Tài liệu ứng dụng màng cellulose vi khuẩn làm màng lọc nước

Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHAÏM QUOÁC VIEÄT ỨNG DỤNG MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÀM MÀNG LỌC NƯỚC Chuyeân ngaønh: Coâng ngheä sinh hoïc Maõ soá ngaønh: 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ Niên khóa 2006-2008 TP.HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2008 TÓM TẮT LUẬN VĂN Màng BC được tạo ra bởi vi khuẩn A.xylinum theo 3 phương pháp: Phương pháp lên men tĩnh truyền thống, phương pháp lên men tĩnh truyền thống trải mỏng và phương pháp lên men với môi trường tối thiểu. Các màng BC thu được sau khi lên men với bề dày 0,5 mm; 1,0 mm; 1,5 mm; 2,0 mm và 2,5 mm được khảo sát các tính chất cơ học và khả năng lọc nước. Màng BC dày 1,0 mm cho kết quả lọc nước khả quan với kết quả như sau: Lọc 100% vi khuẩn trong nước, tốc độ thẩm thấu: 395,6 lít.m-2.h-1 và độ bền kéo là 25,3 MPa. Với định hướng ứng dụng màng BC làm màng lọc nước, chúng tôi tiến hành kiểm chứng khả năng lọc của màng BC khi đưa vào thí nghiệm ứng dụng trong bình lọc nước. Các kết quả chỉ tiêu xét nghiệm về vi sinh và hóa lý qua màng lọc BC cho thấy màng BC đáp ứng được yêu cầu làm màng lọc nước. ABSTRACT Bacterial cellulose is synthesized by Acetobacter xylinum belonging to 3 method: Classic fermentation static, thin layer fermentation static and fermentation minimal medium method. Bacterial cellulose pellicles are harvested with 0,5 mm; 1,0 mm; 1,5 mm; 2,0 mm; 2,5 mm width will be surveyed mechanic properties and ability of water filtration. Bacterial cellulose 1,0 mm width pellicle has the good result: 100% water bacteria filtration, water permeable velocity: 395,6 lit.m-2.h-1 and endurance is 25,3 MPa. Using Bacterial cellulose pellicle as water filtration membrane, we examine its ability of water filtration in water filtration tank. Result: Bacterial cellulose pellicle can use in water filtration. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Trang DANH MỤC CÁC HÌNH CHƯƠNG 1: LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1.Cellulose vi khuẩn (Bacterial cellulose – BC) ………………………… 3 2.1.1 Vi sinh vật sản sinh cellulose và quá trình sinh tổng hợp BC…… 3 2.2. Màng lọc nước …………………………………………………………. 12 2.2.1 Các loại màng lọc nước ……………………………………………. 12 2.2.2 Tính chất các màng lọc nước ………………………………………. 13 2.2.3 Chất lượng màng lọc nước ………………………………………… 17 2.3 Một số yếu tố chính ảnh hưởng đến chất lượng nước ………………… 18 2.4. Các nghiên cứu liên quan đến đề tài …………………………………... 20 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Vật liệu …………………………………………………………………… 22 3.1.1 Giống vi khuẩn ……………………………………………………… 22 3.1.2 Thiết bị và dụng cụ …………………………………………………. 22 3.1.3 Hóa chất …………………………………………………………….. 22 3.1.4 Môi trường ………………………………………………………….. 23 3.2 Nội dung nghiên cứu …………………………………………………….. 24 3.2.1 Xác định phương pháp tạo màng mỏng BC ứng dụng làm màng lọc nước ………………………………………………………... 24 3.3.1 Bề dày màng ………………………………………………………… 27 3.3.2 Đo độ bền cơ học ……………………………………………………. 27 3.3.3 Đo khả năng thẩm thấu của màng ………………………………… 28 3.4 Thử nghiệm ứng dụng màng BC trong lọc nước ……………………… 28 3.4.1 Thử nghiệm khả năng lọc vi sinh của màng BC trong lọc nước … 28 3.4.2 Thử nghiệm ứng dụng màng BC trong bình lọc nước …………… 28 3.5 Các phương pháp kiểm tra chất lượng nước lọc ……………………… 30 3.5.1 Phương pháp lấy, bảo quản và vận chuyển mẫu …………………. 