Tài liệu ứng dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới (ngs) để phân tích gen hbb ở người nghi ngờ mang đột biến gây bệnh β thalassemia

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---    --- Ngô Kim Ngân ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI (NGS) ĐỂ PHÂN TÍCH GEN HBB Ở NGƯỜI NGHI NGỜ MANG ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH β-THALASSEMIA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---    --- Ngô Kim Ngân ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI (NGS) ĐỂ PHÂN TÍCH GEN HBB Ở NGƯỜI NGHI NGỜ MANG ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH β-THALASSEMIA Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 8420101.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. DƯƠNG QUỐC CHÍNH TS. TRẦN ĐỨC LONG Hà Nội – 2020 Lời cảm ơn Để thực hiện thành công khóa luận tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Tiến sĩ Dương Quốc Chính, Trưởng khoa Di truyền - Sinh học phân tử, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương cùng với Tiến sĩ Trần Đức Long người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian em thực hiện luận văn. Em xin gửi lời cảm ơn đến Thạc sĩ Nguyễn Lê Anh, Thạc sĩ Trần Tuấn Anh cùng toàn thể nhân viên khoa Di truyền - Sinh học phân tử, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương đã luôn giúp đỡ chia sẻ những kiến thức chuyên môn, thường xuyên động viên về tinh thần giúp em vững tin trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo Khoa Sinh học đã giảng dạy cho em nhiều kiến thức quý báu. Em xin cảm ơn Bộ môn Di truyền học, Phòng sau đại học, Phòng công tác chính trị Học sinh - Sinh viên đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn thạc sỹ. Xin cảm ơn dự án “Nghiên cứu sản xuất chip sinh học trên nền DNA microarray để chẩn đoán một số bệnh ở người” mã số 01/2017/CNC_HDKHCN của công ty BIMEDTECH đã hỗ trợ tôi thực hiện nghiên cứu này. Cuối cùng em xin gửi lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè thân thiết đã động viên, bên cạnh em trong thời gian em thực hiện luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 30 tháng 12 năm 2020 Sinh viên Ngô Kim Ngân BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ và ý nghĩa Viết tắt bp DNA Cluster Base pair Deoxyribonucleic Acid Cụm khuếch đại của DNA khuôn được gắn trên bề mặt flowcell. Mỗi cụm được khuếch đại từ một sợi DNA khuôn ban đầu cho đến khi có khoảng 1000 bản sao. Mỗi cluster sẽ tạo ra một trình tự đọc duy nhất. HbA Hemoglobin A HbA2 Hemoglobin A2 HbE Hemoglobin E HbF Hemoglobin F Index Là trình tự DNA tag được gắn vào các trình tự đích, cho phép kết hợp nhiều mẫu trong một bể thư viện và phân tách dữ liệu sau khi đã hoàn thành lần chạy kb kilobase = 1000 bp MCH Mean Cell Hemoglobin: lượng hemoglobin trung bình hồng cầu MCV Mean Corpuscular Volume: thể tích trung bình hồng cầu PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid WHO World Health Organization: Tổ chức Y tế thế giới MỤC LỤC Chương 1. 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................2 Đại cương về β-thalassemia .......................................................................2 1.1.1. Đặc điểm và cơ chế sinh bệnh Thalassemia ............................................2 1.1.2. Đặc điểm và phân loại bệnh β-thalassemia .............................................3 1.1.3. Dịch tễ học bệnh β-thalassemia ...............................................................5 1.1.4. Cơ sở phân tử bệnh β-thalassemia ...........................................................6 1.1.5. Các phương pháp chẩn đoán bệnh β-thalassemia..................................11 1.