Tài liệu ứng dụng phương pháp mặt đáp ứng để tối ưu quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme alcalase.

i LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành tốt đề tài khóa luận tốt nghiệp, ngoài nỗ lực của bản thân còn có sự giúp đỡ tận tình của những người đi trước, em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến những người đã giúp đỡ em trong suốt thời gian qua, nhất là thời gian 3 tháng thực tập trên phòng thí nghiệm. Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.Ts Ngô Đăng Nghĩa, cô Th.S Ngô Thị Hoài Dương đã luôn bên em, trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu để em có thể từng bước hoàn thành tốt đề tài. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn các thầy cô trong trường, nhất là các thầy cô trong khoa công nghệ thực phẩm, bộ môn công nghệ chế biến đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt kiến thức trong suốt thời gian em theo học tại nhà trường. Em xin chân thành cảm ơn đến các thầy, cô phụ trách phòng thí nghiệm Hóa sinh – vi sinh thực phẩm, cùng thầy cô bộ môn quản lý chất lượng và an toàn thực phẩm, bộ môn công nghệ lạnh, các anh chị trung tâm công nghệ sinh học và Trung tâm ứng dụng công nghệ chế biến trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian thực tập. Em chân thành cảm ơn chị Ngọc Hoài sinh viên cao học thạc sĩ, các bạn sinh viên lớp 50CBTS, cùng toàn thể các bạn sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ động viên em. Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố, mẹ kính mến cùng anh chị em thân yêu, những người đã ủng hộ nhiệt tình cả vật chất lẫn tinh thần trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Nha Trang, ngày 10 tháng 07 năm 2012 Sinh viên Nguyễn Hồng Anh Diễm ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ..........................................................................................................i MỤC LỤC ..............................................................................................................ii DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... v DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................vi DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ...............................................................................viii LỜI MỞ ĐẦU .........................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ...................................................................................3 1.1. Khái quát về phế liệu tôm.............................................................................3 1.1.1. Tình hình nuôi trồng, chế biến và xuất khẩu tôm Việt Nam....................3 1.1.2. Sản lượng phế liệu tôm trong chế biến thủy sản .....................................4 1.1.3. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của phế liệu tôm ...................5 1.1.3.1. Thành phần hóa học của phế liệu tôm ..............................................5 1.1.4. Các hướng tận dụng phế liệu tôm ...........................................................6 1.1.4.1. Sản xuất thức ăn chăn nuôi...............................................................7 1.1.4.2. Sản xuất chitin – chitosan và các dẫn xuất khác của chitin................7 1.1.4.3. Sản xuất màu Astaxanthin ................................................................8 1.1.4.4. Làm các sản phẩm định hình ............................................................8 1.1.4.5. Sản phẩm súp và canh, mắm tôm và gia vị .......................................8 1.2. Enzyme protease và quá trình thủy phân protein...........................................8 1.2.1. Enzyme protease ...................................................................................8 1.2.1.1. Phân loại protease ............................................................................9 1.2.1.2. Nguồn thu nhận protease ................................................................ 10 1.2.1.3. Cơ chế tác dụng của protease ......................................................... 10 1.2.1.4. Hoạt độ enzyme ............................................................................. 11 1.2.1.5. Enzyme Alcalase ............................................................................ 12 1.2.1.6. Hệ enzyme protease của tôm .......................................................... 12 iii 1.2.2. Quá trình thủy phân protein bằng enzyme protease .............................. 14 1.2.2.1. Protein thủy phân .......................................................................... 