................................................... 4 Hình 2.2: Hệ thống LC-MS/MS ....................................................................10 Hình 2.3: Pha tĩnh của cột sắc ký pha đảo.....................................................11 Hình 2.4: Pha tĩnh của cột sắc ký pha thuận...................................................12 Hình 2.5: Sơ đồ cấu tạo của đầu dò Quadrupole ............................................13 Hình 2.6 khả năng tách của cột C8 và C18. ..................................................14 Hình 2.7 Ảnh hưởng của pH dung môi đến khả năng tách của chất ..............14 Hình 2.8 Ảnh hưởng của độ phân cực dung môi đối với quá trình sắc ký. ....14 Hình 4.1 Đồ thị đường chuẩn STX ................................................................29 Hình 4.2 Đồ thị đường chuẩn NEO................................................................29 Hình 4.3 Đồ thị đường chuẩn GTX 1,4..........................................................30 Hình 4.4 Đồ thị đường chuẩn GTX 2,3..........................................................31 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Những chữ viết tắt sau đây đã được sử dụng trong đề tài luận văn: ACN Acetonitrile AOAC Association of Analytial Communities (Hiệp hội các nhà phân tích) ASP Amnesic Shellfish Poisoning (độc tố gây mất trí nhớ) DSP Diarrhetic Shellfish Poisoning (độc tố gây tiêu chảy) EU European Union (liên minh Châu Âu) ELISA Enzyme-Link ImmunoSorbent Assay (phương pháp miễn dịch) GC Gas Chromatograph (phương pháp sắc ký khí) GTX Gonyautoxin HMV Các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ HPLC High pressure Liquid chromatography (phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao) ILOD Instrumental limit of detection (giới hạn phát hiện của thiết bị) LC-MS/MS Liquid Chromatograph Tandem Mass Spectrometer (sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ) LOD Limit of detection (giới hạn phát hiện) MLOD Method limit of detection (giới hạn phát hiện của phương pháp) Nafiqad 6 Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản vùng 6 NEO Neosaxitoxin NPLC Normal Phase Liquid Chromatography (cột sắc ký lỏng pha thuận) PSP Paralytic Shellfish Poisoning (độc tố gây liệt cơ) RPLC Reversed Phase Liquid Chromatography (cột sắc ký lỏng pha đảo) STX Saxitoxin UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng siêu hiệu năng) vii CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Trong nhiều năm qua ngành thủy sản đã có những đóng góp đáng kể vào tổng thu nhập quốc dân, các sản phẩm thủy sản là một trong những mặt hàng xuất khẩu chủ lực của nước ta (theo số liệu của Cục Hải quan tính đến hết tháng 10-2009, xuất khẩu thủy sản đạt 995,5 tấn, trị giá 3.487,5 triệu USD) Các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ (HMV) cũng đóng góp đáng kể cả về sản lượng và kim ngạch, trong đó nghêu là một đối tượng có sản lượng và thu lại kim ngạch cao nhất điều này thể hiện qua việc giá nghêu trên thị trường ngày càng tăng, từ 800 đồng/kg vào những năm 