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán bệnh β-thalassemia ................13 1.2.1. Kỹ thuật ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System) ...13 1.2.2. Kỹ thuật lai điểm ngược (Reverse hybridization - kit Strip Assay) ......15 1.2.3. Giải trình tự ...........................................................................................16 1.3. Hệ thống giải trình tự thế hệ mới của Illumina - MiSeq . .......................20 1.3.1. Lịch sử phát triển ...................................................................................20 1.3.2. Nguyên tắc hoạt động ............................................................................21 1.4. Các nghiên cứu về các đột biến gây bệnh β-thalassemia ở Việt Nam.....24 1.4.1. Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật multiplex ARMS- PCR ..........................24 1.4.2. Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật lai phân tử ..............................................25 Chương 2. 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP...................................................28 Đối tượng, hóa chất và thiết bị ................................................................28 2.1.1. Đối tượng ...............................................................................................28 2.1.2. Hóa chất .................................................................................................28 2.1.3. Trình tự mồi sử dụng .............................................................................29 2.1.4. Thiết bị...................................................................................................29 2.2. Phương pháp nghiên cứu .........................................................................29 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu ...................................................................................29 2.2.2. Quy trình thí nghiệm .............................................................................30 Chương 3. 3.1. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...............................................................37 Kết quả tối ưu quy trình giải trình tự gen HBB trên hệ thống NGS ........37 i 3.1.1. Thiết kế mồi và tối ưu phản ứng PCR ...................................................37 3.1.2. Tối ưu quy trình chuẩn hóa mẫu............................................................40 3.2. Kết quả phân tích đột biến trên gen HBB ở các mẫu nghiên cứu ............42 3.2.1. Thông tin lần chạy máy MiSeq. ............................................................42 3.2.2. Kết quả phân tích đột biến gen HBB .....................................................42 3.2.3. Kết quả phân tích đột biến trên gen HBB kiểm chứng lại bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger ...........................................................................46 3.2.4. Giá trị của các chỉ số sàng lọc trong nghiên cứu ...................................48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................50 PHỤ LỤC 1: KẾT QUẢ PHẢN ỨNG PCR KHUẾCH ĐẠI GEN HBB ................... a PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM CẬN LÂM SÀNG CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................................................................b ii DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cấu trúc của gen HBB, vị trí và mức độ nghiêm trọng của các đột biến gây ra bệnh β-thalassemia [7]. ...........................................................................................7 Hình 2: Tên và vị trí trên gen HBB của 9 đột biến gây bệnh β-thalassemia