14 1.2.2.2. Phương pháp sản xuất protein thủy phân ....................................... 16 1.2.2.3. Giá trị dinh dưỡng và hoạt tính sinh học của dịch thủy phân protein ....................................................................................................... 16 1.2.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein .................. 17 1.3. Giới thiệu về phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) .................................... 19 1.3.1. Nguyên tắc .......................................................................................... 20 1.3.2. Công dụng của RMS ........................................................................... 21 1.3.3. Ưu, nhược điểm của RMS ................................................................... 22 1.3.4. Các mô hình thí nghiệm trong RMS ..................................................... 22 1.3.4.1. Thiết kế Box-Behnken (BBD) ....................................................... 22 1.3.4.2. Thiết kế Central composit (CCD) .................................................. 23 1.4. Các nghiên cứu và ứng dụng nguyên liệu còn lại từ nguyên liệu tôm.......... 25 1.4.1. Trên thế giới......................................................................................... 25 1.4.2. Ở Việt Nam.......................................................................................... 27 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................... 28 2.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................. 28 2.1.1. Nguyên liệu đầu tôm ............................................................................ 28 2.1.2. Enzyme Alcalase.................................................................................. 28 2.1.3. Hóa chất............................................................................................... 28 2.2. Phương pháp nghiên cứu và xử lý số liệu ................................................... 28 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 28 2.2.1.1. Phương pháp thu nhận mẫu ............................................................ 28 2.2.1.2. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu ................................................ 29 2.3. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM .............................................................................. 30 2.3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ......................................................... 30 2.3.2. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt cho nguyên liệu trước khi thủy phân và việc bổ sung enzyme đến sự thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng ........................................................ 31 iv 2.3.3. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng ................................................ 33 2.3.4. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân protein bằng enzyme Alcalase trên đầu tôm thẻ chân trắng ................................................. 34 2.3.5. Bố trí thí nghiệm đặc trưng tính chất của dịch thủy phân protein thu được..... 37 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................ 39 3.1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme Alcalase đến khả năng thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng............................ 39 3.1.1. Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến hàm lượng protein hòa tan trong dịch thủy phân protein thu được.......................... 39 3.1.2. Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân protein thu được................................ 41 3.1.3. Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến hiệu suất khử protein còn lại trên bã....................................................................... 43 3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng .................................................................... 44 3.2.1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến hàm lượng protein hòa tan của dịch thủy phân ............................................................................. 44 3.2.2. Ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân ....................................................................................................... 50 3.3. Kết quả tối ưu hóa quá trình thủy phân protein bằng enzyme Alcalase trên đầu tôm thẻ chân trắng ................................................................................ 56 3.4. Kết quả đặc trưng tính chất dịch thủy phân protein thu được ...................... 