1994, nay xấp xỉ 20.000 đồng/kg. Chính vì thế, nghề nuôi nghêu ngày càng phát triển ở nhiều địa phương ven biển nước ta. Các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ với đặc tính sinh học là loài ăn lọc trực tiếp các loài vi tảo trong đó có các loài vi tảo độc, chúng có khả năng tích lũy độc tố vi tảo (độc tố gây mất trí nhớ (ASP) độc tố gây tiêu chảy (DSP) và độc tố gây liệt cơ (PSP)) trong cơ thể với một thời gian dài nhưng không hề gây ra hiệu ứng độc với bản thân chúng. Nhưng các độc tố được tích lũy này lại là một mối nguy hại lớn cho con người hoặc các sinh vật khác khi tiêu thụ hai mảnh vỏ bị nhiễm độc tố. Hiện nay, có nhiều phương pháp để xác định độc tố PSP trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ như phương pháp thử sinh hóa trên chuột, phương pháp miễn dịch (ELISA), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC-MS/MS)... Tuy nhiên, phương pháp LC-MS/MS là phương pháp đang được nhiều phòng kiểm nghiệm trên thế giới áp dụng, đặc biệt là hệ thống phòng kiểm nghiệm của Liên Minh Châu Âu vì đây là phương pháp phân tích có khả năng định danh và phân loại chính xác thành phần của các độc tố trong nhóm PSP nếu chúng bị nhiễm vào thực phẩm. Châu Âu là thị trường nhập khẩu lớn của ngành thủy sản Việt Nam. Theo quy định của Ủy ban liên minh Châu Âu, để một nước ngoài khối EU được phép xuất khẩu thủy sản vào EU một trong các yếu tố quan trọng là hệ thống phòng kiểm nghiệm tham gia vào công tác kiểm tra, chứng nhận chất lượng đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm của nước xuất khẩu, phải tương đương với các phòng Kiểm nghiệm của EU với những đòi hỏi nghiêm ngặt về kỹ thuật phân tích. Chính vì vậy việc nghiên cứu đề tài “Xác định độc tố gây 1 liệt cơ (PSP) trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ” là cần thiết. 1.2 Mục tiêu của đề tài Mục tiêu của đề tài là xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp xác định hàm lượng độc tố gây liệt cơ (PSP) trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu áp ghép hai lần khối phổ (UPLC-MS/MS). Việc xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp dựa trên các yêu cầu tại phụ lục C và phụ lục D của AOAC 2007. 1.3 Nội dung của đề tài Tối ưu hóa các điều kiện thiết bị UPLC-MS/MS như thành phần pha động, điện thế mao quản, điện thế đầu Cone, nhiệt độ nguồn, năng lượng va chạm…. Xác định giới hạn phát hiện (LOD), tính tuyến tính, độ lặp lại, độ tái lặp và độ thu hồi của phương pháp. 1.4 Thời gian thực hiện Từ 01-2010 đến 05-2010. 2 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tìm hiểu về độc tố gây liệt cơ (PSP) 2.1.1 PSP là gì? Paralytic Shellfish Poisoning (PSP) là hiện tượng ngộ độc của con người gây ra do tiêu thụ các sinh vật có vỏ (chủ yếu là loài HMV) đã bị nhiễm độc tố của các loài vi tảo (chủ yếu là loài tảo giáp thuộc các giống như Alexandrium, Pyrodinium, và Gymnodinium) (Hashimoto & Noguchi 1989). Ngoài ra, một số loài tảo lam sống nước ngọt {Carmichael, Ahmood, et al. 1990 ID: 38}, tảo calcareous red macroalgae và có thể một số loài vi