thường gặp ở Việt Nam. ..........................................................................................................9 Hình 3: Mô tả đột biến tạo vị trí cắt nối intron – exon mới [48]. .............................11 Hình 4: Sơ đồ sàng lọc bệnh β-thalassemia [2], [16]. ...............................................12 Hình 5: Sơ đồ mô tả nguyên lý kỹ thuật ARMS-PCR ..............................................14 Hình 6: Quy trình giải trình tự thế hệ mới của Illumina ...........................................21 Hình 7: Thông tin lần chạy trên phần mềm Sequencing Analysis Viewer ...............23 Hình 8: Kết quả phân tích đột biến trên Miseq Reporter ..........................................24 Hình 9: Kết quả phân tích đột biến trên phần mềm IGV ..........................................24 Hình 10: Sơ đồ nghiên cứu .......................................................................................30 Hình 11: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen HBB chưa tối ưu .............31 Hình 12: Kết quả blast cặp mồi HBB trên NCBI ......................................................37 Hình 13: Kết quả điện di sản phầm PCR trước tối ưu trên gel agarose 1,5%...........38 Hình 14: Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi điện di trên gel agarose 1.5% .................38 Hình 15: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen HBB sau tối ưu................39 Hình 16: Kết quả điện di sản phẩm sau tối ưu trên gel agarose 1,5%. .....................39 Hình 17: Kết quả chất lượng giải trình tự NGS gen HBB trước khi tối ưu ..............40 Hình 18: Kết quả chất lượng giải trình tự NGS gen HBB sau khi tối ưu .................41 Hình 19: Kết quả giải trình tự NGS mẫu đột biến codon 26 ....................................45 Hình 20: Kết quả so sánh đột biến tại codon 26(G→T) và codon 26 (G→A) với ...46 Hình 21: Kết quả kiểm chứng bằng phương pháp giải trình tự Sanger ....................47 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Đặc điểm của các thể bệnh β–thalassemia [3], [31]. .....................................3 Bảng 2: Đặc điểm của các thể HbE phối hợp β-thalassemia [3] [31]. ........................4 Bảng 3: Trình tự mồi HBB........................................................................................29 Bảng 4: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen HBB .......................................31 Bảng 5: Kết quả phân tích đột biến gen HBB ...........................................................42 Bảng 6: Tỷ lệ các loại đột biến phổ biến ở Việt Nam ...............................................43 Bảng 7: Tỷ lệ các dạng đột biến HbE .......................................................................43 Bảng 8: Tỷ lệ các dạng đột biến ít gặp ở Việt Nam ..................................................44 Bảng 9: Kết quả giải trình tự NGS và Sanger ...........................................................47 Bảng 10: Tỷ lệ phát hiện đột biến của MCH và MCV .............................................49 Bảng 11: Tỷ lệ phát hiện đột biến ở các chỉ số Hb ...................................................49 iv ĐẶT VẤN ĐỀ Beta thalassemia (β-thalassemia) là bệnh thiếu máu, tan máu di truyền gây ra do giảm hoặc mất tổng hợp hoàn toàn chuỗi β-globin, thành phần chính của hemoglobin do gen HBB nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 11 quy định. Ở Việt Nam, đây là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ra tình trạng thiếu máu, tan máu nặng ở trẻ em. Người mắc bệnh β-thalassemia thể nặng đòi hỏi phải được điều trị bằng truyền hồng cầu thay thế suốt đời và thải sắt định kỳ. Việc điều