30 3.5.2 Xác định các chỉ tiêu vi sinh vật trong nước: E. coli, Coliforms, tổng vi khuẩn hiếu khí ………………………………. 30 3.5.3 Phương pháp xác định màu sắc và độ đục ………………………... 32 3.5.4 Phương pháp xác định độ pH ……………………………………… 32 3.5.5 Phương pháp xác định hàm lượng chất hữu cơ …………………... 32 3.5.6 Xác định độ cứng tổng theo phương pháp chuẩn độ EDTA …….. 33 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 34 4.1 Khảo sát một số đặc điểm sinh học của chủng Acetobacter xylinum….. 34 4.2 Các phương pháp tạo màng mỏng BC …………………………………. 36 4.3 Khảo sát khả năng lọc nước của màng BC …………………………….. 40 4.3.1 Phương pháp lên men tĩnh truyền thống trải mỏng ……………… 40 4.3.2 Phương pháp lên men tĩnh truyền thống …………………………..43 4.3.3 Phương pháp lên men với môi trường tối thiểu …………………... 45 4.4 Lựa chọn màng để ứng dụng trong lọc nước …………………………... 47 4.5 Độ bền cơ học của màng BC ……………………………………………. 48 4.6 Đánh giá khả năng lọc nước màng BC trong bình lọc nước ………….. 49 4.6.1 Khả năng lọc vi sinh ………………………………………………... 49 4.6.2 Khả năng thẩm thấu của màng BC trong bình lọc nước ………… 50 4.6.3 So sánh khả năng lọc nước của màng BC với màng lọc sứ trong bình lọc nước …………..................................................................... 50 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 5.1 Kết luận ………………………………………………………………….. 52 5.2 Kiến nghị …………………………………………………………………. 52 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Cấu trúc của màng phụ thuộc vào loại vi khuẩn tạo màng cellulose 10 Bảng 2.2 Tính chất của một số loại màng lọc 17 Bảng 2.3 Chỉ tiêu vi sinh cho nước uống đóng chai 20 Bảng 3.1 Bề dày của màng trong thí nghiệm 25 Bảng 3.2 Cách bố trí thí nghiệm đo bề dày màng 27 Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra một số đặc điểm sinh hóa 36 Bảng 4.2 Bề dày của màng BC 40 Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra khả năng lọc vi sinh của màng BC ở áp suất thường 41 Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra khả năng lọc vi sinh của màng BC ở áp suất chân không 41 Bảng 4.5 Tốc độ thẩm thấu của màng 43 Bảng 4.6 Bề dày màng 1,0 mm của phương pháp lên men tĩnh truyền thống 44 Bảng 4.7 Kết quả kiểm tra khả năng lọc vi sinh của màng B1 44 Bảng 4.8 Tốc độ thẩm thấu của màng B1 45 Bảng 4.9 Bề dày màng 1,0 mm của phương pháp lên men tĩnh truyền thống 45 Bảng 4.10 Kết quả kiểm tra khả năng lọc vi sinh của màng B1 46 Bảng 4.11 Tốc độ thẩm thấu của màng B1 46 Bảng 4.12 Độ lệch chuẩn về bề dày của màng và tốc độ thẩm thấu 47 Bảng 4.13 Độ bền kéo của màng 48 Bảng 4.14 Kết quả lọc vi sinh của màng BC và màng lọc nước 49 Bảng 4.15 Khả năng thẩm thấu của màng BC và màng lọc sứ 50 Bảng 4.16 Chất lượng nước lọc của màng BC và màng lọc sứ 51 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Vi khuẩn A. xylinum 6 Hình 2.2. Màng BC của A. xilinum dưới kính hiển vi điện tử ở điều kiện nuôi cấy tĩnh (a) và sợi cellulose bám trên bề mặt tế bào (b) 10 Hình 2.3 Màng BC ở điều kiện nuôi cấy tĩnh 10 Hình 2.4 Màng BC ở điều kiện nuôi cấy có sử dụng cánh khuấy 10 Hình 2.5 Cấu trúc màng lọc Cellulose acetate 13 Hình 2.6 Cấu trúc màng lọc Cellulose nitrat 13 