khuẩn biển {Kodama, Ogata, et al. 1990 ID: 39} cũng sản sinh loại độc tố thần kinh này. Độc tố PSP không chỉ tìm thấy ở trong các sinh vật HMV ăn lọc mà còn ở cả cua, ốc, cá ngừ và các loài cá ăn thực vật khác nữa. Triệu chứng ngộ độc thường xuất hiện khoảng 5-90 phút sau khi ăn, với cảm giác ban đầu là bỏng rát ở lưỡi và miệng, lan toả đến vùng hầu và cổ họng; ngứa và đau như kim chích ở đầu ngón tay, ngón chân. Tiếp đó là cảm giác nhức đầu, chóng mặt, buồn nôn, nôn và có thể tiêu chảy. Trong trường hợp nghiêm trọng, quá trình liệt cơ xuất hiện, đặc biệt biểu hiện rõ nhất là liệt cơ hô hấp gây ra triệu chứng phát âm và hô hấp khó khăn. Nạn nhân ngộ độc nặng có biểu hiện như bị kích động và hiện tượng tử vong do liệt cơ hô hấp có thể xảy ra trong vòng 2-24 giờ sau khi ăn. Tỉ lệ tử vong gây ra do độc tố PSP là khoảng 1-14%, có thể lên tới 20% nếu như không được cấp cứu kịp thời. Tuy nhiên, biện pháp chữa trị chỉ là hỗ trợ hô hấp, tăng cường sức chống chịu của người bệnh. 2.1.2 Phân loại học và công thức cấu tạo của độc tố PSP Độc tố PSP có bản chất là Saxitoxin và khoảng hơn 20 dẫn xuất - Các hợp chất này tan trong nước và hầu hết đều bền nhiệt (Baden et al. 1993). Saxitoxin và các dẫn xuất khác phong bế kênh Na+ của tế bào thần kinh, ngăn cản sự truyền xung thần kinh và do đó chúng gây ảnh hưởng đến cả hoạt động thần kinh và các phản ứng của hệ cơ (Baden et al. 1993). Công thức cấu tạo của độc tố PSP (Hình 2.1): 3 R4 H R1 N H H N NH2 H 2N N H N OH OH R2 R3 Hình 2.1: Công thức cấu tạo của độc tố PSP Tùy theo sự thay thế các gốc R1,R2,R3,R4 bởi các nhóm khác nhau ta sẽ có các hợp chất có trọng lượng phân tử và độc tính được trình bày trong Bảng 2.1. Bảng 2.1: Cấu tạo, trọng lượng phân tử và độc tính của PSP *Nguồn: Oshima (1995) 4 2.2 Nhuyễn thể hai mảnh vỏ và độc tố PSP 2.2.1 Nhuyễn thể hai mảnh vỏ Giới động vật Ngành mollusca (thân mềm) Lớp Bivalvia (Linnaeus, 1758) Cấu tạo: vỏ có 2 mảnh, khép mở được nhờ hệ thống cơ và bản lề. Cơ thể dẹp bên và có đối xứng hai bên. Đầu tiêu giảm, chân có dạng rìu nằm dưới chân thò ra ngoài vỏ khi di chuyển. Khoang áo nằm ở hai bên mang hình tấm. Hiện có khoảng 8.000 loài và 12.000 loài hóa thạch. Hầu hết sống trong các lớp bùn trầm tích ở sông, hồ và biển. chúng di chuyển chậm chạm hoặc sống bám , một số loài có khả năng bơi lội. Các loài thường gặp ở nước ngọt như Corbicula (hến), Sinanodonta (trai sông), ở biển như anadara granosa (sò huyết), Ostrea (hàu), Meretris (nghêu), Chloromytilus (vẹm xanh), Pteria (trai ngọc), Teredo (hà biển). 2.2.2 Mối liên hệ giữa PSP và thủy triều đỏ/tảo nở hoa (red tide) “Thủy triều đỏ” là sự sinh trưởng mạnh mẽ của các loài phù du nào đó gây ra làm đổi màu nước. Các loài này có thể sản sinh ra độc tố gây chết tôm, cá, thân mềm và con người ăn phải cũng bị ngộ độc và có thể bị tử vong. Hiện tượng nở hoa của tảo độc hại Harmful Algal Blooms là các sự kiện mà tại đó sự tăng mật độ của một hoặc một số loài tảo độc hại đạt tới mức có thể gây nguy hại tới các sinh vật khác. Người ta chia hiện tượng nở hoa của tảo độc