trị này khá tốn kém và lâu dài, là gánh nặng lớn cho gia đình, xã hội và làm tăng chi tiêu ngân sách nhà nước cho lĩnh vực y tế. Đến nay, trên thế giới đã phát hiện hơn 200 đột biến gây bệnh β-thalassemia [11], [17], [43]. Vì vậy, rất cần có một chương trình tầm soát bệnh β-thalassemia trong cộng đồng nhằm hạn chế sự phổ biến của gen bệnh, trong đó việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử giúp xác định chính xác loại đột biến và kiểu gen của bệnh Giải trình tự gen được coi là tiêu chuẩn vàng trong việc phát hiện nhiều đột biến. Next-Generation Sequencing (NGS) là phương pháp giải trình tự thế hệ mới có ưu thế về hiệu suất, cho phép phát hiện nhiều đột biến cùng lúc và đang dần trở thành công cụ trong chẩn đoán thường quy [21]. Năm 2011, hãng Illumina đưa ra thị trường hệ thống giải trình tự thế hệ mới – MiSeq và được sử dụng trong nhiều phòng xét nghiệm sinh học phân tử với ưu điểm cho phép phân tích ít mẫu hơn trong mỗi lần chạy, giảm giá thành, thuận lợi hơn cho các xét nghiệm. Vì vậy, để tăng cường hiệu quả trong việc chẩn đoán bệnh β-thalassemia chúng tôi thực hiện đề tài “Ứng dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới (NGS) để phân tích gen HBB ở người nghi ngờ mang đột biến gây bệnh βthalassemia”. Đề tài được thực hiện tại khoa Di truyền và Sinh học phân tử - Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương với 2 mục tiêu: 1. Tối ưu quy trình “ứng dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới (Next Generation Sequencing – NGS) để phân tích gen HBB”. 2. Ứng dụng quy trình NGS để phân tích đột biến gen HBB ở một số người nghi ngờ mang đột biến gây bệnh β-thalassemia. 1 Chương 1. 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đại cương về β-thalassemia 1.1.1. Đặc điểm và cơ chế sinh bệnh Thalassemia Thalassemia là nhóm bệnh tan máu di truyền, xảy ra do đột biến gen quy định việc sản xuất hemoglobin – thành phần chính trong hồng cầu, đảm nhiệm việc vận chuyển oxy trong cơ thể. Cấu trúc của một phân tử Hb bình thường bao gồm 2 chuỗi α-globin liên kết với 2 chuỗi β-globin (α2β2) và bốn nhân Hem, phân tử này có khả năng vận chuyển được bốn phân tử oxy. Bệnh thalassemia gây ra do sự mất cân bằng tổng hợp giữa chuỗi α-globin và chuỗi β-globin. Nguyên nhân là do rối loạn quá trình tổng hợp một trong hai chuỗi dẫn đến gây thiếu hụt một loại chuỗi và thừa lượng chuỗi còn lại làm thay đổi tỷ lệ của các phân tử huyết sắc tố dẫn đến tình trạng bệnh lý. Số lượng chuỗi globin thừa sẽ trùng hợp tạo nên các thể vùi huyết sắc tố. Những thể vùi này không có tác dụng vận chuyển oxy mà chúng lắng xuống màng hồng cầu và nguyên sinh chất của hồng cầu. Với hồng cầu ở máu ngoại vi, thể vùi huyết sắc tố làm thay đổi tính thấm, tính mềm dẻo của màng cùng với sự gia tăng diện tích tiếp xúc, dễ bị phá hủy bởi các tác nhân oxi hóa, từ đó dẫn đến hồng cầu bị vỡ sớm gây nên hiện tượng tan máu. Còn ở tủy xương, các thể vùi trên gắn lên nguyên sinh chất và màng của các hồng cầu non, làm hồng cầu bị chết trước khi trưởng thành, dẫn đến tăng sinh mạnh các hồng cầu non trong tủy xương làm cho xương bị biến dạng, tăng hấp thụ sắt gây ra nhiễm sắt cho cơ thể [13], [14]. Thalassemia là bệnh di truyền phổ biến nhất trên thế giới với ước tính khoảng 7% dân số mang gen bệnh [31]. Theo thống kê, ở nước ta, ước tính có khoảng 12 triệu người đang mang gen bệnh (chiếm khoảng 12% dân số Việt Nam), mỗi năm có trên 8.000 trẻ sinh ra bị bệnh, trong đó có hơn 2.000 trẻ mắc bệnh ở mức độ nặng cần được điều trị cả đời và hơn 20.000 bệnh nhân đang cần được điều trị theo loại gen nào bị ảnh hưởng mà phân biệt thành bệnh alpha thalassemia (α-thalassemia) và beta thalassemia (β-thalassemia) [52]. 