Hình 2.7 Cấu trúc màng lọc Cellulose tái sinh 14 Hình 2.8 Cấu trúc màng lọc Cellulose tái sinh 15 Hình 2.9 Một đoạn màng UF (dày 0,2mm) 15 Hình 2.10 Lọc bằng màng UF 16 Hình 2.11 Cấu tạo lõi lọc RO 17 Hình 3.1 Bình lọc nước 29 Hình 3.2 Bộ lọc của bình lọc nước 29 Hình 3.3 Đĩa đếm E.coli/ Coliforms 3MTM PetrifilmTM 30 Hình 3.4 Đĩa đếm Aerobic 3MTM PetrifilmTM 31 Hình 4.1 Giống Acetobacter xylinum 34 Hình 4.2 Khuẩn lạc Acetobacter xylinum 35 Hình 4.3 Acetobacter xylinum trên môi trường lỏng 35 Hình 4.4 Màng BC thu từ phương pháp lên men truyền thống trải mỏng 37 Hình 4.5 Màng BC thu từ phương pháp lên men truyền thống 38 Hình 4.6 Màng BC thu từ phương pháp lên men với môi trường tối thiểu 39 Hình 4.7 Màng BC chụp dưới kính hiển vi điện tử 42 -1- Theo báo cáo gần đây của Liên Hiệp Quốc ( 26/07/2005): Có hơn một tỉ người trên thế giới thiếu nước sạch, nước ô nhiễm là nguyên nhân làm thiệt mạng hơn 15 triệu trẻ em mỗi năm. Theo UNESCO, đến năm 2050, khoảng 2 – 7 tỉ người sẽ đối mặt với tình trạng thiếu nước sạch. Việt Nam có nguồn tài nguyên nước mặt và nước ngầm dồi dào. Nhưng hiện nay, lượng nước bị ô nhiễm là rất lớn và có khuynh hướng tăng nhanh. “ 60% nguồn nước nông thôn bị ô nhiễm ” là tỉ lệ được công bố tại Hội nghị giới thiệu dự án luật phòng, chống các bệnh truyền nhiễm do Bộ Y tế phối hợp Văn phòng Chính phủ tổ chức vào ngày 22/06/2006 tại Hà Nội. Theo Bộ Tài nguyên và Môi trường, Việt Nam đang đứng trước nguy cơ thiếu nước sạch trầm trọng vào năm 2010, do tình trạng khô hạn ngày càng trầm trọng trong khi nhu cầu sử dụng nước lại tăng nhanh. Do đó giải quyết vấn đề nước sạch là một trong những vấn đề cấp thiết hiện nay [29]. Công nghệ màng lọc được cho là “ công nghệ xanh ” và đang được áp dụng rộng rãi trong công nghệ lọc nước. Quá trình lọc nước bằng màng lọc đem lại hiệu quả về năng lượng cũng như ít gây ô nhiễm cho môi trường. Do đó, công nghệ màng lọc đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới và Việt Nam. Hiện nay, Việt Nam đang sử dụng nhiều công nghệ lọc nước có sử dụng màng lọc : vi lọc (Microfiltration), siêu lọc (Ultrafiltration), lọc thẩm thấu ngược (Revese Osmosis)… để lọc nước. Các loại màng lọc này đều phải nhập từ nước ngoài nên giá thành nước lọc còn cao và chưa đáp ứng được nhu cầu sử dụng nước của người dân. Vì vậy, việc tìm ra một loại màng lọc mới với giá thành rẻ và có thể sản xuất được trong nước đang là vấn đề cần được giải quyết hiện nay. Đề tài “ Nghiên cứu ứng dụng cellulose vi khuẩn làm vật liệu màng lọc nước ” được hình thành trên cơ sở này . Đề tài “ Nghiên cứu ứng dụng cellulose vi khuẩn làm vật liệu màng lọc nước ” nhằm các mục tiêu và nội dung sau: _ Khảo sát một số phương pháp nuôi cấy tạo màng cellulose của vi khuẩn A.xylinum. -2- _ Khảo sát một số tính chất cơ lý và khả năng lọc nước của màng BC ở các độ dày khác nhau. _ Ứng dụng cụ thể của màng BC trong lọc nước. Giới hạn đề tài: Đề tài được thực hiện với quy mô phòng thí nghiệm Sử dụng một nguồn nước cố định để khảo sát khả năng lọc nước -3- 2.1.Cellulose vi khuẩn (Bacterial cellulose – BC) 2.1.1 Vi sinh vật sản sinh cellulose và quá trình sinh tổng hợp BC 2.1.1.1 Lịch sử nghiên cứu Adrian Brown là người đầu tiên phát hiện vi khuẩn có khả năng khả năng sản sinh cellulose vào năm 1886. Năm 1931, Tarr và Hibbert