70 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN............................................... 73 4.1. Kết luận...................................................................................................... 73 4.2. Đề xuất ý kiến ............................................................................................ 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 74 PHỤ LỤC................................................................................................................1 v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm Penaeus vannamei ............. 6 Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm cho các giá trị ở biên............................................. 33 Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm ở tâm phương án................................................... 34 Bảng 2.4. Mức thí nghiệm của các yếu tố cho thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên đầu tôm .............................................................................. 35 Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên đầu tôm theo RMS-CCD .............................................................................................. 36 Bảng 3.1. Bảng Effect list cho hàm mục tiêu hàm lượng protein hòa tan ............... 44 Bảng 3.2. Bảng Effect list cho hàm mục tiêu nồng độ DPPH bị khử ...................... 50 Bảng 3.4. Kết quả ma trận quy hoạch thực nghiệm theo RMS-CCD ...................... 57 Bảng 3.5. Bảng FIT SUMMARY đối với hàm mục tiêu hàm lượng protein hòa tan ........ 58 Bảng 3.6. Bảng FIT SUMMARY đối với hàm mục tiêu nồng độ DPPH bị khử. .... 58 Bảng 3.7. Bảng FIT SUMMARY đối với hàm mục tiêu hiệu suất khử protein còn lại trên bã........................................................................................................ 58 Bảng 3.8. Kết quả phân tích ANOVA.................................................................... 59 Bảng 3.9. Bảng tổng hợp các tiêu chí lựa chọn chế độ xử lý tối ưu cho quá trình thủy phân protein trên đầu tôm. ..................................................................... 67 Bảng 3.10. Nhận xét cảm quan dịch thủy phân protein từ đầu tôm......................... 70 Bảng 3.11. Một số chỉ tiêu sinh hóa học của dịch thủy phân protein từ đầu tôm .... 71 Bảng 3.12. Thành phần % các axit béo .................................................................. 71 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Phản ứng thủy phân xúc tác bởi protease................................................ 11 Hình 1.2. Phản ứng thủy phân protein.................................................................... 14 Hình 1.3. Sơ đồ chức năng chuyển đổi .................................................................. 20 Hình 1.4. Biểu diễn hình thức của chức năng đáp ứng ........................................... 21 Hình 1.5. Thiết kế Box-Behnken ........................................................................... 23 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ........................................................... 30 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và xử lý enzyme đến sự thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng......... 32 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đặc trưng tính chất dịch thủy phân protein......... 37 Hình 3.1. Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến hàm lượng protein hòa tan trong dịch thủy phân protein thu được ................................. 39 Hình 3.2. Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân protein thu được....................................... 41 Hình 3.3. Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến hiệu suất khử protein còn lại trên bã.............................................................................. 43 Hình 3.4. Đồ thị đánh giá mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng protein hòa tan của dịch thủy phân......................................................................... 45 Hình 3.5. Đồ thị ảnh hưởng của yếu tố nồng độ enzyme, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân đến hàm lượng protein hòa tan................................................ 47 Hình 3.6. Đồ thị ảnh hưởng của tương tác giữa hai yếu tố nồng độ enzyme và nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng protein hòa tan................................................. 48 Hình 3.7. Đồ thị ảnh hưởng của tương tác giữa hai yếu tố nồng độ enzyme và thời gian thủy phân đến hàm lượng protein hòa tan ............................................... 