2 1.1.2. Đặc điểm và phân loại bệnh β-thalassemia Bệnh β-thalassemia xảy ra do đột biến gen HBB dẫn đến không tổng hợp chuỗi globin β (β0-thalassemia, ký hiệu β0) hoặc giảm tổng hợp (β+-thalassemia, ký hiệu β+) hoặc giảm rất ít (β++-thalassempia ký hiệu β++). Theo tổ chức y tế thế giới WHO, hiện nay có tới 1,5% dân số thế giới mang gen bệnh β-thalassemia [20]. Căn cứ vào đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và số lượng alen bị đột biến, bệnh β-thalassemia được chia thành ba thể: thể nặng, thể trung bình và thể nhẹ. Đặc điểm của các thể này được mô tả trong bảng 1. Bảng 1: Đặc điểm của các thể bệnh β–thalassemia [3], [31]. Chẩn đoán β-thalassemia thể nặng Kiểu gen đột biến Huyết đồ β+/β+ Hb < 7g/dL β0/β0 MCV 50-60 fL β+/β0 MCH 14-20 pg Đặc điểm Hb β-thalassemia thể nhẹ β++/ β β+/ β β0 / β đặc trưng Bệnh nặng, thiếu HbA2 tăng máu, phụ thuộc HbF 70-90% truyền máu lâu dài β+/β++ β-thalassemia β+/β0 thể trung β0/β0+ yếu tố bình ảnh hưởng Triệu chứng HbA2 tăng Hb 6-10g/dL HbF tăng đến MCV 55-70 fL 100% MCH 15-23 pg Bệnh vừa, mức độ phụ thuộc truyền máu thay đổi Hb nam 9-15 g/dL Hb nữ 9-13 g/dL HbA2> 3,2% MCV 55-75 fL HbF 0,5-6% MCH 19 - 25 pg Thiếu máu nhẹ β-thalassemia thể nặng: bệnh thường xuất hiện trong vòng 2 năm đầu đời với tình trạng thiếu máu nặng, cần phải truyền hồng cầu thường xuyên. Biểu hiện ở những người không được điều trị hoặc truyền máu là chậm phát triển, xanh xao, vàng da, cơ bắp kém, viêm gan, loét chân, biến dạng hộp sọ và mặt [20]. 3 β-thalassemia thể trung gian: người bệnh có biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn và thường xuất hiện muộn hơn thể nặng, không yêu cầu hoặc chỉ thỉnh thoảng truyền máu [20]. β-thalassemia thể nhẹ: người mắc β-thalassemia thể nhẹ thường không có triệu chứng lâm sàng hoặc đôi khi bị thiếu máu nhẹ. Khi cả hai cha mẹ đều là người mắc β-thalassemia thể nhẹ, có nguy cơ 25% ở mỗi lần mang thai có con mắc bệnh β-thalassemia đồng hợp tử [20]. Ngoài ra, còn có các thể β-thalassemia khác như: thể phối hợp Hemoglobin E (HbE) và β-thalassemia; thể phối hợp β-thalassemia và α-thalassemia. Thể phối hợp β-thalassemia và Hemoglobin E (HbE): HbE là 1 biến thể của hemoglobin khi gen HBB bị đột biến ở codon thứ 26 (GAG→AAG), làm thay đổi acid amin thứ 26 là Glutamic thành Lysin. Người có kiểu gen dị hợp tử hoặc đồng hợp tử HbE mà không phối hợp với β-thalassemia chỉ có biểu hiện thiếu máu nhẹ, chậm phát triển ở mức vừa phải. Ở thể phối hợp, tùy vào thể β-thalassemia mà mức độ biểu hiện của bệnh trở nên đa dạng và được mô tả trong bảng 2. Bảng 2: Đặc điểm của các thể HbE phối hợp β-thalassemia [3] [31]. Thể bệnh Kiểu gen Huyết đồ Đặc điềm Hb Triệu chứng đặc trưng HbE + HbA2: HbE phối hợp β+-thalassemia HbE/β+ Hb thấp 25-80% Thiếu máu HbF 6-50% nhược sắc vừa HbA 5-60% HbE phối hợp β -thalassemia 0 Hb <8 g/dL HbE/β0 MCV < 60fL MCH < 22pg 4 HbE tăng đến 85% HbA2 < 5% HbF 15-25% Giống β-thalassemia thể nặng Thể phối hợp β-thalassemia và α-thalassemia: người có kiểu gen đồng hợp tử hoặc dị hợp tử β-thalassemia khi kết hợp với α-thalassemia làm giảm chuỗi α-globin dư thừa làm giảm mức độ nghiêm trọng của β-thalassemia từ thể nặng sang thể trung gian [8]. 