hại thành một số loại sau: các loài không chứa độc tố nhưng khi nở hoa làm thay đổi màu nước; dưới những điều kiện đặc biệt chẳng hạn như trong các vịnh kín, tảo nở hoa có thể tăng đến mật độ rất cao làm chết cá và các động vật không xương sống có trong thủy vực đó do cạn kiệt oxy. Tiêu biểu trong nhóm này là các loài: Gonyaulax polygramma, Noctiluca scintillans (tảo giáp), Trichodesmium erythraeum (tảo lam).Các loài sản sinh ra các độc tố mạnh mà ta có thể phát hiện được thông qua chuỗi thức ăn tới con người, gây nên một loạt các chứng bệnh về thần kinh và tiêu hóa, chẳng hạn như: PSP (Paralytic Shellfish Poisoning) do các loài tảo giáp: Alexandrium acatenella, A. catenella, A. cohorticula, ... sản sinh ra. DSP (Diarrhetic Shellfish Poisoning) do các loài tảo giáp Dinophysis acuta, D. acuminata, D. fortii, D. norvergica, ... sản sinh ra. 5 ASP (Amnesic Shellfish Poisoning) do các loài tảo khuê Pseudonitzschia multiseries, P. pseudodelicatissima, P. australis, ... sản sinh ra. CFP (Ciguatera Fish Poisoning) do các loài tảo giáp chủ yếu sống đáy Gambierdiscus toxicus, Ostreopsis spp, Prorocentrum spp, ... sản sinh ra. NSP (Neurotoxic Shellfish Poisoning) do các loài Gymnodinium breve, Gymnodinium G. cf.breve (New Zealand), ... sản sinh ra. Các độc tố tảo lam do các loài tảo lam Anabaena circinalis, Mycrocystis aeruginosa, Nodularia spumigena, ... sản sinh ra. 2.2.3 Độc tố PSP trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ Nhiều loài vi tảo đã được khẳng định hoặc nghi ngờ là nguồn gốc sinh ra các độc tố. Hầu hết các loài vi tảo độc này sống trong môi trường biển và nước lợ, thuộc ngành tảo giáp, ngoài ra tảo si líc, tảo đỏ, tảo xanh lam và tảo roi bám cũng có thể chứa độc tố. Con đường chính mà độc tố vi tảo có thể gây ảnh hưởng cho con người và các sinh vật biển bậc cao khác (chim biển, thú biển…) là sự tích lũy trong nhuyễn thể (chủ yếu là các loài hai mảnh vỏ) và một số sinh vật khác như cua, cá ăn thực vật. Các sinh vật nhuyễn thể sử dụng các vi tảo (trong đó có thể có các loài vi tảo độc) như là nguồn thức ăn chính của chúng trong tự nhiên và tích lũy độc tố mà không hề có biểu hiện bệnh lý nào. Nhưng khi con người và các sinh vật bậc cao khác ăn phải những loài nhuyễn thể đã tích lũy một hàm lượng độc tố nhất định nào đó, sẽ có triệu chứng nhiễm độc và có thể dẫn đến tử vong. Hàm lượng độc tố tích lũy trong các loài nhuyễn thể cũng rất khác nhau, phụ thuộc vào khả năng tích lũy, lưu giữ và tốc độ đào thải của từng loài. Theo Bricilj & Shumway (1998) và Shumway (1994), tốc độ tích lũy độc tố của các loài nhuyễn thể ăn lọc có liên quan đến số lượng tế bào vi tảo thích hợp với chúng. Trong khi đó, tốc độ đào thải độc tố này lại phụ thuộc vào bộ phận mà chúng lưu giữ độc tố trong cơ thể. Ví dụ như độc tố được tích lũy trong hệ tiêu hóa (như ở giống vẹm Mytilus) sẽ được đào thải nhanh hơn độc tố lưu giữ trong các mô cơ (như ở các giống Placopecten, Spisula, Saxidomus). Trong các loài hai mảnh vỏ, vẹm (Mytilus spp., Modiolus spp., Perna spp…) được xem như là nhạy cảm