49 Hình 3.8. Đồ thị đánh giá mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân.......................................................................... 51 vii Hình 3.9. Đồ thị ảnh hưởng của yếu tố nồng độ enzymem, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân. ................... 53 Hình 3.10. Đồ thị ảnh hưởng của tương tác giữa hai yếu tố nồng độ enzyme và thời gian thủy phân đến nồng độ DPPH bị khử ...................................................... 54 Hình 3.11. Đồ thị ảnh hưởng của tương tác giữa hai yếu tố nhiệt độ và thời gian thủy phân đến nồng độ DPPH bị khử của dịch thủy phân............................... 55 Hình 3.16. Đồ thị của hàm lượng protein hòa tan , nồng độ DPPH bị khử và hiệu suất khử protein còn lại ................................................................................. 62 Hình 3.17. Đồ thị ei vs Run của hàm lượng protein hòa tan, nồng độ DPPH bị khử và hiệu suất khử protein còn lại ...................................................................... 63 Hình 3.18. Biểu đồ Contour và 3D-surface cho hàm mục tiêu hàm lượng protein hòa tan....................................................................................................... 69 Hình 3.19. Biểu đồ Contour cho hàm mục tiêu nồng độ DPPH bị khử .................. 69 Hình 3.20. Biểu đồ Contour và 3D-surface cho hàm mục tiêu hiệu suất khử protein còn lại trên bã. ........................................................................................... 70 Hình 3.21. Đồ thị biểu diễn thành phần % của các axit amin có trong dịch thủy phân tối ưu. ........................................................................................................... 72 viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT NL : Nguyên liệu XL : Xử lý đv : Đơn vị TLK : Trọng lượng khô DH : Độ thủy phân TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam E : Enzyme S : Cơ chất DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl TN : Thí nghiệm RMS : Phương pháp bề mặt đáp ứng BSA : Bovine serum albumin Da : Dalton (Đơn vị khối lượng phân tử peptid) 1 LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay ở nước ta ngành chế biến thủy sản đã trở thành một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của đất nước, chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Trong đó, mặt hàng tôm được coi là một trong các mặt hàng xuất khẩu thủy sản chủ lực có mức tăng trưởng khá cao. Với sự phát triển ngày càng cao của khoa học công nghệ, bên cạnh các sản phẩm chính, nguyên liệu còn lại bao gồm đầu và vỏ tôm cũng đã và đang được tận dụng một cách tối đa và hiệu quả như sản xuất bột đạm, thức ăn chăn nuôi, tách chiết astaxanthin, sản xuất chitin-chitosan... Điều này đã góp phần to lớn trong việc xử lý ô nhiễm môi trường, nâng cao giá trị cho ngành thủy sản và tạo thêm nhiều công ăn việc làm, thu nhập cho người dân. Trong phế liệu đầu tôm có chứa tới 50% hàm lượng protein [4] với đủ các thành phần axit amin không thay thế và có giá trị cao về mặt sinh học. Vì thế việc nghiên cứu quá trình thủy phân protein từ đầu tôm này là hết sức cần thiết. Một số nghiên cứu về quá trình thủy phân protein trên đầu tôm đã được quan tâm thực hiện ở nước ta nhưng phương pháp bố trí thí nghiệm được sử dụng chủ yếu là phương pháp cổ điển, vì thế chưa đánh giá được đầy đủ tác động của các yếu tố ảnh hưởng. Nghiên cứu của nhiều tác giả trên thế giới đã chỉ ra rằng quá trình thủy phân protein trên đầu tôm là một quá trình chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nồng độ enzyme, nhiệt độ và thời gian thủy phân… (Diniz and Martin 1997a; Deng et al. 2002). Vì vậy để có thể hiểu rõ các yếu tố ảnh hưởng và sự tương tác qua lại của chúng cần sử dụng các công cụ toán học hiện đại để hỗ trợ. Box và Wilson đã giới thiệu phương pháp bề mặt đáp ứng (RMS), một công cụ hết sức hiệu quả cho phép nghiên cứu tối ưu các quá trình thủy phân. Trước tình hình đó, dưới sự hướng dẫn của thầy PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa và cô Th.S Ngô Thị Hoài Dương, em đã thực hiện đề tài “Ứng dụng phương pháp mặt đáp ứng để tối ưu quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Alcalase”. 2 2. Mục đích của đề tài  Xác lập chế độ thủy phân protein tối ưu trên đầu tôm thẻ chân trắng với Alcalase bằng phương pháp bề mặt đáp ứng để thu hồi đồng thời protein và chitin.  Đặc trưng tính chất của dịch thuỷ phân. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Kết quả của đề tài sẽ là dữ liệu khoa học về sử dụng enzyme trong thu hồi sản phẩm hữu ích từ nguyên liệu còn lại trong quá trình chế biến tôm, đồng thời cho phép tối ưu hoá quá trình sản xuất ở qui mô pilot. 