1.1.3. Dịch tễ học bệnh β-thalassemia a. β-thalassemia trên thế giới β -thalassemia là loại bệnh di truyền liên quan chặt chẽ với nguồn gốc dân tộc, phân bố khắp toàn cầu, song mang tính chất địa dư rõ rệt, số người mang gen bệnh trên thế giới rất lớn [59] Những trường hợp thalassemia phát hiện đầu tiên năm 1925 là βthalassemia ở bờ Địa Trung Hải, là người có nguồn gốc Hy Lạp và Italia. Sau đó bệnh đã được phát hiện ở rất nhiều nước trên thế giới. Gen bệnh β-thalassemia phân bố rất rộng trên thế giới, từ vùng Địa Trung Hải, qua khu vực Trung Đông, tới Đông Nam Châu Á và Bắc Phi. Theo Liên đoàn Thalassemia quốc tế (2005) ước tính có 1,5% dân số thế giới mang gen β-thalassemia, ít nhất có từ 80-90 triệu người mang gen bệnh, và cứ mỗi năm có tới 60.000 trường hợp mới sinh mang gen bệnh. Toàn Châu Á có trên 60 triệu người mang gen β-thalassemia. Riêng khu vực Đông Nam Châu Á trong đó có Việt Nam, ước tính số người mang gen βthalassemia chiếm tới 50% người mang gen toàn cầu, khoảng 40 triệu người. Còn ở các nước phát triển, Châu Âu và Châu Mỹ, ước tính người mang gen βthalasemia chỉ chiếm 10-13% người mang gen trên thế giới [51][55]. Tần số mang gen β-thalassemia rất cao ở nhiều nước ở bờ Địa Trung Hải, Châu Âu, như ở Cyprus là 10%, Hy Lạp là 8%, Albania là 8%, Italia là 4,8%. Ở Châu Mỹ, tỷ lệ mang gen β-thalassemia ở Guyana tới 10% dân số. Ở khu vực Châu Á tần số mang gen β-thalassemia ở Ấn Độ từ 3-17% dân số, ở Lào là 9,6%, ở Thái Lan từ 3-9%, ở Indonesia là 4% [56] [57]. Do gen β-thalassemia phân bố rất rộng rãi trên toàn cầu, đồng thời cùng với việc lưu hành nhiều bệnh hemoglobin khác như HbE, HbS do đó hàng năm sinh ra một số lớn trẻ bị thể đồng hợp tử β-thalassemia cũng như thể dị hợp tử kép, phối 5 hợp với một hemoglobin bệnh khác như HbE/β-thalassemia, HbS/β-thalassemia. Đây là những thể bệnh nặng của β-thalassemia, đòi hỏi phải điều trị suốt đời, số đông phải phụ thuộc vào truyền máu [50] [58]. b. β-thalassemia ở Việt Nam Bệnh hemoglobin nói chung và thalassemia nói riêng đã được chú ý khá sớm ở Việt Nam. Những nghiên cứu ban đầu từ thập kỷ 70, 80 và 90 ở thế kỷ XX, đều hướng về nghiên cứu dịch tễ học và lâm sàng. Tiếp theo những năm gần đây đã có một số nghiên cứu tiếp về điều trị, về đột biến gen thalassemia. Các nghiên cứu cho đến nay ở Việt Nam đều thống nhất bệnh hemoglobin khá phổ biến, phổ biến là α-thalasemia, β-thalassemia và HbE. Bệnh phát hiện thấy ở tất cả các tỉnh thành trong cả nước, ở nhiều dân tộc khác nhau [52]. Bệnh phổ biến nhiều hơn ở dân tộc ít người, ở các tỉnh miền núi và cao nguyên, so với người Kinh và vùng đồng bằng [5]. β -thalassemia phổ biến ở người dân tộc ít người miền Bắc hơn. Hemoglobin E phổ biến ở miền Trung và miền Nam hơn [53] [54]. Ở Việt Nam, β0 - thalassemia phổ biến hơn β+ -thalassemia [52] 1.1.4. Cơ sở phân tử bệnh β-thalassemia 1.1.4.1. Vị trí, cấu trúc gen HBB HBB là gen mã hóa phân tử β-globin, nó nằm trên cụm gen dài 70kb trên cánh ngắn NST 11 [10]. Cụm gen bao gồm các gen chức năng 5’- ε – Gγ – Aγ – ψβ – δ – β – 3’ được sắp xếp theo thứ tự biểu hiện trong quá trình phát triển của cơ thể [24], [36]. Gen HBB dài 1600bp, mã hóa cho 146 acid amin gồm vùng 5’ không dịch mã, 3 exon xen kẽ là 2 intron và kết thúc là vùng 3’ không dịch mã (hình 1) [7] [36], [46]. Exon đầu tiên dài 89bp, exon 2 dài 221bp, exon 3 dài 123bp. Intron 1 có kích thước nhỏ dài khoảng 130bp nằm giữa nucleotide thứ hai và nucleotide thứ ba của codon 30, intron 2 có kích thước lớn hơn, dài khoảng 850bp nằm giữa codon 104 và 105 [7], [18]. 6 Hình 1: Cấu trúc của gen HBB, vị trí và mức độ nghiêm trọng của các đột biến gây ra bệnh β-thalassemia [7]. Trình tự bảo thủ quy định sự biểu hiện của gen HBB được tìm thấy ở các vùng promoter, vị trí nối intron- exon, vùng 5’ và 3’ không dịch mã. • Promoter của HBB bao gồm 3 trình tự bảo thủ: TATA box (vị trí −28 đến −31), CCAAT box (vị trí −72 đến −76) và các trình tự CACCC lặp lại (ở vị trí từ −86 đến −90 và từ −101 đến −105) [7], [23], [46]. • Vùng 5’ không dịch mã (5′‐UTR) là vùng dài 50bp nằm giữa vị trí CAP – vị trí bắt đầu phiên mã và codon mở đầu (ATG). Có hai trình tự được bảo thủ nổi bật là CTTCTG và CACC [7], [46]. • Vùng 3’-UTR dài 132bp nằm giữa codon kết thúc (TAA) và đuôi poly (A) chứa một trình tự mang tín hiệu để gắn đuôi poly A là ATAAA [7], [46]. Một số đột biến tại các trình tự này là nguyên nhân gây ra β-thalassemia. 