nhất với độc tố PSP không chỉ ở khả năng tích lũy nhanh mà còn ở khả năng tự đào thải nhanh (trong khoảng 2 tuần) so với các loài khác. 6 2.2.4 Giới hạn cho phép của PSP trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ Quy định của các thị trường nhập khẩu (Canada, Mỹ, Châu Âu, Úc...) và Việt Nam quy định mức giới hạn an toàn của độc tố PSP là 80 μg STX eq/100g thịt HMV. 2.2.5 Một số trường hợp ngộ độc PSP ở Việt Nam và thế giới Ở Việt Nam, một số lần tảo độc hại nở hoa làm thiệt hại về kinh tế đã được ghi nhận: vào tháng 5, 6/1995 tảo Noctiluca scintillans nở hoa ở khu vực vịnh Văn Phong – Bến Gỏi thuộc vùng biển Khánh Hoà đã làm chết khoảng 20 tấn tôm hùm với thiệt hại ước tính khoảng 6 tỷ đồng (Nguyen Ngoc Lam et al., 1996). Về vấn đề an toàn thực phẩm đã có trường hợp 165 du khách (nhà hàng Trống Cơm TP Nha Trang tối 19/6/2006) phải nhập viện do ăn phải thực phẩm có độc tố PSP. Trên thế giới những tác hại do tảo độc hại nở hoa gây nên là rất lớn. Người ta đã thống kê được từ tháng 9/1988 đến tháng 3/1989 tại các vịnh Villareal, Carigara và vùng Samar (Philippin) đã có 45 người bị ngộ độc, trong đó có 6 người chết. ở vịnh Manila từ năm 1988 đến nay đã có 672 trường hợp bị ngộ độc, trong đó có 101 người chết. Năm 1989 ở vịnh False (Nam Phi) loài Gymnodinium sp. nở hoa đã làm chết khoảng 40 tấn bào ngư. ở Monte Hermosa (Achentina) từ ngày 11 đến ngày 17/11/1995 tảo độc nở hoa đã làm chết khoảng 45 triệu con ngao (Mesoderma macroides). Theo thống kê của Fukuyo (1992), các loài tảo độc hại nở hoa ở biển Seto Inland (Nhật Bản) đã gây nên những thiệt hại về kinh tế rất lớn; cụ thể là từ năm 1987 đến năm 1991 ở khu vực này đã xuất hiện 745 lần tảo nở hoa trong đó có 46 lần gây chết cá hàng loạt với tổng số thiệt hại là 4.452 triệu yên. Tại Mỹ hầu hết các trường hợp ngộ độc PSP gần đây đã xảy ra dọc theo bờ biển phía đông bắc Đại Tây Dương, phía tây bắc bờ biển Thái Bình Dương, hoặc Alaska.. Từ năm 1927, tổng số là 500 trường hợp ngộ độc PSP và 30 người tử vong đã được báo cáo tại California. Tháng 5/2002, 13 trường hợp ngộ độc saxitoxin (STX) đã được báo cáo tại Florida. Năm 2008 báo cáo thường niên của Hiệp hội Trung tâm Kiểm soát độc Mỹ dữ liệu cho thấy có 752 trường hợp ngộ độc, nhưng không có trường hợp nào tử vong. Một số trường hợp ngộ độc lẻ tẻ cũng đã được báo cáo ở Châu Âu, Châu Á, Châu Phi, và quần đảo Thái Bình Dương. Thủy triều đỏ và hậu quả của nó giết chết nhiều loài chim và động vật biển đã trở thành một mối 7 quan tâm rất lớn tại châu Âu, Đã có nhiều hội nghị diễn ra để tìm cách giải quyết vấn đề này. 2.3 Các phương pháp xác định hàm lượng độc tố gây liệt cơ (PSP) Hiện nay có nhiều phương pháp phân tích độc tố gây liệt cơ như: phương pháp thử sinh hóa trên chuột, phương pháp miễn dịch (ELISA), phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC/MS/MS)... Tuy nhiên, mỗi phương pháp đều có những ưu nhược điểm riêng dẫn đến việc sử dụng phương pháp LC-MS/MS cụ thể như sau: 2.3.1 Xác định PSP bằng phương pháp thử sinh hoá trên chuột PSP trong mẫu được chiết