4. Nội dung đề tài  Đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt cho nguyên liệu trước khi thuỷ phân và việc bổ sung enzyme Alcalase đến khả năng thủy phân protein trên đầu tôm.  Đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm.  Sử dụng phương pháp mặt đáp ứng để tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Alcalase.  Đặc trưng hóa tính chất sinh học và dinh dưỡng của dịch thủy phân. 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Khái quát về phế liệu tôm 1.1.1. Tình hình nuôi trồng, chế biến và xuất khẩu tôm Việt Nam Bờ biển Việt Nam dài 3.444 km với vùng đặc quyền kinh tế 1.000.000 km2 rất thuận lợi để phát triển ngành nuôi trồng và đánh bắt thủy hải sản. Theo số liệu thống kê của Tổng cục Thủy sản, tổng diện tích nuôi tôm cả nước đã tăng từ 327.194 ha năm 2005 đến 381.728 ha năm 2008. Năm 2011, diện tích nuôi tôm cả nước đạt 656.425 ha tôm, sản lượng đạt 495.657 tấn, tăng 2,71% về diện tích và 5,48% về sản lượng so với năm 2010. Trong đó, diện tích nuôi tôm sú là 623.377 ha, đạt sản lượng 319.206 tấn, tôm thẻ chân trắng là 33.049 ha, sản lượng đạt 176.451 tấn [18]. Đồng bằng Sông Cửu Long vẫn là vùng nuôi tôm trọng điểm của cả nước với diện tích 602.416 ha (bằng 91,8% diện tích cả nước), trong đó diện tích tôm sú là 588.419 ha, tôm thẻ chân trắng là 18.998 ha. Sản lượng thu hoạch đạt 368.983 tấn, bằng 74,4% sản lượng của cả nước, trong đó, tôm sú là 296.958 tấn, tôm thẻ chân trắng là 71.025 tấn. Cà Mau là tỉnh có diện tích nuôi tôm lớn nhất với 266.600 ha [18]. Theo như báo cáo, phương pháp nuôi tôm phổ biến hiện nay là theo phương pháp thâm canh, bán thâm canh và nhiều địa phương đã tiến hành nuôi tôm theo phương pháp quảng canh cải tiến nhằm nâng cao năng suất và thân thiện hơn với môi trường [19]. Xuất khẩu tôm của Việt Nam tăng trưởng liên tục hằng năm. Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), tính trung bình trong đầu những năm 2000, sản lượng tôm đông lạnh xuất khẩu hằng năm đạt khoảng 150.000 tấn, trị giá gần 1tỷ USD. Trong 6 tháng đầu năm 2011, cả nước đã xuất khẩu 101.872 tấn tôm, trị giá 971,109 triệu USD, tăng 16,9% về khối lượng và 35,2% về giá trị so với cùng kỳ năm 2010 và là nhóm hàng có mức tăng trưởng cao nhất trong các nhóm hàng thủy sản xuất khẩu chủ lực của Việt Nam. Tính đến tháng 12/2011, xuất khẩu tôm của Việt Nam đã thu về gần 2,4 tỷ USD, tăng 13,7% so với cùng kỳ 4 năm 2010. Trong đó, tôm sú đạt hơn 1,4 tỷ USD và tôm chân trắng đạt hơn 700 triệu USD [15]. Tôm của Việt Nam đã có mặt trên 70 thị trường ở khắp các châu lục trên thế giới. Có hơn 50 mặt hàng tôm đông lạnh xuất khẩu, được chế biến dưới nhiều dạng sản phẩm khác nhau như tươi sống, đông lạnh, các sản phẩm chế biến sẵn, chế biến ăn liền, các sản phẩm phối chế, các sản phẩm khô, đóng hộp, làm lên mem chua...[20] Theo Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (FAO), từ nay đến năm 2015, tiêu thụ thủy sản tính theo đầu người trên toàn cầu sẽ tăng trưởng khoảng 0,8%/năm, tổng nhu cầu thủy sản và các sản phẩm thủy sản sẽ tăng khoảng 2,1%/năm. Như vậy, có thể thấy, nhu cầu thủy sản thế giới năm 2012 sẽ tiếp tục tăng so với năm nay, đó là một điều kiện thuận lợi để các doanh nghiệp thủy sản Việt Nam tiếp tục đẩy mạnh xuất khẩu trong năm tới, nhất là với các thủy sản nuôi trồng như tôm, cá tra ... 1.1.2. Sản lượng phế liệu tôm trong chế biến thủy sản Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông lạnh giáp xác chiếm từ 70 – 80% công suất chế biến. Hằng năm, các nhà máy chế biến đã thải bỏ một lượng phế liệu giáp xác khá lớn, khoảng 70.000 tấn, riêng ở tỉnh Khánh Hòa lượng phế liệu này vào khoảng 2.300 tấn/năm [21], trong đó chủ yếu là phế liệu tôm. Phế liệu tôm là những thành phần còn lại từ quá trình sản xuất các sản phẩm tôm đông lạnh xuất khẩu bao gồm đầu, vỏ và đuôi tôm. Ngoài ra, còn có tôm gãy thân, tôm lột vỏ sai quy cách hoặc tôm bị biến màu. Tùy thuộc vào loài và các biện pháp xử lý mà lượng phế liệu có thể vượt quá 60% khối lượng sản phẩm [1]. Phần lớn tôm được đưa vào chế biến dưới dạng đã bóc vỏ, bỏ đầu. Phần đầu thường chiếm 34 ÷ 35%, phần vỏ, đuôi và chân chiếm 10 ÷ 15% trọng lượng của tôm nguyên liệu. Tuy nhiên, tỷ lệ này tùy thuộc vào giống loài, giai đoạn sinh trưởng của chúng. Đối với tôm thẻ, lượng phế liệu đầu tôm chiếm khoảng 28%, vỏ chiếm 9% trọng lượng tôm [6]. Như vậy, tổng lượng phế liệu vỏ đầu tôm thẻ là 37%. 