nghiên cứu về polysaccharide trong môi trường nuôi cấy Acetobacter xylinum để tạo ra cellulose với kết quả quan trọng: một lượng nhỏ etanol cần thiết cho quá trình sản xuất cellulose của vi khuẩn. Trong những cơ chất nghiên cứu: hexsose, pentose, manitol, glycerol, galactose, methyl hecxose thì fructose có hiệu suất tạo cellulose cao nhất. Môi trường có glucose và manitol cũng tạo cellulose với hiệu suất cao. Đường pentose sử dụng trong môi trường không có tác dụng trong việc tạo cellulose. Từ năm 1946 đến 1963 Hestrin và các cộng sự ở Đại học Hebrew đưa ra nhiều báo cáo về quá trình tổng hợp cellulose từ Acetobacter xylinum . Các báo cáo nói về các nhân tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp màng cellulose, các cơ chất, chất ức chế, hệ enzyme và các sản phẩm trung gian liên quan đến sản xuất màng cellulose. Năm 1967, Lapuz phân lập và xác định được giống vi khuẩn lên men tạo thạch dừa ở Philippine là Acetobacter xylinum với điều kiện nuôi cấy tối ưu là 280C, pH từ 5 đến 5.5, nguồn N là muối ammoni, nguồn carbon là glucose hoặc succrose và nước dừa già. Sau đó có nhiều công trình nghiên cứu về quá trình tổng hợp cellulose, tạo giống vi sinh vật sản sinh cellulose biến đổi gen và các ứng dụng của màng cellulose…[14]. 2.1.1.2 Vi sinh vật sản sinh cellulose Những loài vi khuẩn : Acetobacter, Aerobacter, Achromobacter, Agrobacterium, Alacaligenes, Azotobacter, Pseudomonas, Rhizobium và Sarcina đều có thể tạo ra cellulose. Tuy nhiên, những vi khuẩn thuộc loài Acetobacter tạo ra lượng cellulose nhiều hơn và có giá trị thương mại cao hơn. Trong đó giống Acetobacter xylinum được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất. -4- Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadieae, phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể phân lập được các vi khuẩn này từ không khí, đất, nước, lương thực thực phẩm, dấm, rượu, bia, hoa quả… Có khoảng 20 loài thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có ý nghĩa kinh tế. Vi khuẩn Acetobacter: Acetobacter là vi khuẩn có dạng hình que, tế bào đứng riêng lẻ hoặc kết thành từng chuỗi, không sinh nha bào tử, chịu được độ acid cao. Tuỳ điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần môi trường nuôi cấy) mà các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra các tế bào có hình thái khác biệt dạng kéo dài hoặc phình to ra. Kích thước của chúng thay đổi tuỳ loài (0.3-0.6 x 1.0-8.0μm). Vi khuẩn Acetobacter có khả năng đồng hoá nhiều nguồn thức ăn cacbon khác nhau nhưng không sử dụng được tinh bột. Chúng có khả năng tạo thành váng trên môi trường lỏng, khả năng tạo thành váng thay đổi tuỳ loài: Acetobacter xylinum: tạo thành váng cellulose khá dày và chắc. Acetobacter orleanoe: tạo thành váng mỏng nhưng chắc. Acetobacter pasteurianum: tạo thành váng khô và nhăn nheo. Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng dễ tan rã. Acetobacter curvum: sinh acid acetic với nồng độ cao nhưng tạo thànhváng không chắc chắn. Acetobacter có khả năng đồng hoá muối (NH4)+ và phân giải pepton. Một số loài đòi hỏi một số acid amin nhất định như: acid pantothenic và các chất khoáng K, Mg, Ca, Fe, P, S …ở dạng muối vô cơ, hữu cơ hoặc hợp chất hữu cơ. Do đó bia, dịch tự phân nấm men, nước mạch nha, nước trái cây…là nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sự phát triển của vi khuẩn Acetobacter.. Phân loại vi khuẩn Acetobacter : Đến nay đã có nhiều tác giả đề cập đến vấn đề phân loại các loài vi khuẩn trong giống Acetobacter, nhưng đáng chú ý nhất là bảng phân loại Acetobacter của JFrateur-1950. Sau đây là một số loài quan trọng nhất: -5- Acetobacter aceti: trực khuẩn ngắn, không chuyển động và chúng có thể liên kết với nhau thành chuỗi dài. Chúng bắt màu vàng với iod, có thể sống ở nồng độ cồn khá cao (11%) và có khả năng oxy hoá cồn tạo thành 6% acid acetic. Nhiệt độ phát triển tối ưu của chúng là 340C. Nếu nhiệt độ cao quá 400C sẽ gây ra hiện tượng co tế bào và tạo thành hình quả lê. Ta thường thấy chúng phát triển trong bia. Acetobacter schutzenbachii: trực khuẩn khá dài, tạo thành váng dày, và không bền vững, có khả năng tích luỹ trong môi trường đến 11.5% acid acetic do đó thường được sử dụng để làm giấm theo phương pháp nhanh (phương pháp của Đức). Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng, dễ vỡ ra, có khả năng chuyển hoá glucose thành acid gluconic hay sorbic thành sorbose. Loại vi khuẩn này muốn phát triển bình thường cần được cung cấp một số chất sinh trưởng như acid para aminopenzoic, acid panthoteric, acid nicotinic. Acetobacter orleansen: trực khuẩn dài trung bình không di động. Gặp điều kiện nhiệt độ cao có thể sinh ra các tế bào dị hình kéo dài hoặc phình to ra. Tạo ra váng rất dày trên môi trường dịch thể ,có thể phát triển được trong môi trường có nồng độ rượu cao (10%-12%) và làm tích luỹ đến 9.5% acid acetic. Thường được dùng trong công nghiệp chuyển rượu vang thành giấm (phương pháp của Pháp). Phát triển thích hợp ở nhiệt độ 25-30oC. Acetobater xylinum: trực khuẩn không di động, tạo thành váng nhăn và khá dày.Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm Iod sẽ bắt màu xanh.Có thể tích luỹ 4.5% acid acetic trong môi trường. Acetobacter pasteurianum: trực khuẩn ngắn, váng vi khuẩn có dạng khô và nhăn nheo, váng bắt màu xanh khi nhuộm với thuốc Iod. Có khả năng oxyhoá và tạo 6.2% acid acetic. Giống Acetobacter xylinum Chủng Acetobacter xylinum có nguồn từ Philippin. Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi khuẩn acetic. Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì -6- Acetobacter xylinum thuộc: lớp Schizommycetes, bộ Pseudomonadales, họ Pseudomonadieae. A.xylinum là loại vi khuẩn hình que dài khoảng 2μm, Gram âm, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi, có khả năng di động nhờ tiên mao. Chúng có khả năng tạo váng hemicellulose khá dày, bắt màu với thuốc nhuộm Iod và H2SO4. Khi nuôi cấy trên môi trường thạch, lúc tế bào còn non, khuẩn lạc mọc riêng rẽ, nhầy và trong suốt. Tế bào mọc dính với nhau thành từng cụm và khuẩn lạc mọc theo đường nuôi cấy khi tế bào già. Ngoài ra, A.xylinum còn có một số đặc điểm sinh hóa: Phản ứng catalase dương tính, oxy hóa ethanol thành CO2 và H2O, không tăng trưởng trên môi trường Hoyer, không tạo sắc tố nâu… Hình 2.1 Vi khuẩn A. xylinum [30] A.xylinum sinh trưởng ở điều kiện pH < 5, nhiệt độ khoảng 28-32oC và có thể tích luỹ 4.5% acid acetic. Acid acetic là sản phẩm sinh ra trong quá trình hoạt động của vi khuẩn, nhưng khi chúng vượt quá mức cho phép, chúng sẽ quay ngược trở lại làm ức chế hoạt động của vi khuẩn. 