tách bằng dung dịch HCl 0.1N, 1ml dịch trích được tiêm vào chuột, quan sát biểu hiện của chuột trong vòng 60 phút và xác định thời gian chết của chuột. Dựa vào thời gian chết của chuột tra bảng Sommer sẽ xác định được giá trị đơn vị chuột (MU), từ đó tính được nồng độ độc tố PSP trong mẫu. + Ưu điểm: Nhanh, đơn giản, dễ làm, có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn, đầu tư ban đầu ít (về nhân lực, thiết bị, hóa chất, dụng cụ), đối với phân tích độc tố thì phương pháp sinh hóa trên chuột đang được chọn là một trong các phương pháp kiểm khẳng định.. + Nhược điểm: Đối với các loại độc tố có nhiều đồng phân thì không thể phân biệt được hàm lượng của từng loại độc tố (ví dụ DSP, PSP có nhiều hợp chất cùng nhóm). Ngoài ra, tại một số nước luật pháp không cho phép làm các thử nghiệm trên động vật. 2.3.2 Phương pháp HPLC với đầu dò huỳnh quang Mẫu được ly trích bằng dung dịch acid chlohydric 0.1N, sau đó được oxy hóa bằng hydro peroxide và periodic acid bởi hệ thống tạo dẫn xuất sau hoặc trước cột của thiết bị HPLC. Thành phần các chất thuộc nhóm PSP được phân tách trên cột C18 pha đảo bằng kỹ thuật ghép cặp ion (ion pair). + Ưu điểm: xác định được chính xác thành phần của PSP, độ nhạy cao. + Nhược điểm: Thời gian phân tích lâu, chi phí hóa chất sử dụng trong quá trình phân tích cao. Trong một số trường hợp không định danh và phân loại được các đồng phân của độc tố. 2.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) 8 Phương pháp dựa vào ái lực của các cấu tử giữa pha tĩnh (pha đảo hoặc pha nghịch) thường là chất rắn và pha động (lỏng) mà mỗi cấu tử sẽ được rửa giải ra khỏi cột theo thứ tự khác nhau. Cấu tử ra khỏi cột được đưa vào đầu dò MS và ở đây cấu tử được ion hóa, phân mảnh và được phát hiện dựa vào thông số m/z. Trên cơ sở này nên đầu dò MS có thể định danh và định lượng một cách rõ ràng, khẳng định về một hợp chất nào đó. Thường mẫu được ly trích bằng một dung môi hữu cơ hoặc đệm phosphat, loại béo bằng chiết lỏng-lỏng hoặc qua cột chiết pha rắn.. Sau đó, dịch chiết được làm sạch và được hòa tan trong dịch pha động tiêm vào hệ thống LC-MS. + Ưu điểm: Định danh và khẳng định được chính xác thành phần của độc tố PSP, thời gian phân tích nhanh, ít tốn kém hóa chất. + Nhược điểm: độ nhạy kém hơn pp HPLC/huỳnh quang, tuy nhiên vẫn phù hợp cho việc phân tích xác định hàm lượng PSP trong nhuyễn thể do giới hạn cho phép của PSP trong nhuyễn thể là 800 µg equ.STX/kg. 2.3.4 Phương pháp ELISA Phương pháp ELISA dựa trên cơ sở sử dụng một thể tiếp hợp chứa kháng thể đặc hiệu với một kháng nguyên và được gắn với một enzyme nhất định. Hoạt tính của kháng nguyên (hoặc của kháng thể) và của enzyme khi liên kết với nhau trong thể tiếp hợp đều không chịu sự thay đổi đáng kể. Enzyme liên kết trong thể tiếp hợp có tác dụng xúc tác một phản ứng hóa học sinh ra một sản phẩm có màu từ cơ chất không màu. Sản phẩm có màu được định lượng bằng quang phổ kế hay khúc xạ kế. + Ưu điểm: Dễ thực hiện, chi phí thiết bị khá rẻ và thời gian phân tích ngắn. + Nhược điểm: chi phí mua kit