5 Với sản lượng tôm nguyên liệu ngày một gia tăng như hiện nay, lượng phế liệu tôm do các nhà máy chế biến thủy sản thải ra là không hề nhỏ. Đây sẽ là nguồn cung cấp nguyên liệu khá dồi dào cho các ngành công nghiệp tận dụng nguồn phế liệu thủy sản để sản xuất ra các sản phẩm có giá trị khác. 1.1.3. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của phế liệu tôm 1.1.3.1. Thành phần hóa học của phế liệu tôm [1] Thành phần chiếm tỷ lệ đáng kể trong đầu tôm là protein, chitin, canxi cacbonate, khoáng, sắc tố [3]…trong đó hàm lượng protein chiếm gần tới 50% [4]. Tỷ lệ các thành phần này không ổn định, chúng thay đổi theo giống, loài, đặc điểm sinh thái, sinh lý… Thành phần chitin và protein trong vỏ tôm thay đổi rất rộng phụ thuộc vào loài, trạng thái dinh dưỡng, chu kỳ sinh sản…của tôm. - Protein Protein trong phế liệu tôm thường là loại protein không hòa tan, do đó khó tách ra khỏi vỏ, tồn tại dưới dạng tự do và dạng phức tạp. + Protein ở dạng tự do thường tồn tại trong cơ quan nội tạng và trong các cơ gắn phần vỏ tôm. Ở phế liệu tôm thì dạng này có nhiều ở phần đầu tôm, đó là phần thịt đầu còn sót lại [2]. + Protein ở dạng phức tạp liên kết với chitin, CaCO3 như một thành phần thống nhất của vỏ tôm. Đặc biệt là phức hợp protein – astaxanthin trong vỏ tôm được gọi là hợp chất cartenoprotein, hợp chất này vừa có giá trị dinh dưỡng rất lớn vừa có những đặc tính sinh học quý của astaxanthin [2]. - Enzyme Trong đầu tôm chứa một lượng không nhỏ enzyme nội tại, đó là enzyme protease. Nó tồn tại trong nội tạng nên chủ yếu nằm trong đầu tôm. Hoạt độ enzyme protease của đầu tôm khoảng 6,5 đv hoạt độ/g tươi. Ngoài ra còn có enzyme alkaline phosphatease, chitinase, -N-acetyl glucosamidase, lipaza, tyrozinaza. - Chitin Tồn tại dưới dạng liên kết với protein, khoáng và những hợp chất hữu cơ khác. 6 - Khoáng Trong đầu tôm chứa một lượng muối vô cơ, chủ yếu là canxi cacbonat. - Sắc tố Sắc tố trong đầu tôm cũng như vỏ tôm chủ yếu là astaxanthin. Chất này kết hợp với protein một cách chặt chẽ. Nhờ kiên kết này mà thành phần astaxanthin trong vỏ được bảo vệ, khi liên kết này bị phá vỡ thì astaxanthin dễ dàng tách ra và bị oxi hóa thành Astaxin. - Chất ngấm ra ở đầu tôm Trymethylamin (TMA), trymethylamin N oxide (TMAO), betain, bazo purin, các axid amin tự do, urê... - Ngoài ra còn có một lượng đáng kể lipid, một lượng nhỏ photpho. Bảng 1.1. Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm Penaeus vannamei (Trung và cộng sự, 2007) [4] Chỉ tiêu phân tích Giá trị Hàm lượng khoáng (%) 24,6 ± 0,8 Hàm lượng chitin (%) 18,3 ± 0,9 Hàm lượng protein (%) 47,4 ± 1,8 Hàm lượng lipid (%) 4,7 ± 0,3 Hàm lượng astaxanthin (%) 130 ± 13,9 Như vậy, phế liệu tôm nhất là đầu tôm là nguồn giàu chitin, protein, giàu chất dinh dưỡng và nguồn enzyme. Từ kết nghiên cứu cho thấy, hàm lượng protein trong phế liệu rất lớn. Protein tôm là protein hoàn hảo. Vì vậy việc tận thu protein này là cần thiết. 1.1.4. Các hướng tận dụng phế liệu tôm Phế liệu tôm từ các khâu chế biến cần được thu hồi và bảo quản thích hợp. Do thành phần và tiềm năng sử dụng của các thành phần phế liệu như đầu, vỏ… là khác nhau nên cần phải thu gom riêng để dễ dàng cho việc tận dụng sản xuất các chế phẩm khác. Một số hướng tận dụng phế liệu tôm: 7 1.1.4.1. Sản xuất thức ăn chăn nuôi Hiện nay ở nước ta đa số sử dụng phế liệu của tôm đông lạnh để sản xuất thức ăn chăn nuôi. Rất nhiều thức ăn chăn nuôi bán chạy hiện nay có chứa bột tôm và nó chiếm 30% thành phần thức ăn. Bột tôm được chế biến tốt có chứa axit amin tương tự như amin trong đậu tương hay trong bột cá. Phế liệu tôm có chất lượng càng cao thì bột tôm có chất lượng càng cao. Do vậy việc xử lý và chế biến phế liệu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc sản xuất bột tôm có chất lượng cao. Nếu công nghệ chế biến không phù hợp thì nó cũng ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng của sản phẩm do các chất béo và axit béo thiết yếu sẽ bị ảnh hưởng. Hiện nay có 2 phương pháp được áp dụng phổ biến trong sản xuất bột tôm là phương pháp sấy khô và phương pháp ủ xi lô: - Phương pháp sấy khô bằng nhiệt Phương pháp có ưu điểm là đơn giản, có thể chế biến nhanh lượng phế liệu tôm đông lạnh, tính kinh tế cao. Nhược điểm là chất lượng kém, giá trị dinh dưỡng không cao. - Phương pháp ủ xi lô Ở phương pháp này người ta sử dụng axit hữu cơ và vô cơ trong việc ủ nhằm tăng tác động của enzyme khử trùng và hạn chế sự phát triển của vi sinh vật. Sau khi ủ tiến hành trung tính bằng các chất kiềm, chất ủ được làm thức ăn chăn nuôi. Phương pháp này có ưu điểm là chất lượng tốt nhưng giá thành cao và phức tạp. 1.1.4.2. Sản xuất