2.1.1.3 Quá trình tổng hợp cellulose: a.Vị trí tổng hợp cellulose ở tế bào vi khuẩn A.xylinum Một tế bào đơn vi khuẩn A.xylinum có thể polymer hoá trên 200.000 đơn vị glucose thành chuỗi β-1,4glucan/giây. Các vị trí tổng hợp cellulose trên bề mặt tế bào là những lỗ có đường kính 3,5nm sắp xếp song song theo đường thẳng dọc trục vi khuẩn. Mỗi lỗ bao phủ một tiểu phần 10nm chứa enzym tổng hợp cellulose liên quan đến phản ứng polymer háo và các protein hỗ trợ liên quan đến chức năng -7- khác. Mỗi tiểu phần 10nm tạo ra các chuỗi glucan hình thành vi sợi 1,5nm. Mỗi lỗ trên bề mặt vi khuẩn tổng hợp nên khảong 16 chuỗi glucan song song và sau đó tạo thành 1 dải sợi. Sự kết tinh trong các vi sợi dẫn đến sự thay đổi lý tính của polymer từ bề mặt tế bào vào trong môi trường nuôi (cellulose không nằm trong vách tế bào như sản phẩm cellulose tiêu biểu trong tế bào thực vật). Các bó sợi tạo thành dải được phun vào trong môi trường nuôi cấy. b.Enzyme tổng hợp cellulose vi khuẩn Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hoà 1 cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại enzym, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà. Sau đây là các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn: CS: cellulose synthase. FBP: fructose-1,6-biphosphate phosphatase. GK: glucokinase FK: fructokinase G6PDH: glucose-6-phosphate dehydrogenase 1PFK: fructose-1-phosphate kinase PGI: phosphoglucoisomerase PGM: phosphoglucomutase PTS: hệ thống của phosphotransferase UGP: UDP-glucose pyrophosphorylase Fru-bi-P: fructose-1,6-bi-phosphate Fru-6-P: fructose-6-phosphate Glc-6-P: glucose-6-phosphate Glc-1-P: glucose-1-phosphate PGA: phosphogluconic acid UDPGlc: uridine diphosphoglucose Gluconcogenesis: Glucose giải -8- c.Quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn Sau khi cấy giống vào môi trường, A.xylinum sẽ lắng xuống đáy môi trường để bắt đầu quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp. Để tổng hợp cellulose, chúng sử dụng các chất dinh dưỡng có trong môi trường chủ yếu là nguồn carbon hydrat và các sinh tố như vitamin B1, vitamin B2, vitamin B12…các chất kích thích….Trong môi trường nuôi cấy A.xilynum, người ta thấy các sợi tơ nhỏ phát triển ngày càng dài hướng từ dưới đáy lên bề mặt. Quá trình sinh tổng hợp gồm nhiều phản ứng liên tiếp nhau được thực hiện bởi sự tham gia của một hệ các enzyme (Sơ đồ 2.1). Con đường sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn gồm hai giai đoạn chính: Giai đoạn polyme hoá: Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hoá chuyển glucose thành glucose-6-phosphate. Sau đó enzyme phosphoglucomutase tiếp tục chuyển hoá glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate thông qua phản ứng isomer hoá. Tiếp theo sau đó glucose-1-phosphate nhờ enzyme UDP-glucose pyrophospholyase chuyển hoá thành UDP-glucose. Cuối cùng,UDP-glucose được tổng hợp nên sẽ được polymer hoá thành cellulose và cellulose được tiết ra môi trường ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là cellulose synthase. Enzyme này được hoạt hoá nhờ một nucleotide vòng là cyclic-di-GMP. Một số vi khuẩn có khả năng sử dụng đường fructose hiệu quả hơn. Lúc này hệ thống enzyme phosphotransferase sẽ chuyển fructose thành fructose-1-phoshate.Sau đó fructose-1-phosphate sẽ được chuyển hoá thành