thử đắt, phương pháp sàng lọc, không có khả năng định danh và phân loại các thành phần của độc tố PSP. Do đó, khi phát hiện mẫu thử dương tính phải dùng phương pháp sắc ký để kiểm tra. 2.3.5 Phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC-MS/MS) Mẫu được ly trích bằng dung dịch acid acetic 0,03M sau đó được tiêm vào thiết bị LC-MS/MS. Thành phần các chất thuộc nhóm PSP được phân tách trên cột Hilic (Hydrophilic interaction chromatography). + Ưu điểm: Phương pháp có tính chọn lọc rất cao và rất nhạy. Giới hạn phát hiện nằm trong vùng ppb. Đường chuẩn tuyến tính dài, rất tốt khi định lượng. Phương pháp rất phù hợp dùng để phân tích khẳng định dư lượng PSP 9 trong thủy sản và sản phẩm thủy sản, đặc biệt có thể dễ dàng ứng dụng phân tích các mẫu có nền phức tạp. + Nhược điểm: Thiết bị đắt tiền, đòi hỏi kỹ năng phân tích cao. Với những ưu nhược điểm của các phương pháp trên đối với PSP , thì việc sử dụng phương pháp LC-MS/MS để phân tích PSP là cần thiết vì nó đáp ứng đủ yêu cầu đề ra của các tiêu chuẩn quốc tế cũng như yêu cầu trong nước. 2.4 Sắc kí lỏng hai lần khối phổ LC-MS/MS 2.4.1 Giới thiệu về sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ Sắc ký lỏng là một trong những kỹ thuật phân tích dụng cụ liên quan đến quá trình tách các chất khác nhau trong cùng một mẫu ra khỏi nhau. Kỹ thuật này cho phép người phân tích nhận danh và định lượng từng cấu tử trong mẫu thông qua các dung dịch chuẩn và phổ đồ tương ứng của chúng. 2.4.2 Nguyên tắc hoạt động của LC-MS/MS Hệ thống LC-MS/MS (của hãng Waters) gồm 7 thành phần cơ bản sau: + Hệ thống bơm (Pump system) + Hệ thống tiêm mẫu (Injection system) + Buồng cột (Column ovent - điều chỉnh nhiệt độ cột) + Cột sắc ký (pha tĩnh – stationary phase) + Pha động (mobile phase – (hỗn hợp) dung môi) + Đầu dò khối phổ (Detector) + Hệ thống xử lý dữ liệu Hình 2.2: Hệ thống LC-MS/MS 10 2.4.2.1 Hệ thống bơm Đặc điểm và yêu cầu của một hệ thống bơm cao áp: Áp suất có thể đạt đến 400 bar, có thể điều chỉnh tốc độ dòng trong khoảng 0,05 – 10 ml/min, thể tích chết nhỏ, trơ với dung môi của pha động, có thể trộn 2 hay nhiều dung môi với nhau 2.4.2.2 Hệ thống tiêm mẫu Có tác dụng tiêm mẫu, tự động tắt khi áp suất cao, có thể bơm tuần hoàn mẫu. 2.4.2.3 Buồng cột Dùng để ổn định nhiệt độ cột và dung môi qua cột trong quá trình phân tích. 2.4.2.4 Cột sắc ký Là 1 loại cột đặc biệt được nhồi đầy bằng các hạt nhồi (pha tĩnh), kích thước cột: Dài (L): 5-30cm, đường kính trong: 2-5mm, kích cỡ hạt: 3, 5, 10µm. Có 2 loại cột thường dùng trong sắc ký lỏng đó là cột pha đảo và cột pha thuận. Cột sắc ký lỏng pha đảo (Reversed Phase Liquid Chromatography - RPLC): Pha tĩnh gồm các phân tử silic dioxyt (silica) có gắn các nhóm chức không phân cực và các nhóm silanol. Các chất phân tích có ái lực khác nhau với nhóm chức không phân cực: Chất không phân cực: phần lớn dùng cột C18 Chất phân cực: một số dùng cột C18 Chất phân cực: Đa số dùng cột C8 Hình 2.3: Pha tĩnh của cột sắc ký pha đảo. Cột sắc ký lỏng pha thuận (Normal Phase Liquid Chromatography - NPLC) 11