chitin – chitosan và các dẫn xuất khác của chitin Trong thành phần của vỏ, đầu tôm có chứa một lượng lớn chitin, vì vậy có thể sử dụng để sản xuất chitin-chitosan, sản xuất chitin-chitosan bao gồm các bước: tách khoáng, tách protein, deacetyl bằng nồng độ cao. Sản phẩm chitin đem đi thủy phân bằng NaOH đậm đặc thu chitosan hoặc thủy phân bằng HCl đặc để thu glucosamine, chúng được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, nông nghiệp, mỹ phẩm, xây dựng…đặc biệt là trong y học. 8 1.1.4.3. Sản xuất màu Astaxanthin Trong phần vỏ của phế liệu cũng chứa sắc tố astaxanthin, tuy nó có hàm lượng nhỏ nhưng giá thành lại cao trên thị trường (2500 USD/kg). Astaxanthin còn là một carotenoid có tác dụng kích thích tăng trưởng, kháng một số bệnh. Nó là chất tạo màu nên được sử dụng trong kỹ thuật nuôi trồng thủy sản, thực phẩm, công nghiệp. Vì hiện nay vấn đề tận dụng Astaxanthin trong công nghiệp chế biến phế liệu tôm là vấn đề đang được nhiều nước quan tâm. 1.1.4.4. Làm các sản phẩm định hình Thịt tôm vụn hoặc không đạt tiêu chuẩn có thể được chế biến thành các sản phẩm định hình như tạo thành hình con tôm hay các hình dạng trang trí như bánh tròn, viên, khoanh tôm. Bằng cách tạo ra các hình dạng khác nhau, tẩm ướp tẩm gia vị hay bao bột, người ta có thể làm ra rất nhiều sản phẩm tôm đẹp mắt. Các sản phẩm này thường được làm chín trong các lò vi sóng. 1.1.4.5. Sản phẩm súp và canh, mắm tôm và gia vị Ngoài ra từ phế liệu tôm có thể tận dụng để chế biến thành nhiều sản phẩm khác như đầu tôm sau khi được loại bỏ vỏ có thể chế biến thành mắm tôm và gia vị, nó cũng được tận dụng làm nguyên liệu tạo mùi cho món súp tôm đặc, tôm vụn được dùng làm món canh tôm. 1.2. Enzyme protease và quá trình thủy phân protein 1.2.1. Enzyme protease [5] Protease là enzyme xúc tác thủy phân liên kết peptid (-CO ~ NH-) trong phân tử polypeptide, protein và các cơ chất tương tự thành các amino acid tự do hoặc các peptid phân tử thấp [24]. Hiệu suất xúc tác của nó có thể gấp hàng trăm, hàng ngàn hoặc hàng triệu lần so với các chất xúc tác vô cơ khác. Quan trọng hơn nữa là nó có khả năng xúc tác cho phản ứng hóa học xảy ra trong điều kiện nhẹ nhàng, nhiệt độ và áp suất bình thường, pH môi trường gần như pH sinh lý và có khả năng xúc tác đặc hiệu cao đối với kiểu phản ứng cũng như cơ chất mà nó tác dụng, sản phẩm tạo ra tinh khiết, ít tạp chất. 9 1.2.1.1. Phân loại protease: có thể căn cứ vào các tiêu chí sau [5]: - Cơ chế phản ứng của enzyme tham gia. - pH tối thích cho hoạt động của enzyme như protease acid, protease kiềm, protease trung tính. - Nguồn thu các enzyme protease. - Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme.  Theo phân loại quốc tế các enzyme protease được chia thành 4 nhóm phụ:  Aminopeptidase: Enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptid ở đầu nitơ của mạch polypeptide.  Cacboxypeptidase: Xúc tác sự thủy phân liên kết peptid ở đầu cacbon của mạch polypeptide.  Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các dipeptid.  Proteinaza: Xúc tác sự thủy phân liên kết peptid nối mạch.  Theo Barett và Donald (1956), protease được phân ra thành 2 nhóm lớn là:  Endopeptidase: Là các enzyme phân giải các liên kết nằm trong mạch polypeptide. Chúng là những enzyme được sử dụng nhiều nhất để thủy phân protein cho tính đặc hiệu rộng hơn. - Phân nhóm 1: Proteinase – serin là những protease mà trong trung tâm hoạt động của nó có nhóm (- OH) của axit amin serin. Phân nhóm này gồm các enzyme như: Trypsin, Chymotrypsin. - Phân nhóm 2: Proteinase – xistein là protease mà trong trung tâm hoạt động của nó có nhóm Thiol (-SH) của axit amin xistein. Nhóm này gồm các enzyme Cathepsin. - Phân nhóm 3: Proteinase – aspartic là những protease mà trong trung tâm hoạt động của nó có nhóm cacboxyl (-COOH) của aspartic như enzyme Pepsin. - Phân nhóm 4: Protease – kim loại. Đây là những protease mà trong trung tâm hoạt động của nó có ion kim loại. Enzyme này hoạt động trong môi truờng trung tính. Ví dụ như Collagenase. 10  Exopeptidase (peptidase): Là các enzyme không có khả năng thủy phân liên kết peptid ngoài cùng của chuỗi polypeptide hoặc đầu amin, hoặc đầu cacboxyl để lần lượt giải phóng ra các axit amin tự do ra khỏi chuỗi polypeptide. Vì vậy, chúng còn được gọi là aminopeptidase hoặc cacboxypeptidase. Ngoài ra, những exopeptidase còn có thể liên kết với các endopeptidase để thực hiện một sự thủy phân phức tạp hơn. 1.2.1.2. Nguồn thu nhận protease: chủ yếu từ 3 nguồn cơ bản sau [5]:  Từ động vật: enzyme đuợc tách ra từ các mô như: tụy tạng, dạ dày, ruột và nội tạng của một số loài thủy sản (mực, cá…) thường là trypsin, pepsin, chymotrypsin, cathepsin…  Từ thực vật: có thể thu nhận được papain từ đu đủ, bromelain từ thân, lá, vỏ dứa.  