1.1.4.2. Cơ chế đột biến trên gen HBB gây bệnh β-thalassemia Cho đến nay, có khoảng hơn 200 đột biến đã tìm thấy trên gen HBB chủ yếu là đột biến điểm, rất ít đột biến mất đoạn [7], [36]. Các đột biến này xảy ra ở các trình tự exon, intron, promoter hoặc vùng 3’-5’ không dịch mã. Những đột biến này gây ảnh hưởng tới khả năng biểu hiện của chuỗi β-globin, do vậy người ta chia các đột biến này thành 3 nhóm:  Đột biến ảnh hưởng tới quá trình phiên mã: 7 • Đột biến điểm tại vùng khởi động (promoter): đột biến thay thế nucleotide tại vị trí TATA hoặc CACCC dẫn đến giảm tổng hợp 10 - 25% lượng chuỗi β-globin so với bình thường, gây β+-thalassemia [48]. Ví dụ: -90 (C→T), -88 (C→T), -28 (A→G); -29 (A→G). • Đột biến vùng 5’ không dịch mã: làm giảm hiệu suất quá trình dịch mã [48]. Ví dụ: đột biến tại vị trí +33 (C→G) làm giảm tổng hợp mRNA 33% so với bình thường [41].  Đột biến ảnh hưởng tới quá trình cải biến mARN • Đột biến tại vị trí cắt- nối intron – exon: quá trình cắt nối intron và exon xảy ra sau phiên mã cần các nucleotide GT (vị trí cho nối) đầu 5’, AG (vị trí nhận nối) ở đầu 3’ của các intron và vùng bảo thủ xung quanh, gây cản trở việc nối exon, do đó không tạo được mARN β-globin nên gây β0-thalassemia [48] như IVS1-1 (G→T). • Đột biến tạo vị trí ghép nối giả tại vùng intron và exon: Dọc các exon và intron đều chứa những trình tự giống với trình tự bảo thủ ở vùng biên intron- exon nhưng thường không được sử dụng cho quá trình cắt nối. Các đột biến này xảy ra tại các vị trí trên tạo ra các trình tự gần giống với trình tự cắt nối bình thường. Ví dụ: IVS2-654 (C→T), IVS2-705 (T→G) và IVS2-745 (C→G). • Đột biến tại vị trí poly A và vùng 3’ không dịch mã: vị trí AATAAA tại vùng không dịch mã là vị trí gắn poly Adenin cần thiết cho mARN di chuyển từ nhân ra tế bào chất để tham gia vào quá trình dịch mã tạo sản phẩm protein. Các đột biến điểm xảy ra tại vị trí AATAAA sẽ gây β+-thalassemia, như: AATAAA → AATGAA, AATAAA → CATAAA.  Đột biến ảnh hưởng tới quá trình dịch mã mARN • Đột biến codon mở đầu: là những đột biến liên quan tới codon ATG mang tín hiệu mở đầu dịch mã. • Đột biến vô nghĩa: những đột biến thay thế hoặc thêm, mất một vài nucleotide tạo ra codon mang tín hiệu kết thúc làm kết thúc sớm chuỗi và tạo sản phẩm β-globin không bền bị phá hủy ngay trong tế bào, gây β0-thalassemia 8 như: codon17 (AAG→TAG), codon 35 (TAC→TAA), codon 39 (CAG→TAG) [45]. • Đột biến dịch khung: những đột biến thêm hoặc mất một vài nucleotide làm thay đổi khung đọc mở, làm kết thúc sớm hoặc thay đổi trình tự các codon 41/42 (–TTCT), codon 71/72 (+A) gây β0-thalassemia [48]. 1.1.4.3. Một số dạng đột biến thường gặp ở Việt Nam Ở Việt Nam, có 9 đột biến gây ra 95% các trường hợp β-thalassemia gồm: -28 (A→G), codon 17 (AAG→TAG), codon 26 (GAG→AAG), IVS1-1 (G→T), IVS1-5 (G→C), codon 41/42(-TCTT), codon 71/72 (+A), codon 95 (+A), IVS2-654 (C→T) được mô tả ở hình 2 [43]. Những đột biến này được chia làm 2 nhóm như sau: Hình 2: Tên và vị trí trên gen HBB của 9 đột biến gây bệnh β-thalassemia thường gặp ở Việt Nam.  Nhóm đột biến gây β0-thalassemia: • Đột biến codon 17 (AAG→TAG): đột biến làm thay đổi bộ ba mã hóa acid amin lysin (AAG) thành bộ ba kết thúc (TAG) gây β0-thalassemia [15], [48]. • Đột biến codon 41/42 (-TCTT): đột biến gây mất 4 nucleotide (TCTT) làm thay đổi khung đọc tạo ra bộ ba kết thúc ở bộ ba thứ 59, gây β0thalassemia [43], [48]. 