fructose-bi-phosphate nhờ enzyme fructose-1-phosphatekinase. Lúc này enzyme phosphoglucose isomerase có hoạt tính cao,sẽ giúp chuyển hoá fructose-6-phosphate thành glucose-6phosphate.Tiếp theo sau đó glucose-6-phosphate lại tham gia vào quá trình chuyển hoá tương tự như trên để tạo ra cellulose. -9- C e l lu lo s e U D P -G lu c o s e G lu c o s e G lu c o s e -1 -P h o s p h a te G lu c o s e -6 -P h o s p h a te F r u c to se F ru c to s e -6 -P h o s p h a te P h o s p h o g lu c o n ic A c id T C A C y c le F ru c to s e -1 -P h o s p h a te F r u c t o s e - 1 ,6 - D i p h o s p h a t e Sơ đồ 2.1 Con đường chuyển hóa fructose và glucose ở A.xylinum [14] Giai đoạn kết tinh: Các chuỗi glucan được nối với nhau nhờ liên kết -1,4-glucan.Trong đó các chuỗi glucan kết hợp với nhau tạo thành lớp chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van Der Waals. Lớp chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó chúng kết hợp với nhau bằng liên kết hydro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16 chuỗi glucan. Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các vi sợi, sau đó các vi sợi lại tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi. 2.1.1.4 Cellulose vi khuẩn Cellulose là polymer được tạo thành từ những phân tử gluco nhờ liên kết β-1,4. Khác với thực vật, cellulose do vi khuẩn tạo ra hòan tòan không có lignin và hemicellulose. Cellulose do vi khuẩn tạo ra có dạng sợi rất mảnh và được kết hợp với nhau để tạo thành màng mỏng. Kích thước của sợi và cấu trúc của màng phụ thuộc vào loại vi khuẩn tạo màng cellulose, môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy (bảng 2.1, hình 2.2 - 2.4). - 10 - Bảng 2.1 Cấu trúc của màng phụ thuộc vào loại vi khuẩn tạo màng cellulose Giống Cấu trúc cellulose Acetobacter Lớp màng ngoại bào tạo thành các dải Achromobacter Sợi Aerobacter Sợi Agrobacterium Sợi ngắn Alcaligen Sợi Pseudomonas Các sợi không tách biệt Rhizobium Sợi ngắn Sarcina Cellulose dị hình. Zoogloea Chưa xác định rõ cấu trúc Hình 2.2. Màng BC của A. xilinum dưới kính hiển vi điện tử ở điều kiện nuôi cấy tĩnh (a) và sợi cellulose bám trên bề mặt tế bào (b) [18] Hình 2.3 Màng BC ở điều kiện nuôi cấy tĩnh [18] Hình 2.4 Màng BC ở điều kiện nuôi cấy có sử dụng cánh khuấy [18] - 11 - 2.1.1.5.Ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy đến qúa trình lên men sản xuất cellulose vi khuẩn a. Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu: Tuỳ vào nguồn nguyên liệu (nước dừa, rỉ đường, nước mía, dịch chiết khoai tây, glucose tinh khiết, dịch chiết từ quả thơm…) trong môi trường nuôi mà ảnh hưởng đến sự phát triển của A.xylinum và khả năng tổng hợp cellulose khác nhau. Do đó, yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến cấu trúc và năng suất của lớp màng BC. b. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy _ Nuôi cấy tĩnh: BC được tạo ra trong môi trường nuôi cấy tĩnh tích tụ ở bề mặt dịch nuôi, nơi giàu nguồn Oxi, các sợi cellulose được đẩy ra từ các lỗ trên bề mặt tế bào vi khuẩn. Các sợi này tạo song song và chồng chéo. _ Nuôi cấy lắc: BC đuợc tạo ra bởi nuôi cấy lắc có dạng hột nhỏ không đều, các sợi có thớ và hình sao, phân tán tốt trong dịch nuôi, theo hướng song song và vuông góc. Các sợi thì phức tạp và uốn cong, bên cạnh đó chúng có bề rộng