Từ vi sinh vật: cũng là nguồn thu nhận enzyme rất phong phú, thường là các loài aspergillus, bacillus, clostridium, streptomyces và một số loài nấm men.  Trong các nguồn nguyên liệu này thì vi sinh vật là nguồn thích hợp cho việc sản xuất enzyme ở quy mô công nghiệp vì nó có những ưu điểm sau: - Có thể chủ động trong quá trình sản xuất. - Chu kỳ phát triển của vi sinh vật ngắn, do đó có thể sản xuất enzyme từ vi sinh vật trong thời gian ngắn từ 36 ÷ 60h. - Có thể định hướng việc tổng hợp enzyme ở vi sinh vật theo hướng sản xuất chọn lọc enzyme với số lượng lớn. - Giá thành các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật thấp hơn so với các nguồn khác vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật tương đối đơn giản, rẻ tiền. Do những đặc điểm này mà ngày nay việc nghiên cứu ứng dụng enzyme trong đời sống mang nhiều ý nghĩa khoa học và thực tiễn. 1.2.1.3. Cơ chế tác dụng của protease [5] Enzyme là chất xúc tác sinh học mang bản chất là protein có tính đặc hiệu cao, nó có khả năng tương tác lên các liên kết peptid (-CO-NH-) trong phân tử protein và cơ chất tương tự, làm cho các liên kết này bị suy yếu và dễ dàng bị đứt ra 11 khi có yếu tố nước tham gia. Thông thường enzyme tác dụng và chuyển hóa cơ chất phải trải qua ba giai đoạn: Giai đoạn 1: Enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng thấp, các liên kết yếu tạo thành giữa enzyme và cơ chất trong phức hợp ES là tương tác tĩnh điện, liên kết Hydrogen, liên kết Vandecvan. Giai đoạn 2: Là giai đoạn tạo phức chất hoạt hóa xảy ra sự biến đổi cơ chất, dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme làm cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động, một số liên kết trong cơ chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi. Giai đoạn 3: Là giai đoạn tạo ra sản phẩm của phản ứng và enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do nhưu ban đầu. E+S ES + EP + H – P H2 O E + P – OH + H – P+ Hình 1.1. Phản ứng thủy phân xúc tác bởi protease Trong đó: P và P+ biểu thị kết quả các peptid có kích thước khác nhau được tách ra. Cách tác động: Endoprotease tiến hành tách các liên kết peptid ở bên trong của nhánh polypeptide, trong khi exopeptidase tách rời các axit amin ở vị trí đầu tiên và cuối cùng của nhánh polypeptide. 1.2.1.4. Hoạt độ enzyme [5] Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme là số đơn vị enzyme/1mg protein (UI/mg) cũng có thể 1g chế phẩm hoặc 1 ml dung dịch enzyme. Thông thường hàm lượng protein được xác định bằng nhiều phương pháp. Khi đã biết khối lượng phân tử của enzyme thì có thể tính hoạt độ phân tử. Công thức tính hoạt độ: a*b*c X = t 12 Trong đó, a: nồng độ tyrosine (µmol/ml) b: độ pha loãng của dịch enzyme c: thể tích của dịch thu được để đo (ml) t: thời gian xảy ra phản ứng (phút) 1.2.1.5. Enzyme Alcalase Enzyme Alcalase là một loại enzyme endoprotease có hoạt độ cao, thu được từ Bacillus licheniformis. Đây là enzyme được phân tách và tinh sạch từ nguồn vi sinh vật. Sử dụng enzyme Alcalase cho phép điều chỉnh dễ dàng độ thủy phân, tính toán được lượng base yêu cầu để duy trì pH không đổi trong suốt quá trình thủy phân. Chọn enzyme này cũng dựa trên đặc trưng của nó cho khả năng không hút nước của các axit amin vào giai đoạn cuối, dẫn đến sản phẩm thủy phân không có vị đắng (Adler-Nissen, 1986), đồng thời sản phẩm có sự cân bằng tốt các axit amin thiết yếu (Kristinsson và Rasco, 2000). Nhiệt độ bảo quản tốt nhất là 0÷10oC. Điều kiện hoạt động tối ưu cho enzyme Alcalase AF 2.4 L: pH = 8 Nhiệt độ: 50 ÷ 60oC (122 ÷ 1400F) DH (%) tối đa 15 ÷ 25. Để kiểm soát đặc tính chức năng của sản phẩm thủy phân thì nên dừng phản ứng enzyme gần với DH % xác định. Tất cả protease có thể bị bất hoạt bằng cách xử lý nhiệt ở 85oC, thời gian 10 phút hoặc protease Alcalase bị bất hoạt tại pH = 4 hay thấp hơn trong khoảng 30 phút. Phản ứng có thể dừng tức thời bằng cách thêm vào các acid thích hợp như: acid hydrochloric, phosphoric, malic, lactic, acetic. Tăng nhiệt độ tức thời khó đạt được dưới các điều kiện công nghiệp và nó có thể khó để kiểm soát DH % do sự thủy phân vẫn tiếp tục trong suốt giai đoạn bất hoạt. 1.2.1.6. Hệ enzyme protease của tôm Sự tiêu hóa và trao đổi chất protein, các hợp chất nitơ khác giữa các loài giáp xác khác nhau rất nhiều. Các enzyme tiêu hóa đặc biệt là enzyme tiêu hóa protein ở giáp xác nói chung và của tôm nói riêng khá giống với enzyme có trong dạ dày của