9 • Đột biến codon 95 (+A): thêm 1 nucleotide A dẫn đến sự thay đổi khung đọc tạo ra bộ ba kết thúc ở bộ ba thứ 101 mới gây β0-thalassemia [49]. • Đột biến codon 71/72 (+A): thêm 1 nucleotide A ở giữa codon 71 và 72 làm thay đổi khung đọc tạo thành bộ ba kết thúc ở vị trí 72 gây β0-thalassemia [48]. • Đột biến IVS1 -1 (G→T): đột biến ở intron 1 tại vị trí 1 gây biến đổi G thành T, làm bất hoạt hoàn toàn vị trí mối nối nên không tạo được mRNA, gây β0-thalassemia [47].  Nhóm đột biến gây β+- thalassemia: • Đột biến -28 (A→G): đột biến thay thế nucleotide ở vị trí -28 biến đổi A thành G làm giảm sự biểu hiện của gen HBB, biểu hiện giảm mức mARN từ 3 đến 5 lần so với mức bình thường, hậu quả làm giảm tổng hợp chuỗi β globin gây β+-thalassemia [43]. • Đột biến IVS1-5 (G→C): đột biến ở intron 1 tại vị trí thứ 5 biến đổi G thành C, dẫn tới giảm khả năng nối ARN chính xác nhưng còn tổng hợp được chuỗi β-globin, gây đột biến β+-thalassemia. • Đột biến IVS2-564 (C→T): đột biến ở intron 2 tại vị trí 654, C đổi thành T (AAGGCAATA→AAGGTAATA), tạo ra vị trí ghép nối mới, gây đột biến β+-thalassemia [43]. • Đột biến codon 26 (GAG→AAG): tại vị trí codon thứ 26 thuộc exon 1 xảy ra đột biến GAG→AAG, sự thay thế một nucleotide này gây ra 2 biểu hiện: - Quá trình cắt intron nối exon xảy ra bình thường, tạo nên chuỗi βglobin có sự thay đổi ở acid amin thứ 26 là glutamic thành lysin hình thành nên Hemoglobin E [48]. - Kích hoạt một vị trí cắt- nối mới trên phân tử tiền mRNA làm ngắn chuỗi β-globin gây nên β+-thalassemia (hình 3) [48]. 10 Hình 3: Mô tả đột biến tạo vị trí cắt nối intron – exon mới [48]. Đột biến tại codon 26 kích hoạt mối nối mới giữa vị trí cho nối GT của codon 25 trên exon 1 với vị trí nhận nối AG của codon 30 thuộc exon 2 làm mất 16 nucleotide trên phân tử mRNA, làm ngắn chuỗi β–globin gây ra β+-thalassemia. Đột biến này vừa tạo nên biến thể HbE vừa gây β+-thalassemia. Chính vì vậy đột biến tại codon 26 gây bệnh HbE là một thể β-thalassemia đặc biệt. 1.1.5. Các phương pháp chẩn đoán bệnh β-thalassemia Những phương pháp trong sàng lọc và chẩn đoán bệnh thalassemia được chia làm 3 nhóm chính tương ứng với 3 giai đoạn trong quá trình sàng lọc. Một là nhóm phương pháp sàng lọc ban đầu bao gồm những kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp, thời gian thao tác nhanh, áp dụng với lượng mẫu ít và có thể dễ dàng áp dụng ở cả các cơ sở y tế. Hai là nhóm phương pháp phân tích và định lượng hemoglobin cho phép phân loại bệnh thalassemia với 2 kỹ thuật là điện di mao quản và sắc ký lỏng hiệu năng cao. Ba là nhóm phương pháp sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử nhằm xác định cụ thể những đột biến gây bệnh. Sơ đồ sàng lọc cụ thể được mô tả ở hình 4. 11 Hình 4: Sơ đồ sàng lọc bệnh β-thalassemia [2], [16]. 1.1.5.1. Phân tích tế bào máu ngoại vi Hầu hết các quy trình chẩn đoán bệnh nhân thalassemia hiện nay đều sử dụng phương pháp phân tích các chỉ số hồng cầu để để sàng lọc người mang gen bệnh thalassemia. Hai chỉ số cần quan tâm là thể tích trung bình hồng cầu (MCV) và lượng hemoglobin trung bình hồng cầu. MCV < 80 fL trong trường hợp thiếu máu thiếu sắt hoặc bị thalassemia, MCH < 27pg có nghĩa là hồng cầu nhược sắc. Khi MCH < 27 pg kết hợp với MCV < 80fL sẽ có đặc điểm thiếu máu nhược sắc, đây là biểu hiện đặc trưng của bệnh thalassemia (hình 4) [16]. Tuy nhiên ở một số nơi có tỷ lệ mắc bệnh cao nhưng nguồn lực còn hạn chế và cơ sở vật chất không đầy đủ như khu vực nông thôn ở Đông Nam Á, Ấn Độ và các quốc gia Nam Á thì việc sử dụng xét nghiệm tủa HbE (Dichlorophenol Indophenol)- DCIP để sàng lọc HbE là lựa chọn thay thế đơn giản và chi phí thấp để sàng lọc sơ bộ β-thalassemia [13]. 12