lớn hơn các sợi trong nuôi cấy tĩnh. _ pH: Vi khuẩn A.xylinum phát triển thuận lợi trên môi trường có pH thấp (pH tối thích = 4.5). Do đó trong môi trường nuôi cấy cấn bổ sung thêm acid acetic nhằm acid hoá môi trường. Đồng thời acid acetic còn có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật có hại. _ Độ thoáng khí: Vi khuẩn A.xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Do vậy, điều kiện tiên quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thoáng khí. Trong cơ chế của quá trình oxy hoá lượng cung cấp oxy không khí là tương đối lớn. Trong thực tế càng thoáng khí năng suất càng cao. Ở phương pháp lên men bề mặt, do bề mặt tiếp xúc giữa tế bào và oxy bị hạn chế bới sự bao phủ bề mặt dịch lên men của lớp váng BC và độ dày của lớp dung dịch nên trong quá trình lên men kéo dài hơn so với lên men chìm. Vì vậy hình thức sục khí cung cấp oxy và sử dụng cánh khuấy trong lên men động là - 12 - phù hợp nhất cho sinh khối cao nhất. Trong lên men tĩnh cần sử dụng dụng cụ cần bề mặt rộng, thoáng và lớp mội trường mỏng. _ Nhiệt độ: Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm ưa ấm, nhiệt độ thích hợp với chúng là từ 25320C. Ở nhiệt độ thấp quá trình lên men xảy ra chậm. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào làm tăng sự tổn thất cho vi khuẩn và hiệu suất lên men sẽ giảm. Tác động của nhiệt độ không ảnh hưởng đáng kề đến độ ẩm BC, khi đun sôi hay ở –20oC thì độ ẩm của BC không thay đổi. Nhiệt độ cao không thay đổi đáng kể cấu trúc sợi BC, nhiệt độ lạnh làm tăng tính đàn hồi của sợi BC. 2.2. Màng lọc nước 2.2.1 Các loại màng lọc nước Có nhiều cách phân loại màng. Nhưng trong đó có hai cách phân loại thông dụng nhất: phân loại theo vật liệu cấu tạo màng và theo công nghệ lọc. 2.2.1.1 Phân loại theo vật liệu cấu tạo màng: Màng lọc được làm từ nhiều loại vật liệu khác nhau: kim loại, gốm, sứ, polymer, composite… Màng kim loại thường được làm bằng thép không rỉ và được sử dụng trong công nghệ vi lọc. Màng gốm, sứ được làm từ những loại gốm sứ đã được xử lý để có kích thước lỗ màng đồng đều và được sử dụng trong công nghệ vi lọc, công nghệ siêu lọc. Màng lọc polymer: màng cellulose, màng Polysunfone, màng Polyvinylidenedifluoride… được sử dụng nhiều nhất và màng lọc cellulose cũng có nhiều loại. Một số loại màng lọc cellulose đang được sử dụng làm màng lọc : Cellulose acetate (CA), Cellulose nitrate (CN), Cellulose tái sinh (RC), Cellulose triacetate (CTA)… 2.2.1.2 Phân loại theo công nghệ lọc: Màng sử dụng trong công nghệ : vi lọc ( MF: microfiltration), siêu lọc( UF: ultrafiltration ), lọc nano ( nanofiltration) và lọc thẩm thấu ngược (RO: reverse osmosis). - 13 - 2.2.2 Tính chất các màng lọc nước: 2.2.2.1 Tính chất một số loại màng cellulose: _Cellulose acetate (CA): Đặc điểm: Bền nhiệt (tới 1800C), ưa nước, hấp phụ và dính bám các phân tử protein thấp. Tương thích hoá học với các dung dịch có pH 4-8; không tươngthích hoá học với cồn, hydrocarbon và các loại dầu Ứng dụng: lọc dịch vô trùng, lọc kiểm tra vi sinh vật Hình 2.5 Cấu trúc màng lọc Cellulose acetate [20] _ Cellulose nitrate (CN): Đặc điểm: Bền nhiệt (đến 1300C), ưa nước, tốc độ lọc lớn, khả năng bám với protein, nucleic acid lớn. Tương thích hoá học với các dung dịch có pH 4-8 Hình 2.6 Cấu trúc màng lọc Cellulose nitrat [20]